一种抑制溶藻弧菌生长的杀菌剂及应用

胰化蛋白胨、5.5-6.8g/l氯化钠和1.3-5.0g/l聚谷氨酸。
13.进一步的，所制得的杀菌剂在预防或治疗溶藻弧菌引起感染的疾病中应用。
14.进一步的，所制得的杀菌剂在预防或治疗溶藻弧菌在预防或治疗水产溶藻弧菌病中的应用。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16.1、耐硼赖氨酸芽孢杆菌不仅具有广谱的抗菌特性，且对环境和人体健康无害，在普通lb培养基上即可生长，易培养，生长周期短，因此可在短时间内大量制备抑制弧菌病的杀菌剂，具有成本低，效益高的特点。
17.2、耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液中含多种抗菌的次级代谢产物，加入本发明特定的活化剂，相比于单一的使用耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液的杀菌效果更佳，多种次级代谢产物联合发挥的杀菌效果会更佳，同时这些次生代谢产物一般具广谱活性，快速的杀灭动力学，低水平的诱导抗性和对宿主具低毒性等特征。
18.3、可将耐硼赖氨酸芽孢杆菌改造成底盘微生物细胞，成为可以大量生产某一种或者多种抑菌活性物质的微生物细胞工厂。
附图说明
19.图1为杀菌剂对溶藻弧菌的平板抑制实验效果图；
20.图中图(左)为实施例3，图(右)为对照组。
具体实施方式
21.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
22.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
23.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
24.本发明提及的od值(optical density，简写od)，指被检测物吸收的光密度，检测单位用od值表示。通过测量耐硼赖氨酸芽孢杆菌培养液在600nm处的od值(用od
600
表示)，可以测量耐硼赖氨酸芽孢杆菌培养液的浓度，从而估计耐硼赖氨酸芽孢杆菌的生长情况。
25.实施例1
26.一种抑制溶藻弧菌生长的杀菌剂包括以下重量份原料：耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液20份、水15份和15份活化剂，所述活化剂为体积比1.8:7.0羟基乙酸和l-乳酸锌；
27.所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液是取耐硼赖氨酸芽孢杆菌1-2环接种至增殖培养液中，置于摇床在36℃中经24小时培养，至菌液od
600
值达到2.5时的发酵产物，再置于离心机中，以8000rpm离心去除沉淀，获得发酵上清液；所述增殖培养液包括以下组分：6.1g/l酵母提取物、3.6g/l胰化蛋白胨、5.5g/l氯化钠和1.3g/l聚谷氨酸。
28.实施例2
29.一种抑制溶藻弧菌生长的杀菌剂包括以下重量份原料：耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液80份、水40份和38份活化剂，所述活化剂为体积比3.2:7.2羟基乙酸和l-乳酸锌；
30.所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液是取耐硼赖氨酸芽孢杆菌1-2环接种至增殖培养液中，置于摇床在38℃中经60小时培养，至菌液od
600
值达到2.5时的发酵产物，再置于离心机中，以8000rpm离心去除沉淀，获得发酵上清液；所述增殖培养液包括以下组分：6.5g/l酵
母提取物、8.3g/l胰化蛋白胨、6.8g/l 氯化钠和5.0g/l聚谷氨酸。
31.实施例3
32.一种抑制溶藻弧菌生长的杀菌剂包括以下重量份原料：耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液50份、甘油30份和25份活化剂，所述活化剂为体积比2.0:7.1羟基乙酸和l-乳酸锌；
33.所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液是取耐硼赖氨酸芽孢杆菌1-2环接种至增殖培养液中，置于摇床在37℃中经96小时培养，至菌液od
600
值达到2.5时的发酵产物，再置于离心机中，以8000rpm离心去除沉淀，获得发酵上清液；所述增殖培养液包括以下组分：6.3g/l酵母提取物、6.0g/l胰化蛋白胨、6.0g/l 氯化钠和3.2g/l聚谷氨酸。
34.一、对溶藻弧菌的抑制作用
35.培养方法：
36.1.挑取溶藻弧单菌落分别接种至lb液体培养基中，37℃，150r/min过夜培养；
37.2.稀释菌液od
600
为0.1od
600
/ml，吸取1ml，6000rpm离心10min，弃上清，加1ml pbs缓冲液冲洗3次，6000rpm，3min，弃上清，加入500μl实施例3杀菌剂重悬菌体，置于37℃恒温培养箱孵育10～12h，对照组将杀菌剂换成 pbs缓冲液；
38.3.吸取5μl经杀菌剂/pbs处理过的病原细菌悬液垂直滴入lb平板的中心点，置于37℃恒温培养箱静止培养18～20h；
39.4.观察病原菌菌落直径；
40.以上步骤1-4重复至少三次，即做至少三个生防菌对特定细菌抑菌性测试实验。
41.抑制效果如图1所示，溶藻弧菌(vibrio alginolyticus)的生长明显被耐硼赖氨酸芽孢杆菌抑制。
42.二、白虾溶藻弧菌病的防治实验
43.由海南文昌某渔港提供白虾，先适应性养殖7天，禁食1天，水温20℃，将本发明的实施例1～3制得的杀菌剂作为实验组1～3，阳性对照组为未加活化剂的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液，空白组为无菌水进行喷洒，共5组，并设立5 组池塘，每组20只白虾同时设三个平行实验；
44.实验方法：建立上述实验组后，2h后在各组中使用5.0
×
106cfu/ml溶藻弧菌，每24h浸浴一次，记录各组白虾死亡情况，
45.46.由上述结果显示，本发明的实验组中，死亡率较低，第一天死亡率为2～4％，第三天死亡率6～10％，第六天死亡率10～15％，与对照组和空白组比较，说明本方的杀菌剂将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液与活化剂结合，更加有效防治溶藻弧菌，本发明的杀菌剂可以作为生物杀菌剂应用于白虾养殖中溶藻弧菌的预防。
47.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种抑制溶藻弧菌生长的杀菌剂，其特征在于：包括以下重量份原料：耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液20～80份和辅料15～40份，所述辅料为水、培养基、甘油中至少一种。2.如权利要求1所述的一种抑制溶藻弧菌生长的杀菌剂，其特征在于：还包括15～38重量份的活化剂，所述活化剂为体积比1.8-3.2:7.0-7.2羟基乙酸和l-乳酸锌。3.如权利要求1所述的一种抑制溶藻弧菌生长的杀菌剂，其特征在于：所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液是取耐硼赖氨酸芽孢杆菌1-2环接种至增殖培养液中，在36-38℃中经24-96小时培养，至菌液od
600
值达到4.8-2.5时的发酵产物。4.如权利要求3所述的一种抑制溶藻弧菌生长的杀菌剂，其特征在于：所述增殖培养液包括以下组分：6.1-6.5g/l酵母提取物、3.6-8.3g/l胰化蛋白胨、5.5-6.8g/l氯化钠和1.3-5.0g/l聚谷氨酸。5.权利要求1～4任意一项所制得的杀菌剂在预防或治疗溶藻弧菌引起感染的疾病中应用。6.权利要求1～4任意一项所制得的杀菌剂在预防或治疗溶藻弧菌在预防或治疗水产溶藻弧菌病中的应用。

技术总结
本发明提供一种抑制溶藻弧菌生长的杀菌剂及应用，杀菌剂包括以下重量份原料：耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液20～80份、辅料15～40份和15～38份的活化剂，所述活化剂为体积比1.8-3.2:7.0-7.2羟基乙酸和L-乳酸锌，经科学调整其配比，具广谱活性，快速的杀灭动力学，低水平的诱导抗性和对宿主具低毒性等特征，可在预防或治疗溶藻弧菌引起感染的疾病中应用。或治疗溶藻弧菌引起感染的疾病中应用。


技术研发人员：曹欣 刘柱 马香 陈银华 章跃陵 林向民
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2021.12.27
技术公布日：2022/5/17