一种快速筛选高产胞外多糖嗜热链球菌的方法

1.本发明属于菌种筛选技术领域，涉及一种快速筛选高产胞外多糖嗜热链球菌的方法。


背景技术：

2.嗜热链球菌作为唯一用于食品发酵的链球菌，广泛应用于酸奶等乳制品的制作。嗜热链球菌在生长代谢过程中会形成一种多糖类化合物并分泌到细胞壁外，也就是嗜热链球菌胞外多糖(eps，exopolysaccharides)。eps具有稳定的保水性和凝胶性，不仅能增加酸奶和奶油的质构，还能作为增稠剂和稳定剂提高酸奶的质量。此外，还具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、降血脂等生理活性。
3.嗜热链球菌eps是菌株适应环境产生的次级代谢产物，虽然具有安全性高、副作用小、理化特性独特等优点，但菌株稳定性差、产率低等问题限制其在工业生产中大规模应用。因此，筛选出高产eps菌株是工业化关键步骤，通常采用改良微生物的遗传性状，或通过基因工程和代谢工程等方法对菌株进行定向进化，加速菌株选种并优化代谢途径。建立高通量筛选方法可以对庞大的定向进化文库进行快速筛选，获到高产eps菌株，为嗜热链球菌eps实现工业应用奠定基础。
4.嗜热链球菌eps生产周期短，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。但eps高粘度特性，导致发酵传氧传质困难、能耗高，是影响嗜热链球菌eps产率重要问题。目前苯酚硫酸法、蒽酮比色法、咔唑比色法、液相色谱、目测组织状态、拉丝长度和粘度测定等方法是产eps菌株常用的筛选方法，操作复杂，醇沉、去蛋白和透析等纯化过程繁琐耗时长，且易受杂质(蛋白质和还原糖)和发酵体积的影响，精确度不足。因此需要一种方法能够对嗜热链球菌eps进行快速分析获得高产菌株。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是为了提供一种快速筛选高产胞外多糖嗜热链球菌的方法，48h内可实现菌株培养和eps产量分析，方法简便、操作简单，并具有较好的可靠性，适于实验室和工业规模化使用。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
7.一种快速筛选高产胞外多糖嗜热链球菌的方法，包括以下步骤：
8.(1)取嗜热链球菌样品稀释涂布于刚果红平板培养，确定菌落颜色，选择red值较低的菌株作为初筛菌株；
9.(2)采用微孔板培养初筛菌株，离心弃去菌体，煮沸，得到对应不同初筛菌株的发酵液；
10.(3)取发酵液与刚果红缓冲液在微孔板中反应，测定其吸光值，选取吸光值较高的初筛菌株作为复筛菌株，即目标菌株，完成高产胞外多糖嗜热链球菌的筛选。
11.进一步的，步骤(1)中，所用刚果红平板通过在lm17培养基的基础上替换乳糖为等
质量的蔗糖，并添加刚果红0.8g/l，琼脂20g/l得到。
12.进一步的，步骤(1)中，嗜热链球菌样品在刚果红平板上的涂布密度为：30～300个菌落/49cm2。
13.进一步的，步骤(1)中，确定菌落颜色并得到red值的过程为：对菌落拍照后，采用屏幕颜色拾取工具colors pro 4000识别菌落上若干位置点的red值，取平均值，即得到对应菌落的red值。更进一步的，一般而言，red值小于110的菌株，为所需要的初筛菌株。
14.进一步的，步骤(2)中，微孔板内采用lm17培养基替换乳糖为等质量的蔗糖培养初筛菌株。
15.进一步的，步骤(2)中，煮沸时间控制为8～12min。
16.进一步的，步骤(2)中，所用微孔板为96深孔板。
17.进一步的，步骤(3)中，所述刚果红缓冲液的浓度为0.2～0.4mg/ml，所用缓冲液为ph＝7.2的pbs缓冲液，发酵液与刚果红缓冲液的体积比为1:1。
18.进一步的，步骤(3)中，反应时间为15～25min。
19.进一步的，步骤(3)中，吸光值在480nm处测定。更进一步的，吸光值大于0.4的菌株，才为所需要的复筛菌株。
20.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
21.1、基于刚果红染料与胞外多糖特异性结合作用，建立以刚果红染色对嗜热链球菌eps进行筛选的方法。
22.2、以菌株颜色和吸光值作为菌株筛选标准，快速完成胞外多糖产量的比较，节省时间成本。
23.3、建立完整的高通量筛选流程，包含平板初筛和微孔板复筛。对筛选体系进行优化，在48h完成菌株培养与菌株筛选。
附图说明
24.图1为菌落直径、red值分别与胞外多糖相关性的拟合分析图。
25.图2为嗜热链球菌胞外多糖刚果红液体的吸光测试图。
26.图3为不同因素对显色反应的影响图，其中，(a)反应时间；(b)最大波长；(c)缓冲液种类和ph；(d)刚果红浓度。
27.图4为刚果红比色法吸光值与胞外多糖产量的相关性图。
28.图5为利用cra平板法和液体微孔板比色法快速筛选产eps嗜热链球菌突变库流程图。
29.图6为筛选菌株在微孔板比色法480nm吸光值(absorbance)和eps产量。
30.图7为特征菌株的菌落形态和eps产量图。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
32.以下实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其均为本领域的常规市
售原料或常规处理技术。
33.实施例：
34.1材料与方法
35.1.1材料
36.lm17培养基的组分配方为：胰蛋白胨5g/l，大豆蛋白胨5g/l，酵母浸粉2.5g/l，牛肉浸出粉5g/l，乳糖20g/l，β-磷酸甘油二钠19g/l，mgso
4.
7 h2o 0.58g/l，乳糖20g/l；
37.刚果红平板：在lm17培养基基础上替换乳糖为蔗糖，添加刚果红0.8g/l，琼脂20g/l；
38.菌株：嗜热链球菌s-3以及17株嗜热链球菌菌株；
39.试剂：苯酚、三氯乙酸、硫酸、pbs缓冲液、tris-hcl缓冲液。
40.1.2仪器与设备
41.du-800分光光度计、spectra max i3x多功能酶标仪、厌氧培养箱、正置荧光显微镜
42.1.3平板图像筛选
43.选取36株嗜热链球菌样品稀释涂布于刚果红平板上(cra,congo red agar)培养24h，刚果红平板的尺寸为7cm
×
7cm，放置室温下过夜，随eps产量的高低菌落形态有所区别，分别对菌株直径和颜色进行形态分析。确认菌落颜色通过矩阵rgb中三原色红色(r)、绿色(g)和蓝色(b)的三种原色光谱产生，相应单色初级刺激在700、546、436nm处发生，量化范围为0(黑暗)至256(白度)。rgb值＝red green
×
256 blue
×
256
×
256。采用屏幕颜色拾取工具colors pro 4000快速识别菌落的不同位置点(一般均匀的选取3-5个点即可)的red值，取平均值，即得到对应菌落的red值。菌落直径通过采用屏幕几何尺快速测量，利用摄像头和感应器来获知物体长度。对36株嗜热链球菌进行eps提取及苯酚硫酸法测定产量，分析菌落直径和颜色与eps产量的拟合相关性。
44.1.4微孔板筛选
45.采用96深孔板培养菌株24h(此处采用的培养基为lm17培养基替换乳糖为等质量的蔗糖)，离心弃去菌体，煮沸10min得到发酵液。取140μl发酵液和140μl刚果红缓冲液在96孔板中混合反应测定吸光值。采用方差分析，对最优染料浓度、基质效应和工作范围对校正曲线进行优化，将嗜热链球菌s-3的发酵液作为梯度浓度为2.5～25μg/ml的标准溶液，设置刚果红缓冲液为不同浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml)不同基质(水、不同ph的pbs缓冲液和tris-hcl)以及测定的不同反应时间(0、10、20、30、40min)和不同波长(460、470、480、490、500nm)，每组三个平行，以吸光值为纵坐标，发酵液浓度为横坐标绘制标准曲线，以此获得校准曲线的最大斜率和灵敏度，确定反应最佳条件。以上述方法测定24株嗜热链球菌在刚果红比色的吸光值并与对应eps产量进行拟合分析，确定方法的可行性。
46.1.5eps产量测定
47.将嗜热链球菌单菌落接种于lm17培养基，37℃培养12h作为种子液，调至od
600
＝1。以3％接种量于离心管中，37℃培养24h，离心取上清(20min，6000g，4℃)，煮沸10min，加入80％三氯乙酸至终浓度5％(w/v)，4℃静置过夜，离心除蛋白(30min，6000g，4℃)。取上清液透析72h(截留量8000-10000da)，对胞外多糖透析液按照苯酚硫酸法测定菌株胞外多糖含量，每组三个平行。
48.1.6紫外诱变文库的建立
49.最小抑菌浓度的确定(minimum inhibitory concentration,mic)：制备嗜热链球菌s-3的菌悬液(od
600
＝1)，梯度稀释至10-5
后取100μl涂布于含有不同梯度抗生素浓度(0～20μg/ml)的lm17平板，以不含抗生素平板为对照，37℃培养24～72h，肉眼观察未长菌落的最小浓度即为链霉素对该菌株的mic；
50.测定致死曲线：取细胞悬液5ml于无菌培养皿中，放在磁力搅拌机上紫外照射(功率30w，灯距25cm)0、30、60、90、120、150s，将诱变处理后的菌悬液稀释涂布于lm17培养基上，37℃培养36h，菌落计数，取三个平行，计算致死率。
51.菌株诱变筛选：收集嗜热链球菌s-3的菌悬液至浓度约为10
8-109cfu.ml-1
，取5ml于无菌培养皿中，紫外灯持续照射30-60s，致死率达70～80％，诱变处理的菌悬液适当稀释后涂布于2
×
mic链霉素的cra平板，37℃培养36h。挑选诱变过后的单菌落，采用cra平板法和微孔板比色法进行文库筛选。筛选得到的菌株进行摇瓶发酵，采用苯酚硫酸法测定eps产量，验证筛选方法的实用性。
52.2结果
53.2.1嗜热链球菌胞外多糖cra平板法的建立
54.不同嗜热链球菌在含刚果红的cra平板上生长会显示不同的菌落颜色和大小，eps阳性株表现为大量黑色团块菌体，eps缺失菌株是细小均质白色菌体，通过产生的颜色反应检测eps产生的能力。
55.对于(1.3)方案中选取的36株嗜热链球菌的菌落颜色和菌落直径与eps产量进行相关性分析，结果发现菌落直径与eps产量的相关性仅为54.19％，而菌株颜色矩阵rgb总值与eps产量无明显关联。进一步比较发现rgb中的red值(红色)与eps产量呈负相关，相关系数r2值达77.92％(图1)。因此，采用red值作为cra平板上eps产量的初筛依据。图7为5株eps产量差异的嗜热链球菌菌株，其red值越小，eps产量越高，呈线性关系。选择red值小于110的菌株，即为高产eps的初筛菌株。
56.2.2嗜热链球菌胞外多糖刚果红液体微孔板比色法的建立
57.根据刚果红与嗜热链球菌eps中β-1，3-d-葡聚糖发生特异的相互作用，在可见光488nm至516nm处会发生红移现象，基于此判断嗜热链球菌eps是否具有三螺旋三级结构特征，同时也发现吸光值变化与eps含量具有较好的相关性。从图2可知，对不同浓度的刚果红(0～200μg/ml)和20μg/well嗜热链球菌eps的混合溶液进行全波长扫描，发现在480nm处都表现最大吸收峰。基于此，本发明继续通过基于96微孔板的高通量快速嗜热链球菌eps检测方法，实现对菌株的复筛。
58.与传统方法对比，微孔板方法具有速度快、成本低、可同时测定多个样品等优点，我们对影响微孔板测定嗜热链球菌eps方法的影响参数进行优化，改变染料浓度、反应波长、反应时间、缓冲液种类和ph(图3)。每组三个平行，以吸光值为纵坐标，发酵液浓度为横坐标绘制标准曲线。通过优化不同参数条件获得校准曲线的最大斜率，确定最佳反应时间。由图3可知，在ph＝7.2的pbs缓冲液中0.3mg/ml刚果红与发酵液反应，r2达到0.989和0.994，混合物反应20min后在480nm处测定吸光值，r2达到0.990和0.993，且校准曲线斜率最大，吸光值范围在0.3～0.8之间，确定其结果准确性，作为最佳反应条件。
59.选取24种嗜热链球菌的发酵液样品，以上述最佳反应条件测定吸光值，并测定菌
株的胞外多糖产量。如图4所示，eps产量与微孔板的吸光值有较高的拟合度，相关性达到86.17％。证明本发明的开发的微孔板法对测定嗜热链球菌发酵液中eps含量具有较好的可靠性。
60.2.3、利用cra平板法和液体微孔板比色法快速筛选产eps嗜热链球菌突变库
61.为进一步验证上述方法的可行性，实现对定向进化文库的快速筛选，本发明先按照图5方法对eps产量较高的嗜热链球菌s-3进行紫外诱变，确定最小抑菌浓度为10μg/ml，紫外照射时间为30s，得到115株突变株。
62.将上述115株突变株经过(2.1)中的cra平板法初筛挑选出46株red值小于110的菌株，进一步通过(2.2)中的液体微孔板比色法复筛得到14株吸光值大于0.4的突变株。对其测定eps产量(图6)，yb-4、yb-12、yb-13和yb-14产量高于出发菌株s-3，其中yb-13产量高达188.91mg/l，比s-3增长13.75％。对突变菌株采用传统苯酚硫酸法与微孔板比色法进行比较分析，两者具有较好的相关性，但采用传统苯酚硫酸法需要对菌株发酵液进行醇沉、除蛋白、透析等步骤，总耗时需6-7天，而采用我们开发的微孔板比色法可快速实现菌株间eps产量比较，达到高通量筛选效果，从样品测定到eps测定仅需1h。因此，结合建立的cra平板法和液体微孔板比色法，可实现简单、快速和有效的筛选大量改造和突变的产eps嗜热链球菌文库。
63.上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。