一种基于PFOR酶活性导向的FMT供体筛选方法及其应用

一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及医药检测技术领域，具体是指一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法及其应用。


背景技术：

2.艰难梭菌(cd)是一种芽孢形成的厌氧革兰氏阳性细菌，存在于动物和人类的环境和肠道中。艰难梭菌感染(cdi)是长期或不规范使用广谱抗菌药物、免疫抑制剂以及放、化疗药物等，导致肠道菌群失调，艰难梭菌大量繁殖并分泌毒素，导致腹痛、腹泻等一系列临床症状。对于cdi的治疗方法探索已久，目前对于艰难梭菌的治疗方法较少，抗菌药物是其感染治疗的首要手段，两种抗生素(甲硝唑和万古霉素)和最近的第三种抗生素(非达西霉素)已常规用于cdi治疗。然而，对于顽固性艰难梭菌感染，目前没有很好的临床治疗方法，对于最佳药物方案治疗无效的cdi患者，只能采取结直肠切除术作为补救治疗措施，但这一手术方式具有较高的术后死亡率。
3.多项研究表明，fmt(粪菌移植)在复发性和难治性cdi病例中具有显著的疗效，这可能归因于fmt后正常微生物群的持续恢复。复发性或难治性cdi患者的治疗成功率约为90％，远优于长期抗菌治疗，成功率为20～30％[4]。2013年，fmt首次被写入美国医学指南，用于复发性难辨梭状芽孢杆菌感染(clostridiumdifficileinfection，cdi)的治疗。2013年5月，美国食品药品管理局(fda)发布了一项声明，将人类粪便定义为了“生物产品和药品”，归属fda管理。2015版美国艰难梭菌感染临床实践指南指出如果常规疗法失败，可考虑使用粪便细菌疗法(肠道细菌移植)治疗难治性cdi病人。2018年，美国最新临床指南将粪菌移植适应症更新为第2次及以上复发的cdi。粪菌移植(fmt)是将健康供体粪便中的功能菌群移植到患者胃肠道内，调节肠道微生态，增强肠道抵抗致病菌的能力。作为重建肠道菌群的重要方式，粪菌移植已成为复发性、难治性艰难梭菌感染最有效的治疗方式之一，不良反应极少。但是对于粪菌移植的供体来说，不同的个体所提供的粪菌的质量不一，同一个供体在不同时间的粪菌质量也有所不同，在进行移植之前，如果将供者的粪无菌液进行艰难梭菌的抑制率检测可以对其的抑菌作用进行预测和评价，也可以通过此方法对供体的粪菌进行筛选后再进行移植，从而节约大量时间以及减少财力物力的消耗，经过筛选后再进行移植，可以减轻患者移植后的不良反应，提高患者的生活质量。
[0004]
对于以往探究药物对艰难梭菌的抑制作用，通常采用培养艰难梭菌，探究药物对于艰难梭菌的抑制作用，但艰难梭菌的培养条件极为苛刻，必须保证培养环境的绝对无氧，因此无法通过培养艰难梭菌作为筛选fmt供体。


技术实现要素：

[0005]
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、可信度高的基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法。
[0006]
本发明的另一个目的在于提供上述方法的具体应用。
[0007]
为了实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，以艰难梭菌体内的pfor酶为靶点，通过测试fmt供体提供的粪菌液对pfor酶的抑制率，筛选预测和/或评价fmt对于艰难梭菌感染的治疗效果。
[0008]
本技术方案的工原理为，在艰难梭菌体内的酶pfor(丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶)催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶a(乙酰coa)和co2，丙酮酸脱羧反应是艰难梭菌通过糖酵解获取能量的第一步，抑制pfor的活性可以对艰难梭菌产生有效抑制作用。因此本技术方案以艰难梭菌内的pfor酶为靶点，通过培养带有pfor酶质粒的大肠杆菌，并诱导其在iptg的作用下产生pfor酶，通过体外实验检测fmt供者所提供的粪菌液对pfor酶的抑制率，即可初步判断基于该供体的fmt对于艰难梭菌感染的治疗疗效，可用于筛选fmt的供体，或者评价所提供的粪便质量的优劣。
[0009]
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，包括以下步骤：
[0010]
(1)培养带有pfor酶质粒的大肠杆菌；
[0011]
(2)诱导带有pfor酶质粒的大肠杆菌产生pfor酶；
[0012]
(3)提取大肠杆菌产生pfor酶；
[0013]
(4)制备fmt供者所提供的粪菌液；
[0014]
(5)配制pfor酶的反应体系，通过体外实验，检测fmt供者所提供的粪菌液在pfor酶的反应体系中，对pfor酶的抑制情况；
[0015]
(6)根据fmt供体提供的粪菌液对pfor酶的抑制率，判断感染症状缓解的指标判断fmt供体对艰难梭菌的抑制作用。
[0016]
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，
[0017]
所述步骤(1)中，培养带有pfor酶质粒的大肠杆菌的具体如下：
[0018]
(1.1)制备lb培养基，具体包括液体培养基和固定培养基：
[0019]
(1.1.1)液体培养基的配置：将5glb肉汤粉末溶于500ml蒸馏水，再加入以肉汤为基质的液体培养基中，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压灭菌15min，培养瓶内液体体积不超过瓶本身量程的1/3，待其冷却后加入氨苄青霉素(使其终10ml浓度为100μg/ml)，氨苄青霉素混匀即可；
[0020]
(1.2.1)固体培养基的配置：将3.5glb琼脂粉末溶于100ml蒸馏水，在加入以琼脂为基质的固体培养基中，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压灭菌15min，65℃左右将培养基从高温灭菌锅中取出，在固体培养基凝固之前加入终10ml浓度为100μg/ml氨苄青霉素后混匀，然后将培养基倒入培养皿中，静置待其冷却凝固；
[0021]
(1.2)选取带有pfor酶质粒的大肠杆菌进行平板接种：挑取单菌落，在已加入氨苄青霉素的固体培养基中进行平板划线，置于细菌培养箱中，37℃，培养12小时左右；
[0022]
(1.3)培养约12小时后，在已经生长细菌得到平板上挑取单菌落到含有50ml液体培养基(已加入氨苄青霉素)的离心管中，放在震荡培养箱中，37℃，220rpm,约200min；震荡约200分钟后，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，(iptg终浓度为0.5mmol/ml)，置于震荡培养箱中，25℃，220rpm，20h。
[0023]
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(2)中，诱导带有pfor酶质粒的大肠杆菌产生pfor酶的具体过程为：使用100μg/ml浓度氨苄青霉素诱导大肠杆菌质粒表达，使用终浓度为0.5mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导pfor酶的产生。
[0024]
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(3)中，提取大肠杆菌产生pfor酶的具体过程为：取50ml诱导菌液，12000g，4℃，5min，离心去上清；纯水等体积重悬，再次离心去上清；然后10ml纯水重悬，10ml菌液冰上400w超声5s，间隔5s，大约持续10min，所获得的溶液即含有pfor的粗酶液。
[0025]
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(4)中，制备fmt供者所提供的粪菌液的具体过程为，挑选健康状况、饮食习惯良好的fmt供者既往提供的粪便，将其均质，在最终浓度为50mg粪便/ml的无菌盐水中稀释，收集的样本以100g离心2分钟，收集上清液并通过70和0.22μm滤膜，收集上清。
[0026]
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(5)中，pfor酶的反应体系具体为，100mm磷酸钾缓冲液(ph＝7.4)、10mm丙酮酸钠、5mm1,1'-二苄基-4,4'-联吡啶鎓盐二氯化物水合物(ε＝9.2mm-1，cm-1at546nm)、0.18mm辅酶a、1mmmgcl2。
[0027]
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(5)中，通过体外实验检测fmt供者所提供的粪菌液对pfor酶抑制情况的具体过程为：在pfor酶的反应体系中加入50μl粗酶液和10μl粪无菌液，定容至200μl。
[0028]
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述步骤(6)中，所述判断感染症状缓解的指标为腹泻缓解次数、血液白细胞减少数目和白介素6下降数目。
[0029]
为了应用上述方法而制得的一种fmt供体筛选的试剂盒，所述试剂盒为能够营造无氧环境的anaeropack培养盒，其内包含pfor酶反应体系作为检测试剂，所述检测试剂采用上述基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法对fmt供体的粪便菌液进行检测。
[0030]
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
[0031]
(1)本发明以艰难梭菌内的pfor酶为靶点，通过培养带有pfor酶质粒的大肠杆菌，并诱导其在iptg的作用下产生pfor酶，通过体外实验检测fmt供者所提供的粪菌液对pfor酶的抑制率，即可初步判断基于该供体的fmt对于艰难梭菌感染的治疗疗效，可用于筛选fmt的供体，或者评价所提供的粪便质量的优劣，既避免了直接培养艰难梭菌的复杂过程，通过酶反应，即可推断fmt供者所提供的粪菌液对于艰难梭菌的抑制作用，且pfor酶为艰难梭菌获取能量的步骤，对于艰难梭菌的意义重大；
[0032]
(2)本发明通过对酶的抑制可以很好地达到抑制艰难梭菌生长、改善艰难梭菌感染症状的目的，以填补在筛选预测和/或评价fmt方面的空白；
[0033]
(3)本发明提供的方法运用到试剂盒中，能够精确检测fmt供者所提供的粪菌液对艰难梭菌抑制情况，试剂盒构成简单，操作方便，可信度高，具有良好的应用前景，适宜广泛推广应用。
附图说明
[0034]
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其他特征、目的和优点将会变得更为明显：
[0035]
图1为本发明采用pfor酶作为靶点的技术原理图；
[0036]
图2为在厌氧盒中反应结束后bv被还原情况的孔板图；
[0037]
图3为腹泻缓解次数与抑制率相关性分析；
[0038]
图4为白细胞减少数目与抑制率相关性分析；
[0039]
图5为白介素6减少数目与抑制率相关性分析；
[0040]
图6为cdi患者接受fmt供者的粪菌移植前的肠镜表现；
[0041]
图7为cdi患者接受fmt供者的粪菌移植后的肠镜表现。
具体实施方式
[0042]
为使本发明的目的、工艺条件及优点作用更加清楚明白，结合以下实施实例，对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内，此处所描述的具体实施实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0043]
实施例1：
[0044]
本实施例提供一种基于pfor酶活性导向的fmt供体筛选方法，以艰难梭菌体内的pfor酶为靶点，通过测试fmt供体提供的粪菌液对pfor酶的抑制率，筛选预测和/或评价fmt对于艰难梭菌感染的治疗效果。
[0045]
其技术原理如图1所示，pfor酶参与艰难梭菌丙酮酸代谢，即pfor(丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶)催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶a(乙酰coa)和co2，丙酮酸脱羧反应是艰难梭菌通过糖酵解获取能量的第一步，抑制pfor的活性可以对艰难梭菌产生有效抑制作用。
[0046]
其筛选方法的具体步骤如下：
[0047]
(1)培养带有pfor酶质粒的大肠杆菌；
[0048]
(2)诱导带有pfor酶质粒的大肠杆菌产生pfor酶；
[0049]
(3)提取大肠杆菌产生pfor酶；
[0050]
(4)制备fmt供者所提供的粪菌液；
[0051]
(5)配制pfor酶的反应体系，通过体外实验，检测fmt供者所提供的粪菌液在pfor酶的反应体系中，对pfor酶的抑制情况；
[0052]
(6)根据fmt供体提供的粪菌液对pfor酶的抑制率，判断感染症状缓解的指标判断fmt供体对艰难梭菌的抑制作用。
[0053]
实施例2：
[0054]
本实施例在上述实施例的基础上，进一步限定培养带有pfor酶质粒的大肠杆菌的培养方法：
[0055]
1、lb培养基配制：液体培养基(肉汤)：5glb粉末溶如500ml蒸馏水，固体培养基(琼脂)：3.5glb粉末溶于100ml蒸馏水中。将配制好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压灭菌15min，培养瓶内液体体积不宜超过瓶本身量程的1/3。65℃左右将培养基从高温灭菌锅中取出，在固体培养基凝固之前加入氨苄青霉素(100μg/ml)后混匀，然后将培养基倒入培养皿中，每个约加入10ml左右培养基即可。然后静置待其冷却凝固后。液体培养基待其冷却后加入氨苄青霉素即可。2、细菌平板接种：从已有培养基中挑取单菌落，在固体培养基(已加入氨苄青霉素)中进行平板划线，置于细菌培养箱中，37℃，培养12小时左右。
[0056]
实施例3：
[0057]
本实施例针对上述培养的带有pfor酶质粒的大肠杆菌，对其进行pfor酶的诱导和提取，具体如下：
[0058]
1、取约50ml液体培养基(已加入氨苄青霉素)于离心管中，在已经生长细菌得到平板上挑取单菌落到离心管中，放在震荡培养箱中，37℃，220rpm,约200min。震荡约200分钟后，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，(iptg终浓度为0.5mmol/ml)，置于震荡培养箱中，25℃，220rpm，20h。
[0059]
2、取50ml诱导菌液，12000g，4℃，5min，离心去上清。纯水等体积重悬，再次离心去上清。然后10ml纯水重悬。10ml菌液冰上400w超声5s，间隔5s，大约持续10min，所获得的溶液即含有pfor的粗酶液。
[0060]
实施例4：
[0061]
本实施例针对上述实施例提取的pfor的酶，对其进行是否成功提取的验证：
[0062]
首先，按照pfor酶的反应体系，对所需试剂进行配制，具体如表1，表2所示：
[0063]
表一ph＝7.4pbs缓冲液配制
[0064] 浓度体积k2hpo40.05mm80.2mlkh2po40.05mm19.8ml
[0065]
表二反应物配制
[0066] 母液浓度终浓度体积(μl)丙酮酸钠50mm10mm40bv50mm5mm20mgcl250mm1mm4coa18mm0.18mm2
[0067]
其次，利用pfor酶抑制剂硝唑尼特(ntz)对其活性进行抑制反向验证酶的成功提取，具体如下：
[0068]
测定ntz(硝唑尼特)对pfor酶的抑制率，96孔板铺板，分别设置对照组和实验组，再另外设置两组空白对照组于1.5mlep管中，用作测定本底值。将96孔板放在无氧培养盒中，放入氧气耗竭剂，密封。将装有96孔板的无氧培养盒和两组ep管中的空白对照组放入细菌恒温培养箱中，25℃，孵育12小时以上，用酶标仪测定并计算pfor酶抑制率。
[0069]
在厌氧盒中反应结束后如图2所示，厌氧条件下反应12小时后，5mm1,1'-二苄基-4,4'-联吡啶鎓盐二氯化物水合物(bv)被还原，变成蓝紫色(第五行，第六行的第2、3、6、7、11、12列，第七行的第2、3、6、7、11、12列，第八行的第2、3列)。
[0070]
在546nm处用酶标仪所测得数据如表3所示：
[0071]
表三ntz(硝唑尼特)对pfor酶进行抑制情况
[0072] od值对照组1(有氧)0.043对照组2(有氧)0.04对照组3(厌氧)0.776实验组(厌氧)0.386
[0073]
本底值平均值：(0.043 0.04)/2＝0.0415
[0074]
对照组3：0.776-0.0415＝0.7345
[0075]
实验组：0.386-0.0415＝0.3445
[0076]
抑制率：(0.7345-0.3445)/0.7345＝53％
[0077]
经计算，ntz对pfor酶的抑制率约为50％左右，与既往文献报道一致，也证明了pfor酶提取成功。
[0078]
实施例5：
[0079]
本实施例选取了一组fmt的供者与受者，受者为复发性艰难梭菌感染者，既往有服用甲硝唑治疗艰难梭菌的病史。其感染症状缓解的指标为腹泻的缓解、血液白细胞计数和il-6的数量，三个方面进行考量。
[0080]
挑选健康状况、饮食习惯良好的fmt供者既往提供的粪便，将其均质，在最终浓度为50mg粪便/ml的无菌盐水中稀释。收集的样本以100g离心2分钟，收集上清液并通过70μm和0.22μm滤膜，收集上清，按照实施例4进行反应，孵育12小时后，用酶标仪测定并计算pfor酶抑制率，结果如表4所示：
[0081]
表四fmt供者的粪菌液对pfor酶进行抑制情况
[0082] od值对照组1(有氧)0.043对照组2(有氧)0.039对照组3(厌氧)0.781实验组(厌氧)0.561
[0083]
计算可知，供体的无菌粪液对pfor酶的抑制率约为30％。
[0084]
实施例6：
[0085]
采用上述供体的无菌粪液对临床上25名复发性艰难梭菌感染患者进行fmt，移植前测定患者腹泻、血浆白细胞、血浆中il-6的水平，移植后3周，再次测量前述指标作为其疾病活动情况的判断依据，如表5所示：
[0086]
表五25名复发性艰难梭菌感染患进行fmt前后求情况对比
[0087][0088]
根据表5内容，缓解指标和pfor酶的抑制率进行相关性分析，分析结果如下：
[0089]
(1)腹泻缓解次数与抑制率相关性分析(显示95％置信区间)
[0090]
如图3所示。
[0091]
(2)白细胞减少数目与抑制率相关性分析(显示95％置信区间)
[0092]
如图4所示。
[0093]
(3)白介素6减少数目与抑制率相关性分析(显示95％置信区间)
[0094]
如图5所示。
[0095]
根据图3～5可知，cdi患者接收fmt治疗后的腹泻与发热症状的缓解与其粪液对pfor酶的抑制率呈正相关。
[0096]
实施例6：
[0097]
本实施例选取了fmt供体抑制率为30％的1号患者，对其进行移植前检查患者接受fmt前后肠镜结果，如图6所示，移植后3周，检查18号患者接受fmt前后肠镜结果，如图7所示，根据图6和图7的结果可知，检测fmt供体抑制率较高的供者，能够很好地达到抑制艰难梭菌生长、改善艰难梭菌感染症状，说明本发明方法可初步判断基于该供体的fmt对于艰难梭菌感染的治疗疗效，可用于筛选fmt的供体，或者评价所提供的粪便质量的优劣。
[0098]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。