禽流感病毒三聚体亚单位疫苗及其应用

1.本发明属于医药技术领域，涉及禽流感病毒三聚体亚单位疫苗及其应用。


背景技术：

2.流行性感冒病毒(influenza virus)，简称流感病毒。是正粘病毒科(orthomyxoviridae)的代表种，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型，是流感的病原体。
3.流感病毒是一种负链rna病毒，包含编码至少12种蛋白质的八个rna片段(pb2，pb1，pb1-f2，pa、pa-x、ha、na、np、m1、m2、ns1和ns2)。其中两种蛋白质，血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)，是细胞表面糖蛋白，使病毒能够分别进入(通过受体结合和膜融合)和逃离宿主细胞；由于ha和na容易在传播过程中发生突变，导致免疫原性发生改变，所以根据的ha和na抗原性区别，流感病毒又可以分为不同的亚型，例如h1n1、h5n1、h3n2等。
4.ha是病毒颗粒的主要表面抗原，也是病毒中和抗体(abs)的主要目标，ha是一种合成为单个多肽链(hao)的同源三聚体，随后被宿主细胞蛋白酶切割以达到具有融合能力的状态。因此，成熟的ha三聚体由ha1和ha2亚单位组成，它们在切割后通过一个二硫键保持交联。ha三聚体可分为两个结构和功能域，头部和茎，分别包括受体结合位点和融合机制。ha1亚单位形成膜远端的球状头部和膜近端茎部区的一部分。ha2亚单位代表茎部区的主要成分。ha的头部介导受体结合，而ha2亚单位代表茎部区是介导膜融合作用的主要部分。中和抗体反应主要针对ha的免疫显性结构域。然而，由于头部区域表位的高度遗传可塑性，抗体反应是毒株特异性的，缺乏与不同ha亚型的广泛交叉反应性。相比之下，ha茎部的序列和结构在不同的流感亚型中更加保守，广泛中和该结构域的抗体被认为是对抗各种流感病毒株的潜在方法。虽然不同亚型的ha氨基酸序列存在差异，但是其ha1的氨基酸数量及空间结构具有很强的保守性，通过结构生物学解析的不同亚型ha比较我们发现，其空间结构基本一致。
5.最保守的ha茎部区之一是55个氨基酸长的d螺旋(lah)。已有研究表明，在体外表达的lah能够自发组装成为可溶性的三聚体蛋白复合物，这也和ha在病毒表面形成天然三聚体有紧密的联系。利用这一特点，可以将lah与重要病毒抗原蛋白融合，形成依赖于lah的三聚体可溶蛋白，提高抗原的免疫原性。
6.目前，病毒疫苗的种类主要包括：灭活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒疫苗。灭活疫苗：灭活疫苗是传统的经典技术路线，即在体外培养病毒，然后将其灭活，使之没有毒性。灭活疫苗的优点是制备方法简单快速，安全性比较高，但灭活疫苗也有缺点，如接种剂量大、免疫期短，最可怕的缺点是有时候会造成抗体依赖增强效应(ade)，使病毒感染加重。腺病毒载体疫苗：腺病毒载体疫苗是用经过改造后无害的腺病毒作为载体，装入病毒的表面重要蛋白基因，制成腺病毒载体疫苗，刺激人体产生抗体，优点是安全、高效、引发的不良反应少；缺点是重组病毒载体疫苗以5型腺病毒作载体，但绝大多数人成长过程中曾感染过5型腺病毒，体内可能存在能中和腺病毒载体的抗体，降低疫苗效果。核
酸疫苗：核酸疫苗包括mrna疫苗和dna疫苗，是将编码表面蛋白的基因，mrna或者dna直接注入人体，利用人体细胞在人体内合成表面蛋白，刺激人体产生抗体。核酸疫苗的优点是研制时不需要合成蛋白质或病毒，流程简单，安全性相对比较高；缺点是无成功先例。减毒疫苗：是用已批准上市的减毒流感病毒疫苗作为载体，携带病毒表面蛋白，共同刺激人体产生针对两种病毒的抗体；由于减毒流感病毒容易感染鼻腔，所以这种疫苗仅通过滴鼻的方式就可以完成疫苗接种。重组蛋白疫苗：也称基因工程重组亚单位疫苗，是通过基因工程方法，大量生产病毒最有可能作为抗原的表面蛋白，把它注射到人体，刺激人体产生抗体；重组亚单位疫苗的优点是安全、高效、可规模化生产；比较成功的基因工程亚单位疫苗是乙型肝炎表面抗原疫苗。


技术实现要素：

7.本发明针对禽流感病毒，我们依据流感病毒ha蛋白的天然三聚体结构，以及亚单位疫苗的优势，设计了三聚体形式的流感病毒亚单位疫苗；该疫苗是使用昆虫细胞体外表达流感病毒h1n1 ha2蛋白三聚体形成区域lah在n端、h7n9 ha1或h5n1 ha1蛋白在c端的融合三聚体蛋白h7n9 ha1c-trimer、h5n1 halc-trimer，且与各自单体蛋白(h7n9 ha1-monomer、h5n1 ha1-monomer)相比，三聚体蛋白的免疫效果更好，能够使小鼠产生更高滴度的针对流感病毒ha1的特异性抗体。本发明的三聚体形式ha1克服了ha1单体免疫原性不足的缺点，大大提高了小鼠针对流感病毒ha1的特异性抗体的水平。所以，本发明的三聚体疫苗具有优异的免疫原性，为针对流感病毒疫苗的设计提供了一种全新的形式。
8.具体地，本发明提供以下实施方案：
9.1.流感病毒抗原，其中：
10.(1)所述流感病毒抗原从5’端到3’端的方向依次包括：
11.流感病毒a/california/07/2009 h1n1 ha蛋白三聚体形成区lah k403-n474，其氨基酸序列为seq id no：1；
12.以及流感病毒h7n9 ha1区，所述流感病毒h7n9 ha1区与a/shanghai/2/2013 h7n9 ha1区d18-s340的氨基酸序列同源性大于90％，例如大于90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或等于100％，且存在差异的位点在流感病毒h7n9 ha1区的loop区，所述流感病毒h7n9 ha1区例如选自：
13.a/shanghai/2/2013 h7n9 ha1区d18-s340，其氨基酸序列为seq id no：2，
14.或a/anhui/1/2013 h7n9 ha1区d18-s340，其氨基酸序列为seq id no：3，
15.或a/guangdong/17sf003/2016 h7n9 ha1区d18-s340，其氨基酸序列为seq id no：4，
16.或a/hong_kong/125/2017 h7n9 ha1区d18-s340，其氨基酸序列为seq id no：5；或
17.(2)所述流感病毒抗原从5’端到3’端的方向依次包括：
18.流感病毒a/california/07/2009 h1n1 ha蛋白三聚体形成区lah k403-n474，其氨基酸序列为seq id no：1，
19.以及流感病毒h5n1 ha1区，所述流感病毒h5n1 ha1区与a/indonesia/5/2005 h5n1 ha1区d18-e341的氨基酸序列同源性大于90％，例如大于90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％、或等于100％，且存在差异的位点在流感病毒h5n1 ha1区的loop区，所述流感病毒h5n1 ha1区例如选自：
20.a/indonesia/5/2005 h5n1 ha1区d18-e341，其氨基酸序列为seq id no：6，
21.或a/hong kong/156/97 h5n1 ha1区d18-e341，其氨基酸序列为seq id no：7；
22.优选地，其中所述流感病毒抗原是三聚体蛋白。
23.2.如项1所述的流感病毒抗原，其进一步包括在5’端的分泌信号肽(例如氨基酸序列为seq id no：8的流感病毒a/california/07/2009 h1n1 ha蛋白信号肽，氨基酸序列为seq id no：9的gp67信号肽，或其他流感病毒h7n9 ha1或流感病毒h5n1 ha1的信号肽)以及在3’端的纯化标签(例如，6
×
his标签)和终止密码子(例如：taa、tag或tga)。
24.3.如项1或2所述的流感病毒抗原，其包含如(1)或(2)所示氨基酸序列：
25.(1)如seq id no：10、seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14或seq id no：15所示的流感病毒抗原的氨基酸序列；
26.(2)(1)中的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个氨基酸或更多个氨基酸且不改变(1)的抗原性的由(1)衍生的多肽或其类似物，且自身能够形成三聚体。
27.4.分离的多核苷酸，其编码项1-3中任一项所述的流感病毒抗原，优选地所述分离的多核苷酸包含如seq id no：19、seq id no：20、seq id no：21、seq id no：22、seq id no：23或seq id no：24所示的序列。
28.5.重组载体或者表达盒，其包含项4所述的分离的多核苷酸。
29.6.转基因细胞系或者重组菌，其包含项5所述的重组载体或者表达盒。
30.7.如项6所述的转基因细胞系，其源自昆虫细胞，例如昆虫细胞sf9或hi5。
31.8.如项1-3中任一项所述的流感病毒抗原在制备抗流感病毒药物，例如疫苗的用途。
32.9.如项8所述的用途，其中将所述流感病毒抗原与佐剂合用。
33.10.试剂盒，其含有如项1-3中任一项所述的流感病毒抗原、如项4所述的分离的多核苷酸，或者如项5所述重组载体或者表达盒，如项6所述的转基因细胞系或者重组菌。
34.在本发明的流感病毒三聚体疫苗设计中，将a/california/07/2009 h1n1 ha蛋白三聚体形成区lah设计在如上流感病毒ha1区域的5’端还是3’端尤为重要，因为发明人在尝试将其设计在5’端时，并不能表达出完整的预期蛋白。
附图说明
35.图1：h7n9 halc-trimer、h7n9 ha1-monomer的wb鉴定；
36.图2：h7n9 ha1c-trimer分子筛层析和sds-page鉴定；
37.图3：h7n9 ha1-monomer分子筛层析和sds-page鉴定；
38.图4：h7n9 ha1c-trimer的分析超速离心确定；
39.图5：h7n9 ha1c-trimer、h7n9 ha1-monomer免疫后小鼠血清抗体滴度测定；
40.图6：不同h7n9 ha1序列同源性比较；
41.图7：不同h5n1 ha1序列同源性比较；
42.图8：h5n1 ha1c-trimer、h5n1 ha1-monomer的wb鉴定；
43.图9：h5n1 ha1c-trimer分子筛层析和sds-page鉴定；
ha1c-trimer的分子量为140kda，与三聚体理论分子量一致(h7n9 ha1蛋白单体的分子量为42kda，三聚体标签为9kda，整体三聚体理论分子量约153kda)，可以判定为三聚体。
63.实施例4：小鼠免疫实验
64.将实施例3得到的h7n9 ha1-monomer、h7n9 ha1c-trimer抗原按照下表1的方法于生理盐水中稀释，并与等体积佐剂进行分组乳化，然后对6周龄的balb/c小鼠(维通利华)进行分组免疫。免疫策略为通过大腿肌肉注射的方式，每只小鼠分别在第0天进行1次疫苗免疫，每次100μl的接种体积。第14天对小鼠进行尾部取血。小鼠血清在静置一段时间后血清析出，通过3000rpm离心10分钟获得血清，将血清在56℃，30分钟灭活后，用于elisa结合检测。
65.表1：动物免疫分组情况
[0066][0067]
实施例5：小鼠免疫后血清elisa检测实验
[0068]
将上一步实施例4制备的小鼠血清，进行elisa检测，测定ha1特异性抗体水平。向elisa板中的每孔加入200ng实施例3得到的纯化的h7n9 ha1-monomer蛋白，然后各孔用elisa包被液(50mm的na2co3、nahco3缓冲液，ph 9.6)在4℃下包被过夜；弃去包被液后，每孔加入150μl 5％脱脂奶粉室温封闭1小时。封闭结束后，用含0.05％吐温20的pbs洗elisa板2次，每孔加入梯度稀释的抗原免疫后血清或pbs免疫后血清100μl，室温孵育1小时；弃去上清后用含0.05％吐温20的pbs洗elisa板5次；每孔加入1∶3000稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠igg抗体(二抗，购自中杉金桥)100μl，室温孵育1小时；弃去二抗后用含0.05％吐温20的pbs洗elisa板5次，每孔加入50μl elisa显色液显色15分钟，每孔加入50μl 2m h2so4终止反应，酶标仪读取od
450
数值；抗体滴度(titer)计算方法为，以未加血清组的阴性对照数值
×
2.1倍，将高于该数值的最低稀释倍数取1g值，即算得每组血清抗体滴度。结果显示，h7n9 ha1c-trimer免疫组小鼠血清中结合h7n9 ha1抗原的抗体滴度(4.289)显著高于h7n9 ha1-monomer(3.988)及pbs对照组(1.000)(图5)，说明三聚体形式ha1的免疫原性更好。
[0069]
实施例6不同h7n9 ha1的序列同源性比较
[0070]
为证明利用a/california/07/2009h1n1的lah标签形成h7n9 ha1三聚体具有通用性，我们从gisaid数据库获取不同的h7n9 ha1的氨基酸序列，包括：a/shanghai/2/2013 h7n9 ha1(epi439502)、a/anhui/1/2013 h7n9 ha1(epi439507)、a/guangdong/17sf003/2016 h7n9 ha1(epi919607)、a/hong kong/125/2017 h7n9 ha1(epi977395)。将上述序列进行比对后，我们发现，以上h7n9 ha1与a/shanghai/2/2013 h7n9 ha1具有很高的序列相似性，同源性均大于96％(图6)，存在差异的氨基酸位点位于不影响空间结构的loop区。根据以上比对结果，我们认为利用实施例1中构建形式，a/shanghai/2/2013 h7n9的lah与上述不同的h7n9 ha1抗原均可以形成类似实施例3制备的h7n9 ha1三聚体形式蛋白，用于提高h7n9 ha1抗原的免疫原性，达到诱导更高滴度的抗体的效果。
ha1c-trimer及h5n1 ha1-monomer抗原。经过分析超速离心，结果如图11所示，测得h5n1 halc-trimer的分子量为148kda，与三聚体理论分子量一致(h5n1 ha1蛋白单体的分子量为45kda，三聚体标签为9kda，整体三聚体理论分子量约162kda)，可以判定为三聚体。
[0087]
实施例10：小鼠免疫实验
[0088]
将实施例9得到的h5n1 ha1-monomer、h5n1 ha1c-trimer抗原按照下表2的方法于生理盐水中稀释，并与等体积佐剂进行分组乳化，然后对6周龄的balb/c小鼠(维通利华)进行分组免疫。免疫策略为通过大腿肌肉注射的方式，每只小鼠分别在第0天进行1次疫苗免疫，每次100μl的接种体积。第14天对小鼠进行尾部取血。小鼠血清在静置一段时间后血清析出，通过3000rpm离心10分钟获得血清，将血清在56℃，30分钟灭活后，用于elisa结合检测。
[0089]
表2：动物免疫分组情况
[0090][0091]
实施例11：小鼠免疫后血清elisa检测实验
[0092]
将上一步实施例10制备的小鼠血清，进行elisa检测，测定ha1特异性抗体水平。向elisa板中的每孔加入200ng实施例9得到的纯化的h5n1 ha1-monomer蛋白，然后各孔用elisa包被液(50mm的na2co3、nahco3缓冲液，ph 9.6)在4℃下包被过夜；弃去包被液后，每孔加入150μl 5％脱脂奶粉室温封闭1小时。封闭结束后，用含0.05％吐温20的pbs洗elisa板2次，每孔加入梯度稀释的抗原免疫后血清或pbs免疫后血清100μl，室温孵育1小时；弃去上清后用含0.05％吐温20的pbs洗elisa板5次；每孔加入1∶3000稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠igg抗体(二抗，购自中杉金桥)100μl，室温孵育1小时；弃去二抗后用含0.05％吐温20的pbs洗elisa板5次，每孔加入50μl elisa显色液显色15分钟，每孔加入50μl 2m h2so4终止反应，酶标仪读取od
450
数值；抗体滴度(titer)计算方法为，以未加血清组的阴性对照数值
×
2.1倍，将高于该数值的最低稀释倍数取lg值，即算得每组血清抗体滴度。结果显示，h5n1 ha1c-trimer免疫组小鼠血清中结合h5n1 ha1抗原的抗体滴度(5.358)显著高于h5n1 ha1-monomer(4.731)及pbs对照组(1.000)(图12)，说明三聚体形式ha1的免疫原性更好。
[0093]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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