一种Stargardt病突变检测试剂盒

一种stargardt病突变检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种stargardt病突变检测试剂盒。


背景技术：

2.stargardt病(stgd1 omim#248200)，也被称为stargardt黄斑营养不良、青少年黄斑变性或黄斑眼底，是遗传性视网膜疾病最常见的原因之一，占遗传性视网膜疾病相关失明的12％。stargardt病由karl stargardt于1909年首次描述，临床表现以青春期黄斑营养不良伴中心视力下降和双侧黄斑区萎缩性改变为特征，包括黄斑紫铜样改变、牛眼黄斑病变、进行性黄斑萎缩和视网膜后极部的黄白色斑点；组织学上，该病与视网膜色素上皮中大量脂褐素沉积所导致的感光细胞死亡和视网膜变性密切相关。1998年，blacharski等人估计stargardt病的全球流行率为1/10000，而最近英国眼科监测局的报告中表示，在英国每年的发病率估计为每100,000人中有0.110-0.128人。
3.stargardt病遗传方式主要为常染色体隐性遗传，由abca4基因的双等位基因突变引起。abca4基因定位于染色体1p22.1，由50个外显子组成，编码视网膜特异性膜相关abca4蛋白。abca4蛋白是一个2273个氨基酸的蛋白质，分子量约为250kda，属于atp结合盒转运蛋白超家族的成员，定位于视杆和视锥感光细胞外节的盘膜边缘，并在视觉周期中的视黄醇循环中发挥重要作用。在结构上，abca4蛋白由两个不相同但同源的部分组成，每个部分都包含一个跨膜结构域，一个核苷酸结合结构域和一个胞浆结构域。abca4基因突变导致abca4转运蛋白的功能障碍，有毒的维a酸积累，导致视网膜色素上皮和光感受器的退化，从而导致不可逆的中心视力丧失。
4.abca4基因是allikmets等人于1997年首次发现的，到目前为止，文献中已经报道了2000多个abca4突变(www.lovd.nl/abca4)，但仍有许多患者无法获得明确诊断，与stargardt病相关的致病位点仍需进一步研究，任何一个新突变的发现对于疾病的诊断和预防都有着重要作用。
5.因此开发一种快速、简便、准确、经济的基因突变检测方法，对stargardt病患者abca4基因突变筛查工作具有重要意义。


技术实现要素：

6.基于上述的原因，本发明提供了一种stargardt病突变检测试剂盒，该试剂盒包括扩增引物、特异性探针、锁式探针、滚环引物、taq dna连接酶、bst dna聚合酶及反应缓冲液等；该试剂盒首先以人dna片段为模板，在taqdna连接酶的作用下使锁式探针连接成环状产物，然后在滚环引物的作用下进行等温滚环扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测人dna中是否存在abca4基因上c.215的g到a的新突变位点。本发明首先发现的新突变增加了abca4基因突变谱，同时所提供的试剂盒特异性强、灵敏度高，无需温度循环，操作简单，为临床上stargardt病的检测提供了指导。
7.本发明首先对我国一个患有stargardt病的家系进行了研究，通过全外显子测序，
首次发现了abca4基因上的一个新突变位点，具体为c.215的g到a的突变位点，并通过sanger测序对家系成员及200名正常对照进行验证和共分离分析(图2所示)，最终确定其为一个新的突变位点。对应的发明人公开了突变位点所在dna片段，其核苷酸序列如seq id no:1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no:2所示，未突变的dna片段，其核苷酸序列如seq id no:3所示，其编码的氨基酸序列如seq id no:4所示，根据比对可知，突变的dna片段包含c.215g》a突变，对应的氨基酸序列，存在p.g72e突变。
8.在上述发现的基础上，发明人进一步提供了一组检测引物：
9.上游引物为5
’‑
cactacaccgggagcttgaga-3’，其核苷酸序列如seq id no:5所示，
10.下游引物为5
’‑
tgaccagaaggcagtggacacat-3’，其核苷酸序列如seq id no:6所示，可用于上述突变的检测扩增上述dna片段；
11.更进一步的，发明人提供了一种用于检测上述突变的试剂盒，该试剂盒的主要组成如下：
12.10μm扩增引物、10μm特异性探针、10μm锁式探针、10μm滚环引物、taq dna连接酶、bst dna聚合酶及反应缓冲液；更具体的组成为：
13.扩增引物，上游引物为5
’‑
cactacaccgggagcttgaga-3’，其核苷酸序列如seq id no:5所示，下游引物为5
’‑
tgaccagaaggcagtggacacat-3’，其核苷酸序列如seq id no:6所示；
14.特异性探针(对照探针)包括：
15.突变型探针5
’‑
ggctccaggagatcttctgc-3’，其核苷酸序列如seq id no:7所示，(作为阳性对照)；
16.野生型探针5
’‑
ggctccaggggatcttctgc-3’，其核苷酸序列如seq id no:8所示，(作为阴性对照)；
17.锁式探针5
’‑
cctggagccaaatacagatgaatgtgtcctactcgagtccttaac caaaatgtataaagcagaagatct-3’，其核苷酸序列如seq id no:9所示；
18.滚环引物5
’‑
gttaaggactcgagtagga-3’，其核苷酸序列如seq id no:10所示；
19.除此之外，试剂盒中还含有
20.40u/μl taq dna连接酶；8u/μl taq bst dna聚合酶；反应缓冲液包括2
×
taq pcr预混液、1
×
taq dna连接酶反应缓冲液、1
×
bst dna聚合酶反应缓冲液和1mm dntps。
21.对应的上述试剂盒的反应体系如下：
22.对照组：(阳性对照和阴性对照各一组)
23.连接反应为10μl体系，包括2.5μl 10μm特异性探针(阴性对照或阳性对照)、1μl 10μm的锁式探针、0.1μl 40u/μl的taq dna连接酶、1μl taq dna连接酶反应缓冲液和5.4μl的无核酶水；
24.聚合反应为10μl体系，包括7μl连接产物、0.8μl 1mm的dntps、0.7μl 8u/μl的bst dna聚合酶、1μl bst dna聚合酶反应缓冲液和0.5μl的无核酶水；
25.上述对照组采用的特异性探针既可以充当模板又可以充当引物，因此不需额外加入滚环引物。
26.待测样本组：
27.连接反应为10μl体系，包括2.5μl人dna样本(浓度为60ng/μl)、1μl 10μm的锁式探
针、0.1μl 40u/μl的taq dna连接酶、1μl taq dna连接酶反应缓冲液和5.4μl的无核酶水；
28.聚合反应为10μl体系，包括7μl连接产物、0.3μl 10μm的滚环引物、0.8μl 1mm的dntps、0.7μl 8u/μl的bst dna聚合酶、1μl bst dna聚合酶反应缓冲液和0.2μl的无核酶水。
29.上述试剂盒的具体使用方法如下：
30.(1)样本预处理：
31.基因组dna的提取：利用现有技术从待测样本中提取基因组dna；
32.目的片段的扩增：利用试剂盒提供的扩增引物(seq id no:5和6所示)进行pcr扩增，扩增产物大小为79bp；
33.扩增产物的纯化：利用现有技术从扩增产物中纯化出待测dna片段；
34.(2)预变性：将2.5μl人dna样本(或特异性探针)及1μl的锁式探针混合预变性，反应条件为95℃、10min，然后以0.02℃/s的速度缓慢降至40℃；
35.(3)连接：体系为上述10μl连接体系，反应条件为68℃、30min；
36.(4)聚合：体系为上述10μl聚合体系，反应条件为56℃、2.5h；
37.(5)电泳：取聚合后的滚环扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并分析。
38.结果判定标准如下：
39.在琼脂糖电泳图中，对于突变型，由于突变的存在发生了滚环扩增，分子量较大，无法进行电泳，条带滞留在上样孔处；而野生型未发生滚环扩增，分子量较小，上样孔处无条带。
40.综上所述，采用本发明提供的试剂盒，结合滚环扩增技术，可以在较短时间内检测出stargardt病相关基因abca4 c.215g到a突变，丰富stargardt病诊断试剂盒的诊断位点，且特异性强、准确率高，灵敏度高，无需温度循环，操作简单，为临床上stargardt病的检测提供了指导，进而对于stargardt病的筛查和防治具有十分重要的意义。
附图说明
41.图1为本发明对应突变的stargardt病患者的家系图谱，
42.图2为图1中该家系stargardt病有无abca4基因c.215g》a突变的sanger测序验证峰对比图，
43.其中i-1代表家系图中一名有该突变的成员的sanger测序峰图，指的是i代1号成员；i-2代表家系图中一名无该突变的成员的sanger测序峰图，指的是i代2号成员；
44.图3为本发明提供的taq dna连接酶作用abca4突变基因c.215g》a的连接原理示意图，
45.突变型序列(mt)可以与锁式探针(p)完全互补配对，在连接酶的作用下形成环状产物，而野生型序列(wt)与锁式探针(p)错配，无法连接成环状产物；
46.图4为本发明提供的对照组扩增原理图，
47.锁式探针在taqdna连接酶的作用下，以突变型探针为模板连接形成环状产物，并以突变型探针为引物，在bst聚合酶的作用下进行滚环扩增，扩增出滚环产物；野生型探针与锁式探针形成错配，锁式探针无法连接成环状产物，故无法进行滚环扩增；
48.图5为本发明对照组检测突变琼脂糖凝胶电泳图，
49.泳道1、2为仅加入特异性探针和锁式探针的反应产物，泳道3、4为加入特异性探针、锁式探针和taq dna连接酶的反应产物；泳道5、6为加入连接产物和dntp的反应产物，泳道7、8为加入连接产物、dntp和bst聚合酶的产物，其中泳道7、8即为本发明的阳性和阴性对照结果，可见泳道7在上方上样孔处有条带；
50.图6为本发明提供的待测样本组扩增原理图，
51.首先提取待测样本中的dna(gdna)，pcr扩增出79bp的片段(dsdna)，然后变性成单链dna(ssdna)，之后锁式探针在taq dna连接酶的作用下，含有突变的待测样本，以突变型dna链(mt-ssdna)为模板连接形成环状产物，并在滚环引物和bst聚合酶的存在下进行滚环扩增，扩增出滚环产物；不含有突变的待测样本，也就是野生型dna链(wt-ssdna)与锁式探针形成错配，锁式探针无法连接成环状产物，故无法进行滚环扩增；
52.图7为本发明待测样本组检测突变琼脂糖凝胶电泳图，
53.泳道2、3为图1家系中成员i-1和i-2连接产物电泳结果，泳道4、5为二者聚合产物电泳结果，明显看出，i-1成员存在该突变(泳道4)，i-2成员没有该突变(泳道5)，与图2中的sanger测序结果一致。
具体实施方式
54.在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
55.实施例1突变位点确定
56.首先对我国一个患有stargardt病的家系(图1所示)进行了研究，通过全外显子测序，首次发现了abca4基因上的一个新突变位点，具体为c.215的g到a的突变位点，并通过sanger测序对家系成员及200名正常对照进行验证和共分离分析(图2所示)，最终确定其为一个新的突变位点。对应的发明人公开了突变位点所在dna片段，其核苷酸序列如seq id no:1所示，其编码的氨基酸序列如seq id no:2所示，未突变的dna片段，其核苷酸序列如seq id no:3所示，其编码的氨基酸序列如seq id no:4所示，根据比对可知，突变的dna片段包含c.215g》a突变，对应的氨基酸序列，存在p.g72e突变。
57.实施例2检测试剂盒的组成
58.发明人提供了一组检测引物：
59.上游引物为5
’‑
cactacaccgggagcttgaga-3’，其核苷酸序列如seq id no:5所示，
60.下游引物为5
’‑
tgaccagaaggcagtggacacat-3’，其核苷酸序列如seq id no:6所示，可用于上述dna片段的扩增；
61.更进一步的，发明人提供了一种用于检测上述突变的试剂盒，该试剂盒的主要组成如下：10μm扩增引物、10μm特异性探针、10μm锁式探针、10μm滚环引物、taq dna连接酶、bst dna聚合酶及反应缓冲液；更具体的组成为：
62.扩增引物，上游引物为5
’‑
cactacaccgggagcttgaga-3’，其核苷酸序列如seq id no:5所示，下游引物为5
’‑
tgaccagaaggcagtggacacat-3’，其核苷酸序列如seq id no:6所示；
63.特异性引物探针(对照探针)包括：
64.突变型引物探针5
’‑
ggctccaggagatcttctgc-3’，其核苷酸序列如seq id no:7所示，(作为阳性对照)；
65.野生型引物探针5
’‑
ggctccaggggatcttctgc-3’，其核苷酸序列如seq id no:8所示，(作为阴性对照)；
66.锁式探针5
’‑
cctggagccaaatacagatgaatgtgtcctactcgagtccttaac caaaatgtataaagcagaagatct-3’，其核苷酸序列如seq id no:9所示；
67.滚环引物5
’‑
gttaaggactcgagtagga-3’，其核苷酸序列如seq id no:10所示；
68.除此之外，试剂盒中还含有
69.40u/μl taq dna连接酶；8u/μl taq bst dna聚合酶；反应缓冲液包括2
×
taq pcr预混液、1
×
taq dna连接酶反应缓冲液、1
×
bst dna聚合酶反应缓冲液和1mm dntps。
70.对应的上述试剂盒的反应体系如下：
71.对照组：(阳性对照和阴性对照各一组)
72.连接反应为10μl体系，包括2.5μl 10μm特异性探针(阴性对照或阳性对照)、1μl 10μm的锁式探针、0.1μl 40u/μl的taq dna连接酶、1μl taq dna连接酶反应缓冲液和5.4μl的无核酶水；
73.聚合反应为10μl体系，包括7μl连接产物、0.8μl 1mm的dntps、0.7μl 8u/μl的bst dna聚合酶、1μl bst dna聚合酶反应缓冲液和0.5μl的无核酶水；
74.上述对照组采用的特异性探针既可以充当模板又可以充当引物，因此不需额外加入滚环引物。
75.待测样本组：
76.连接反应为10μl体系，包括2.5μl人dna样本(浓度为60ng/μl)、1μl 10μm的锁式探针、0.1μl 40u/μl的taq dna连接酶、1μl taq dna连接酶反应缓冲液和5.4μl的无核酶水；
77.聚合反应为10μl体系，包括7μl连接产物、0.3μl 10μm的滚环引物、0.8μl 1mm的dntps、0.7μl 8u/μl的bst dna聚合酶、1μl bst dna聚合酶反应缓冲液和0.2μl的无核酶水。
78.实施例3试剂盒的使用
79.利用实施例2制备获得的试剂盒，检测abca4基因c.215g》a突变的方法，具体步骤如下：
80.步骤1，样本预处理
81.(1)采用常规dna提取试剂盒(本实施例采用品牌为corning公司的axygen，货号为ap-md-fbl-gdna-20)进行基因组dna的提取，具体步骤如下：
82.1)将2ml待测血样加入5ml buffer ap1，剧烈混匀；
83.2)加入1ml buffer ap2，立即混匀，4630g离心15min；
84.3)上清转移至中量制备管中，开启负压，保持负压，加入7ml buffer w1，8ml buffer w2，4ml buffer w2；
85.4)卸下中量管管头12000g离心2min；
86.5)加入0.4ml elution buffer，室温静置5min，12000g离心2min，-20℃保存备用。
87.(2)目的片段的扩增：利用试剂盒提供的扩增引物进行pcr扩增，得到大小为79bp的dna片段。
88.按照如下体系及程序进行pcr扩增：
89.pcr反应体系：
[0090][0091]
pcr反应程序：
[0092][0093]
(3)采用常规pcr产物纯化试剂盒(本实施例采用上海生工的sanprep柱式pcr产物纯化试剂盒，货号为b518141-0050)进行pcr产物的纯化，具体步骤如下：
[0094]
1)在pcr反应液中加入5倍体积的buffer b3，充分混匀；
[0095]
2)8000g离心30秒，倒掉收集管中的液体；
[0096]
3)加入500μl wash solution，9000g离心30秒，倒掉收集管中的液体；
[0097]
4)重复步骤3)一次；
[0098]
5)空柱9000g离心1分钟；
[0099]
6)将吸附柱置于干净1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入20μl elution buffer，室温静置1分钟后，离心1分钟，置于-20℃保存。
[0100]
步骤2，预变性
[0101]
将2.5μl人dna样本(或特异性探针)及1μl的锁式探针混合预变性，反应条件为95℃、10min，然后以0.02℃/s的速度缓慢降至40℃。
[0102]
步骤3，连接
[0103]
连接反应为10μl体系，包括2.5μl 10μm人样本dna(60ng/μl)或10μm特异性探针(阴性对照和阳性对照)、1μl 10μm的锁式探针、0.1μl 40u/μl的taq dna连接酶、1μl taq dna连接酶反应缓冲液和5.4μl的无核酶水；反应条件为68℃、30min。
[0104]
步骤4，聚合
[0105]
聚合反应为10μl体系，包括7μl连接产物、0.3μl 10μm的滚环引物、0.8μl 1mm的dntps、0.7μl 8u/μl的bst dna聚合酶、1μl bst dna聚合酶反应缓冲液和0.2μl的无核酶水(对照组不需要加滚环引物，需要加入0.5μl无核酶水)；反应条件为56℃、2.5h。
[0106]
步骤5，电泳
[0107]
取聚合后的滚环扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并分析：
[0108]
(1)配胶(2％琼脂糖):称取0.8g琼脂糖溶于40ml 1xtbe液中；
[0109]
(2)溶胶：微波炉中加热至沸腾后取出，加入2μl g-red，再置微波炉中加热至沸腾；
[0110]
(3)铺胶：将40ml的胶液全部倒入胶槽中，插入梳尺；
[0111]
(4)上胶：将胶槽和胶放入盛有1xtae液的电泳槽中，液面距胶面1-2mm，拔下梳尺；
[0112]
(5)加样：将混有loading buffer的扩增产物加到胶孔中；
[0113]
(6)走胶：盖上电泳槽盖，检查正负极，开启电泳仪，调节电压110v跑胶；
[0114]
(7)拍照：当电泳40min时，关闭电泳仪，小心取胶，放入成像仪拍照。
[0115]
图5为对照组琼脂糖凝胶电泳图，如泳道7、8所示，突变型产物滞留在胶孔(阳性对照)，野生型胶孔无条带(阴性对照)；图7为待测样本组电泳图，如泳道4、5所示，该家系i-1成员存在该突变，i-2成员没有该突变，与图2中的sanger测序结果一致。说明本试剂盒可以在较短时间内检测出stargardt病相关基因abca4 c.215g到a突变。
[0116]
应理解以上具体实施例仅是对本发明的技术方案及核心原理的理解，并不是对本发明范围的限制。对于本领域技术人员，依据本发明的核心原理，可对本实施例各条件和参数根据需要而变动，但这些等价变化与修饰，仍均属于本发明的保护范围。