一种基于减毒李斯特菌的肿瘤疫苗的制备和应用的制作方法

1.本公开主要涉及生物技术领域。具体来说，本公开提供一种个性化肿瘤疫苗的制备和应用。更具体来说，本公开提供一种基于减毒李斯特菌的多靶点个性化肿瘤疫苗的制备和应用。


背景技术：

2.近年来，随着对于机体抗肿瘤免疫应答、肿瘤免疫逃逸机制、肿瘤微环境等的深入探索，个性化肿瘤免疫疗法成为了癌症研究的一个非常活跃的领域[1]。目前肿瘤的个性化免疫治疗的主要研究方向有肿瘤免疫检查点抑制剂、过继性细胞免疫疗法、溶瘤病毒和肿瘤疫苗[2]。肿瘤免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，icis)通过消除免疫抑制因子而诱导有效的抗肿瘤免疫应答，目前在临床治疗中已显示令人振奋的结果，但ici作为单一药物对各种癌症患者的反应率较低[3-4]。过继性细胞免疫治疗(adoptive cell transfer,act)通过从肿瘤患者中分离免疫活性细胞，在体外扩增和功能鉴定，然后向患者传输，直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤，但act对合适靶点的选择要求非常高，细胞体外培养扩增后回输的成本也颇为不菲[5-6]。溶瘤病毒是一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，能选择性感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中复制继而杀伤肿瘤细胞，并刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应。目前如何找到能发挥最大抗癌效果的安全剂量和如何找到合适的生物标志物来筛选病人成为溶瘤病毒急需攻克的难题[7]。肿瘤疫苗通过表达特异性的、具有免疫原性的肿瘤抗原(如：多肽、dna和rna等)，在细胞因子、趋化因子等佐剂的辅助下，克服肿瘤引起的免疫抑制状态，激活或加强机体自身抗肿瘤免疫，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，进而杀伤和清除肿瘤细胞[8]。而制约肿瘤疫苗发展的主要原因是机体对于自身抗原的免疫原性弱且容易造成肿瘤免疫耐受和免疫逃逸。新生抗原是由肿瘤细胞基因突变产生，不仅具有肿瘤特异性，而且具有很强的免疫原性，能够诱发t细胞的免疫应答，因此发展新生抗原是个性化肿瘤疫苗研发的重要方向[9]。然而个性化治疗中往往会挑选多个评分较高的新生抗原作为靶点进行治疗，因此个性化肿瘤疫苗载体是否能高效负载多个靶点成为技术实施的关键。
[0003]
与此同时，现有技术中存在的肿瘤治疗方案同样存在着如下缺陷：
[0004]
对于肿瘤免疫检查点抑制剂，其无法专一地激活肿瘤特异性t细胞应答并ici作为单一药物对各种癌症患者的反应率较低；对于过继性细胞免疫疗法，其对合适靶点的选择要求非常高，不能有效的识别肿瘤细胞，且细胞体外培养扩增后回输的成本昂贵；而对于溶瘤病毒，其病毒毒副作用发生机制尚不清楚，机体免疫系统对溶瘤病毒的应用影响甚大。
[0005]
现有技术文献：
[0006]
[1]topalian s l,weiner g j,pardoll d m.cancer immunotherapy comes of age.[j].nature clinical practice oncology,2011,2(3):115.
[0007]
[2]yoshitaro shindo,shoichi hazama,ryouichi tsunedomi.novel technologies and emerging biomarkers for personalized cancer immunotherapy
[j].journal for immunotherapy of cancer,2016,4(1):3.
[0008]
[3]koji k.advances in cancer immunotherapy for gastroenterological malignancy[j].annals of gastroenterological surgery,2018,2(4):244-245.
[0009]
[4]hodi f s,o'day s j,mcdermott d f,et al.improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma[j].new england journal of medicine,2010,363(8):711-723.
[0010]
[5]rosenberg s a,restifo n p,yang j c,et al.adoptive cell transfer:a clinical path to effective cancer immunotherapy[j].nature reviews cancer,2008,8(4):299-308.
[0011]
[6]rosenberg s a,restifo n p.adoptive cell transfer as personalized immunotherapy for human cancer[j].science,2015,348(6230):62-68.
[0012]
[7]lun x,yang w,alain t,et al.myxoma virus is a novel oncolytic virus with significant antitumor activity against experimental human gliomas.[j].cancer research,2005,65(21):9982-9990.
[0013]
[8]chakraborty n g,chattopadhyay s,mehrotra s,et al.regulatory t-cell response and tumor vaccine-induced cytotoxic t lymphocytes in human melanoma[j].human immunology,2004,65(8):0-802.
[0014]
[9]ott p a,hu z,keskin d b,et al.an immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma[j].nature,2017,547(7662):217.


技术实现要素：

[0015]
发明要解决的问题
[0016]
本发明构建一种以李斯特菌为基础的非整合质粒表达多种抗原肽的多靶点肿瘤疫苗，提高肿瘤抗原免疫原性，并在体内充分激活多种肿瘤特异性t细胞，同时识别某一肿瘤的多个靶点或识别多种肿瘤的不同靶点，提高肿瘤疫苗的疗效并为新生抗原个性化肿瘤疫苗的应用奠定基础。
[0017]
用于解决问题的方案
[0018]
本公开提供了如下技术方案。
[0019]
(1)一种重组核酸分子，其包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(llo)多肽的异源性抗原，其中，所述异源性抗原的氨基酸序列为如seq id no:2所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如seq id no:2所示的异源性抗原的活性的多肽。
[0020]
(2)根据(1)所述的重组核酸分子，其中，所述异源性抗原的氨基酸序列为和seq id no:2所示的氨基酸序列相比，具有至少80％同一性的序列。
[0021]
(3)根据(1)-(2)任一项所述的重组核酸分子，其中，编码所述异源性抗原的核苷酸序列为如seq id no：1所示的序列。
[0022]
(4)根据(1)-(3)任一项所述的重组核酸分子，其中，所述重组核酸分子的序列为如seq id no：4所示的序列。
[0023]
(5)一种重组质粒或重组表达载体，其包含(1)-(4)任一项所述的重组核酸分子的
序列。
[0024]
(6)一种重组蛋白，其由(1)-(4)任一项所述的重组核酸分子编码，或由(5)所述的重组质粒或重组表达载体形成。
[0025]
(7)一种重组李斯特菌，其含有如(1)-(4)任一项所述的重组核酸分子，或含有(5)所述的重组质粒或重组表达载体，或表达如(6)所述的重组蛋白。
[0026]
(8)一种药物组合物，其含有治疗有效量的，根据(7)中所述的重组李斯特菌。
[0027]
(9)一种预防或治疗性疫苗，其特征在于，该疫苗包含预防或治疗有效量的，根据(7)所述的重组李斯特菌。
[0028]
(10)根据(7)所述的重组李斯特菌，(8)所述药物组合物或(9)所述的疫苗在制备用于杀死细胞的药物中的应用。
[0029]
(11)根据(10)所述的应用，其中，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；优选的，所述细胞选自转移性的细胞；更优选的，所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
[0030]
(12)根据(7)所述的重组李斯特菌，(8)所述药物组合物或(9)所述的疫苗在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的应用。
[0031]
(13)—种持续杀伤细胞的方法，包括将所述细胞与(7)所述的重组李斯特菌，(8)所述药物组合物或(9)所述的疫苗接触；优选的，所述细胞为肿瘤细胞。
[0032]
(14)一种在受试者中诱导免疫应答的方法，其特征在于该方法包含对受试者施用：(7)所述的重组李斯特菌，(8)所述药物组合物或(9)所述的疫苗。
[0033]
(15)一种分离的肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自存在保守突变的，并且包含与seq id no：2或seq id no：4的氨基酸序列具有至少80％同一性的序列；或所述氨基酸序列选自如seq id no：2或seq id no：4所示的序列。
[0034]
(16)一种用于编码(15)所述分离的肽的核苷酸序列。
[0035]
发明的效果
[0036]
本专利提供了一种非整合质粒同时表达多种抗原肽的李斯特菌个性化多靶点肿瘤疫苗方法。
[0037]
在一种实施方式中，该方法的优势在于携带多个肿瘤抗原靶点的李斯特菌，可以提高抗肿瘤免疫应答。
[0038]
在另一种实施方式中，该方法还能够同时激活体内多种肿瘤特异性t细胞，识别某一肿瘤的多个靶点或识别多种肿瘤的不同靶点，进而在受试者中诱导多靶点免疫应答。
[0039]
在另一种实施方式中，该方法能够提高肿瘤疫苗的疗效，并推动新生抗原个性化肿瘤疫苗的发展。
附图说明
[0040]
图1示出了李斯特菌表达抗原基因的质粒图谱；
[0041]
图2示出了菌落pcr检测lm-llo
267-ma2疫苗目的序列的检测结果，其中，m示出了500bp dna条带参照物；line 1-3分别示出了lm 10403s
△
acta(pam401-llo
267-ma2-his)pcr产物；
[0042]
图3示出了western blot验证lm-llo
267-ma2疫苗的蛋白表达情况；
[0043]
图4示出了elispot验证正常小鼠对lm-llo
267-ma2疫苗特异性免疫反应的激活结果；
[0044]
图5示出了肿瘤生长曲线；
[0045]
图6示出了细胞治疗后7天elispot反应结果。
具体实施方式
[0046]
定义
[0047]
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
[0048]
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
[0049]
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
[0050]
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
[0051]
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
[0052]
当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“降低”或“防止”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如癌症治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。
[0053]
本公开中的疫苗接种方法可用于治疗哺乳动物的癌症。本公开使用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌(例如脑癌、乳癌、肝癌、胃癌、肺癌和结肠癌)及白血病。
[0054]
本公开中的术语“哺乳动物”是指人以及非人类哺乳动物。
[0055]
本公开的所述方法包括将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的疫苗给予哺乳动物。本公开使用的术语“预存免疫力”意指包括通过用抗原接种诱导的免疫力以及哺乳动物内天然存在的免疫力。
[0056]
本公开中的术语“ova”是指鸡卵白蛋白(ovalbumin)，也称鸡卵清白蛋白，由386个氨基酸组成，其分子量约45kd。
[0057]
本公开中的术语“phly”是编码llo(溶菌素，listeriolysion o)基因的启动子。
[0058]
本公开中的术语“疫苗”是将病原微生物(如细菌等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防疾病的免疫制剂。
[0059]
本公开中的术语“放疗剂”包括使用引起dna损伤的药物。放疗已广泛用于癌症和疾病治疗，并且包括通常称为γ射线、x射线的那些和/或将放射性同位素定向递送至肿瘤细胞。
[0060]
本公开中的术语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生
素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂、抗-孕酮、雌激素受体下调剂、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、egfr抑制剂、vegf抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。
[0061]
本公开中的术语“免疫治疗剂”包括“免疫调节剂”和促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。其中，“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导t细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性t细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性t细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于pd-1、pd-l1、pdl2、ctla4、lag3、tim3、tigit和cd103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，等等。pd-1靶向抑制剂包括经批准的药物试剂派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)，而易普利姆玛(ipilimumab)是经批准的ctla-4抑制剂。对pd-l1、pd-l2、lag3、tim3、tigit和cd103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
[0062]
本公开中的术语“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸”包括“保守突变”。本公开中的术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性例子为保守置换。保守置换是指，例如，在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在phe、trp、tyr间相互置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在leu、ile、val间相互置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在gln、asn间相互置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在lys、arg、his间相互置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在asp、glu间相互置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在ser、thr间相互置换的突变。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出ala向ser或thr的置换、arg向gln、his或lys的置换、asn向glu、gln、lys、his或asp的置换、asp向asn、glu或gln的置换、cys向ser或ala的置换、gln向asn、glu、lys、his、asp或arg的置换、glu向gly、asn、gln、lys或asp的置换、gly向pro的置换、his向asn、lys、gln、arg或tyr的置换、ile向leu、met、val或phe的置换、leu向ile、met、val或phe的置换、lys向asn、glu、gln、his或arg的置换、met向ile、leu、val或phe的置换、phe向trp、tyr、met、ile或leu的置换、ser向thr或ala的置换、thr向ser或ala的置换、trp向phe或tyr的置换、tyr向his、phe或trp的置换、及val向met、ile或leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
[0063]
本公开中的“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸插入或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸插入或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残
基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
[0064]
在本公开的一个技术方案中，所述ma2抗原肽序列和如seq id no：2所示的ma2抗原肽序列相比，具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性(包括这些数值之间所有范围和百分数)。本公开中，ma2抗原肽序列具有特定百分数的同一性指的是，ma2抗原肽仍然存在其抗原活性时，编码所述ma2抗原肽的序列。
[0065]
本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(current protocols in molecular biology，wiley出版)”，“分子克隆实验指南(molecular cloning：a laboratory manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
[0066]
在本公开中，不同序列编号所示的核苷酸或氨基酸的编号的含义如下：
[0067]
seq id no：1所示的序列是ma2抗原肽的核苷酸序列；
[0068]
seq id no：2所示的序列是ma2抗原肽的氨基酸序列；
[0069]
seq id no：3所示的序列是llo267-ma2的核苷酸序列；
[0070]
seq id no：4所示的序列是llo267-ma2的氨基酸序列。
[0071]
实施例
[0072]
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
[0073]
除非有特别说明，否则本公开中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。
[0074]
实施例1：携带非整合的以g4s序列为连接序列连接多个抗原肽质粒的减毒李斯特菌菌株及载体的构建
[0075]
本研究中用做疫苗的菌株采用的是lm 10403sδacta。前述菌株的制备方法可示例性的参见如下文献：shen h et.al.，pnas，92(9):3987-91，1995。该菌缺失acta基因，使得侵染宿主细胞的菌体不能通过其特有的肌动蛋白尾向临近细胞传播扩散，从而大大减弱其毒性及致病性。相比野生型菌株lm 10403s(ld
50
为1x 104)，lm-δacta的ld
50
为0.5-1x108，被证明是高度减毒的。
[0076]
本研究用做表达抗原基因的质粒基本构成如下：(如图1所示)
[0077]
(1)维持质粒复制稳定的基本序列：pam401；
[0078]
(2)转录抗原基因的启动子：phly，即lm染色体上毒力岛llo的启动子；
[0079]
(3)表达分泌抗原蛋白到李斯特菌外的信号肽序列：llo signal peptide(llo1-28 aa)及llo半截断基因，用于增加外源蛋白的表达量；
[0080]
(4)李斯特菌属于原核细胞，而通常需要用作肿瘤疫苗的抗原肽属于真核细胞，需要进行相应密码子优化方能在原核细胞中表达真核细胞蛋白；
[0081]
(5)检测分泌蛋白的标签序列：flag tag或his tag；
[0082]
用于抗原肽插入的酶切位点：psti。
[0083]
实施例2：抗原肽质粒的构建
[0084]
构建李斯特菌疫苗质粒需要将抗原基因插入到质粒载体中，载体上已设计有酶切位点，目的抗原的基因序列通过公司进行基因密码子优化后合成。以g4s为linker连接小鼠2个抗原肽的组合物具体如下，组合物包含ovalbumin 257-264、tyrosinase related protein-2 180-188抗原肽，简称ma2。
[0085]
我们使用基于一定同源序列的同源重组技术将产物克隆到pam401-phly-llo
1-28-llo
22-267-psti-llo
524-529-his载体(简称psti载体质粒)上psti位点，获得pam401-phly-llo
1-28-llo
22-267-psti-ma2-psti-llo
524-529-his，简称pam401-llo
267-ma2载体质粒，并制备lm-llo267-ma2疫苗。
[0086]
同源序列为：5’端同源序列(ccgaaatatagtaataaactgcag)；3’端同源序列(ctgcaggtagataatccaatcgaa)
[0087]
主要步骤如下：
[0088]
psti载体质粒20μl psti单酶切体系：
[0089]
psti质粒2ugpsti限制性内切酶(neb)2μl10x nebuffer 3.12μl去离子水补齐至20μl
[0090]
37℃水浴锅，反应30min。
[0091]
将20μl酶切产物进行dna回收纯化，即酶切线性化psti载体
[0092]
同源重组20μl体系：
[0093][0094]
ddh2o：补齐至20μl
[0095]
37℃水浴30分钟，立即置于冰上5分钟，全部转化100μl e.coli感受态，涂布抗性平板，筛选单克隆进行测序验证。
[0096]
实施例3：携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌的制备
[0097]
测序验证正确的质粒通过电转化技术，转化到减毒李斯特菌株中，挑选单克隆进行后续质粒及表达验证。
[0098]
电转化具体步骤如下：
[0099]
(1)电转化感受态的制备
[0100]
a)过夜培养的李斯特菌转接到bhi培养基中，37℃振荡培养至od
600
值0.2-0.25；
[0101]
b)加入png继续培养约两个小时，到od
600
到0.3-0.9；
[0102]
c)冰浴10分钟后，5000g离心收集菌体；
[0103]
d)用200ml甘油重悬菌体，洗两次；
[0104]
e)用45ml甘油重悬菌体，并加入无菌的溶菌酶溶液，37℃水浴20分钟；
[0105]
f)在4℃环境下，5000g离心收集菌体，再用20ml甘油洗涤菌体一次；
[0106]
g)用1ml甘油重悬菌体，50μl/管分装保存。
[0107]
(2)确定最适电转化条件：
[0108]
a)取一管感受态细胞，用手心化冻，置于冰上；
[0109]
b)将待转的质粒加入感受态细胞中，混匀，冰浴5分钟。
[0110]
c)上述混合体系加入预冷的1mm电转杯中，进行电击处理；
[0111]
d)立即加入bhi培养基，混匀，取出到ep管中；
[0112]
e)将菌体涂布bhi 抗性平板，37℃倒置培养，挑取单菌落验证。
[0113]
实施例4：携带非整合抗原肽质粒的减毒李斯特菌外源蛋白表达的改进及检测
[0114]
经bhi液体培养基37℃培养过夜的李斯特菌，离心去除菌体，上清以3倍体积的10％tca(三氯乙酸)/丙酮溶液混匀，沉淀-20℃过夜。15000rpm离心30分钟收集沉淀蛋白，冰预冷丙酮洗涤两次，去除残留tca。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用含0.01n naoh的蛋白上样缓冲液溶解沉淀。煮沸变性蛋白后上样通过蛋白所接的flag tag或his tag进行western blot检测蛋白表达量。
[0115]
将表达高的菌株收集加入dmso冻存液，制备成lm-llo267-ma2疫苗，在-80℃条件下保存。
[0116]
实施例5：elispot验证正常小鼠对ma2疫苗特异性免疫反应的激活情况
[0117]
取三只正常c57小鼠尾静脉接种lm-llo267-ma2疫苗，免疫第7天，取小鼠全部外周血，裂解红细胞，pbs洗两次获得外周血单个核细胞，使用1ml 1640完全培养基重悬待用。取其淋巴结、脾脏，研磨过滤网，将收集的细胞进行cd8-pe染料染色，pbs洗两次，将收集细胞与anti-pe磁珠共同冰上孵育，离心收集后过磁力柱，和anti-pe磁珠结合的细胞被吸附在磁力柱上，随后从磁力架上去下磁力柱，收集目的细胞，即cd8 t细胞。分别将淋巴结t细胞、脾脏t细胞用1640完全培养基重悬，以每孔100μl接入elispot预处理孔板中，随后加入小鼠外周血单个核细胞100μl每孔。之后通过在elispot孔板中分别加入tyrosinase related protein-2 180-188多肽、ovalbumin 257-264多肽刺激t细胞产生inf-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应tyrosinase related protein-2 180-188多肽和ova多肽的特异性免疫反应情况(具体elispot实验流程参照bd
tm elispot mouse ifn-γelispot set说明书，产品货号551083)。
[0118]
实施例6：ma2疫苗的分子鉴定
[0119]
将构建的llo
267
连接ma2的载体质粒电转化至lm感受态中，将菌体涂布bhi氯霉素平板，37℃培养箱倒置培养后待长出单菌落，对各组单菌落进行菌落pcr验证。
[0120]
实验结果如图2所示，实验组出现明显符合实际大小的目的产物。表明质粒已电转化至lm感受态中，可用于疫苗制备。
[0121]
实施例7：lm-llo
267-ma2疫苗表达验证
[0122]
为了准确检测lm-llo
267-ma2疫苗的蛋白表达情况，我们通过培养不同单菌落进行上清蛋白沉淀通过western blot实验验证。具体过程：挑取ma2的1号和2号菌落加入至含氯霉素抗性bhi培养液中，摇床培养14-16h，随后4500rpm离心沉淀菌体。取上清10ml以tca/丙酮溶液混匀，沉淀过夜。15000rpm离心收集沉淀蛋白，预冷丙酮洗涤两次，去除残留tca。通风橱里挥发掉多余的丙酮，用蛋白上样缓冲液溶解沉淀，煮沸变性后保存。
[0123]
分别配制10％的分离胶和4％的浓缩胶，每孔上样20μl，80v电泳样品跑至浓缩胶分离胶交接处改为120v。待电泳完成后，取分离胶，将滤纸和0.22um pvdf膜(预先甲醇中激活)剪成与胶同样大小，进行转膜冰浴。5％脱脂牛奶tbst封闭，tbst洗涤3次。使用hrp标记的anti-his抗体室温孵育，tbst洗涤3次。在pvdf膜上滴加ecl显影液，bio-rad凝胶成像仪进行显影。
[0124]
实验结果如图3，lm-llo
267-ma2疫苗有明显的蛋白表达。
[0125]
实施例8：验证lm-llo
267-ma2中以g4s序列为连接序列连接的多个抗原肽在体内被特异性的抗原提呈，激活特异性的t细胞
[0126]
我们取三只正常小鼠尾静脉注射lm-llo
267-ma2疫苗，免疫7天后，取小鼠外周血和淋巴结t细胞、脾脏t细胞在elispot孔板中共培养，以ovalbumin 257-264、tyrosinase related protein-2 180-188多肽为刺激物，如g4s序列为连接序列连接的多个抗原肽能被特异性提呈现象，则会激活特异性cd8 t细胞分泌inf-γ干扰素进而在elispot中显示出斑点，以未加任何多肽刺激的共培养细胞为阴性对照。具体过程：取三只正常c57小鼠尾静脉接种lm-llo
267-ma2疫苗，免疫第7天，取小鼠全部外周血，裂解红细胞，pbs洗两次获得外周血单个核细胞，使用1640完全培养基重悬待用。取其淋巴结、脾脏，研磨过滤网，将收集的细胞进行cd8-pe染料染色，pbs洗两次，将收集细胞与anti-pe磁珠共同冰上孵育，离心收集后过磁力柱，和anti-pe磁珠结合的细胞被吸附在磁力柱上，随后从磁力架上去下磁力柱，收集目的细胞，即cd8 t细胞。分别将淋巴结t细胞、脾脏t细胞用1640完全培养基重悬，以每孔100μl接入elispot预处理孔板中，随后加入小鼠外周血单个核细胞100μl每孔。之后通过在elispot孔板中分别加入tyrosinase related protein-2 180-188多肽、ovalbumin 257-264多肽刺激t细胞产生inf-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应ova多肽的特异性免疫反应情况(具体elispot实验流程参照bd
tm elispot mouse ifn-γelispot set说明书，产品货号551083)。
[0127]
实验结果如图4，ovalbumin 257-264、tyrosinase related protein-2 180-188多肽为刺激物的elispot有明显的斑点反应，证明lm-llo
267-ma2中以g4s序列为连接序列连接的多个抗原肽在体内被特异性的抗原提呈，进而激活特异性的cd8 t细胞分泌inf-γ干扰素，为体内抗肿瘤多靶点个性化免疫反应提供直接证据。
[0128]
实施例9：证明lm-llo
267-ma2中以g4s序列为连接序列连接的多个抗原肽激活多种特异性的cd8 t细胞在体内杀伤肿瘤细胞的有效性
[0129]
取15只c57小鼠皮下接种b16-ova产生肿瘤，注射lm-llo
267-ma2疫苗验证抗肿瘤效果。b16-ova细胞接种量为2
×
106，在接种后第4天开始进行肿瘤测量。根据肿瘤大小将15只小鼠均一的分成三组如下：
[0130]
[0131][0132]
在第9天进行pbs对照组、llo
267
对照组、ma2实验组疫苗注射，持续观察肿瘤大小。肿瘤持续跟踪测量23天。
[0133]
肿瘤曲线见图5，pbs对照组、llo
267
对照组小鼠肿瘤随着时间的增加不断增长，ma2实验组从12天开始肿瘤生长相对缓慢，有明显的肿瘤抑制效果。
[0134]
实施例10：利用elispot从功能学检测lm-llo
267-ma2对b16-ova肿瘤模型小鼠体内肿瘤特异性免疫反应的激活情况
[0135]
我们在细胞治疗注射后第7天通过尾静脉取血3-7滴，裂解红细胞，pbs洗两次获得外周血单个核细胞，最终分别使用100μl的1640完全培养基重悬细胞加入elispot预处理孔板中。随后通过在elispot孔板中加入ova257-264、trp-2 180-188多肽刺激外周血单个核细胞产生inf-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应ova多肽的特异性免疫反应情况(具体elispot实验流程参照bd
tm elispot mouse ifn-γelispot set说明书，产品货号551083)。
[0136]
实验结果如图6，pbs对照组、llo
267
对照组无或者有少量的elispot斑点反应，ma2实验组以ova257-264多肽、trp-2 180-188多肽刺激的实验组均有明显的elispot反应，表明lm-llo
267-ma2以g4s序列为连接序列连接的多个抗原肽在体内都能被特异性的抗原提呈，从而识别肿瘤的多个靶点并激活小鼠多种特异性的cd8 t细胞杀伤肿瘤细胞，提高肿瘤疫苗的疗效。
[0137]
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。