一种三维流动培养装置、系统及分析方法

2-1上的大孔进入培养孔板3-3的一个孔单元中，最后由灌注单元3-2-1上的小孔流出孔层3-2，回到流道层3-1中第i行第j 1列的灌注流道单元3-1-4，最后经过液体流出通道3-1-5，从液体出口3-1-6流出。灌注单元3-2-1上的小孔半径为r2，灌注单元3-2-1上的大孔半径为r1。
9.进一步的，所述的灌注流道单元3-1-4中流道宽度逐渐由小变大，且两端形状为半圆圆弧。所述的灌注孔单元3-2-1为一半径为r的柱形凸起，柱形凸起中贯通设置两个孔，其中一个孔的半径与灌注流道单元3-1-4中流道宽度大的端部半圆圆弧的半径r1相同，另一个孔的半径与灌注流道单元3-1-4中流道宽度小的端部半圆圆弧的半径r2相同。柱形凸起插入所述孔板3-3的孔单元中，且柱形凸起端面与孔单元底面留有空间，为待培养的物质提供培养空间。
10.进一步的，流道层3-1的灌注流道单元3-1-4、孔层3-2的灌注孔单元3-2-1和培养孔板3-3的孔单元对准；其中，第i行第j列的灌注流道单元3-1-4半径为r1的半圆圆弧和第i 1行第j列灌注孔单元3-2-1半径为r1的孔的下半圆弧对准，第i行第j列的灌注流道单元3-1-4半径为r2的半圆圆弧和第i行第j列灌注孔单元3-2-1半径为r2的孔的上半圆弧对准，灌注孔单元3-2-1半径为r的柱形凸起和培养孔板3-3的孔单元对准。
11.进一步的，孔层3-2的灌注孔单元3-2-1的设计方式为如下两种方式之一；
12.第一种：半径为r1的液体流入孔和半径为r2的液体流出孔的孔深相同，都等于半径为r的柱形凸起高度h2和孔层底面厚度h3之和，即h2 h3；
13.第二种：半径为r1的液体流入孔的孔深为h2 h3 h4，半径为r2的液体流出孔的孔深仅为h2 h3。h4为流入孔高出柱形凸起的高度；
14.进一步的，灌注孔单元3-2-1中，参数l1表示培养孔板3-3两个相邻孔中心的距离，柱形凸起的半径r比培养孔板3-3的孔半径大0.5至1毫米，液体流出孔半径r2略小于待培养物质的等效半径，h2 h4小于培养孔板3-3孔的深度；同时，r1、r2、h2、h3和h4的选取需满足能使液体充分充满培养孔板3-3的孔内空间，且不产生紊乱的流动影响待培养物质的生长；r1、r2、h2、h3和h4的数值可通过流体力学仿真和实验测量进行选取和优化；h1的选取由通入液体的通量决定，通量小时h1取值小例如，几十到几百微米，通量大时h1取值可达几百微米至几十毫米。
15.进一步的，流道层3-1可设计多个液体入口3-1-1，其连接的分流通道3-1-2可根据实际需求设计复杂流道形状如“圣诞树”型，将液体入口与不同的灌注流道单元3-1-4相连，实现向培养孔板3-3的不同孔单元中灌注不同种类或浓度的溶液。利用流体力学中集中参数模型仿真辅助设计灌注流道形状。
16.进一步的，培养孔板3-3为平底的细胞培养的384孔板，或者pcr 384孔板、96孔板、48孔板；流道层和孔层的设计尺寸包括l1、l2、r1、r2、h1等依据孔板的尺寸进行选择和调整。
17.一种三维流动培养装置的制作方法，所述的制作方法包括以下四个主要步骤：
18.步骤一：利用3d打印或其它精密微纳加工技术制作流道层3-1和孔层3-2的阳模，其中流道层3-1和孔层3-2中的流道和通孔在阳模中为凸起区域，而孔层3-2的柱形凸起在阳模中为凹槽；
19.步骤二：基于阳模利用翻模法制作pdms流道层3-1和孔层3-2；
20.步骤三：利用等离子体处理pdms流道层3-1和孔层3-2表面，在显微镜下进行两层
结构对准，键合，并在烘箱内烘烤直至两层pdms紧密粘合在一起。
21.步骤四：将键合后构成的pdms装置与培养孔板3-3组装，使孔层4-2的所有柱形凸起卡入培养孔板3-3的孔中。
22.一种三维流动培养系统，所述的三维流动培养系统包括细胞培养箱、多通道流体控制泵1、液体灌注系统2、三维流动培养装置3、显微镜和图像采集系统4以及计算机5。
23.进一步的，由流体控制泵1通过液体灌注系统2可连接很多个三维流动培养装置3，从而实现在很多个孔板中同时进行组织和类器官的培养，有效提高培养通量和药物检测通量。
24.一种三维流动培养分析方法，具体步骤如下：
25.步骤一：利用溶液如聚(甲基丙烯酸-2-羟乙酯)poly-hema溶液处理培养孔板3-3底面，使形成疏水的、细胞不贴附的表面；
26.步骤二：向液体灌注系统2中的试管内加入培养物质的溶液或待测药物；
27.步骤三：向培养孔板3-3中加入待培养的物质，并将流道层3-1和孔层3-2与孔板3-3组装构成三维流动培养装置3；通过导管将液体控制泵1出口和含有溶液的试管口相连，将试管的另一个出口与三维流动培养装置3的流体入口相连，最后将三维流动培养装置3的流体出口和储存废液的试管口相连；
28.步骤四：将三维流动培养装置3放置于细胞培养箱中进行培养；
29.步骤五：控制多通道流体控制泵1的运行，进行定时、定量地向三维流动培养装置3中输送培养物质的溶液或待测药物；
30.步骤六：通过显微镜和图像采集系统4进行待培养的物质的实时观测和图像采集；
31.步骤七：利用计算机5中的图像分析算法和软件分析培养过程。
32.所述的待培养的物质包括：悬浮细胞、三维生物组织、类器官、线虫、斑马鱼等生物医学中常用的细胞和动物模型。
33.本发明的有益效果：1)本发明所设计的三维流动培养装置由细胞培养孔板和双层pdms硅胶盖构成；细胞培养孔板(如384孔板)是生物医学领域最常用的细胞和组织培养装置，成本低廉；硅胶盖采用翻模法制作，材料为聚二甲基硅氧烷(pdms)，制作流程简单，成本低廉；且硅胶盖与孔板通过卡入式组装，可拆卸，使用方便灵活；2)通过硅胶盖、灌流系统和流体泵能实现编程控制孔板内物质运输和更换，同时避免孔板内悬浮培养的细胞和组织等物质随液体流出孔板，提高了培养流程的自动化和可控性；3)便于实现同时按需向多个孔板内进行营养物质和药物输运，极大地提高了培养通量和药物检测通量；能够实现在不同时间点的有序药物输运和动态药物检测。
附图说明
34.图1是生物体(如组织和类器官)的三维流动培养系统示意图；
35.图2是三维流动培养装置的爆炸图，以及装置中重复单元结构和其中液体流动方向的三维示意图；
36.图3是三维流动培养装置中流道层结构示意图和设计参数；
37.图4是三维流动培养装置中孔层结构示意图和设计参数；
38.图5是三维流动培养装置的孔层中灌流孔单元的截面图；其中，(a)为方式一，(b)
为方式二；
39.图6是流动层和孔层的对准示意图；其中，实线表示流道层，虚线表示孔层；
40.图7(a)是实施例一中所用的赛默飞世尔公司的384孔板及尺寸示意图；
41.图7(b)和图7(c)是基于comsol流体力学仿真得到的一个培养孔内的液体流线；
42.图1中：1流体控制泵；2灌流系统；3三维流动培养装置；4显微镜和图像采集系统；5计算机。
43.图2中：3-1流道层；3-2孔层；3-3培养孔板；
44.图3中：3-1-1液体入口；3-1-2分流通道；3-1-3灌注流道模块；3-1-4灌注流道单元；3-1-5流出通道；3-1-6液体出口；
45.l1灌注流道单元尺寸；l2流入孔和流出孔间距；r1流入孔半径；r2流出孔半径；h1流道高度。
46.图4中：3-2-1灌注孔单元；
47.l1灌注孔单元尺寸；r1流入孔半径；r2流出孔半径；r柱形凸起半径；d1流入孔圆心距离灌注孔单元中心的距离；d2流出孔圆心距离灌注孔单元中心的距离；h2柱形凸起高度；h3孔层底面厚度。
48.图5中：r1流入孔内半径；r2流出孔内半径；r3流入孔外半径；r柱形凸起半径；h2柱形凸起高度；h3孔层底面厚度；h4流入孔高出柱形凸起的高度。
49.图6：l1流道层灌注流道单元尺寸和孔层灌注孔单元尺寸。
具体实施方式
50.下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
51.实施例1
52.选取美国赛默飞世尔科技有限公司(thermo fisher)的384细胞培养孔板(货号：165195)作为装置第三层。该384孔板的每个孔形状为长方体，尺寸参数如图7(a)所示。设计如图2、图3、图4、图5(中的(a))所示的生物组织和类器官的培养装置；其中受孔板形状影响，pdms孔层设计长方体形凸起而非柱形凸起，即将图4和5中半径为r的柱形凸起改为长方体形凸起，长方体凸起的横截面为边长r的正方形，凸起的高度为h2；具体设计参数如下表所示。
53.r10.2mmr20.7mmr3.8mmd12mmd21mml18.3mmh10.5mmh27.1mmh33mm
54.表1：实施例1中装置的设计参数
55.液体通过长方体凸起上半径为r2的孔流入孔板中，然后从半径为r1的孔流出，重新回到pdms流道层。基于comsol仿真计算可得到孔板中液体的流动情况，如图7(b)所示；液体能够充满孔板(包括到达孔的底部)，且流动较为平稳，因此上述设计参数基本符合要求。
56.实施例2
57.仍选取美国赛默飞世尔科技有限公司(thermo fisher)的384细胞培养孔板(货号：165195)作为装置第三层。设计如图2、图3、图4、图5(中的(b))所示的生物组织和类器官的培养装置；相较于实施例1，将液体流入孔的外围孔壁延伸至靠近孔板底部的位置，从而
使液体能够直达孔底，更好的充满整个孔板。此时，设计参数h2＝3mm和h4＝9mm，其它参数与实施例1相同。
58.基于comsol仿真计算可得到孔板中液体的流动情况，如图7(c)所示，此时流动更加平稳且液体能充分充满孔板，能起到较好的孔板内外物质运输效果。