一种ENO2单克隆抗体1C5及其制备方法和应用与流程

一种eno2单克隆抗体1c5及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种eno2单克隆抗体1c5及其制备方法和应用。


背景技术：

2.烯醇化酶是生物体内糖酵解过程中的关键酶，在脊椎动物中，烯醇化酶(enolase)存在3种同功酶:α、β和γ。α-enolase(eno1)又称为非神经元烯醇化酶(non-neuralenolase,nne)，在许多组织均存在；β-enolase(eno3)又称为肌肉特异性烯醇化酶(muscle-specificenolase,mse)、骨胳肌enolase(skeletalmuscleenolase)，几乎仅见于肌肉组织；γ-enolase(eno2)又称为神经元烯醇化酶(neuraleno-lase)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificeno-lase,nse)，主要存在于神经元和神经内分泌组织。enolase的活性形式均为二聚体，即由两个亚基组成，目前已知有5种形式的组合：αα、ββ、γγ、αβ和αγ。
3.烯醇化酶2(eno2)又称nse，nse主要存在于神经元和神经内分泌细胞的胞质。神经元特异性烯醇化酶是一种普遍存在于生物体细胞质中能敏感反映神经元损伤的神经系统特异糖酵解酶。
4.nse最早是作为小细胞肺癌的肿瘤标记物，但近年来越来越多的研究结果表明nse可作为各类神经元损伤的特异性标志。在脑血管病，尤其在脑出血方面，越来越受到人们的重视。测定nse在脑出血的诊断、判断疾病严重程度、估计预后和指导治疗等方面具有重要意义。
5.在脑损伤性疾病中，神经细胞中的nse透过血脑屏障释放入脑脊液及血液中，引起血清及脑脊液中nse水平升高，不同程度及不同性质的脑损伤nse释放的量及速度亦不相同，且在广泛的脑损伤和越来越严重的继发性脑损伤患者中nse持续升高，因此，其水平不仅能反映原发性脑损伤的程度，而且能反映继发性脑损伤的进展。检测血清nse水平可为颅脑损伤和脑出血等脑血管性疾病诊断及预后判断提供一种新的手段。nse作为神经重症监护的长期预后生物标志物和治疗指标具有极好的潜力。
6.但是目前关于nse的检测，传统的产单克隆抗体的杂交瘤细胞不易保存，时间过长会出现细胞状态变差，甚至难以复苏，产生抗体量降低，并且抗体的序列未知，无法对抗体做更深入的研究


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种eno2单克隆抗体1c5及其制备方法和应用
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
9.本发明提供了一种eno2单克隆抗体1c5，所述单克隆抗体1c5包括重链和轻链；
10.所述轻链的可变区的互补决定区的氨基酸序列如seq id no.1～seq id no.3所示；
11.所述重链的可变区的互补决定区的氨基酸序列如seq id no.4～seq id no.6所示。
12.优选的，所述单克隆抗体1c5的轻链可变区的骨架区的氨基酸序列如seq id no.7～10所示；
13.所述单克隆抗体1c5的重链的可变区的骨架区的氨基酸序列如seq id no.11～14所示。
14.优选的，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.15所示；
15.所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.16所示。
16.本发明还提供了编码上述eno2单克隆抗体1c5的核酸，编码所述单克隆抗体1c5的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.17所示；
17.编码所述单克隆抗体1c5的重链可变区的核苷酸序列如seq id no.18所示。
18.本发明还提供了一种表达上述单克隆抗体1c5的重组载体，所述重组载体的基础载体包括携带编码重链可变区核苷酸序列的pfuse-chig-mg1，和携带编码轻链可变区核苷酸序列的pfuse2ss-clig-mk。
19.优选的，所述编码重链可变区的核苷酸序列连接到pfuse-chig-mg1的ecori和nhei之间；
20.所述编码轻链可变区的核苷酸序列连接到pfuse2ss-clig-mk的ecori和nhei之间。
21.本发明还提供了一株表达上述单克隆抗体1c5的重组细胞，所述重组细胞的基础细胞包括哺乳动物细胞。
22.本发明还提供了上述重组细胞的构建方法，包括以下步骤：将所述单克隆抗体1c5的重链可变区连接到pfuse-chig-mg1上，得1c5mg1；
23.将所述单克隆抗体1c5的轻链可变区连接到pfuse2ss-clig-mk上，得1c5mk；
24.分别提取1c5mg1和1c5mk的质粒，混合后转染所述基础细胞，得重组细胞。
25.本发明还提供了一种制备上述单克隆抗体1c5的方法，对上述重组细胞培养48h，收集上清液，所述上清液中包含所述单克隆抗体1c5。
26.本发明还提供了上述单克隆抗体1c5或利用上述方法制备得到的单克隆抗体1c5在制备特异性检测eno2的试剂中的应用。
27.本发明还提供了上述单克隆抗体1c5或利用上述方法制备得到的单克隆抗体1c5在制备脑血管性疾病诊断和/或预后判断的试剂中的应用。
28.有益效果：本发明提供一种eno2单克隆抗体1c5，并具体公开了重链和轻链的可变区的互补决定区序列，基于所述序列，可将可变区序列构建到抗体表达载体上，转染细胞表达获得重组单克隆抗体。本发明得到的单克隆抗体1c5载体易于保存，易于抗体生产过程质量控制；也方便对抗体做一系列的改造，更深入的研究，更广泛的应用。经实施例验证，本发明所述单克隆抗体1c5或利用重组细胞生产得到的单克隆抗体1c5，可以识别eno2蛋白，具有生物学活性，可用于eno2抗原检测等其它科学研究，具有非常好的应用价值和非常重要科研指导意义。
leu-tyr-leu-gln-met-asn-thr-leu-arg-pro-glu-asp-ser-ala-thr-tyr-tyr-cys-val-arg；
56.fr4(seq id no.14)：trp-gly-gln-gly-thr-leu-val-thr-val-ser-ala。
57.在本发明中，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.15所示：mawislilsllalssgaisqavvtqesalttspgetvtltcrsntgavttsnyanwvqekpdhlftgliggtynrapgvparfsgsligdkaaltitgaqtedeaiyfcslwysnhwvfgggtkltvl；所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.16所示：mklwlnwiflvtllngiqcevklvesggdlvqpggslrlscatsgftftdyymiwvrqppgkalewlgfirnkangyttqynasvkgrftisrdnsqsilylqmntlrpedsatyycvrdrrgttfaywgqgtlvtvsa。
58.本发明还提供了编码上述eno2单克隆抗体1c5的核酸，编码所述单克隆抗体1c5的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.17所示：atggcctggatttcacttatactctctctcctggctctcagctcaggggccatttcccaggctgttgtgactcaggaatctgcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactcacttgtcgctcaaatactggggctgttacaactagtaactatgccaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactggtctaataggtggtacctacaaccgagctccaggtgttcctgccagattctcaggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacgggggcacagactgaggatgaggcaatatatttctgttctctatggtacagcaaccattgggtgttcggtggaggaaccaaactgactgtccta；编码所述单克隆抗体1c5的重链可变区的核苷酸序列如seq id no.18所示：atgaagttgtggctgaactggattttccttgtaacacttttaaatggtatccagtgtgaggtgaagctggtggagtctggaggagacttggtacagcctgggggttctctgagactctcctgtgcaacttctgggttcaccttcactgattactacatgatctgggtccgccagcctccaggaaaggcacttgagtggttgggttttattagaaacaaagctaatggttacacaacacagtacaatgcatctgtgaagggtcggttcaccatctccagagataattcccaaagcatcctctatcttcaaatgaacaccctgagacctgaggacagtgccacttattactgtgtaagagataggagggggacgacatttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca。
59.本发明还提供了一种表达上述单克隆抗体1c5的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞的构建方法优选包括构建包含人eno2基因序列(nm_001975.3，seq id no.19)的原核表达载体，并将所述原核表达载体转化至top10感受态细胞中，挑取单克隆，提取质粒后转入大肠杆菌bl21(de3)表达感受态细胞中，挑取单克隆培养并离心收集上清，经纯化得到纯化抗原；将所述纯化抗原免疫小鼠后，取免疫效果较好的小鼠的脾脏制备脾细胞；将所述脾细胞与杂交瘤细胞融合，筛选elisa检测阳性杂交瘤细胞。
60.本发明还提供了一种利用所述杂交瘤细胞制备所述单克隆抗体1c5的方法，优选包括利用腹水制备单克隆抗体，纯化后得所述单克隆抗体1c5。本发明获得的eno2单克隆抗体，重链属于igg2a，轻链为lambda。
61.本发明还提供了一种表达上述单克隆抗体1c5的重组载体，所述重组载体的基础载体包括携带编码重链可变区核苷酸序列的pfuse-chig-mg1，和携带编码轻链可变区核苷酸序列的pfuse2ss-clig-mk。
62.本发明所述携带编码重链可变区核苷酸序列的pfuse-chig-mg1优选购自invivogen公司，且优选将所述seq id no.18所示的核苷酸序列优选插入所述pfuse-chig-mg1的ecori和nhei位点，形成重组载体1c5mg1。
63.本发明所述携带编码轻链可变区核苷酸序列的pfuse2ss-clig-mk优选购自invivogen公司，且优选将所述seq id no.17所示的核苷酸序列优选插入所述pfuse2ss-clig-mk的ecori和nhei位点，形成重组载体1c5mk。
ecori-r(10μm)1μl、fastpfu dna polymerase(2.5units)1μl、5
×
fastpfu buffer 10μl、2.5mm dntp 4μl和余量的nuclease-free water；
88.pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，变性到延伸35个循环；72℃再延伸5min；4℃保存。
89.3.将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，分别将目的片段和载体用相应的限制性内切酶酶切，回收；
90.4.将目的片段和载体用同源重组酶连接，50℃连接15min；
91.5.将连接产物转化至top10感受态细胞，37℃培养箱过夜培养；
92.6.挑取单克隆至相应amp抗性的lb培养基，37℃摇床过夜培养；
93.7.提取质粒，测序，比对结果。
94.步骤二、eno2蛋白表达及纯化
95.1.将构建好且测序正确的质粒转入大肠杆菌bl21(de3)表达感受态细胞中；
96.2.挑取单克隆接于lb培养基中，37℃摇菌至od值0.5～1，加iptg诱导，16℃过夜表达；
97.3.收集菌体，超声破碎，离心后收集上清，pet-30a表达的eno2蛋白利用ni柱亲和层析纯化，纯化的蛋白记为eno2-his；pgex 4t-1表达的eno2蛋白利用gst柱纯化，纯化的蛋白记为eno2-gst；
98.纯化后的蛋白经过透析、浓缩，得到高浓度的eno2-his蛋白作为抗原备用，eno2-gst蛋白用于包被elisa板检测eno2抗体。
99.实施例2杂交瘤细胞的获得
100.步骤一、eno2抗原免疫小鼠
101.1.将40μg纯化好的eno2-his抗原与完全氟氏佐剂1:1混合；
102.2.取5只6～8周龄的雌性balb/c小鼠，左侧后小腿肌肉注射100μl(40μg抗原)混合好的抗原；三周后进行第二次免疫，40μg抗原与不完全氟氏佐剂1:1混合，右侧后小腿肌肉注射100μl(40μg抗原)混合好的抗原；
103.步骤二、elisa检测小鼠产生抗体的情况
104.第二次免疫后再过三周采集鼠尾血，离心收集血清，elisa检测小鼠产生抗体的情况，具体步骤如下：
105.①
用纯化好的eno2-gst蛋白包被elisa板，100ng/孔，4℃过夜包被，包被液：25ml碳酸盐缓冲液，ph 9.6(na2co30.03975g，nahco30.07325g，kh2po40.00625g)；
106.②
pbst洗3次，每次3min，每次拍干；
107.③
2％bsa满孔封闭，37℃孵育1h；
108.④
pbst洗3次，每次3min，每次拍干；
109.⑤
将血清用稀释液进行倍比稀释，按1：4万、1：8万、1：16万、1：32万、1：64万、1:128万、1:256万、1:512万稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h，用pbst洗涤3次，每次3min，每次拍干；
110.⑥
羊抗鼠igg-hrp 1：5000稀释，37℃孵育30min；
111.⑦
pbst洗涤3次，拍干后，tmb显色10min，2m h2so4终止，450nm测得吸光值。结果见图1，33号小鼠抗体效价1024万以上，44号小鼠抗体效价500万以上。
112.步骤三、细胞融合
113.1.骨髓瘤细胞的准备
114.复苏sp2/0细胞，用15％胎牛血清dmem培养液传代培养一周。融合时，选对数生长期的骨髓瘤细胞。
115.2.脾细胞的制备
116.取免疫效果好的44号小鼠，摘除眼球采血分离血清，并颈脱位将小鼠致死，75％酒精中浸泡5min消毒；在超净台内，固定好小鼠，取出脾脏，用剪刀去掉粘连细胞的脂肪组织和结缔组织；将脾脏用无血清培养液冲洗后，置于细胞滤网上，用注射器内芯轻轻研磨，并用无血清培养液轻柔冲洗滤网，收集脾细胞悬液；500g离心5min，洗涤细胞3次，弃掉上清液，细胞沉淀用无血清dmem培养液悬浮，计数备用。
117.3.细胞融合
118.在超净台内准备好37℃水浴锅，将sp2/0细胞和脾细胞按1:10比例加入50ml离心管中，混匀。500g离心10min，吸出上清液，轻弹离心管底部，使细胞沉淀略加松动；在90s内慢慢滴入预温至37℃的45％peg1450溶液1ml；并不断地轻轻摇晃离心管；整个过程离心管都在37℃水浴中。
119.然后向细胞混合物中逐渐加入dmem培养基，第一分钟逐滴滴入lml，第二分钟加2ml，第3min加3ml，第4min加4ml，第5min加5ml，37℃水浴中边加边摇晃。然后37℃孵育15min，500g离心5min，去掉上清。
120.加入5ml含有hat的dmem培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，最后补加含有hat的dmed培养基至100ml左右。分装于已铺巨噬细胞的96孔细胞培养板中，100ul/孔，然后将培养板置37℃，5％co2培养箱培养。
121.步骤三、elisa检测阳性杂交瘤细胞
122.1.用pgex 4t-1载体表达的eno2(eno2-gst)蛋白包被elisa板，100ng/孔，4℃过夜包被。
123.2.观察杂交瘤细胞的生长情况，七天后待其细胞培养上清变黄时，吸取适量细胞上清进行elisa检测抗体。
124.3.根据elisa结果，选取od值高的克隆，高于阴性对照两倍以上，铺96孔板，进行第一次亚克隆筛选。
125.4.七到十天后再进行elisa检测抗体，选取od值高的克隆，铺96孔板，进行第二次亚克隆筛选，使每孔约1个细胞；
126.5.培养七到十天后再进行elisa检测抗体，选取od值高的克隆，铺96孔板，进行第三次亚克隆筛选，使每孔约1个细胞。选取od值高的几个克隆，进行进一步的验证。最终筛选出1个阳性克隆细胞，命名为：1c5。
127.实施例3腹水制备单克隆抗体及单克隆抗体纯化
128.步骤一、腹水制备单克隆抗体
129.1.注射300μl腹水佐剂至12周龄balb/c小鼠腹腔。
130.2.两周后将杂交瘤细胞培养至细胞活性状态最佳，将细胞数量调至约1
×
106个/100ul，接种100ul杂交瘤细胞到已注射腹水佐剂的小鼠腹腔。
131.3.7～10天后收集腹水。
132.步骤二、单克隆抗体纯化
133.1.腹水用pbs ph7.4稀释，离心取上清，用protein g亲和层析进行纯化。
134.2.平衡：用0.4m pb缓冲液(ph 7.0)平衡纯化柱子；
135.3.上柱：将稀释后的腹水上清缓慢过柱，保证抗体更好的结合在protein g柱子上；
136.4.洗涤：再用平衡缓冲液洗涤柱子；
137.5.洗脱：用0.1m甘氨酸缓冲液(ph 2.7)洗脱结合在柱子上的抗体，并加入1m tris-hcl(ph 8.0)中和甘氨酸，使ph保持为适合抗体保存的中性。
138.分别取纯化后的单克隆抗体和对照血清进行sds-page电泳，结果如图2所示，可清晰的看到抗体的重链和轻链。
139.实施例4单克隆抗体分型鉴定
140.1.用pgex 4t-1载体表达的eno2包被elisa板，100ng/孔，过夜包被。
141.2.用pbst洗涤包被好的elisa板3次，用2％bsa满孔封闭1小时；
142.3.加杂交瘤细胞上清100μl，37℃孵育1h；用pbst洗涤3次；
143.4.孵育hrp标记的二抗(igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3、igm、igg kappa chain)，37℃孵育30min。
144.5.pbst洗涤3次，tmb显色，450nm测得吸光值。
145.实验结果如图3，1c5单克隆抗体重链为igg2a。轻链抗kappa抗体未能检出信号，推测1c5单克隆抗体轻链为lambda，需要经过测序确定。
146.实施例5单克隆抗体序列测定
147.1.提取实施例2中培养好的杂交瘤细胞提取rna；
148.2.用5’race方法扩增出抗体重链和轻链可变区片段；
149.3.将扩增出的片段连接到peasy-blunt载体上，提取质粒，测序，结果显示轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.15所示，重链可变区的氨基酸序列如seq id no.16所示；
150.4.使用kabat方法标记出抗体氨基酸序列的cdr区(seq id no.1～seq id no.6)，如图4所示。
151.经过测序确定1c5单克隆抗体轻链为lambda。
152.实施例6单克隆抗体应用效果
153.1、western验证单克隆抗体的特异性
154.1)将eno2 c末端加上flag标签，连接到真核表达载体pcdna3.1的nhei和noti之间；
155.2)将构建好的eno2flag-pcdna3.1和空载体对照pcdna3.1转染至10cm细胞培养皿；
156.3)48h后，收集细胞，超声破碎，15000rpm离心20min收集上清蛋白。
157.4)取50μl蛋白上清，加10μl 6
×
protein loading，100℃金属浴煮10min；
158.5)准备好sds-page胶，煮好的蛋白上样20μ，120v电压至蓝色loading跑至胶底部；
159.6)转pvdf膜后用5％脱脂奶粉封闭2h；
160.7)孵育杂交瘤细胞上清2h，tbst洗涤3次，hrp标记的二抗孵育1h；
161.8)tbst洗涤3次，ecl显色曝光。结果如图5所示：eno2mab是购买的商业化的抗体，
作为阳性对照，正常鼠血作阴性对照。单克隆抗体1c5能够特异的识别eno2抗原，在293t细胞和人血清中均具有较高的特异性。
162.2、elisa验证单克隆抗体的作用效果
163.1)构建载体
164.将eno1(nm_001428.5，seq.id.no.22)、eno3(nm_001374524.1，seq.id.no.23)分别构建在pgex 4t-1载体的ecori和noti之间；
165.2)构建好的质粒转化至bl21(de3)表达感受态，摇菌，itpg诱导表达；
166.3)收集菌体，超声破碎后离心，收集上清，过gst柱纯化；
167.4)得到的eno1、eno3蛋白记为eno1-gst、eno3-gst，将蛋白透析、浓缩，测得蛋白浓度；
168.5)将eno1-gst、eno2-gst、eno3-gst包被elisa板，100ng/孔，4℃过夜包被；
169.6)用pbst洗涤包被好的elisa板3次，再用2％bsa满板封闭1小时；
170.7)用pbst洗涤3次，每次拍干；
171.8)加杂交瘤细胞上清100μl，37℃孵育1h；用pbst洗涤3次，每次拍干；
172.9)孵育hrp标记的二抗，37℃孵育30min。
173.10)用pbst洗涤3次，每次拍干；
174.11)tmb显色10min，2m h2so4终止，450nm测得吸光值。实验结果见表1和图6，1c5单克隆抗体可以识别eno2抗原。
175.表1 elisa验证单克隆抗体的作用效果(od
450
)
176.[0177][0178]
实施例7重组1c5单克隆抗体及其作用效果
[0179]
步骤一、抗体表达载体构建
[0180]
1)将测序确定的抗体重链(seq id no.16)和轻链(seq id no.15)可变区分别连接到抗体表达载体pfuse-chig-mg1/g2a、pfuse2ss-clig-mk的ecori和nhei之间，记为1c5mg1、1c5mk。
[0181]
2)测序正确后大量提取质粒，用于细胞转染制备抗体。
[0182]
步骤二、elisa验证重组单克隆抗体的作用效果
[0183]
1)将玻片铺在10cm细胞培养皿里，多聚赖氨酸处理后，将293t细胞均匀的种在皿里，置于37℃、5％co2细胞培养箱过夜培养；
[0184]
2)细胞转染：将构建好的重组抗体表达质粒1c5mg1、1c5mk、1c5mg1 1c5mk、mg1 mk转入上述准备好的293t细胞，mg1 mk为空载体对照，37℃、5％co2培养48h。
[0185]
3)将纯化的eno2蛋白包被elisa板，100ng/孔，4℃过夜包被；
[0186]
4)用2％bsa37℃满板封闭1小时，pbst洗涤3次；
[0187]
5)收集上述培养好的细胞上清，离心取上清，加100μl到包被好的elisa板孔里，杂交瘤细胞上清作为阳性对照，37℃孵育1h；用pbst洗涤3次，每次拍干；
[0188]
6)孵育hrp标记的抗重链二抗igg、抗轻链二抗igg kappa chain，37℃孵育30min。
[0189]
7)用pbst洗涤3次，每次拍干；
[0190]
8)tmb显色10min，2m h2so4终止，450nm测得吸光值。
[0191]
实验结果见表2，单独转染重组1c5抗体重链1c5mg1和轻链1c5mk，细胞上清未能检测出信号；共同转染重链1c5mg1和轻链1c5mk，细胞上清检测出抗eno2抗体。1c5单克隆抗体在293t细胞中成功表达，并且分泌于细胞上清。该重组单克隆抗体可以识别eno2蛋白，具有生物学活性。
[0192]
表2 elisa验证重组1c5单克隆抗体作用效果
[0193][0194]
步骤三、免疫荧光验证重组单克隆抗体在细胞内的表达情况
[0195]
1)将步骤二中的细胞用丙酮固定30min，培养箱干燥后备用；
[0196]
2)分别用alexa fluor 594标记的抗重链二抗igg、抗轻链二抗igg kappa chain孵育上述制备好的片子，室温30min；
[0197]
3)pbst洗涤3次，alexa fluor 594标记的二抗孵育30min；
[0198]
4)pbst洗涤3次，显微镜观察结果。
[0199]
实验结果如图7所示，重链1c5mg1和轻链1c5mk共同转染293t细胞后，可以检测到信号；结合上述elisa结果，重组1c5单克隆抗体在293t细胞中成功表达，并且成功分泌于细胞上清。该重组单克隆抗体可以识别eno2蛋白，具有生物学活性。
[0200]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。