一株降解有机酸的酵母菌株及其应用的制作方法

1.本发明属于食品工程技术领域，具体涉及一株降解有机酸的酵母菌株b5及其应用。


背景技术：

2.有机酸在中草药的叶、根、特别是果实中广泛分布，如乌梅、五味子，覆盆子等。常见的植物中的有机酸有脂肪族的一元、二元、多元羧酸如酒石酸、草酸、苹果酸、枸椽酸、抗坏血酸（即维生素c）等，亦有芳香族有机酸如苯甲酸、水杨酸、咖啡酸等。除少数以游离状态存在外，一般都与钾、钠、钙等结合成盐，有些与生物碱类结合成盐。脂肪酸多与甘油结合成酯或与高级醇结合成蜡。有的有机酸是挥发油与树脂的组成成分。多数水果中都含有各种有机酸，其中以柠檬酸含量居多，如柠檬、柑橘、菠萝、蓝莓等果实，通常由于收获期等因素的影响，其柠檬酸含量不尽相同。柠檬酸能促进人体热量代谢，可消除疲劳、促进消化等，但过多将破坏产品口感。
3.长白山野生浆果中(蓝靛果、沙棘)有机酸含量较高，然而，过多有机酸导致其加工成原果含量高的产品，口感却不佳。因此需要采用合理有效的降酸方法降低长白山浆果中有机酸含量，改善其风味，从而改善产品口感，使之更易被接受，同时可以促进长白山野生资源的产品开发。
4.研究表明降解有机酸的方法主要包括物理降酸法、化学降酸法及生物降酸法，其中生物降酸是指通过微生物发酵作用降解有机酸，从而达到降酸的目的。物理降酸包括了加水勾兑法、结晶析出法等，其中加水勾兑法适合于风味较为浓郁以及含糖量较高的水果种类；化学降酸法通过添加偏碱无机盐类起中和反应、离子交换树脂法可实现降酸的目的。与化学方法和物理方法相比，生物降酸效果好耗能少，还能够提升产品的质量，是近年来研究较多的降酸方法。


技术实现要素：

5.本发明目的是为提高含浆果产品的口感和质量，而提供一种可以有效降解有机酸的酵母菌。
[0006] 一株二孢接合酵母菌株zygosaccharomyces bisporus b5，保藏编号为cctcc m 2020912。
[0007]
所述的一株二孢接合酵母菌株b5在降解浆果中有机酸方面的应用。
[0008]
所述的有机酸为苹果酸、柠檬酸和/或酒石酸。
[0009]
降低浆果有机酸的方法，它包括：1）将浆果打浆；2）加入保藏编号为cctcc m 2020912二孢接合酵母菌株b5；3）发酵；所述的浆果为蓝靛果或沙棘；
所述的发酵，温度为25~30℃，时间为3~5天。
[0010]
本发明提供了一株降解有机酸的酵母菌，它的拉丁文学名为zygosaccharomyces bisporus，保藏编号为cctcc m 2020912；以及所述的酵母菌在降解浆果有机酸方面的应用；所述的有机酸为苹果酸、柠檬酸和/或酒石酸；所述的浆果为蓝靛果或沙棘；结果表明，该株酵母菌对苹果酸，柠檬酸，酒石酸的降解率分别为42.60
ꢀ±ꢀ
0.85%、18.28
ꢀ±ꢀ
0.80%、13.09
ꢀ±ꢀ
0.61%，对苹果酸降解效果最好；本发明通过自筛途径选取有效的降酸酵母菌株，同时采用工程技术手段改善菌株特性，并对蓝靛果和沙棘原果进行降酸应用，同时对降酸后的蓝靛果和沙棘果汁进行了色泽、滋味、气味、组织状态等感官评价，发现降酸后果汁的色泽、滋味、气味、组织状态与蓝靛果和沙棘原果汁无明显差异，无酒精、乳酸等明显异味。为现代生物技术提供可利用资源，推进长白山野生资源产品行业的发展在保证产品中营养成分不流失的前提下调整其口感，提高产品品质，使其兼具营养及风味。
附图说明
[0011]
图1 5株酵母菌株对三种有机酸的降解效果；图2 菌株b5对三种有机酸的降解效果；图3 优势菌株b5菌株革兰氏染色形态；图4 优势菌株b5的pcr扩增片段图谱；图5 26s rdna序列系统进化树分析结果；图6 l
‑
酒石酸，苹果酸、柠檬酸混合标准品hplc测定结果；1. l
‑
酒石酸，2.苹果酸、3.柠檬酸;图7 蓝靛果中有机酸hplc图；a.加入优势菌株b5前；b.加入优势菌株b5发酵后；2.苹果酸、3.柠檬酸;图8 沙棘中有机酸hplc图；a.加入优势菌株b5前；b.加入优势菌株b5发酵后; 2.苹果酸、3.柠檬酸。
具体实施方式
[0012]
实施例1 一株降解有机酸的酵母菌株筛选与鉴定高效降解浆果中有机酸的优势菌株基因序列如序列表seq id no.1所示；该优势菌株与接合酵母属 (zygosaccharomyces bisporus) 遗传距离最近，同源性最好，结合菌株的形态学特征及生理生化试验可以判断出菌株为二孢接合酵母 (zygosaccharomyces bisporus)；该优势菌株已于2020年12月16日保藏在湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 cctcc m 2020912。菌株的筛选与鉴定方法如下：一、菌种分离纯化取4.9g酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基溶于100ml蒸馏水中，放于高压灭菌锅中以121℃，15min条件下进行灭菌处理，将选取的长白山野生浆果蓝靛果破碎研磨成果浆，用接种环挑取果浆在平板划线，在30℃生化培养箱中培养72h，继续挑取酵母菌单菌落进行纯化培养，相同条件下继续培养72 h，重复平板画线纯化培养直到生成形态良好的酵母菌单菌落。
[0013]
取5.0 g ypd液体培养基 (配制方法：酵母膏10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，氯霉
素0.1 g，蒸馏水定容至1000 ml) 溶于100 ml蒸馏水中，灭菌后挑取长势优良的酵母菌单菌落放入液体培养基中培养，在振荡培养箱中以30 ℃，150 r/min条件下培养72 h，最后进行甘油保存并命名（b1，b2，b3，b4，b5）。
[0014]
二、配制碳源唯一的有机酸液体培养基称取5.0 g ypd液体培养基溶于100 ml蒸馏水中，再加入苹果酸，配制质量浓度为12 g/l的苹果酸溶液(由于ypd培养基中含有少量含酸物质，故初始酸值略高于12g/l)，装于250 ml三角瓶中，121℃灭菌15 min，得到碳源唯一的苹果酸液体培养基；柠檬酸、酒石酸液体培养基的配制方法同上述的苹果酸液体培养基相同；三、优势降酸菌株筛选将纯化培养后的菌液分别加入上述的三种有机酸（苹果酸、柠檬酸、酒石酸）液体培养基中，每种酸液中加入菌液100
µ
l，培养初期，先将处于对数生长期的菌悬液放入培养皿放在距离30w的紫外灯30 cm处进行照射6min (波长254 nm)，对酵母菌进行高酸紫外工程技术处理。随后将菌悬液放入培养皿中以25~30℃，130~150 r/min条件下培养5 d。培养液进行总酸滴定，实验重复3次。
[0015]
总酸测定法：配置0.05 mol/l的naoh标准溶液，用邻苯二甲酸氢钾标定后实际浓度为0.043 mol/l。称取50 ml蒸馏水分别置于250 ml的锥形瓶中，各滴入酚酞指示剂2～3滴，分别抽取2 ml待测液加入250 ml的锥形瓶中，用naoh标准溶液滴定至溶液呈微红色，30 s不褪色，即为终点；记录naoh使用量。按以上方法对加入菌液培养前后的培养液进行滴定，实验重复3次取平均值。
[0016]
对各菌株进行降酸率计算，筛选优势降酸菌株。降酸率公式如下，结果如图1所示。
[0017]
a0=未加菌液的有机酸质量浓度a1=加入菌液以后的有机酸质量浓度由图1可见共筛选出5株酵母菌株分别命名b1，b2，b3，b4，b5其中对苹果酸、柠檬酸、酒石酸三种主要有机酸降解率分析可知菌株b1降酸率为16.95
ꢀ±ꢀ
0.36%，1.13
ꢀ±ꢀ
0.23%，1.87
ꢀ±ꢀ
0.40%；菌株b2降酸率为2.93
ꢀ±ꢀ
0.58%，
‑
0.29
ꢀ±ꢀ
0.71%，12.09
ꢀ±ꢀ
0.69%；菌株b3降酸率为
‑
1.74
ꢀ±ꢀ
0.42%，3.12
ꢀ±ꢀ
0.38%，
‑
0.65
ꢀ±ꢀ
0.61%；菌株b4降酸率为12.18
ꢀ±ꢀ
0.72%，7.51
ꢀ±ꢀ
0.27%，0.66
ꢀ±ꢀ
0.25%；菌株b5降酸率为42.60
ꢀ±ꢀ
0.85%，18.28
ꢀ±ꢀ
0.80%，13.09
ꢀ±ꢀ
0.61%；其中菌株b5对于苹果酸降酸率最高为42.60
ꢀ±ꢀ
0.85%，降解苹果酸效果最好，同时对柠檬酸和酒石酸也具有降酸效果，故选取自筛菌株b5为最佳降酸菌株进行分析。
[0018]
按照总酸测定法测定优势降酸菌株发酵5d内有机酸含量变化，试验重复3次取平均值，以有机酸质量浓度为指标对降酸效果最优的菌株进行降酸效果分析，结果如图2所示。
[0019]
由图2可得，三种主要有机酸中苹果酸含量由13.33
ꢀ±ꢀ
0.13 g/l下降到7.65
ꢀ±ꢀ
0.09 g/l；柠檬酸含量由12.53
ꢀ±ꢀ
0.17 g/l下降到10.24
ꢀ±ꢀ
0.10 g/l；酒石酸含量由13.04
ꢀ±ꢀ
0.06 g/l下降到11.33
ꢀ±ꢀ
0.09 g/l；其中在3～4天过程中苹果酸降酸率最高，降酸效果最明显；降酸前后含酸量经过t检验得到差异极显著 (p < 0.01)。
[0020]
四、优势降酸菌株鉴定1、菌株形态学鉴定优势菌株进行平板培养，挑取菌落进行染色镜检，观察菌落的生长状况及形态特征。将酵母菌菌液稀释涂布于酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基上，30 ℃培养72 h，观察其菌落形态；挑取单菌落与载玻片，经美蓝染液染色后，用生物显微镜观察其菌株生长状况及细胞形态特征。结果如图3所示。
[0021]
将菌株分别培养于酵母菌固体培养基中，在30℃条件下培养5d后进行形态观察。用肉眼观察可发现菌株菌落为乳白色，球形，表面光滑，中间略有凸起，质地均匀粘稠，边缘整齐。用显微镜观察细胞呈圆形或椭圆形。繁殖方式为芽殖，子囊内含有1～4枚光滑的椭圆形子囊孢子。根据初步观察可得菌株为酵母菌株。
[0022]
2、菌株生理生化鉴定参照《酵母菌的特征与鉴定手册》进行优势降酸菌株的糖发酵、同化碳源、同化氮源试验等生理生化鉴定，结果如表1所示。
[0023]
由表1可知，优势菌株能利用葡萄糖发酵，而不能利用麦芽糖，蔗糖等其他糖源；优势菌株能同化的碳源有丙三醇，不能同化纤维二糖，菊糖等其他碳源；优势菌株能同化的氮源有硫酸铵，不能同化的氮源有硝酸盐。
[0024]
3、分子生物学鉴定取筛选出降酸效果良好的菌体溶于50 μl takara lysis buffer for microorganism to direct pcr (code no.d304) 中变性后离心取上清作为模板 (template dna)，反应条件为80 ℃，15 min。
[0025]
使用2
×
transtaq
®
high fidelity(hifi)pcr supermix i (transgen biotech，
code no：as131)，进行 pcr扩增目的片段。阴性对照使用3 μl的 26s
‑
free h2o替代模板dna；阳性对照使用3 μl的某已知菌株26s rdna替代模板dna，结果如图4所示。
[0026]
对纯化后的酵母菌株进行pcr扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳分析，在紫外灯照射下的结果可知菌株的电泳条带为592 bp。
[0027]
pcr反应体系为：template dna 3 μl，forward primer (10 pmol/μl) 1 μl，reverse primer (10 pmol/μl) 1 μl，2
×
transtaq
®ꢀ
hifi pcr supermix i 25 μl，16s
‑
free h2o 20 μl，total 50 μl。
[0028]
pcr扩增条件为：94 ℃预变性5 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 1.5 min，循环35次；72 ℃延伸10 min。
[0029]
26s rdna测序：以nl1和nl4为引物；上游引物nl1：5'
ꢀ‑
gcatatcaataagcggaggaaaag
‑
3'；下游引物nl4：5'
ꢀ‑
ggtccgtgtttcaagacgg
‑
3'。
[0030]
优势菌株基因序列如序列表seq id no.1所示；将上述测序结果输入genebank中，利用blast功能组件将测得的基因序列与genebank数据库中26s rdna序列进行同源性比较。选取blast结果中得分较高的菌的26s rdna序列，使用mega5.2.1软件根据neighbor
‑
joining进行系统进化树分析，结果如图5所示；由图5可以看出优势菌株与接合酵母属 (zygosaccharomyces bisporus) 遗传距离最近，同源性最好，结合菌株的形态学特征及生理生化试验可以判断出菌株b5为二孢接合酵母 (zygosaccharomyces bisporus)。菌株b5已于2020年12月16日保藏在湖北省武汉市的中国典型培养物保藏中心，保藏号为 cctcc m 2020912。
[0031]
实施例2 优势菌株降解浆果中有机酸的实验利用优势菌株降解蓝靛果和沙棘有机酸的高效液相色谱测定条件：色谱柱agilent zorbax extend
‑
c18 (250 mm
ꢀ×ꢀ
4.6 mm)，以甲醇－0.1% 磷酸水溶液梯度洗脱 (见表2)，体积比为 97.5:2.5的流动相等度洗脱10 min，然后用较短的时间梯度让甲醇相达到100 %并平衡5 min，再将流动相调整为0.1%磷酸溶液－甲醇体积比比例为97.5:2.5，平衡5 min。流速为0.7 ml/min，进样量为20 μl，柱温为40 ℃，检测波长为210 nm。依次测定标品系列和样品。
[0032]
用标样浓度对峰面积绘制标准曲线，计算线性相关系数。
[0033]
标准曲线：分别用纯净水溶解配制不同浓度的l
‑
酒石酸，苹果酸、柠檬酸混合标准溶液，经0.22 μm的微孔滤膜过滤后进行hplc分析，得到有机酸质量浓度 (x ) 和峰面积 (y) 的回归方程及相关系数。将不同浓度的标品浓度为 (x) 轴，以色谱峰面积为 (y) 轴，绘制标准曲线，结果如图6所示。
[0034]
待测样品处理：将蓝靛果或沙棘原果各打浆分别取5g浆液，用纯净水定容至100ml容量瓶中混匀，
经滤纸抽滤，离心(4000 r/min，15 min)取上清获得蓝靛果或沙棘果汁；分别向上述制备好的50ml蓝靛果或沙棘果汁加入优势降酸菌株b5液100
ꢀµ
l，并将加入菌液的果汁以30 ℃、150 r/min条件下培养5 d；降酸后的蓝靛果或沙棘果汁发酵液分别离心 (4000 r/min，15 min)取上清，再用0.22 μm滤膜过滤后注入高效液相色谱仪中测定；测定结果如图7、图8。
[0035]
由图6可知有机酸混合标准溶液分离良好，且与图7、8的三种主要有机酸出峰时间几乎对应；图7为蓝靛果中有机酸hplc图，与加入优势菌株后的蓝靛果中有机酸hplc；相比三种有机酸峰面积均有不同程度减小，而其中苹果酸最为明显，可知优势酵母菌株对蓝靛果中苹果酸的降解效果最好。在图8中未检测到酒石酸，沙棘果中有机酸hplc图，与加入优势菌株后的沙棘果中有机酸hplc图相比苹果酸和柠檬酸有机酸峰面积均有不同程度减小，而其中苹果酸最为明显，可知优势酵母菌株对沙棘果中苹果酸降解效果最好。
[0036]
由表3可知，将所得的这株具有优良降解长白山浆果中主要有机酸能力的酵母菌菌株运用到蓝靛果和沙棘中，可分别降低苹果酸（原果汁含量：0.914 g/l、0.438 g/l；降酸后含量：0.583 g/l、0.261 g/l），柠檬酸（原果汁含量：0.484 g/l、0.196 g/l；降酸后含量：0.400、0.163 g/l），酒石酸（原果汁含量：0.213 g/l、0 g/l；降酸后含量：0.188 g/l、0 g/l）三种有机酸尤其是苹果酸的浓度，优势降酸菌分别对蓝靛果和沙棘的降酸效果为苹果酸降解率36.47
ꢀ±ꢀ
0.26%、40.31
ꢀ±ꢀ
0.10%，柠檬酸降解率17.33
ꢀ±ꢀ
0.02%、16.98
ꢀ±ꢀ
0.30%，酒石酸降解率11.57
ꢀ±ꢀ
0.17%、0%，说明优势菌株可以应用到蓝靛果和沙棘的降酸中，有利于高酸野生浆果未来的开发。
[0037]
通过在长白山野生蓝靛果中筛选并运用酵母菌工程技术对其进行高酸紫外处理，获得一株具有降解有机酸含量的酵母菌株，可分别降低苹果酸（原果汁含量：0.914 g/l、0.438 g/l；降酸后含量：0.583 g/l、0.261 g/l），柠檬酸（原果汁含量：0.484 g/l、0.196 g/l；降酸后含量：0.400、0.163 g/l），酒石酸（原果汁含量：0.213 g/l、0 g/l；降酸后含量：0.188 g/l、0 g/l）三种有机酸尤其是苹果酸的浓度，优势降酸菌分别对蓝靛果和沙棘的降酸效果为苹果酸降解率36.47
ꢀ±ꢀ
0.26%、40.31
ꢀ±ꢀ
0.10%，柠檬酸降解率17.33
ꢀ±ꢀ
0.02%、16.98
ꢀ±ꢀ
0.30%，酒石酸降解率11.57
ꢀ±ꢀ
0.17%、0%。通过对该酵母菌株在酸液中5天内的发酵性能测定分析可知其降酸能力在逐渐减弱，在第5天后趋于平缓。经过酵母菌株形态学，生理生化及分子生物学鉴定得该降酸酵母菌株为二孢接合酵母 (zygosaccharomyces bisporus)。将所得的这株具有优良降解长白山浆果中主要有机酸能力的酵母菌菌株运用到蓝靛果和沙棘产品的生产过程中，可降低苹果酸，柠檬酸，酒石酸三种有机酸尤其是苹果酸的浓度，同时对降酸后的蓝靛果和沙棘果汁进行了色泽、滋味、气味、组织状态等感官评价，发现降酸后果汁的色泽、滋味、气味、组织状态与蓝靛果和沙棘原果汁无明显差异，无酒
精、乳酸等明显异味。为现代生物技术提供可利用资源，推进长白山野生资源产品行业的发展。