靶向转位蛋白TSPO的新型正电子药物[的制作方法

靶向转位蛋白tspo的新型正电子药物[
18
f]tpo1开发
技术领域
[0001]
本发明属于放射性药物研发和分子显像领域，涉及靶向转位蛋白tspo的新型正电子药物[
18
f]tpo1开发，具体涉及一种含芳香氟环系结构且靶向转位蛋白tspo且具有弱基金多态性敏感度的正电子药物[
18
f]tpo1的合成、标记、正电子影像分析。


背景技术：

[0002]
神经炎症是中枢神经系统复杂的免疫反应，无论是作为神经损伤的诱因还是作为疾病的继发性反应，神经炎症在一系列神经系统疾病的发生和发展中都发挥着重要作用。因此，深入了解神经炎症的动态改变，可以为许多神经系统疾病的诊断及治疗干预提供理论依据，是目前中枢神经系统疾病研究的重要方向。小胶质细胞是中枢神经系统内的免疫细胞，当发生神经炎症时，小胶质细胞异常活化，而与之密切相关的生物靶标，即为转位蛋白18kda(tspo)。转位蛋白tspo是一种由细胞核编码，内含169个氨基酸(富含色氨酸)的疏水性蛋白，在各种族间高度保守，在组织中主要定位于线粒体外膜，特别是在与甾体合成相关的组织中高度表达，如肾上腺、性腺、唾液腺等，在肾脏及心脏组织中也有部分表达，而在肝脏及脑中表达水平很低。研究表明，tspo是甾体激素合成的重要组成部分，可促进胆固醇跨膜转运进入磷脂膜，增加孕烯醇酮形成及下游神经类固醇合成，修复损伤神经和促进神经生长等。此外，tspo还参与许多生理功能，如细胞增殖、免疫应答和线粒体呼吸凋亡等。
[0003]
鉴此，tspo作为重要的药物靶点，越来越多的得到了研究者们的关注。靶向tspo的正电子成像逐渐成为评价脑损伤、诊断脑外伤进展与状态、区分外周炎症与肿瘤的重要工具；同时，该类正电子药物为神经退行性疾病等中枢神经系统疾病的早期诊断提供影像学研究依据。随着越来越多的正电子药物被开发并推进临床使用，科学家发现，tspo存在单核苷酸多态性(rs6971 polymorphism)，不同人群的蛋白序列中，第147位氨基酸或为丙氨酸(ala)或为苏氨酸(thr)，即对同一个配体而言，不同人群体内的tspo会存在三种亲和度：高亲和力结合(hab)指第147位氨基酸全部都是ala，低亲和力结合(lab)指第147位氨基酸全部都是thr，交叉亲和力结合(mab)指第147位氨基酸部分为ala、部分为thr。目前，几乎全部的tspo靶向型正电子药物，对这种多态性都比较敏感(例如[
11
c]pbr28的k
i(lab/hab)
高达55)，导致pet显像个体差异大，对正常人和疾病人群脑内pet定量化研究及数据比较造成了局限性，严重限制了临床及多中心应用。因此，开发对tspo多态性敏感度弱的正电子药物是目前全球研发的主要方向。


技术实现要素：

[0004]
本发明提供一种tpo1结构的化合物、其立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于tpo1结构如下：
[0005][0006]
本发明的另一实施方案提供[
18
f]tpo1结构的化合物、其立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于[
18
f]tpo1结构如下：
[0007][0008]
本发明的另一实施方案提供tpo1的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0009][0010]
化合物5与化合物1于dmf中在碳酸钾、碘化钠的作用下，反应得到tpo1。反应温度优选90-120℃。溶剂dmf、反应物化合物1、试剂碳酸钾、碘化钠的用量，本领域的技术人员可以根据本领域的基础知识进行适当调整优化，这属于本领域技术人员的基本技能，根据反应常识可知，化合物1、碳酸钾、碘化钠的摩尔用量应多于化合物5，化合物5、化合物1、碳酸钾、碘化钠的优选摩尔比为1:1.3:2.0:1.5。
[0011]
本发明的另一实施方案提供[
18
f]tpo1的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0012]
标记前体化合物pre1与氟-18负离子于有机溶剂中反应得到[
18
f]tpo1；
[0013]
其中标记前体化合物pre1的结构如下：
[0014][0015]
有机溶剂选自dmf、dmac(n,n-二甲基乙酰胺)、t-buoh叔丁醇中的一种或几种混合；上述反应优选在100-150℃下进行，优选110℃、120℃、130℃、140℃。
[0016]
本发明的另一实施方案提供[
18
f]tpo1的正电子药物的制备方法，其特征在于还包
括pre1的制备步骤：
[0017][0018]
本发明的另一实施方案提供[
18
f]tpo1的制备方法，其特征在于还包括化合物6的制备步骤：
[0019][0020]
本发明的另一实施方案提供一种制备[
18
f]tpo1的标记前体，其特征在于所述标记前体具有pre1所示结构：
[0021][0022]
本发明的另一实施方案提供上述tpo1、[
18
f]tpo1、其立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐中的一种或几种在制备以tspo为作用靶点的药物中的应用。
[0023]
本发明的另一实施方案提供一种以tspo为作用靶点的药物，其特征在于该药物以tpo1、[
18
f]tpo1、其立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐中的一种或几种作为有效成分。
[0024]
本发明所述氟-18负离子优选来源于：
18
f-氟化物或
18
f-标记的合成子，优选[
18
f]kf/k222或[
18
f]et4nf，
18
f-氟化物通过
18
o(p,n)
18
f核反应的水溶液获得。为了增加反应性且避免由水的存在产生的羟基化副产物，在该反应之前通常从
18
f-氟化物中除去水，且氟化反应使用无水反应溶剂进行(aigbirhio等，1995，j fluor chem；70:279-87)。自
18
f-氟化物除去水称为制备“纯(naked)”18
f-氟化物。改善上述用于放射性氟化反应的
18
f-氟化物的反应性的另一步骤是在除去水之前加入阳离子反荷离子，合适地所述反荷离子在无水反应溶剂内应当具有足够溶解性以保持
18
f的溶解性。因此，通常使用的反荷离子包括诸如铷或铯的大但软的金属离子、与诸如kryptofix
tm
的穴状配体络合的钾、或四烷基铵盐(如四乙基碳酸氢铵)，其中优选与诸如kryptofix
tm
的穴状配体络合的钾或四烷基铵盐(如四乙基碳酸氢铵)。
[0025]
与现有技术相比，本发明的有益效果：本发明设计开发了新型的tspo配体tpo1，并利用
18
f及螺环高价碘叶立德前体pre1实现了标记，合成了新型tspo靶向型正电子药物
[
18
f]tpo1；通过经过基因测序的人脑脑片实施体外放射自显影，结果显示该药物的特异性较高，且对rs6971的敏感度较弱；同时，大鼠活体pet动态扫描结果显示，该探针可以通过血脑屏障。
附图说明
[0026]
图1是制备[18f]tpo1反应溶液的hplc图；
[0027]
图2是利用ge tracerlab
tm fxfn合成模块自动化制备[18f]tpo1的流程图；
[0028]
图3是[
18
f]tpo1的hplc图；
[0029]
图4是[
18
f]tpo1 tpo1共同进样的hplc图；
[0030]
图5是大鼠pet影像图；
[0031]
图6是人脑切片的体外放射自显影图。
具体实施方式
[0032]
下面结合附图对本发明作进一步描述。
[0033]
实施例1 tpo1的合成：
[0034][0035]
将4-fluoro-n-methyl-aniline(2.00g,16.0mmol)，2-bromopropanoyl bromide(3.62g,16.8mmol)加入到无水二氯甲烷(30ml)中，冰浴下滴加三乙胺(3.5ml,25mmol)，滴完反应半小时再移到室温反应。点板分析，原料反应完全，倒入25ml冷水中，用dcm萃取(30ml
×
3)，有机相用饱和食盐水反洗一次，之后用无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析(pe/dcm＝2/1)得淡黄色油状物1，质量为4.0g。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.38-7.28(m,2h),7.16(t,j＝8.5hz,2h),4.24(q,j＝6.6hz,1h),3.29(s,3h),1.75(d,j＝6.7hz,3h).hrms(esi):calcd for c
10h12
brfno[m h]

260.0086,found 260.0093。
[0036][0037]
将2(1.0g,7.1mmol)加入到氯化亚砜(10ml,137.8mmol)中，再加入dmf(0.05ml)做催化剂，氮气保护回流反应。反应3h后停止反应，直接旋干氯化亚砜，得灰色固体产品3，质量为1.4g。不做处理，直接下一步。
[0038]
将3(1.1g,6.9mmol)加入到乙腈(30ml)中，再加入4(1.2g,7.6mmol)和dipea(4.6g,36mmol)，加完氮气保护90℃反应过夜。点板分析，原料反应完全，将反应液倒入水中，用dcm萃取(25ml
×
3)，有机相用饱和食盐水反洗，无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析(ea/meoh＝50/1)得灰色固体5，质量0.55g。hrms(esi):calcd for c
13h10
n3o[m h]

224.0824,
found 224.0831。
[0039][0040]
将化合物5(300mg,1.34mmol)和化合物1(452mg,1.74mmol)加入到dmf(10ml)中，再加入碳酸钾(369mg,2.67mmol)和碘化钠(300mg,2.00mmol)，加完100℃反应3h。点板分析，原料反应完全，直接处理，将反应液倒入30ml水中，用dcm萃取(10ml
×
3)，有机相合并，用饱和食盐水反洗，之后无水硫酸钠干燥，柱层析(ea/meoh＝50/1)得黄色固体粗产品，再用pe/ea＝9/1的混合溶液10ml打浆，得黄色固体产品tpo1，质量0.16g。1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.91(d,j＝4.2hz,1h),8.43(d,j＝7.8hz,1h),8.27(d,j＝8.4hz,1h),8.14(d,j＝8.1hz,1h),7.94-7.85(m,2h),7.67-7.58(m,3h),7.46(t,j＝5.7hz,1h),7.08(t,j＝8.1hz,2h),5.89(q,j＝6.3hz,1h),3.31(s,3h),1.59(d,j＝6.6hz,3h).
13
c nmr(75mhz,cdcl3):δ170.6,166.2,161.9(d,j＝246.6hz),158.5,155.2,151.7,149.4,138.9,137.0,133.9,129.8(d,j＝8.2hz),128.4,127.4,124.6,124.1,123.8,116.7(d,j＝22.4hz),115.4,69.8,38.1,17.3.hrms(esi):calcd for c
23h20
fn4o2[m h]

403.1570,found 403.1565。
[0041]
实施例2pre1的合成：
[0042]
(1)利用实施例1合成tpo1相同合成路线(以替代化合物1)，得到芳基碘化物6。1h nmr(300mhz,cdcl3):δ8.89(d,j＝4.5hz,1h),8.42(d,j＝7.8hz,1h),8.25(d,j＝8.1hz,1h),8.13(d,j＝8.4hz,1h),7.93-7.84(m,2h),7.72(d,j＝8.7hz,2h),7.63-7.57(m,1h),7.45(q,j＝3.6hz,3h),5.93-5.88(m,1h),3.29(s,3h),1.59(d,j＝6.6hz,3h).hrms(esi):calcd for c
23h20
in4o2[m h]

511.0631,found 511.0645。
[0043][0044]
(2)将一价芳基碘化物6(50毫克，0.11毫摩尔)溶解在三氟乙酸(0.39毫升)和氯仿(0.13毫升)的混合溶液中，向其中加入过硫酸氢钾复合盐oxone(100毫克，0.165毫摩尔)，室温下搅拌50分钟后，加压蒸发掉所有溶剂，将粗产品置于真空泵上抽干约30分钟，随后加入乙醇(0.8毫升)。将裸环辅基spiad(25.3毫克，0.11毫摩尔)溶于10％的碳酸钠水溶液中(0.5毫升)，缓慢加入上述乙醇反应体系，室温下剧烈搅拌下至体系呈透明状，随后向其中补加10％的碳酸钠水溶液中(0.3毫升)调整ph等于9。反应液室温下剧烈搅拌1小时后，加水(5毫升)稀释体系，随后用二氯甲烷萃取三次，每次5毫升。合并有机相，用无水硫酸镁干燥
后，过滤旋干有机溶剂。粗产品进行硅胶色谱柱层析，洗脱体系为乙酸乙酯(200毫升)，之后加大极性至甲醇：乙酸乙酯＝1:10(200毫升)，得到产物浓缩旋干为白色固体粉末状pre1，质量26.1毫克。1h nmr(600mhz,cd3cn):δ8.81(s,1h),8.51(d,j＝7.6hz,1h),8.23(d,j＝7.2hz,1h),8.18(br s,2h),8.01-7.93(m,3h),7.82(d,j＝5.5hz,2h),7.67(t,j＝7.3hz,1h),7.51(t,j＝5.3hz,1h),5.74(s,1h),3.24(s,3h),2.36(s,2h),1.99(d,j＝13.2hz,4h),1.79(s,2h),1.69(d,j＝9.9hz,6h),1.50(s,3h).
13
c nmr(150mhz,dmso):δ170.8,166.3,163.1,159.1,155.1,151.4,149.7,145.4,137.7,135.1,133.7,131.3,128.5,128.3,125.7,124.3,123.9,115.0,105.7,70.1,57.9,37.8,36.9,35.3,33.6,26.4,17.4.hrms(esi):calcd for c
36h33
in4nao6[m na]

767.1342,found 767.1358。
[0045][0046]
实施例3[
18
f]tpo1的合成
[0047]
放射化学标记：氟-18负离子的生产是通过
18
o(p,n)
18
f，应用小体积[
18
o]h2o靶，用18mev的质子束流持续轰击15min。利用waters sep-pak plus qma固相萃取柱，从[
18
o]h2o捕获并分离高纯度氟-18负离子。将4.5毫克四乙基碳酸氢铵(teab)溶于0.7毫升乙腈和0.3毫升水的混合溶液中，利用该溶液洗脱qma上的氟-18负离子并收集在v形反应瓶中。反应瓶置于110摄氏度进行加热，并同时伴有10毫升每分钟流速的干燥氮气鼓吹，进行5分钟后反应瓶中的溶剂完全被吹干，之后向其中加入1毫升无水乙腈，继续在110摄氏度加热条件下进行氮气鼓吹5分钟至溶剂完全被吹干，此过程重复3次，之后将反应瓶从加热器中取出，氮气鼓吹至体系温度降至室温。将2.12毫克的螺环三价碘叶立德前体pre1溶于0.5毫升dmf中，随后加入v形反应瓶，体系封口，置于120摄氏度下反应10分钟。反应瓶取出后置于冰中冷却30秒后开盖，加入0.5毫升高效液相色谱流动相溶液终止反应。将所有反应溶液注射入半制备hplc进行纯化分离(图1)。
[0048][0049]
机器：日本岛津高效液相色谱仪
[0050]
半制备色谱柱:capcell pak c
18
,250x 10mm
[0051]
流动相溶液:50％乙腈,50％水，0.1％三乙胺
[0052]
流速:4.0毫升每分钟
[0053]
收集产物保留时间：16.3分钟
[0054]
收集分离得到的产物，蒸干所有溶剂，重新溶于3毫升无菌生理盐水中，并通过
0.22微米针头式滤器，得到可供注射用的[
18
f]tpo-1放射量为53mci)。全部反应时间为95分钟，产率为22％，比活度大于2ci/μmol。
[0055]
实施例4.ge tracerlab
tm fx
fn
自动化标记：质子束轰击制得的氟-18负离子通过氦气压力转移到ge tracerlab
tm fx
fn
合成模块。对利用ge tracerlab
tm fx
fn
合成模块制备[
18
f]tpo-1的流程如图2所示。
[0056]
自动化合成涉及以下几个方面的内容：(1)放射性氟-18的共沸干燥；(2)放射性氟-18负离子的标记过程；和(3)高效液相色谱纯化及产品的制剂化过程。合成模块中所有的序列编号见图2。
[0057]
a.使用ge回旋加速器通过
18
o(p，n)
18
f核反应产生的放射性氟-18负离子通过线路10进入反应模块中，随后通过氦气压力被吸附于waters qma固相萃取柱上；
[0058]
b.将4.5毫克teab溶于0.7毫升乙腈和0.3毫升水的混合溶液中，预先注入小瓶1中，反应开始后通过真空泵将小瓶1中的teab溶液通过v10、qma固相萃取柱、v11抽入反应瓶12中，即将放射性氟-18负离子从qma上洗脱至反应瓶12中；
[0059]
c.反应瓶12处开始进行加热(85℃)、鼓氮气过程，持续3分钟后，在氦气压力下将预先置于小瓶5中的1毫升干燥乙腈溶液注入反应瓶12，85℃下鼓氮气8分钟，之后体系升至110℃，鼓氮气同时进行真空抽气，持续4分钟，确保反应瓶12中的溶剂全部蒸干。之后反应体系在空气气流下降温至40℃待加料。
[0060]
d.预先将2.12毫克螺环三价碘叶立德前体pre1溶于1毫升无水dmf中，加入小瓶3中。氦气压力下将该溶液注入反应瓶12中，随后反应瓶周围的阀门v13，v20和v24都关闭，反应体系升温至120℃反应10分钟。
[0061]
e.反应完毕后v24和v25打开，体系降温至40℃，然后将预先置于小瓶6中的1.5毫升乙腈和1.5毫升水的混合溶液加入反应体系停止反应。瓶14中预先加入2.5毫升的hplc流动相溶剂。反应瓶12中的全部溶液由氦气压力转移至瓶14中；
[0062]
f.瓶14中的所有溶液通过氦气压力注射入半制备hplc中，随即开始分离纯化，条件为半制备色谱柱capcell pak c18 ug80 5μm,10x 250mm，流动相溶液50:50ch3cn/0.1％et3n，流速4毫升每分钟。分离过程由紫外检测器(λ＝254nm)和放射量检测器共同检测；
[0063]
g.将产物峰对应的部分(保留时间为16.3分钟)，通过v18收集如大瓶15中，15中预先加入了23毫升注射用级别的无菌水(united states pharmacopeia(usp)；hospira)；
[0064]
h.大瓶15中的溶液在氦气压力作用下通过置于16号位置的c18固相萃取柱，并用小瓶7中预先加入的10毫升无菌水冲洗c18以去除可能残余的盐类杂质、hplc流动相和放射性氟-18负离子。最后在氦气压力下利用小瓶8中预先注入的1.0毫升无水乙醇洗脱c18柱上的产物，收集至预先加入了10毫升无菌生理盐水的产物收集瓶17中。
[0065]
i.收集瓶17中的所有溶液在氦气压力作用下通过0.22微米针头式滤器，得到可供注射用的[
18
f]tpo-1。
[0066]
自动化合成完毕后，测量得到产物[
18
f]fdpa的非衰减校正产率为10％，比活度大于2ci/μmol。
[0067]
实施例4产物纯度及专一性测试通过与tpo-1共同注射入hplc进行(图3 图4)：经质量控制测试后，手动及自动方法制备的[
18
f]tpo-1放射化学纯度均大于99％，溶剂残余量低，比活度高，满足临床前及临床pet影像要求。测试参数如下：
[0068]
色谱柱:capcell pak c18 ug80,5μm,4.6x 250mm
[0069]
流动相:50/50,et3n 0.1％
[0070]
流速:1.5ml/min
[0071]
压力：11.9mpa
[0072]
实施例5大鼠pet影像学评价：通过尾静脉注射入1.1mci的[
18
f]tpo1，动态扫描60分钟，进行pet影像实验。结果表明，该探针可迅速通过血脑屏障，最高值达1.6suv，过脑量好(图5)。
[0073]
实施例6人脑切片的体外放射自显影实验：取已经去世的、经过基因鉴定的lab和hab人脑切片，将0.1mci的[
18
f]tpo1滴入缓冲溶液中，将脑片泡入；先将pk11195溶解如缓冲溶液，将脑片泡入，10min后取出脑片，再泡入上述缓冲液中。分别会得到baseline和blocking的显像结果(图6)。结果显示，该探针有较好的特异性，加入pk11195之后信号明显降低；且对hab和lab的敏感度较弱，比例仅为1.7。