抗Her-2抗体-趋化因子融合蛋白及其制法和应用的制作方法

抗her-2抗体-趋化因子融合蛋白及其制法和应用
技术领域
1.本发明涉及属于生物医学领域，更具体地，本发明涉及一种抗her-2抗体-趋化因子融合蛋白及其制法和应用。


背景技术：

2.her-2为原癌基因，属于人表皮生长因子受体家族，通过调节下游信号通路来抑制癌细胞凋亡，促进其增殖、侵袭，her-2扩增或过表达在乳腺癌患者中占比约20％-30％，此外，胃癌中也常检测到her-2阳性(her-2 )。her-2靶点的代表药物曲妥珠单抗目前在her-2 的乳腺癌和胃癌中取得了不错的疗效，但是目前乳腺癌对曲妥珠单抗的耐药率及复发率逐年升高，其最终耐药率高达65％，这其中包括70％的患者在治疗初期对曲妥珠单抗治疗敏感，最终也出现耐药性。因此亟需新的组合来实现对her-2 肿瘤的有效控制。
3.综上所述，本领域迫切需要开发一种更安全、有效、精准靶向肿瘤的抗her-2的融合蛋白。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种安全、有效、精准靶向肿瘤的抗her-2的融合蛋白。
5.在本发明的第一方面，提供了一种融合蛋白单链，所述融合蛋白单链包括融合在一起的以下元件：
6.(a)第一蛋白元件；
7.(b)第二蛋白元件；以及
8.(c)任选的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之间的接头元件；
9.其中，所述第一蛋白元件为抗her-2抗体或其活性片段的蛋白元件；
10.第二蛋白元件为选自趋化因子cc家族的蛋白元件。
11.在另一优选例中，所述趋化因子选自ccl-11或ccl2。
12.在另一优选例中，所述抗her-2抗体或其活性片段为含有f(ab)、scfv、vh、ch、vl或vhh的活性片段。
13.在另一优选例中，所述抗her-2抗体或其活性片段选自曲妥珠单抗的活性片段。
14.在另一优选例中，所述接头元件为肽键或肽接头。
15.在本发明的第二方面，提供了一种由本发明第一方面所述的融合蛋白单链组成的融合蛋白，所述融合蛋白具有下式i或ii所示的二聚体结构：
[0016][0017]
式中，
[0018]
h-chain
--
v-chain为抗her-2抗体或其活性片段的蛋白元件，其中，
[0019]
h-chain为无、或抗her-2抗体或其活性片段中的重链融合蛋白；
[0020]
v-chain为无、或抗her-2抗体或其活性片段中的轻链融合蛋白；
[0021]
ccl为选自趋化因子cc家族的蛋白元件；
[0022]
表示重链和轻链之间的二硫键；
[0023]
“-”
代表肽键或肽接头。
[0024]
在另一优选例中，所述的重链融合蛋白包括或含有抗her-2抗体中的重链、vh、ch、vhh、fc区或hcdr。
[0025]
在另一优选例中，所述的轻链融合蛋白包括或含有抗her-2抗体中的轻链、vl、cl或lcdr。
[0026]
在另一优选例中，h-chain为曲妥珠单抗的重链。
[0027]
在另一优选例中，v-chain为曲妥珠单抗的轻链。
[0028]
在另一优选例中，ccl优选为ccl-11。
[0029]
在另一优选例中，在所述的融合蛋白中，所述的h-chain或v-chain与ccl以头-头、头-尾、或尾-尾方式相连。
[0030]
在另一优选例中，所述的“头部”指多肽或其片段的n端，尤其是野生型多肽的或其片段的n端。
[0031]
在另一优选例中，所述的“尾部”指多肽或其片段的c端，尤其是野生型多肽的或其片段的c端。
[0032]
在另一优选例中，所述的肽接头的长度为0-20个氨基酸，较佳地1-15个氨基酸。
[0033]
在另一优选例中，所述的h-chain含有或具有seq id no:19中的第1-449位，所述的v-chain含有或具有seq id no:22中的第1-214位，所述的ccl11含有或具有seq id no:19中的第450-523位，或seq id no:22中的第215-288位。
[0034]
在另一优选例中，所述肽接头的序列为seq id no:23中的第215-221位。
[0035]
本发明的第三方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第二方面所述的融合蛋白。
[0036]
本发明的第四方面，提供了一种载体，它含有本发明的第三方面所述的多核苷酸。
[0037]
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
[0038]
本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明的第四方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第三方面所述的多核苷酸。
[0039]
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
[0040]
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括哺乳动物细胞。
[0041]
本发明的第六方面，提供了一种产生本发明第二方面所述融合蛋白的方法，它包括步骤：
[0042]
(1)在适合表达的条件下，培养本发明的第五方面所述的宿主细胞，从而表达出本发明的第二方面所述的融合蛋白；和
[0043]
(2)任选地分离所述融合蛋白。
[0044]
本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含：
[0045]
本发明第二方面所述的融合蛋白，以及
[0046]
药学上可接受的载体。
[0047]
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有：额外的活性成分，较佳地所述的活性成分包括：小分子化合物、细胞因子、抗体(如抗pd-1抗体、抗ox40抗体、抗cd137抗体、抗cd47抗体、adc、car-免疫细胞)。
[0048]
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
[0049]
本发明的第八方面，提供了一种免疫细胞，所述的免疫细胞携带本发明第二方面所述的融合蛋白。
[0050]
本发明的第九方面，提供了一种药物组合物，所述的组合物包含：
[0051]
本发明的第八方面所述的免疫细胞，以及
[0052]
药学上可接受的载体。
[0053]
本发明第十方面，提供了一种如本发明第二方面所述的融合蛋白或本发明第八方面所述免疫细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
[0054]
在另一优选例中，所述的肿瘤包括：乳腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、大肠癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝癌肿瘤、黑色素肿瘤。
[0055]
在另一优选例中，所述治疗肿瘤的药物可与另一种肿瘤免疫治疗联用，包括但不限于：化疗、抗cd20 mab、抗tim-3mab、抗lag-3mab、抗cd73 mab、抗cd47mab、抗dll3 mab、抗frmab mab、抗ctla-4抗体、抗ox40抗体、抗cd137抗体、抗pd-1抗体、pd-1/pd-l1治疗、其他免疫肿瘤药物、抗血管生成剂、放射治疗、抗体-药物偶联物(adc)、靶向治疗或其他抗癌药物。
[0056]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0057]
图1a-1b显示了本发明抗her-2单克隆-趋化因子融合蛋白实施方式的两种结构示意图。
[0058]
图2a-2b显示了曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白的sds-page电泳分析研究。其中，图2a：非还原6％sds-page电泳分析。图2b：还原10％sds-page电泳分析。泳道1为曲妥珠单抗；泳道2为曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白；mw为蛋白分子量标准(kda)。
[0059]
图3显示了曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白与细胞膜上her-2结合的流式细胞技术分
析研究。her-2高表达的人乳腺癌细胞bt-474与不同浓度的曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白或曲妥珠单抗孵育，然后用fitc标记的羊抗人igg1 fc抗体检测与her-2结合的抗体，fitc荧光强度用流式细胞仪检测。
[0060]
图4显示了曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白与细胞膜上受体ccr3结合的流式细胞技术分析研究。ccr3高表达的人胚肺细胞mrc-5与不同浓度的曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白或曲妥珠单抗孵育，然后用fitc标记的羊抗人igg1 fc抗体检测与ccr3结合的抗体，fitc荧光强度用流式细胞仪检测。
[0061]
图5显示了曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白抑制表达人her-2的小鼠黑色素瘤细胞b16在小鼠体内生长的研究。将人her-2基因转染的稳定细胞株b16/her-2接种在小鼠背部，3天后通过尾静脉注射分别给予pbs(表示)、曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白(表示)和曲妥珠单抗(表示)，然后每周1次，共给药4次。药物剂量均为4mg/kg。肿瘤体积测量按(长
×
宽
×
宽/2)计算。
具体实施方式
[0062]
本发明人过广泛而深入的研究，意外发现，将(a)抗her-2抗体或其活性片段、(b)趋化因子cc家族的蛋白相融合，获得的融合蛋白具有高效杀伤肿瘤细胞活性、毒副作用小的协同作用。本发明的融合蛋白靶向her-2表达的肿瘤，并与有生物活性的趋化因子融合。具体地，本发明中的融合蛋白，特异性识别人表皮生长因子受体(her-2)，并吸引和调节嗜酸性粒细胞的趋化因子ccl11。所得的融合蛋白可以特异性结合肿瘤组织表达的her-2，抑制肿瘤生长；将趋化因子ccl11传递到靶向的肿瘤组织，增强嗜酸性粒细胞杀伤肿瘤的作用。因此，本发明中的融合蛋白可用于her-2 肿瘤的治疗。在此基础上，发明人完成了本发明。
[0063]
本发明设计的融合蛋白中，如图1a、1b所示，趋化因子可以以头-头、头-尾、或尾-尾方式与抗her-2抗体或其活性片段连接。抗her-2抗体或其活性片段可以是含有f(ab)、f(ab)2、scfv或vhh的活性片段，趋化因子可以是ccl2、ccl11。本发明中一种优选的连接方式为趋化因子ccl11连接在曲妥珠单抗的重链末端。实验证明，本发明的融合蛋白具有良好的协同作用，优于曲妥珠单抗或趋化因子ccl11单独施用的效果，优于曲妥珠单抗和趋化因子ccl11联合使用的效果。
[0064]
术语
[0065]
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0066]
在本发明中，术语“本发明的融合蛋白”、“本发明的her-2抗体-趋化因子融合蛋白”、“her-2抗体-ccl11融合蛋白”可互换使用，皆指本发明中第一方面所提及的融合蛋白。
[0067]
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0068]
如本文所用，除非另外说明，fc是指人免疫球蛋白的fc片段。术语“免疫球蛋白fc区”指免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白fc区可包括重链ch1、ch2、ch3的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组
合，在优选例中，所用的免疫球蛋白的fc区包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个ch2结构域和一个ch3结构域，优选缺少ch1结构域。
[0069]
已知人免疫球蛋白有多种类别，如iga、igd、ige、igm及igg(包括igg1、igg2、igg3、igg4四个亚类)，从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白fc区是在本领域技术人员所掌握的范围之内的，在一个优选的实例中，免疫球蛋白fc区可选择包含有人免疫球蛋白igg4亚类fc区的编码序列，其中缺失一个免疫球蛋白重链1结构域(ch1)，但包括了铰链区以及ch2、ch3、二个结构域的编码序列。
[0070]
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”、和“由
……
构成”；“主要由
……
构成”、“基本上由
……
构成”和“由
……
构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0071]
融合蛋白
[0072]
如本文所用，除非另外说明，所述的融合蛋白是一种分离的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞所表达的，或经分离或纯化的产物。
[0073]
本发明构建的融合蛋白，由以下二部分组成：
[0074]
(1)识别肿瘤特异性抗原her-2的全长单克隆抗体或最小识别抗原的部分；
[0075]
(2)趋化性细胞因子家族中的一个具有生物活性的趋化因子，比如ccl-11或ccl2。
[0076]
利用重组dna技术构建融合蛋白编码核糖核苷酸，融合蛋白含有抗her-2抗体重链，其含或不含重链恒定区的ch1或ch2或ch3，其c末端与有活性的细胞趋化因子融合。
[0077]
当融合蛋白重链表达质粒与抗her-2抗体轻链表达质粒共转染，可以产生抗her-2抗体-趋化因子(如ccl11)融合蛋白，此融合蛋白能结合表达her-2的肿瘤细胞，并能把趋化因子递送到肿瘤部位。
[0078]
将有生物活性的趋化因子与抗her-2的单链抗体融合，完整的融合蛋白是一条多肽链，各功能区域由连接肽连接，保证融合蛋白具有正确的空间结构，保持其生物活性。
[0079]
本发明的融合蛋白是一类全新的分子，具有二种生物功能：第一，它们能靶向表达her-2的肿瘤组织，第二，它们能把具有生物活性的细胞因子特异性递送到肿瘤部位。这些细胞因子具有吸引免疫细胞并调节免疫细胞活性的功能，因此，能增加免疫细胞肿瘤组织浸润以及增强免疫细胞活性，使肿瘤，例如乳腺癌、胃癌等，生长得到抑制。由于趋化因子主要局限在肿瘤组织部位，给患者造成的毒性相对较小。
[0080]
本发明中融合蛋白里的抗体可以是全长抗体，也可以是抗体的某一关键片段，比如，scfv、f(ab)2或vhh。从理论上来说，所有能结合肿瘤细胞膜上her-2受体的抗体都适用于构建本发明的抗体-趋化因子融合蛋白(曲妥珠单抗、拉帕替尼单抗、和帕妥珠单抗)。在本发明中，优选曲妥珠单抗。
[0081]
本发明的融合蛋白趋化因子部分，选自有生物活性的cc家族的趋化因子，直接或通过肽接头与抗体部分连接。
[0082]
本发明提供了一种融合蛋白，包含以下元件：
[0083]
(a)抗her-2抗体或其活性片段的蛋白元件、(b)趋化因子cc家族(如ccl11)的蛋白元件、和(c)接头元件。本发明所述的融合蛋白中，所述的各元件之间(如元件a与元件b之间)，可以含有或不含有接头。
[0084]
本发明的融合蛋白，不仅具有更长的体内半衰期，可以更有效地抑制血清中免疫
疾病相关的抗体(尤其是ige)的浓度。
[0085]
根据本发明提供的氨基酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于：重组dna法，人工合成，等[参见murray km,dahl slann；pharmacother 1997nov；31(11):1335-8]。
[0086]
在得知了本发明的融合蛋白的氨基酸序列后，本领域人员可以方便地根据所述的氨基酸序列获得编码本发明的融合蛋白的基因序列。
[0087]
一种优选的融合蛋白为曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白，其重链核苷酸序列如seq id no:14所示，重链氨基酸序列如seq id no:19所示；其中，重链氨基酸(seq id no:19)序列中的1-449位为曲妥珠单抗的氨基酸序列；第450-523位为ccl11氨基酸序列。
[0088]
一种优选的融合蛋白为曲妥珠单抗lc-ccl11融合蛋白，其轻链核苷酸序列如seq id no:17所示，轻链氨基酸序列如seq id no:22所示；其中，轻链氨基酸(seq id no:22)序列中的1-214位为曲妥珠单抗的轻链氨基酸序列；第215-288位为ccl11氨基酸序列。
[0089]
一种优选的融合蛋白为曲妥珠单抗lc-linker-ccl11融合蛋白，其轻链核苷酸序列如seq id no:18所示，轻链氨基酸序列如seq id no:23所示；其中，轻链氨基酸(seq id no:23)序列中的1-214位为曲妥珠单抗的轻链氨基酸序列；第215-221位为linker序列；第222-295位为ccl11氨基酸序列。
[0090]
在另一优选例中，本发明的曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白的轻链核苷酸序列如seq id no:15所示，轻链氨基酸序列如seq id no:20所示。
[0091]
在另一优选例中，本发明的曲妥珠单抗lc-ccl11或lc-linker-ccl11融合蛋白的重链核苷酸序列如seq id no:16所示，重链氨基酸序列如seq id no:21所示。
[0092]
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0093]
如本文所用，“分离的重组融合蛋白”是指重组融合蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化重组融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
[0094]
本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
[0095]
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
[0096]
如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在dna聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的dna链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的rna、dna，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如lna或zna等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有
足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
[0097]
根据本发明提供的氨基酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于：重组dna法，人工合成等。
[0098]
本发明融合蛋白的元件(如抗her-2抗体活性片段或ccl)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0099]
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0100]
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0101]
应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的基因。用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。
[0102]
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
[0103]
通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：
[0104]
(1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0105]
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0106]
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0107]
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0108]
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0109]
包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0110]
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos、或293细胞的动物细胞等。
[0111]
一种特别优选的细胞为人和非人哺乳动物的细胞，尤其是免疫细胞，包括t细胞、nk细胞。
[0112]
用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原
核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0113]
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0114]
在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0115]
趋化因子
[0116]
根据序列特征，趋化因子分为几个主要家族，比如cc、cxc和cx3c等。在本发明中，趋化因子优先选自cc家族。在cc家族中，ccl11和cc2是优先选择的趋化因子。
[0117]
在一具体实施例中，本发明提供了一种抗体-趋化因子融合蛋白，其趋化因子选自cc家族中的ccl11。
[0118]
肽接头
[0119]
本发明的双功能融合蛋白可任选地含有或不含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。
[0120]
肽接头的长度一般为0-20个氨基酸，较佳地1-15个氨基酸。
[0121]
优选的肽接头的例子包括(但并不限于)：gsggggs、ggggsggggsggggs。
[0122]
在本发明的一个具体实施例中，肽接头的氨基酸序列为：曲妥珠单抗lc-linker-ccl11氨基酸序列(seq id no:23)中的第215-221位。
[0123]
药物组合物及施用方法
[0124]
本发明还提供了一种组合物，它含有(a)有效量的本发明融合蛋白和/或有效量的本发明的免疫细胞，以及药学上可接受的载体。
[0125]
通常，可将本发明的融合蛋白配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地，ph约为6-8。
[0126]
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0.001-99wt％；较佳的0.01-95wt％；更佳的，0.1-90wt％。
[0127]
当本发明的药物组合物含有免疫细胞时，“有效量”或“有效剂量”是指1
×
10
3-1
×
107个所述的免疫细胞/ml。
[0128]
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接
受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0129]
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的融合蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
[0130]
本发明融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：本发明融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的融合蛋白每天以约5mg-20mg/kg动物体重(较佳的5mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0131]
本发明融合蛋白特别适合用于治疗肿瘤等疾病。代表性的肿瘤包括(但并不限于)：乳腺癌肿瘤、胃癌肿瘤、膀胱癌肿瘤、胰腺癌肿瘤、大肠癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝癌肿瘤、黑色素肿瘤。
[0132]
本发明的主要优点包括：
[0133]
(1)本发明的her-2与ccl11的融合蛋白具有精确识别、免疫治疗、毒性可控的优势。
[0134]
(2)本发明的her-2与ccl11的融合蛋白在识别异常表达her-2的肿瘤并抑制其生长的同时，通过ccl11介导的趋化并增强嗜酸性粒细胞在肿瘤微环境中的杀伤，进一步提高对her-2 肿瘤的疗效。
[0135]
(3)本发明的her-2与ccl11的融合蛋白，通过her-2靶向肿瘤的特性，精准的将ccl11携带至肿瘤微环境，进一步强化嗜酸性粒细胞介导的局部肿瘤杀伤，同时降低了正常组织嗜酸性粒细胞相关的不良反应(嗜酸粒细胞性胃肠炎、嗜酸粒细胞气管炎等)的发生率。
[0136]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅以阐释为目的而非限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
[0137]
以下实施例中未注明具体条件的实验方法可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，new york：cold spring harbor laboratory press，1989)或按照供应商所建议的条件。dna的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
[0138]
实施例1.抗体-ccl11融合蛋白表达质粒的构建
[0139]
1.her-2抗体hc-ccl11融合蛋白表达质粒的构建
[0140]
曲妥珠单抗作为her-2抗体的以图1a示例。编码曲妥珠单抗重链和轻链的完整cdna由genscrip(usa)公司合成，分别克隆在puc57载体上。人ccl11的cdna购自openbiosystems(美国)。
[0141]
有大量报道显示，在单克隆抗体表达和制备过程中，绝大部分抗体的重链c-末端
赖氨酸被降解掉，所以在构建抗体-ccl11融合蛋白时，去掉了这个赖氨酸，使本发明的抗体融合蛋白能保持完整性。
[0142]
编码曲妥珠单抗重链的基因与编码ccl11的基因用两步聚合酶链式反应技术(pcr)方法连接起来。第一步，用pcr方法(高保真聚合酶pfx，invitrogen)以人工合成的抗体重链dna为底物扩增重链基因：
[0143]
5'端引物m13-f(seq id no:1)：5'-tgtaaaacgacggccagt-3'，位于puc57载体上。
[0144]
3'端引物kdp004(seq id no:2)：5'-tcctggggacagtgacagtg-3'，是抗体重链基因专一引物。
[0145]
同样，用pcr方法扩增成熟ccl11蛋白部分(gly24-pro97)的基因：
[0146]
5'端引物kdp008(seq id no:3)：
[0147]
5'-cactgtcactgtccccaggagggccagcttctgtcccaacc-3'；
[0148]
3'端引物kdp007(seq id no:4)：
[0149]
5'-tggtggtgtctagagacttatggctttggagttgg-3'，是ccl11基因专一引物。
[0150]
其中引物kdp008的头20个核苷酸序列与引物kdp004的核苷酸序列互补，这样在第二步的重叠延伸pcr过程中，可以把这2个pcr片段连接起来。
[0151]
上面2个pcr片段经dna胶纯化后(天根生化科技有限公司，北京)，进行第二步重叠pcr。5'端引物m13-f(seq id no:1)，3'端引物kdp007(seq id no:4)含有用于克隆的xba i酶切序列。
[0152]
曲妥珠单抗重链基因转录起始位点前有not i的酶切位点，在胶纯化重叠pcr得到的片段后，进行not i/xba i双酶切(takara)。然后把酶切的pcr片段克隆到同样酶切的哺乳动物细胞表达载体上。此哺乳动物细胞表达载体是改进的pcdna3.1(invitrogen)，pcdna3.1里的抗neomycin(新霉素)基因被dhfr(二氢叶酸还原酶)基因取代，改进后的载体适用于筛选稳定转染蛋白高表达的哺乳动物细胞。将重组质粒转染进dh5a感受态细菌，用菌落pcr方法鉴定含有正确重组质粒的阳性菌落，提纯重组质粒。经酶切和测序鉴定，曲妥珠单抗重链-ccl11重组基因具有正确的序列。
[0153]
用亚克隆方法把曲妥珠单抗轻链cdna克隆到另一个改进的pcdna3.1质粒，克隆酶是not i和xba i。
[0154]
2.her-2抗体lc-ccl11融合蛋白表达质粒的构建
[0155]
以曲妥珠单抗作为her-2抗体的示例。ccl11直接连接到曲妥珠单抗轻链的c末端(lc-ccl11)，或通过连接肽连接到曲妥珠单抗轻链的c末端(lc-linker-ccl11)。结构如图1b所示。
[0156]
(i)编码曲妥珠单抗lc-ccl11的基因用两步聚合酶链式反应技术(pcr)方法连接起来。第一步，用pcr方法(高保真聚合酶pfx，invitrogen)以人工合成的抗体轻链链dna为底物扩增轻链基因：
[0157]
5'端引物kdp068(seq id no:5)：5'-ctttggcaaagaattggg-3'，位于载体上。
[0158]
3'端引物kdp206(seq id no:6)：5'-acattcgccacgattaaaggat-3'，是抗体轻链基因专一引物。
[0159]
同样，用pcr方法扩增成熟ccl11蛋白部分(gly24-pro97)的基因：
[0160]
5'端引物kdp603(seq id no:7)：
[0161]
5'-ctttaatcgtggcgaatgtgggccagcttctgtc-3'；
[0162]
3'端引物bghr(seq id no:8)：
[0163]
5'-aactagaaggcacagtcgaggc-3'，位于载体上。
[0164]
其中引物kdp603的头19个核苷酸序列与引物kdp206的核苷酸序列互补，这样在第二步的重叠延伸pcr过程中，可以把这2个pcr片段连接起来。
[0165]
上面2个pcr片段经dna胶纯化后(天根生化科技有限公司，北京)，进行第二步重叠延伸pcr反应。
[0166]5’
端引物kdp066(seq id no:9)：5'-cgaacatcgattgaattcc-3'；
[0167]3’
端引物kdp605(seq id no:10)：5'-gaatagggccctctagagacttatggctttggagttg-3'
[0168]
用与实施例1中构建hc-ccl11表达基因相同的方法，把lc-ccl11重组基因克隆到哺乳动物细胞表达载体中，然后制备质粒。
[0169]
(ii)编码曲妥珠单抗lc-linker-ccl11的基因用两步聚合酶链式反应技术(pcr)方法连接起来。方法与构建lc-ccl11基因的方法相同，只是轻链pcr的3’端引物和ccl11 pcr的5’端引物不同。
[0170]
轻链pcr的3’端引物kdp602(seq id no:11)：5'-gatccgccaccgccgctgccacattcgccacgattaaag-3'
[0171]
ccl11 pcr的5’端引物kdp601(seq id no:12)：5'-ggcagcggcggtggcggatccgggccagcttctgtc-3'
[0172]
其中引物kdp601的头20个核苷酸序列与引物kdp602的头20个核苷酸序列互补，这样在第二步的重叠延伸pcr过程中，可以把这2个pcr片段连接起来。
[0173]
上面2个pcr片段经dna胶纯化后(天根生化科技有限公司，北京)，进行第二步重叠延伸pcr反应。
[0174]
用与实施例1中构建hc-ccl11表达基因相同的方法，把lc-linker-ccl11重组基因克隆到哺乳动物细胞表达载体中，然后制备质粒。
[0175]
肽接头linker核苷酸序列(seq id no:13)：
[0176]
ggcagcggcggtggcggatcc
[0177]
(iii)用亚克隆方法把曲妥珠单抗重链cdna克隆到哺乳动物细胞表达载体中，比如pcdna3.1质粒，克隆酶是not i和xba i。
[0178]
实施例3.建立曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白稳定表达细胞株
[0179]
用于稳定表达曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白的宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞cho-ks。cho-ks是生长在含胎牛血清(fbs)培养基里的cho-k1细胞经过逐渐降低培养基中fbs含量的培养直至无fbs培养基培养，最终驯化成在不含fbs的opticho培养基(invitrogen)中悬浮生长的细胞。含有融合蛋白基因的pcdna3.1载体中的抗新霉素基因用大鼠谷氨酰胺合成酶基因取代，采用电转染(bio-rad，gene pulser xcell)的方法把重链表达质粒和轻链表达质粒共转染进cho-ks细胞，转染的细胞在培养24-48个小时后，用有限稀释法在96孔培养板上对转染的细胞进行筛选培养。筛选培养基是opticho，5μg/ml重组人胰岛素和10μm氨基亚砜蛋氨酸(msx)。在37℃，8％co2的培养箱里培养细胞。3个星期后，用elisa方法(碱性磷酸酶偶联的羊抗人igg fc抗体，jackson immunoresearch lab)对每个长有细胞群的孔
的细胞培养液进行分析，把融合蛋白表达阳性的细胞群进一步扩增，再elisa检测，再扩增，最后得到融合蛋白表达稳定细胞群。
[0180]
用于表达曲妥珠单抗hc-ccl融合蛋白的质粒为hc-ccl表达质粒和lc表达质粒，用于表达曲妥珠单抗lc-ccl11融合蛋白或lc-linker-ccl11融合蛋白的质粒为hc表达质粒和lc-ccl11表达质粒或lc-linker-ccl11表达质粒。
[0181]
实施例4.曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白的制备、纯化和鉴定
[0182]
将实施例3所得曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白、曲妥珠单抗lc-ccl11融合蛋白和曲妥珠单抗hc-linker-ccl11融合蛋白高表达的细胞系，分别培养扩增至2升。培养液上清用来纯化制备抗体。protein-a亲和层析(poros mabcapture a，life tech)，接着用阴离子柱(流穿)纯化。
[0183]
结果与分析
[0184]
图2a的非还原sds-page电泳胶显示完整曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白的分子量略大于曲妥珠单抗，接近其理论值162kda。图2b的还原sds-page电泳胶显示曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白的重链略大于曲妥珠单抗重链，与其理论分子量一致(58kda)。曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白的轻链与曲妥珠单抗的轻链相同。
[0185]
实施例5.曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白与her-2的结合研究
[0186]
用流式细胞仪方法(flow cytometry)检测以上制备的曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白与细胞膜上her-2受体的结合。人乳腺癌细胞bt-474(购自中国科学院细胞库)是高表达her-2的肿瘤细胞。各取适量的bt-474细胞，用预冷的facs工作液(pbs含0.1％fbs)调整其细胞密度为2
×
106个/ml，分装100μl/管，冰上封闭1小时。然后用facs工作液稀释曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白和曲妥珠单抗到100μg/ml，然后系列稀释，取系列稀释的10μl加到100μl的细胞悬液中，使抗体终浓度分别为10、3、1、0.3、0.1、0.03和0μg/ml。冰上孵育30分钟后，向每管细胞悬液加1ml facs工作液，涡旋混匀细胞，离心5分钟，1200rpm/min，弃去上清，重复洗涤一遍。用facs工作液稀释fitc标记的羊抗人igg fc抗体(jackson immunoresearch lab)，每管细胞悬液加10μl抗体，使其终浓度为1μg/ml，避光，冰上孵育30分钟。孵育完成后，向每管细胞悬液加1ml facs工作液，涡旋混匀细胞，离心5分钟，1200rpm/min，弃去上清，重复洗涤一遍。用流式细胞仪c6(bd biosciences)检测细胞。
[0187]
结果与分析
[0188]
流式细胞术试验显示：曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白能够结合细胞膜上的her-2，结合能力和曲妥珠单抗相当，见图3。
[0189]
本发明不同结构的曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白完好保留了与her-2的结合特性。
[0190]
实施例6.抗体-ccl11融合蛋白与表达ccr3的mrc-5细胞体外结合
[0191]
人胚肺细胞mrc-5表达ccl11的受体膜蛋白ccr3。用流式细胞仪方法研究各曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白与细胞mrc-5的结合(mrc-5细胞购自中国科学院细胞库)。实验方法参照实施例4中的方法。各曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白的浓度分别为0、0.1、1和10μg/ml。用曲妥珠单抗作为阴性对照。
[0192]
结果与分析
[0193]
结果如图4所示，曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白能与mrc-5结合，而曲妥珠单抗不与mrc-5结合，证明本发明的曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白完整的保存了特异性结合细胞
膜上ccl11受体ccr3的功能。
[0194]
实施例7.人her-2稳定表达小鼠肿瘤细胞株的构建
[0195]
小鼠黑色素瘤细胞b16来自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，小鼠卵巢癌细胞id-8购自上海弘顺生物科技有限公司，肿瘤细胞均培养在rpmi1640/10％fbs(gibco)培养基里。
[0196]
人her-2表达基因克隆在表达载体pcdna3.1中(invitrogen)，重组质粒用lipofectmaine 3000(invitrogen)分别转染进小鼠黑色素瘤细胞b16和小鼠卵巢癌细胞id-8里，转染的细胞在含g418(sigma)的rpmi/10％fbs培养基里培养，得到稳转细胞池。用流式细胞分选仪(influx，bd biosciences)从稳转细胞池中筛选出her-2高表达的单克隆稳定细胞株b16/her-2和id8/her-2。
[0197]
实施例8.曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白抑制表达人her-2的小鼠黑色素瘤b16在小鼠体内生长的研究
[0198]
c57bl/6小鼠来自上海斯莱克有限公司，饲养在spf级别环境里。
[0199]
将6-7周龄的c57/b6小鼠，分组，每组8-10只，用皮下接种的方法，在小鼠腋下注射b16/her-2细胞3
×
106个/只。细胞接种2天后，各组小鼠尾静脉分别给予小鼠pbs(对照组)、曲妥珠单抗4mg/kg、ccl11 0.4mg/kg(与曲妥珠单抗同等摩尔质量)、曲妥珠单抗 ccl11 4mg/kg(3.6mg/kg 0.4mg/kg，曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白中ccl11的重量百分比是10％)、曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白4mg/kg、曲妥珠单抗lc-ccl11融合蛋白4mg/kg和曲妥珠单抗hc-linker-ccl11融合蛋白4mg/kg。然后每周给药1次，共4次。每次给药时测量瘤体积，称小鼠重量。肿瘤体积测量按(长
×
宽
×
宽/2)计算。在接种细胞第27天结束实验，引颈脱臼处死小鼠，摘眼球取血，收集小鼠血液，并解剖小鼠，记录肿瘤重量、脾脏重量大小，同时，记录各组肿瘤照片。实验结果如图5和表1所示。其中，表1显示在不同时间点曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白和曲妥珠单抗对b16/her-2肿瘤生长的抑制率。数据表明曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白对肿瘤生长的抑制效果要优于曲妥珠单抗的效果。
[0200]
表1.不同时间点曲妥珠单抗融合蛋白和曲妥珠单抗对b16/her-2肿瘤生长的抑制率
[0201][0202]
结果与分析
[0203]
图5显示，与对照组小鼠肿瘤平均体积相比，曲妥珠单抗hc-ccl11融合蛋白能显著抑制b16/her-2肿瘤在小鼠体内的生长，具有统计学意义(p值《0.01)。曲妥珠单抗对b16/her-2肿瘤生长有些影响，但与对照组相比，没有统计学差异。此外，本发明的曲妥珠单抗-ccl11融合蛋白中的各部分具有协同作用，不仅优于ccl11或曲妥珠单抗单独施用的效果，也优于曲妥珠单抗和ccl11的联合使用效果。
[0204]
讨论：
[0205]
近期研究显示，嗜酸性粒细胞在抑制肿瘤生长的过程中发挥了显著的作用，其可以通过直接和间接机制介导抗肿瘤反应，嗜酸性粒细胞能够分泌细胞毒蛋白(碱性蛋白mbp，嗜酸性粒细胞阳离子蛋白ecp，嗜酸性粒细胞衍生神经毒素edn)来诱导肿瘤细胞死亡。另外嗜酸性粒细胞可通过il-12、il-10、nk细胞、ifnγ、cd8 t细胞等途径间接介导抗肿瘤作用。(sharon grisaru-tal，a new dawn for eosinophils in the tumour microenvironment，nat rev cancer.2020jul 16)研究显示，lmp胰腺癌肿瘤和braf黑色素瘤模型中发现了大量嗜酸性粒细胞浸润，这对后续肿瘤免疫将起到很大作用。(allen b m,systemic dysfunction and plasticity of the immune macroenvironment in cancer models.nature medicine,2020:1-10.)在大量黑色素瘤患者中已证实绝对嗜酸性粒细胞计数(aec)与黑色素瘤患者的预后呈正相关。(martens,a.et al.baseline peripheral blood biomarkers associated with clinical outcome of advanced melanoma patients treated with ipilimumab.clin.cancer res.22,2908
–
2918(2016).)
[0206]
在体内，ccl11对嗜酸性粒细胞的调控起到了重要的作用。主要可分为以下两大途径：一是诱导嗜酸性粒细胞向肿瘤微环境趋化(lorena,s eotaxin expression in oral squamous cell carcinomas with and without tumour associated tissue eosinophilia.oral.dis.9,279
–
283(2003))；二是增强嗜酸性细胞介导的肿瘤杀伤作用(simson,l.regulation of carcinogenesis by il-5and ccl11:a potential role for eosinophils in tumor immune surveillance.j.immunol 178,4222
–
4229(2007))。在结直肠癌活检切片中观察到了ccl11的表达与肿瘤浸润嗜酸性粒细胞具有统计学的正相关性，在相应的动物模型中也得到了相同的结论。(eosinophils in colorectal neoplasms associated with expression of ccl11 and ccl24.j.pathol.transl.med.50,45
–
51(2016))肿瘤微环境中的ccl11将有助于嗜酸性粒细胞参与肿瘤微环境中的免疫识别与肿瘤杀伤。
[0207]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。