抗CD47抗体及其用途的制作方法

抗cd47抗体及其用途
技术领域
1.本发明属于治疗性单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及一种针对整合素相关蛋白(cd47)的抗体；还涉及所述抗体用于制备治疗多种疾病(包括肿瘤和感染性疾病)药物中的用途。


背景技术：

2.cd47又称整联蛋白(integrin-associated protein，iap)，其全长含305个氨基酸，胞外氨基端为一个igv样的结构域，高度疏水延伸的5个跨膜片段和1个短的选择性拼接的羧基端胞质尾区，其中igv样结构域是其主要配体结合部位。其配体包括：信号调节蛋白α链(signal-regulatory protein α,sirpα)、凝血酶敏感蛋白(thrombospondin,tsp)和整合素(integrins)。cd47广泛表达于细胞膜表面，存在于所有组织的不同细胞上，尤其是白细胞，如多形核白细胞(pmn)、树突状细胞(dc)、t细胞、红细胞、胎盘、血小板及造血干细胞(hematopoietic stem cells，hscs)等正常细胞。同时，cd47在人体大部分肿瘤细胞中高表达，并且它可以作为肿瘤诊断及判断预后的一个标准。如它在急慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤以及膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌、肾癌、多发性骨髓瘤等多种实体肿瘤细胞或肿瘤干细胞上(如白血病干细胞leukemia stem cells,lsc)存在过表达，并且其高表达与临床预后差相关。
3.研究表明，肿瘤细胞表面的cd47通过与巨噬细胞、dc细胞等免疫细胞表面的sirpα配体结合，向其传递―“别吃我”(don't eat me)的抑制信号，从而逃避这些细胞的吞噬(kershaw mh等,science,2013,341:41-42)，并进而逃避吞噬后肿瘤抗原的递呈所导致的t细胞对肿瘤细胞的杀伤作用(vonderheide rh,nature medicine,2015,21:1122
–
1123)。通过阻断肿瘤细胞表面的cd47与巨噬细胞或dc细胞表面的sirpα 的相互作用，可以促进巨噬细胞、dc细胞对肿瘤细胞的吞噬，并进一步增加肿瘤抗原的提呈，激活获得性免疫应答(chao mp,curr opin immunol,2012,24(2):225-32；liu xj,nature medicine,2015,21(10):1209-1215)。因此，通过使用cd47抗体阻断cd47-sirpα通路，介导巨噬细胞吞噬作用，能够靶向性杀伤肿瘤细胞。目前，国内外为数不多的同靶点抗体药物正处于i～ii期临床研究阶段，例如forty seven公司的hu5f9-g4，处于临床i/ii期阶段，单用治疗急性骨髓性白血病及淋巴瘤；与利妥昔单抗联用治疗b细胞非霍奇金淋巴瘤；或与西妥昔单抗联用治疗结直肠癌。celgene公司的cc-90002处于临床i期阶段，针对的适应症是实体瘤、多发性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤。信达生物的全人单克隆抗体ibi188，正在开展针对晚期恶性肿瘤(包括非霍奇金淋巴瘤和卵巢癌)的临床研究。
4.此外，多数cd47抗体被报道可引起人红细胞的血凝反应。血凝反应是同型相互作用的一个示例，使用二价cd47抗体处理后可引起两个表达cd47的细胞聚合或凝集。例如，一种全igg或f(ab')2构型的cd47抗体mabl被报道能够引起红细胞的血凝反应，且仅当mabl变为scfv或二价scfv时该作用减弱(参见例如unos等,oncol rep,2007,17:1189-1194；kikuchi y等,biochem biophys res commun,2004,315:912-918)。其它已知的cd47抗体
(包括b6h12、brc126和cc2c6)也会引起红细胞的血凝反应。因此，引起红细胞凝集是现有靶向cd47的全igg或f(ab')2构型抗体应用于临床的主要限制。因此，目前仍然迫切需要开发不仅能够有效促进巨噬细胞的吞噬作用而且与红细胞结合微弱，不导致红细胞凝集的cd47抗体。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种能够特异性识别并高亲和力结合cd47(尤其是人cd47)的抗体。本发明所述抗体能够调节(如阻断、抑制、减少、拮抗、中和或干扰)cd47的活性和/或信号传递，且这些抗体不会导致血红细胞出现显著的血凝反应。本发明公开的cd47抗体可以用于治疗、预防和/或诊断多种疾病，例如肿瘤。
6.在第一个方面，本发明提供了一种能够特异性结合cd47的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含的重链可变区(vh)包含至少一个、两个或三个选自下组的互补决定区(cdr)：
7.(i)cdr-h1，其具有如seq id no：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的vh中含有的cdr-h1的序列，或者与所述vh中含有的cdr-h1的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
8.(ii)cdr-h2，其具有如seq id no：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的vh中含有的cdr-h2的序列，或者与所述vh中含有的cdr-h2的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
9.(iii)cdr-h3，其具有如seq id no：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35或37所示的vh中含有的cdr-h3的序列，或者与所述vh中含有的cdr-h3的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
10.和/或，其包含的轻链可变区(vl)包含至少一个、两个或三个选自下组的互补决定区(cdr)：
11.(iv)cdr-l1，其具有如seq id no：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示的vl中含有的cdr-l1的序列，或者与所述vl中含有的cdr-l1的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
12.(v)cdr-l2，其具有如seq id no：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示的vl中含有的cdr-l2的序列，或者与所述vl中含有的cdr-l2的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
13.(vi)cdr-l3，其具有如seq id no：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36或38所示的vl中含有的cdr-l3的序列，或者与所述vl中含有的cdr-l3的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
14.或，
15.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
16.在某些优选的实施方案中，所述重链可变区(vh)中含有的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3，和/或所述轻链可变区(vl)中含有的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3由kabat或imgt编号系统定义。
17.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：如seq id no：
5、13、15、17或19所示的重链可变区(vh)中含有的至少一个、两个或三个cdr；和/或，如seq id no：6、14、16、18或20所示的轻链可变区(vl)中含有的至少一个、两个或三个cdr；其中，所述重链可变区(vh)中含有的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3和所述轻链可变区(vl)中含有的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3通过imgt或kabat编号系统确定。
18.在某些更优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
19.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
20.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：79，或与seq id no：79相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
21.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：80，或与seq id no：80相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
22.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：81，或与seq id no：81相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
23.(b)下述3个轻链可变区(vl)cdr：
24.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：82，或与seq id no：82相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
25.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：83，或与seq id no：83相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
26.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：44，或与seq id no：44相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
27.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由imgt编号系统定义。
28.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
29.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：79所示的cdr-h1；如seq id no：80所示的cdr-h2；以及，如seq id no：81所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：82所示的cdr-l1；如seq id no：83所示的cdr-l2；以及，如seq id no：44所示的cdr-l3。
30.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
31.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
32.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：39，或与seq id no：39相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
33.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：40，或与seq id no：40相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
34.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：41，或与seq id no：41相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
35.(b)下述3个轻链可变区(vl)cdr：
36.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：42，或与seq id no：42相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
37.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：43，或与seq id no：43相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
38.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：44，或与seq id no：44相比具有一个
或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
39.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
40.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
41.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：39所示的cdr-h1；如seq id no：40所示的cdr-h2；以及，如seq id no：41所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：42所示的cdr-l1；如seq id no：43所示的cdr-l2；以及，如seq id no：44所示的cdr-l3。
42.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
43.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
44.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：39，或与seq id no：39相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
45.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：40，或与seq id no：40相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
46.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：41，或与seq id no：41相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
47.(b)下述3个轻链可变区(vl)的cdr：
48.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：45，或与seq id no：45相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
49.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：46，或与seq id no：46相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
50.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：44，或与seq id no：44相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
51.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
52.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
53.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：39所示的cdr-h1；如seq id no：40所示的cdr-h2；以及，如seq id no：41所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：45所示的cdr-l1；如seq id no：46所示的cdr-l2；以及，如seq id no：44所示的cdr-l3。
54.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
55.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
56.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：47，或与seq id no：47相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
57.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：48，或与seq id no：48相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
58.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：41，或与seq id no：41相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
59.(b)下述3个轻链可变区(vl)的cdr：
60.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：49，或与seq id no：49相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
61.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：50，或与seq id no：50相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
62.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：44，或与seq id no：44相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
63.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
64.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
65.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：47所示的cdr-h1；如seq id no：48所示的cdr-h2；以及，如seq id no：41所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：49所示的cdr-l1；如seq id no：50所示的cdr-l2；以及，如seq id no：44所示的cdr-l3。
66.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：如seq id no：7、21、23、25或27所示的重链可变区(vh)中含有的至少一个、两个或三个cdr；和/或，如seq id no：8、22、24、26或28所示的轻链可变区(vl)中含有的至少一个、两个或三个cdr；其中，所述重链可变区(vh)中含有的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3和所述轻链可变区(vl)中含有的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3通过imgt或kabat编号系统确定。
67.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
68.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
69.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：84，或与seq id no：84相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
70.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：85，或与seq id no：85相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
71.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：86，或与seq id no：86相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
72.(b)下述3个轻链可变区(vl)cdr：
73.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：87，或与seq id no：87相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
74.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：88，或与seq id no：88相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
75.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：56，或与seq id no：56相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
76.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由imgt编号系统定义。
77.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
78.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：84所示的cdr-h1；如seq id no：85所示的cdr-h2；以及，如seq id no：86所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：87所示的cdr-l1；如seq id no：88所示的cdr-l2；以及，如seq id no：56所示的cdr-l3。
79.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
80.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
81.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：51，或与seq id no：51相比具有一个
或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
82.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：52，或与seq id no：52相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
83.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：53，或与seq id no：53相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
84.(b)下述3个轻链可变区(vl)cdr：
85.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：54，或与seq id no：54相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
86.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：55，或与seq id no：55相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
87.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：56，或与seq id no：56相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
88.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
89.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
90.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：51所示的cdr-h1；如seq id no：52所示的cdr-h2；以及，如seq id no：53所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：54所示的cdr-l1；如seq id no：55所示的cdr-l2；以及，如seq id no：56所示的cdr-l3。
91.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
92.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
93.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：51，或与seq id no：51相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
94.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：57，或与seq id no：57相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
95.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：53，或与seq id no：53相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
96.(b)下述3个轻链可变区(vl)的cdr：
97.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：54，或与seq id no：54相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
98.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：55，或与seq id no：55相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
99.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：56，或与seq id no：56相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
100.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
101.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
102.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：51所示的cdr-h1；如seq id no：57所示的cdr-h2；以及，如seq id no：53所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：54所示的cdr-l1；如seq id no：55所示的cdr-l2；以及，如seq id no：56所示的cdr-l3。
103.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
104.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
105.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：58，或与seq id no：58相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
106.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：59，或与seq id no：59相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
107.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：53，或与seq id no：53相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
108.(b)下述3个轻链可变区(vl)的cdr：
109.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：60，或与seq id no：60相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
110.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：61，或与seq id no：61相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
111.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：56，或与seq id no：56相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
112.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
113.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
114.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：58所示的cdr-h1；如seq id no：59所示的cdr-h2；以及，如seq id no：53所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：60所示的cdr-l1；如seq id no：61所示的cdr-l2；以及，如seq id no：56所示的cdr-l3。
115.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：如seq id no：9、29、31、33或35所示的重链可变区(vh)中含有的至少一个、两个或三个cdr；和/或，如seq id no：10、30、32、34或36所示的轻链可变区(vl)中含有的至少一个、两个或三个cdr；其中，所述重链可变区(vh)中含有的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3和所述轻链可变区(vl)中含有的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3通过imgt或kabat编号系统确定。
116.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
117.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
118.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：89，或与seq id no：89相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
119.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：90，或与seq id no：90相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
120.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：91，或与seq id no：91相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
121.(b)下述3个轻链可变区(vl)cdr：
122.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：92，或与seq id no：92相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
123.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：93，或与seq id no：93相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
124.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：67，或与seq id no：67相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
125.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由imgt编号系统定义。
126.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
127.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：89所示的cdr-h1；如seq id no：90所示的cdr-h2；以及，如seq id no：91所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：92所示的cdr-l1；如seq id no：93所示的cdr-l2；以及，如seq id no：67所示的cdr-l3。
128.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
129.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
130.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：62，或与seq id no：62相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
131.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：63，或与seq id no：63相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
132.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：64，或与seq id no：64相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
133.(b)下述3个轻链可变区(vl)cdr：
134.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：65，或与seq id no：65相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
135.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：66，或与seq id no：66相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
136.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：67，或与seq id no：67相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
137.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
138.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
139.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：62所示的cdr-h1；如seq id no：63所示的cdr-h2；以及，如seq id no：64所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：65所示的cdr-l1；如seq id no：66所示的cdr-l2；以及，如seq id no：67所示的cdr-l3。
140.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
141.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
142.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：62，或与seq id no：62相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
143.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：68，或与seq id no：68相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
144.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：64，或与seq id no：64相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
145.(b)下述3个轻链可变区(vl)的cdr：
146.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：69，或与seq id no：69相比具有一个
或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
147.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：70，或与seq id no：70相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
148.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：67，或与seq id no：67相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
149.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
150.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
151.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：62所示的cdr-h1；如seq id no：68所示的cdr-h2；以及，如seq id no：64所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：69所示的cdr-l1；如seq id no：70所示的cdr-l2；以及，如seq id no：67所示的cdr-l3。
152.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
153.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
154.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：71，或与seq id no：71相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
155.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：72，或与seq id no：72相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
156.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：64，或与seq id no：64相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
157.(b)下述3个轻链可变区(vl)的cdr：
158.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：73，或与seq id no：73相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
159.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：74，或与seq id no：74相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
160.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：67，或与seq id no：67相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
161.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
162.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
163.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：71所示的cdr-h1；如seq id no：72所示的cdr-h2；以及，如seq id no：64所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：73所示的cdr-l1；如seq id no：74所示的cdr-l2；以及，如seq id no：67所示的cdr-l3。
164.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：如seq id no：11或37所示的重链可变区(vh)中含有的至少一个、两个或三个cdr；和/或，如seq id no：12或38所示的轻链可变区(vl)中含有的至少一个、两个或三个cdr；其中，所述重链可变区(vh)中含有的cdr-h1、cdr-h2及cdr-h3和所述轻链可变区(vl)中含有的cdr-l1、cdr-l2及cdr-l3通过imgt或kabat编号系统确定。
165.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
166.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
167.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：79，或与seq id no：79相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
168.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：80，或与seq id no：80相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
169.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：81，或与seq id no：81相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
170.(b)下述3个轻链可变区(vl)cdr：
171.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：94，或与seq id no：94相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
172.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：83，或与seq id no：83相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
173.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：77，或与seq id no：77相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
174.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由imgt编号系统定义。
175.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
176.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：79所示的cdr-h1；如seq id no：80所示的cdr-h2；以及，如seq id no：81所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：94所示的cdr-l1；如seq id no：83所示的cdr-l2；以及，如seq id no：77所示的cdr-l3。
177.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
178.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
179.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：39，或与seq id no：39相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
180.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：40，或与seq id no：40相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
181.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：41，或与seq id no：41相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
182.(b)下述3个轻链可变区(vl)cdr：
183.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：75，或与seq id no：75相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
184.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：76，或与seq id no：76相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
185.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：77，或与seq id no：77相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
186.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
187.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
188.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：39所示的cdr-h1；如seq id no：40所示的cdr-h2；以及，如seq id no：41所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：75所示的cdr-l1；如seq id no：
76所示的cdr-l2；以及，如seq id no：77所示的cdr-l3。
189.在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
190.(a)下述3个重链可变区(vh)cdr：
191.(i)cdr-h1，其由下述序列组成：seq id no：39，或与seq id no：39相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
192.(ii)cdr-h2，其由下述序列组成：seq id no：40，或与seq id no：40相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
193.(iii)cdr-h3，其由下述序列组成：seq id no：41，或与seq id no：41相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；和
194.(b)下述3个轻链可变区(vl)的cdr：
195.(iv)cdr-l1，其由下述序列组成：seq id no：75，或与seq id no：75相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
196.(v)cdr-l2，其由下述序列组成：seq id no：78，或与seq id no：78相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，和
197.(vi)cdr-l3，其由下述序列组成：seq id no：77，或与seq id no：77相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
198.其中，所述重链可变区(vh)cdr和所述轻链可变区(vl)cdr由kabat编号系统定义。
199.在某些优选的实施方案中，(i)-(vi)任一项中所述的置换为保守置换。
200.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含：如seq id no：39所示的cdr-h1；如seq id no：40所示的cdr-h2；以及，如seq id no：41所示的cdr-h3；并且，所述抗体或其抗原结合片段的vl包含：如seq id no：75所示的cdr-l1；如seq id no：78所示的cdr-l2；以及，如seq id no：77所示的cdr-l3。
201.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的构架区(fr)。
202.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含来源于鼠免疫球蛋白的重链可变区(vh)构架区(fr)，和/或所述抗体或其抗原结合片段的vl包含来源于鼠免疫球蛋白的轻链可变区(vl)构架区(fr)。
203.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的vh包含来源于人免疫球蛋白的重链可变区(vh)构架区(fr)，和/或所述抗体或其抗原结合片段的vl包含来源于人免疫球蛋白的轻链可变区(vl)构架区(fr)。在此类实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区fr和/或轻链可变区fr可以包含一个或多个非人源(例如，鼠源)氨基酸残基，例如所述重链构架区fr和/或轻链构架区fr可以包含一或多个氨基酸回复突变，在这些回复突变中有相应的鼠源氨基酸残基。
204.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
205.(a)人免疫球蛋白的重链构架区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个保守置换；例如1个，2个，3个，4个或5个保守置换)；和/或
206.(b)人免疫球蛋白的轻链构架区或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有至多20个氨基酸保守置换(例如至多15个、至多10个、或至多5个保守置换；例如1个，2个，3
个，4个或5个保守置换)。
207.因此，在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
208.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
209.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
210.(i)seq id nos：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37任一项所示的序列；
211.(ii)与seq id nos：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
212.(iii)与seq id nos：5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
213.和/或，
214.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
215.(iv)seq id nos：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38任一项所示的序列；
216.(v)与seq id nos：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
217.(vi)与seq id nos：6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
218.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
219.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：选自如seq id no：5、13、15、17和19所示的重链可变区(vh)；和/或，选自如seq id no：6、14、16、18和20所示的轻链可变区。
220.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
221.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
222.(i)seq id no：5所示的序列；
223.(ii)与seq id no：5所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
224.(iii)与seq id no：5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
225.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
226.(iv)seq id no：6所示的序列；
227.(v)与seq id no：6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
228.(vi)与seq id no：6所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
229.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
230.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
231.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
232.(i)seq id no：13所示的序列；
233.(ii)与seq id no：13所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
234.(iii)与seq id no：13所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
235.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
236.(iv)seq id no：14所示的序列；
237.(v)与seq id no：14所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
238.(vi)与seq id no：14所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
239.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
240.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
241.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
242.(i)seq id no：15所示的序列；
243.(ii)与seq id no：15所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
244.(iii)与seq id no：15所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
245.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
246.(iv)seq id no：16所示的序列；
247.(v)与seq id no：16所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
248.(vi)与seq id no：16所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
249.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
250.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
251.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
252.(i)seq id no：17所示的序列；
253.(ii)与seq id no：17所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
254.(iii)与seq id no：17所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
255.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
256.(iv)seq id no：18所示的序列；
257.(v)与seq id no：18所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
258.(vi)与seq id no：18所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
259.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
260.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
261.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
262.(i)seq id no：19所示的序列；
263.(ii)与seq id no：19所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
264.(iii)与seq id no：19所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
265.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
266.(iv)seq id no：20所示的序列；
267.(v)与seq id no：20所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
268.(vi)与seq id no：20所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
269.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
270.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：选自如seq id no：7、21、23、25和27所示的重链可变区(vh)；和/或，选自如seq id no：8、22、24、26和28所示的轻链可变区。
271.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
272.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
273.(i)seq id no：7所示的序列；
274.(ii)与seq id no：7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
275.(iii)与seq id no：7所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
276.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
277.(iv)seq id no：8所示的序列；
278.(v)与seq id no：8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
279.(vi)与seq id no：8所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
280.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
281.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
282.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
283.(i)seq id no：21所示的序列；
284.(ii)与seq id no：21所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
285.(iii)与seq id no：21所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
286.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
287.(iv)seq id no：22所示的序列；
288.(v)与seq id no：22所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
289.(vi)与seq id no：22所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
290.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
291.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
292.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
293.(i)seq id no：23所示的序列；
294.(ii)与seq id no：23所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
295.(iii)与seq id no：23所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
296.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
297.(iv)seq id no：24所示的序列；
298.(v)与seq id no：24所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
299.(vi)与seq id no：24所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
300.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
301.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
302.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
303.(i)seq id no：25所示的序列；
304.(ii)与seq id no：25所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
305.(iii)与seq id no：25所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
306.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
307.(iv)seq id no：26所示的序列；
308.(v)与seq id no：26所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
309.(vi)与seq id no：26所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
310.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
311.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
312.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
313.(i)seq id no：27所示的序列；
314.(ii)与seq id no：27所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
315.(iii)与seq id no：27所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
316.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
317.(iv)seq id no：28所示的序列；
318.(v)与seq id no：28所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
319.(vi)与seq id no：28所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
320.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
321.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：选自如seq id no：9、29、31、33和35所示的重链可变区(vh)；和/或，选自如seq id no：10、30、32、34和36所示的轻链可变区。
322.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
323.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
324.(i)seq id no：9所示的序列；
325.(ii)与seq id no：9所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
326.(iii)与seq id no：9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
327.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
328.(iv)seq id no：10所示的序列；
329.(v)与seq id no：10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
330.(vi)与seq id no：10所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
331.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
332.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
333.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
334.(i)seq id no：29所示的序列；
335.(ii)与seq id no：29所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
336.(iii)与seq id no：29所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
337.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
338.(iv)seq id no：30所示的序列；
339.(v)与seq id no：30所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
340.(vi)与seq id no：30所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
341.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
342.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
343.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
344.(i)seq id no：31所示的序列；
345.(ii)与seq id no：31所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
346.(iii)与seq id no：31所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或
100％的序列同一性的序列；和
347.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
348.(iv)seq id no：32所示的序列；
349.(v)与seq id no：32所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
350.(vi)与seq id no：32所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
351.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
352.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
353.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
354.(i)seq id no：33所示的序列；
355.(ii)与seq id no：33所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
356.(iii)与seq id no：33所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
357.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
358.(iv)seq id no：34所示的序列；
359.(v)与seq id no：34所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
360.(vi)与seq id no：34所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
361.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
362.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
363.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
364.(i)seq id no：35所示的序列；
365.(ii)与seq id no：35所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
366.(iii)与seq id no：35所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
367.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
368.(iv)seq id no：36所示的序列；
369.(v)与seq id no：36所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
370.(vi)与seq id no：36所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或
100％的序列同一性的序列。
371.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
372.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：选自如seq id no：11和37所示的重链可变区(vh)；和/或，选自如seq id no：12和38所示的轻链可变区。
373.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
374.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
375.(i)seq id no：11所示的序列；
376.(ii)与seq id no：11所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
377.(iii)与seq id no：11所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
378.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
379.(iv)seq id no：12所示的序列；
380.(v)与seq id no：12所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
381.(vi)与seq id no：12所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
382.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
383.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
384.(a)重链可变区(vh)，其包含选自下列的氨基酸序列：
385.(i)seq id no：37所示的序列；
386.(ii)与seq id no：37所示的序列相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
387.(iii)与seq id no：37所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
388.(b)轻链可变区(vl)，其包含选自下列的氨基酸序列：
389.(iv)seq id no：38所示的序列；
390.(v)与seq id no：38所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
391.(vi)与seq id no：38所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
392.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
393.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含来源于哺乳动物(例如，鼠或人)免疫球蛋白的恒定区序列或其变体，所述变体与其所源自的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加。在某些优选的实施方案中，所述变体与其所源自的
序列相比具有一个或多个氨基酸的置换。在某些实施方案中，抗cd47抗体分子具有重链恒定区(从n端到c端顺序连接的ch1结构域、铰链区、ch2结构域和ch3结构域)，其选自例如igg1、igg2、igg3、igg4、igm、iga1、iga2、igd和ige的重链恒定区；特别地选自例如igg1、igg2、igg3和igg4的重链恒定区，更特别地选自igg1、igg2或igg4(例如是人igg1、igg2或igg4)的重链恒定区。在一些实施方案中，抗cd47抗体分子具有轻链恒定区，其选自例如κ或λ的轻链恒定区，优选κ轻链恒定区(例如人κ轻链)。
394.在一些优选实施方案中，所述重链恒定区序列的fc片段被改变，例如被突变，以修饰本发明所述抗体分子的性质(例如改变下列中的一个或更多个特性：例如，fc受体结合、效应细胞功能或补体功能、fab臂交换等)。
395.例如，本发明提供的抗体包含具有改变的效应子功能(例如降低或消除)的氨基酸置换、缺失或添加的fc变体。抗体的fc片段介导几种重要的效应子功能，例如adcc、adcp、cdc等。通过替换抗体的fc片段中的氨基酸残基，以改变抗体对效应子配体(如fcγr或补体c1q)的亲和力，从而改变效应子功能的方法是本领域已知的(参见，例如ep 388,151a1；us 564,8260；us 562,4821；natsume a等,cancer res.,68:3863-3872,2008；idusogie ee等,j.immunol.,166:2571-2575,2001；lazar ga等,pnas,103:4005-4010,2006；shields rl等,jbc,276:6591-6604,2001；stavenhagen jb等,cancer res.,67:8882-8890,2007；stavenhagen jb等,advan.enzyme.regul.,48:152-164,2008；alegre ml等,j.immunol.,148:3461-3468,1992；和kaneko e等,biodrugs,25:1-11,2011)。与fcγr相互作用主要影响抗体的adcc活性，对应的氨基酸位点为p232-s239、d265-d270、y296-t299和n325-i332。在本发明一些优选实施例中，对抗体重链恒定区上的氨基酸l235(eu编号)进行修饰以改变fc受体相互作用，例如l235e或l235a。在本发明另一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸234和235同时进行修饰，例如l234a和l235a(l234a/l235a)(eu编号)。在本发明另一些优选实施例中，对抗体重链恒定区上的氨基酸d265(eu编号)进行修饰以改变fc受体相互作用，例如d265a。与c1q相互作用主要影响抗体的cdc活性，对应的氨基酸位点为d270、k322、p329和p331。在一些优选实施例中，对抗体恒定区上p331的氨基酸进行突变以消除cdc效应，例如p331s(eu编号)；在另一些优选实施例中，对抗体恒定区上p329的氨基酸进行置换，例如p329a(eu编号)。
396.例如，本发明提供的抗体可包含具有延长的循环半衰期的氨基酸置换、缺失或添加的fc变体。影响半衰期的主要是与fcrn的相互作用的残基，对应的氨基酸位点为l251-s254、l309-q311和n434-h435。例如，m252y/s254t/t256e、m428l/n434s或t250q/m428l都能够延长抗体在灵长类动物中的半衰期。更多的与新生儿受体(fcrn)结合亲和力增强的fc变体所包含突变位点可以参见中国发明专利cn 201280066663.2、us 2005/0014934a1、wo 97/43316、us 5,869,046、us 5,747,03、wo 96/32478。在本发明一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸m428(eu编号)进行修饰以增强fcrn受体的结合亲和力，例如m428l。在另一些优选实施例中，对抗体恒定区上的氨基酸250和428(eu编号)同时进行修饰，例如t250q和m428l(t250q/m428l)。
397.例如，本发明提供的抗体也可包含具有可以降低或消除fc糖基化的氨基酸置换、缺失或添加的fc变体。例如，igg在ch2结构域的氨基酸n297处含有保守的糖基化位点，n297位糖基化对igg的活性有很大影响，如果该位点糖基化被移除，则会影响igg分子ch2上半部
分的构象，从而丧失对fcγrs的结合能力，影响抗体相关的生物活性，如adcc效应。在本发明的一些优选实施例中，对人igg恒定区上的氨基酸n297(eu编号)进行修饰以避免抗体的糖基化，例如n297a。
398.例如，本发明提供的抗体也可包含具有可以消除fab臂交换的fc变体。例如，在本发明的一些优选实施例中，将igg4的核心铰链区228位ser替换为pro(s228p)(eu编号)，可消除fab交换作用，增强fab稳定性。
399.本发明的一些优选实施例中，所述人igg重链恒定区序列选自以下变体：
400.(i)含有leu234val和leu235ala突变的人igg1的重链恒定区序列；
401.(ii)含有asn297ala突变的人igg1的重链恒定区序列；
402.(iii)含有thr250gln、asn297ala和met428leu突变的人igg1的重链恒定区序列；
403.(iv)含有asp265ala和pro329ala突变的人igg1的重链恒定区序列；
404.(v)含有pro331ser突变的人igg2的重链恒定区序列；
405.(vi)含有ser228pro突变的人igg4的重链恒定区序列；
406.(vii)含有ser228pro和leu235glu突变的人igg4的重链恒定区序列；
407.更优选地，所述抗体重链恒定区的氨基酸序列优选自seq id nos：96、97、98、99、100、101、102、103、104或105所示的天然的或突变的人igg重链恒定区。
408.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
409.(a)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：
410.(i)seq id no：107所示的序列；
411.(ii)与seq id no：107所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
412.(iii)与seq id no：107所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
413.(b)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：
414.(iv)seq id no：109所示的序列；
415.(v)与seq id no：109所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
416.(vi)与seq id no：109所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
417.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
418.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
419.(a)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：
420.(i)seq id no：111所示的序列；
421.(ii)与seq id no：111所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
422.(iii)与seq id no：111所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、
或100％的序列同一性的序列；和
423.(b)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：
424.(iv)seq id no：113所示的序列；
425.(v)与seq id no：113所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
426.(vi)与seq id no：113所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
427.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
428.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
429.(a)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：
430.(i)seq id no：115所示的序列；
431.(ii)与seq id no：115所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
432.(iii)与seq id no：115所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
433.(b)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：
434.(iv)seq id no：117所示的序列；
435.(v)与seq id no：117所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
436.(vi)与seq id no：117所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
437.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
438.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
439.(a)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：
440.(i)seq id no：119所示的序列；
441.(ii)与seq id no：119所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
442.(iii)与seq id no：119所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
443.(b)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：
444.(iv)seq id no：121所示的序列；
445.(v)与seq id no：121所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
446.(vi)与seq id no：121所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或
100％的序列同一性的序列。
447.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
448.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
449.(a)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：
450.(i)seq id no：123所示的序列；
451.(ii)与seq id no：123所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
452.(iii)与seq id no：123所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
453.(b)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：
454.(iv)seq id no：125所示的序列；
455.(v)与seq id no：125所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
456.(vi)与seq id no：125所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
457.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
458.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
459.(a)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：
460.(i)seq id no：127所示的序列；
461.(ii)与seq id no：127所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
462.(iii)与seq id no：127所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
463.(b)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：
464.(iv)seq id no：129所示的序列；
465.(v)与seq id no：129所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
466.(vi)与seq id no：129所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
467.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
468.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
469.(a)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：
470.(i)seq id no：131所示的序列；
471.(ii)与seq id no：131所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
472.(iii)与seq id no：131所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
473.(b)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：
474.(iv)seq id no：133所示的序列；
475.(v)与seq id no：133所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
476.(vi)与seq id no：133所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
477.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
478.在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
479.(a)重链，其包含选自下列的氨基酸序列：
480.(i)seq id no：135所示的序列；
481.(ii)与seq id no：135所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
482.(iii)与seq id no：135所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；和
483.(b)轻链，其包含选自下列的氨基酸序列：
484.(iv)seq id no：137所示的序列；
485.(v)与seq id no：137所示的序列相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个置换、缺失或添加)的序列；或
486.(vi)与seq id no：137所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
487.在某些优选的实施方案中，(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
488.在某些实施方案中，本发明的抗cd47抗体还涵盖其抗体片段，抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab
′
、fab
’-
sh，f(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的双特异性抗体或多特异性抗体。
489.再一方面，本发明提供了编码以上任何抗cd47抗体或其抗原结合片段的核酸。在某些实施方案中，编码所述抗cd47抗体分子的核苷酸序列是密码子最优化的。例如，本发明优选实施例中提供分别地编码抗cd47的抗体分子的重链和轻链的第一和第二核酸，所述抗体分子选自下列中的任意一种：ab12w3、ab12w4、ab12w5、ab12w6、ab12w7、ab12w8、ab12w9和ab12w10；或与其基本上相同的序列。例如，编码所述抗体重链的第一核酸包含如seq id no：106、110、114、118、122、126、130或134所示的序列或与其基本上相同的序列(例如与其至少大约85％、90％、95％、99％或更高度相似的序列或具有一个或更多个核苷酸取代(例如保守性取代))的序列，或与上述序列相差不超过3、5、10、15、20、25或30个核苷酸的序列)；和编码所述抗体轻链的第二核酸包含如seq id no：108、112、116、120、124、128、132或
136所示的序列或与其基本上相同的序列(例如与其至少大约85％、90％、95％、99％或更高度相似的序列或具有一个或更多个核苷酸取代(例如保守性取代))的序列，或与上述序列相差不超过3、5、10、15、20、25或30核苷酸的序列)。
490.再一方面，本发明提供了包含上述核酸的载体。
491.再一方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。
492.再一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含上述分离的核酸分子或上述载体。宿主细胞可以是真核细胞(例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)或原核细胞(例如大肠杆菌)。适宜的真核细胞包括但不限于ns0细胞、vero细胞、hela细胞、cos细胞、cho细胞、hek293细胞、bhk细胞、和mdckii细胞。适宜的昆虫细胞包括但不限于sf9细胞。在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如cho(例如cho-k1、cho-s、cho dxb11、cho dg44)。
493.再一方面，本发明提供制备抗cd47抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述方法包含在适于表达编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及分离所述抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收所述抗体或其抗原结合片段。
494.再一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体、和/或赋形剂和/或稳定剂和至少一种本发明所述cd47抗体或其抗原结合片段。
495.再一方面，本发明涉及在受试者中抑制cd47与sirpα结合的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明所述cd47抗体或其抗原结合片段。
496.再一方面，本发明还涉及所述cd47抗体或其抗原结合片段制备用于在受试者中抑制cd47与sirpα结合的组合物或药物中的用途。
497.再一方面，本发明涉及促进受试者的巨噬细胞发挥吞噬作用的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明所述cd47抗体或其抗原结合片段。
498.再一方面，本发明还涉及任何所述cd47抗体或其抗原结合片段在制备用于促进受试者的巨噬细胞发挥吞噬作用的组合物或药物中的用途。
499.再一方面，本发明涉及治疗可以通过消除、抑制或降低cd47活性而被改善、减缓、抑制或预防的任何与cd47相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者或个体施用有效量的本发明所述cd47抗体或其抗原结合片段。例如，本发明提供了治疗(或预防)对象中肿瘤的方法，所述方法包括：向所述受试者或个体施用本发明所述cd47抗体或其抗原结合片段。
500.再一方面，本发明还涉及所述cd47抗体及其抗原结合片段在制备针对治疗对象中cd47介导的病症或疾病的药物中的用途。
501.在某些实施方案中，所述抗体分子可以用于治疗血液癌症，例如，选自以下的血液癌症：急性成淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、非霍奇金淋巴瘤(例如，弥漫性大b细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、b成淋巴细胞白血病/淋巴瘤和伯基特淋巴瘤)、b-成淋巴细胞白血病/淋巴瘤；b细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、
慢性淋巴细胞白血病(cll)例如，转化的cll、richter综合征、慢性髓细胞白血病(cml)、滤泡淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓纤维化、真性红细胞增多症、皮肤t细胞淋巴瘤、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(mgus)、骨髓增生异常综合征(mds)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b-成淋巴细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述癌症优选自以下的血液癌症：多发性骨髓瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、aml、cll例如转化的cll、richter综合征或滤泡淋巴瘤。
502.在某些实施方案中，所述抗体分子可以用于治疗实体瘤。在某些实施方案中，所述癌症选自：肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫内膜癌、结肠/直肠癌、肛门癌、子宫内膜癌、食道癌、胆囊癌、胃肠道癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、胃癌、子宫癌、阴道癌和甲状腺癌。
503.再一方面，本发明涉及检测样品中cd47蛋白的方法，所述方法包括(a)将样品与本发明所述的任何抗cd47抗体或其抗原结合片段接触；和(b)检测抗cd47抗体或其抗原结合片段和cd47蛋白间的复合物的形成。在某些实施方案中，cd47是人cd47。在一个实施方案中，该检测方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗cd47抗体被用于选择适合利用抗cd47抗体治疗的受试者。在一个实施方案中，抗cd47抗体是被可检测地标记的。
504.再一方面，本发明提供了检测样品中cd47蛋白含量或水平的试剂盒，其包括任何本发明所述的抗cd47抗体或其抗原结合片段和使用说明书。
505.本发明所述cd47抗体或其抗原结合片段以高亲和力与人cd47结合，阻断cd47与sirpα的相互作用，并促进巨噬细胞对表达cd47的肿瘤细胞的吞噬活性，同时不导致显著的红细胞血凝反应。此外，本发明提供的cd47抗体在人burkkit’s淋巴瘤的小鼠移植瘤模型中显示出极其显著的抗肿瘤活性。因此，本发明的cd47抗体克服了用于治疗性靶向cd47的关键限制因素。
506.另外，本发明提供的cd47抗体可同时结合人和食蟹猴和/或恒河猴的cd47天然抗原，使其临床前毒理学评价不需要再构建替代分子，且获得的有效剂量、毒性剂量和毒副反应更客观、准确，可以直接进行临床剂量的转换，降低临床研究的风险。
507.发明详述
508.在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
509.缩写和定义
510.cdr
ꢀꢀꢀꢀ
用kabat编号系统界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区
511.ec
50
ꢀꢀꢀ
产生50％功效或结合的浓度
512.elisa
ꢀꢀ
酶联免疫吸附测定
513.fr
ꢀꢀꢀꢀꢀ
抗体构架区：将cdr区排除在外的免疫球蛋白可变区
514.hrp
ꢀꢀꢀꢀ
辣根过氧化物酶
515.ic
50
ꢀꢀꢀ
产生50％抑制的浓度
516.igg
ꢀꢀꢀꢀ
免疫球蛋白g
517.kabat
ꢀꢀ
由elvinakabat倡导的免疫球蛋白比对及编号系统
518.mab
ꢀꢀꢀꢀ
单克隆抗体
519.pcr
ꢀꢀꢀꢀ
聚合酶链式反应
520.v区
ꢀꢀꢀ
在不同抗体之间序列可变的igg链区段。其延伸到轻链的109位kabat残基和重链的第113位残基。
521.vh
ꢀꢀꢀꢀ
免疫球蛋白重链可变区
522.vk
ꢀꢀꢀꢀ
免疫球蛋白κ轻链可变区
523.kdꢀꢀꢀꢀ
平衡解离常数
524.ka
ꢀꢀꢀꢀ
结合速率常数
525.kd
ꢀꢀꢀꢀ
解离速率常数
526.术语“凝集”是指细胞凝集，而术语“血细胞凝集”是指特定细胞亚型即红细胞的凝集。因此，血细胞凝集是凝集的一种类型。本发明的所述抗体不导致显著的凝集水平，例如血红细胞血凝反应(“rbc血凝反应”)。我们观察到，本发明的抗体以不促进cd47阳性细胞凝集的方式特异性结合cd47；并且，本发明的抗体结合细胞表面的cd47且不产生细胞凝集现象的能力不限于红血球细胞。
527.本领域的技术人员可以通过常规实验对凝集水平进行定量，例如rbc的血凝反应。例如，本领域的技术人员可在本发明的cd47抗体存在的条件下进行血凝反应试验，其后测量rbc斑点的面积以确定血凝反应的水平，如下文实施例中所述。在一些情况下，对存在本发明cd47抗体时的rbc斑点面积与不存在本发明cd47抗体时(即零血凝反应条件下)的rbc斑点面积，以及存在其他已知cd47抗体时的rbc斑点面积进行了比较。在这种方式下，相对于基线对照对血凝反应进行定量。rbc斑点的面积越大表明血凝反应的水平越高。或者，也可使用rbc斑点的密度分析对血凝反应进行定量。
528.术语“血红细胞”和“红细胞”是同义词并可互换使用。
529.本文所用术语“超变区”或“cdr区"或“互补决定区”是指负责抗原结合的抗体氨基酸残基。cdr区序列可以由imgt、kabat、chothia和abm方法来定义或本领域熟知的任何cdr区序列确定方法而鉴定的可变区内的氨基酸残基。抗体cdr可鉴定为最初由kabat等人定义的高变区，例如，轻链可变结构域的24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)位残基和重链可变结构域的31-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)位残基，参见kabat等，1991，sequences of proteins of immunological interest(免疫目的物的蛋白质序列)，第5版，public health service，national institutes of health，bethesda，md.；cdr的位置亦可鉴定为最初由chothia等人描述的“超变环”(hvl)结构来界定的，例如，轻链可变结构域的26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)位残基和重链可变结构域的26-32(h1)、52-56(h2)和95-102(h3)位残基(参见例如chothia等人,j mol biol,1992,227:799-817；tomlinson等人,j mol biol,1992,227:776-798)。imgt(immunogenetics)也提供了包括cdr的免疫球蛋白可变区的编号系统，根据imgt编号定义cdr区，例如，轻链可变结构域的27-32(l1)、50-52(l2)和89-97(l3)位残基和重链可变结构域的26-35(h1)、51-57(h2)和93-102(h3)位残基，参见如lefranc,m.p.等的dev comp immunol,2003,27:55-77，其通过引用并入本文。用于cdr鉴定的其它方法包括“abm定义”，其为kabat与chothia之间的折衷且使用oxford molecular
′
s abm抗体模型软件得到；或cdr的“接触定义”，其基于所观察的抗原接触且阐述于maccallum等人，1996，j.mol.biol.，262：732-745中。cdr的“构型定义”方法中，cdr的位置
可鉴定为对抗原结合作出焓贡献的残基，参见例如makabe等人，2008，journal of biological chemistry，283：1156-1166。本发明所用的方法可利用或根据这些方法中的任一种所定义的cdr，包括但不限于kabat定义、imgt定义、chothia定义、abm定义、接触定义和/或构型定义中的任一者来定义。
530.术语“构架区”“可变构架区”、“fr区”为除本发明定义的超变区残基之外的可变结构域残基。在某些实施方案中，抗cd47抗体分子的轻链可变构架区或重链可变构架区可以选自：(a)包含至少70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、97、98、99％或优选地100％的来自人轻链或重链可变构架区的氨基酸残基(例如来自人成熟抗体、人种系序列或人共有序列的轻链或重链可变构架区残基)的轻链或重链可变构架区；(b)非人构架区(例如啮齿类动物构架)；或(c)已经被修饰的(例如被修饰以除去抗原决定簇或细胞毒性决定簇)的非人构架区，例如去免疫的或部分地人源化的构架。在一些实施方案中，轻链或重链可变构架区包含与人生殖细胞基因的v
l
或vh段的构架区至少70、75、80、85、86、87、88、89、90、91、92、94、95、96、97、98、99％相同或相同的轻或重链可变构架区序列。在某些实施方案中，抗cd47抗体分子包括来自例如完整可变区(例如在表1中所示的)中fr区的氨基酸序列的具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、10个、15个、20个或更多个改变(例如氨基酸取代、插入或缺失)的重链可变区。在某些实施方案中，抗cd47抗体分子包括来自例如完整可变区(例如在表1中所示的)中fr区的氨基酸序列的具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、10个、15个、20个或更多个改变(例如氨基酸取代、插入或缺失)的轻链可变区。
531.术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。可以通过任何合适的重组dna技术产生嵌合抗体。一些是本领域已知的(参见pct/us86/02269；ep184,187；ep171,496；ep173,494；wo86/01533；us4,816,567；ep125,023；better等人,science,1988,240:1041-1043)；liu等人,pnas,1987,84:3439-3443；liu等人,j immunol,1987,139:3521-3526；sun等人,pnas,1987,84:214-218；nishimura等人,canc res,1987,47:999-1005；wood等人,nature,1985,314:446-449；和shaw等人,j natl cancer inst,1988,80:1553-1559)。在本发明的一优选实施方案中，所述的cd47嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链fr区。所述cd47嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源igg1、igg2、igg3或其变体的重链fr区。人抗体的恒定区可选自人源igg1、igg2、igg3或igg4或其变体的重链恒定区，优选包含人源igg1或igg4重链恒定区。
[0532]“人共有框架”是指这样的框架，即在选择人免疫球蛋白vl或vh框架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白vl或vh序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如kabat等，sequences of proteins ofimmunological interest，第五版，nih publication 91-3242，bethesda md(1991)，1-3卷中的亚型。
[0533]“人源化”抗体是指包含来自非人hvr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的hvr(例如，cdr)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的fr对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
[0534]“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0535]
本文所用术语“阻断”表示存在本发明的抗体时减少的cd47信号传递。cd47介导的信号传递阻断指本发明的cd47抗体存在时cd47信号传递水平低于cd47的对照水平(即不存在抗体时的cd47信号传递水平)，降低的幅度大于或等于5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或100％。可使用多种标准技术测量cd47信号传递水平，如作为非限制性实施例，测量下游基因激活和/或响应cd47激活的荧光素酶报告试验。本领域技术人员应理解可使用多种试验测量cd47信号传递水平，包括例如市售可得的试剂盒。
[0536]
本文使用的术语“免疫结合”和“免疫结合性质”是指一种非共价相互作用，其发生在免疫球蛋白分子和抗原(对于该抗原而言免疫球蛋白为特异性的)之间。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数(kd)表示，其中kd值越小，表示亲和力越高。所选多肽的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kd或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出。(参见malmqvist m,nature,1993,361:186-187)。kd/ka的比率等于解离常数kd(通常参见davies等人,annual rev biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、ka和kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法(例如，实施例2.5中所述的fortebio octet法)来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如biacore)或kinexa来测量解离常数。当平衡结合常数(kd)为≤10μm，优选为≤100nm，更优选为≤10nm，和最优选为≤100pm～约1pm时，本发明的抗体被认为特异性地结合至cd47表位。
[0537]
本发明的抗cd47抗体
[0538]
除非另外说明，术语“cd47”、“整合素相关蛋白(iap)”、“卵巢癌抗原oa3”和“rh-相关的抗原”同义并且可互换使用，当用于本文中时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然cd47，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的cd47以及由细胞内加工产生的任何形式的cd47或其任何片段。该术语还包括天然存在的cd47的变体，例如，剪接变体或等位变体。
[0539]
术语“抗cd47抗体”、“抗cd47”、“cd47抗体”或“结合cd47的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合cd47蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向cd47中的诊断剂和/或治疗剂。在一些实施方案中，本文提供的抗cd47的抗体的解离常数(kd)≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm、≤0.1nm、≤0.01nm或≤0.001nm(例如10-8
m以下，例如10-8
m至10-13
m，例如10-9
m至10-13
m)。
[0540]
在一些实施方案中，本发明的抗cd47抗体或其抗原结合片段包含取代、插入或缺失。在优选的实施方案中，取代、插入或缺失发生在cdr外的区域(例如在fr中)。任选地，本发明的抗cd47抗体包括对轻链可变区、重链可变区、轻链或重链的翻译后修饰。
[0541]
在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生fc区变体。fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人fc区序列(例如人igg1、igg2、igg3或igg4 fc区)。
[0542]
在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代mab”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基取代。
[0543]
在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(peg)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。
[0544]
在一些实施方案中，本发明涵盖抗cd47抗体的片段。抗体片段的实例包括但不限于fv、fab、fab
′
、fab
’-
sh，f(ab’)2、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0545]
在一些实施方案中，本发明的抗cd47抗体是人源化抗体。用于使抗体人源化的不同方法是技术人员已知的，如由almagro&fransson综述的，其内容通过引用完整并入本文(almagro jc和fransson j,frontiers in bioscience,2008,13:1619-1633)。almagro&fransson区分理性办法和经验办法。理性办法的特征在于生成少数工程化抗体变体并评估其结合或任何其它感兴趣的特性。如果设计的变体不产生预期的结果，那么启动新一轮的设计和结合评估。理性办法包括cdr嫁接、表面重建(resurfacing)、超人源化(superhumanization)和人字符串内容优化(human stringcontent optimization)。相比之下，经验办法基于生成大的人源化变体库并使用富集技术或高通量筛选选出最佳克隆。因而，经验办法依赖于能够对大量抗体变体进行搜索的可靠的选择和/或筛选系统。体外展示技术，如噬菌体展示和核糖体展示满足这些要求并且是技术人员公知的。经验办法包括fr库、导向选择(guided selection)、框架改组(framework-shuffling)和humaneering。
[0546]
在一些实施方案中，本发明的抗cd47抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van dijk和van de winkel,curr opin pharmacol,2001,5:368-374以及lonberg,curr opin immunol,2008,20:450-459。
[0547]
适用于本发明的“抗体及其抗原结合片段”包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双特异性、异缀合物、多特异性、重组、异源、异源杂合、嵌合、人源化(特别是嫁接有cdr的)、去免疫的、或人的抗体、fab片段、fab
′
片段、f(ab
′
)2片段、由fab表达库产生的片段、fd、fv、二硫化物连接的fv(dsfv)、单链抗体(例如scfv)、双抗体或四抗体(holliger p等,proc natl acad sci usa,1993,90(14):6444-6448)、纳米抗体(nanobody)(也称为单域抗体)、抗独特型(抗id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗id抗体)和上述任一种的表位结合片段。
[0548]
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性或多特异性的。多特异性单抗可以对一种靶多肽的不同表位是特异性的或可以含有对超过一种靶多肽特异性的抗原结合域。参见例如，tutt等,j immunol,1991,147:60-69。抗cd47单抗可以与另一种功能性分子(例如另一种肽或蛋白质)连接或共表达。例如抗体或其片段可以功能性与一或多种其它分子，如另一种抗体或抗体片段连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价联合或以其它方式)以产生具有第二或更多结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
[0549]
在一些实施方案中，本发明的抗体结合人cd47蛋白，部分或完全地调节、阻断、抑
制、减少、拮抗、中和或干扰cd47与sirpα的结合从而完全或部分地抑制cd47的功能活性。cd47的功能活性包括例如通过与sirpα的相互作用传导信号、在细胞粘附至细胞外基质后调节(如增加)细胞内钙离子浓度、与血小板反应蛋白的c端细胞结合结构域相互作用、与血纤蛋白原相互作用以及与多种整联蛋白相互作用。例如，cd47抗体通过抑制sirp-α与cd47结合，减少cd47-sirpα介导的信号传导，促进吞噬作用，并且抑制肿瘤生长和/或迁移。
[0550]
本发明的cd47抗体表现出多种需要的特性，如通过非限制性实施例的方式有效地阻断cd47与其配体sirpα的相互作用，同时不导致显著的红细胞血凝反应，以及有效的抗肿瘤活性。例如，与不存在本文所述cd47抗体时cd47与sirpα之间的相互作用水平相比，本发明的cd47抗体阻断了cd47与sirpα之间至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％或至少99％的相互作用。
[0551]
本发明的cd47抗体不会导致显著的细胞凝集，例如本发明的cd47抗体不会导致显著的血红细胞血凝反应。在一些情况下，显著的细胞凝集指现有cd47抗体存在时的凝集水平。在一个方面，与现有cd47抗体存在时的凝集水平相比，本发明的cd47抗体存在时的凝集水平下降了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。在一些实施方式中，如果与现有cd47抗体存在时的凝集水平相比，本发明的cd47抗体存在时的凝集水平下降了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％，则说明本发明的cd47抗体未导致显著的凝集水平。
[0552]
与本领域已知的抗体相比，在肿瘤模型中本发明的抗体也显著有效。例如，与现有cd47抗体存在时巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力相比，本发明的cd47抗体存在时巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力升高了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少99％。
[0553]
药物组合物和药物制剂
[0554]
本发明还提供了包括一种或多种结合cd47或其免疫活性片段的单克隆抗体的药物组合物。应理解，本发明提供的抗cd47抗体或药物组合物可以整合至制剂中合适的运载体、赋形剂和其他试剂以联合给药，从而改善其转移、递送、耐受等性质。
[0555]
术语“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
[0556]
术语“药用载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂或媒介物。
[0557]
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性，以及避免相关疾病的复发。
[0558]
本发明还包括包含抗cd47抗体的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和包含编码抗cd47抗体的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种结合cd47的抗体或一种或多种编码一种或多种结合cd47的抗体的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的药用载体，如本领域中已知的药用赋形剂，包括缓冲剂。
[0559]
本发明的药物组合物可包括本发明的抗体和药用载体。这些药物组合物可包括于
试剂盒中，如诊断试剂盒。
[0560]
适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些具有石油、动物、植物或合成来源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“hand book of pharmaceutical excipients”,第五版,r.c.rowe等,pharmaceuticalpress,london,chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或ph缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准载体，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。
[0561]
可以通过将具有所需纯度的本发明的抗cd47抗体与一种或多种任选的药用载体(remington’s pharmaceutical sciences,1980,第16版,osol a.编)混合来制备包含本文所述的抗cd47抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。
[0562]
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和wo2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
[0563]
本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分，所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
[0564]
本发明的药物组合物可制备成持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
[0565]
具有保守修饰的抗体
[0566]
术语“保守修饰”意图指氨基酸修饰不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸的取代、添加和缺失。修饰可以通过本领域已知的标准技术，例如定点诱变和pcr介导的优点引入到本发明的抗体中。保守氨基酸取代指氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基替换。本领域中对具有类似侧链的氨基酸残基家族已有详细说明。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，可以用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换本发明抗体cdr区中的一个或多个氨基酸残基。
[0567]
cd47抗体的治疗用途
[0568]
本发明还提供了所述cd47抗体用于治疗细胞、组织、器官、动物或患者中癌症的方法。
[0569]
癌症的实例包括但不限于：实体瘤、软组织肿瘤、造血系统肿瘤和转移性病变。
[0570]
造血系统肿瘤的实例包括：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病(aml)、慢性髓细胞白血病(cml)、慢性淋巴细胞白血病(cll)例如转化的cll、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(mds)、淋
巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或richter综合征(richter转化)。
[0571]
另外的血液癌症包括：骨髓增生异常综合征(mds)(例如，白血病前期、难治性贫血、ph阴性慢性髓细胞白血病、慢性髓单核细胞白血病、髓样化生)、非霍奇金淋巴瘤(例如，弥漫性大b细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、b成淋巴细胞白血病/淋巴瘤、外周t细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤)、b成淋巴细胞白血病/淋巴瘤；b细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤；b细胞-幼淋巴细胞白血病；淋巴浆细胞性淋巴瘤；脾边缘区b细胞淋巴瘤(
±
绒毛状淋巴细胞)；毛细胞白血病；浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤；malt类型的结外边缘区b细胞淋巴瘤；结节性边缘区b细胞淋巴瘤(
±
单核细胞样b细胞)；滤泡淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；弥漫性大b细胞淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；前体t成淋巴细胞淋巴瘤/白血病；t细胞幼淋巴细胞白血病；t细胞颗粒淋巴细胞白血病；侵袭性nk细胞白血病；成人t细胞淋巴瘤/白血病(htlv 1阳性)；结外nk/t细胞淋巴瘤，鼻型；肠病型t细胞淋巴瘤；肝脾型γ-δt细胞淋巴瘤；皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤；蕈样霉菌病/塞扎里综合征；间变性大细胞淋巴瘤，t/裸细胞(null cell)，原发皮肤型；间变性大细胞淋巴瘤，t/裸细胞，原发系统型；外周t细胞淋巴瘤(没有对其它方面进行表征)；血管免疫母细胞性t细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓细胞白血病(cml)、多发性骨髓瘤、真性红细胞增多症或骨髓纤维化、皮肤t细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、边缘区淋巴瘤、cns淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤和前体b成淋巴细胞淋巴瘤。
[0572]
实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和癌，如影响头颈(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(nsclc))、乳腺、淋巴样、胃肠(例如，口腔、食道、胃、肝脏、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和泌尿生殖道(例如，肾、泌尿上皮、膀胱、卵巢、子宫、子宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、cns(例如，神经或胶质细胞，例如，神经母细胞瘤或胶质瘤)或皮肤(例如，黑色素瘤)的那些。在某些实施方案中，所述实体瘤为nmda受体阳性畸胎瘤。在某些实施方案中，所述癌症选自：乳腺癌、结肠癌、胰腺癌(例如，胰腺神经内分泌肿瘤(pnet)或胰腺导管腺癌(pdac))、胃癌、子宫癌或卵巢癌。
[0573]
抗cd-47抗体，包括例如本文所述的抗体分子，也可以用于治疗炎性病症、自身免疫性病症、纤维化病症、纤维增生性病症、特应性病症或血管生成病症。炎性病症的实例包括但不限于：慢性阻塞性肺病、哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、多发性硬化症、银屑病、缺血再灌注损伤、败血性休克、年龄相关性黄斑变性(例如，湿性年龄相关性黄斑变性)、动脉粥样硬化、阿尔茨海默氏病、帕金森病、心血管疾病、血管炎、i型和ii型糖尿病、代谢综合征、糖尿病视网膜病变、再狭窄。自身免疫性疾病的实例包括但不限于：哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、i型糖尿病、系统性红斑狼疮(sle)、斯耶格伦氏综合征、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、格林巴利综合征、自身免疫性肝炎和重症肌无力。纤维化疾病的实例包括但不限于：硬皮病、肝纤维化、胰腺纤维化、慢性阻塞性肺病、糖尿病性肾病、结节病、特发性肺纤维化、肝硬化、囊性纤维化、神经纤维瘤病、子宫内膜异位、术后肌瘤和再狭窄。特应性疾病的实例包括但不限于：特应性皮炎、特应性哮喘和过敏性鼻炎。
[0574]
cd47抗体的治疗方法和用途
[0575]
在一方面中，本发明涉及在受试者中抑制、拮抗cd47与sirpα结合的方法，所述方
法包括向受试者施用有效量的本文所述的任何抗cd47抗体或其片段。在另一方面中，本发明涉及促进受试者的吞噬细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任何抗cd47抗体或其片段。在一方面中，本发明涉及治疗以cd47为治疗靶点的相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任何抗cd47抗体或其片段。在一方面中，本发明涉及可以通过消除、抑制或降低cd47与sirpα的结合而改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症的方法。在另一方面，本发明通过向有需要的受试者施用本发明的抗cd47抗体或其片段而提供治疗受试者癌症或者肿瘤的方法、缓解受试者癌症或者肿瘤症状的方法、避免受试者肿瘤或者癌症复发的方法。
[0576]
在一方面，本发明提供的抗cd47抗体及其抗原结合片段和包含其的药物组合物可以用作治疗剂，用于诊断、预后、监控、治疗、缓和和/或预防受试者中异常cd47的表达、活性和/或信号传递相关的疾病和病症。通过使用标准方法鉴定受试者中存在异常cd47的表达、活性和/或信号传递相关的疾病和病症时，可以给药本发明公开的抗cd47抗体及其抗原结合片段和包含其的药物组合物。
[0577]
在其他方面，本发明提供抗cd47抗体在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗上文提及的相关疾病或病症。
[0578]
本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
[0579]
为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。
[0580]
在另一方面，本发明的抗体可以用于体内或者体外检测与cd47相关的疾病的治疗的进程，例如，通过测量表达cd47的细胞(例如癌症细胞)的数目的增加或者减少，可以确定是否某种特定的旨在治疗疾病、缓解症状的疗法是否有效。
[0581]
用于诊断和检测的方法和组合物
[0582]
在某些实施方案中，本文中提供的任何抗cd47抗体或其抗原结合片段可以用于检测cd47在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。
[0583]
在某些实施方案中，提供标记的抗cd47抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32p、14c、125i、3h和131i，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(hr)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，
葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如hr，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。
[0584]
免疫结合及免疫应答
[0585]
术语“免疫结合”和“免疫结合性质”是指一种非共价相互作用，其发生在免疫球蛋白分子和抗原(对于该抗原而言免疫球蛋白为特异性的)之间。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的平衡解离常数(kd)表示，其中kd值越小，表示亲和力越高。所选多肽的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法测定。一种测定方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kd或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见malmqvist m,1993,nature,361:186-187)。kd/ka的比率等于解离常数kd(通常参见davies dr et al,1990,annual rev biochem,59:439-473)。可用任何有效的方法测量kd、ka和kd值。
[0586]
术语“免疫细胞”包括具有造血起源并在免疫应答中起作用的细胞，包括淋巴细胞，例如b细胞和t细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞和粒细胞。
[0587]“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如t淋巴细胞，b淋巴细胞，自然杀伤(nk)细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，树突状细胞和嗜中性粒细胞)和由这些细胞或肝脏中的任何一种产生的可溶性大分子(包括抗体，细胞因子和补体)的作用，该作用导致选择性地靶向，结合，损伤，破坏和/或从脊椎动物体内清除入侵的病原体，感染病原体的细胞或组织，癌细胞或其他异常细胞，或者在自身免疫或病理性炎症的情形下，是正常的人类细胞或组织。免疫反应包括例如t细胞(例如效应t细胞或th细胞，如cd4 或cd8 t细胞)的活化或抑制，或treg细胞的抑制。
[0588]
术语“免疫原性”指特定物质引发免疫应答的能力。
[0589]
效应子功能
[0590]
术语“效应细胞”是指免疫系统的一种细胞，其表达一种或多种fcr并介导一种或多种效应器功能。优选地，该细胞表达至少一种类型的激活性fc受体，例如人fcγriii，并执行adcc效应器功能。介导adcc的人白细胞的实例包括外周血单个核细胞(pbmc)、nk细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。效应细胞也包括例如t细胞。他们可以来源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物体。
[0591]
术语“效应子功能”是指，那些可归因于抗体fc区(天然序列fc区或氨基酸序列变体fc区)的生物学活性，且其随抗体不同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括但不限于：fc受体结合亲和性、adcc、adcp、cdc、细胞表面受体(例如b细胞受体)的下调、b细胞活化、细胞因子分泌、抗体和抗原/抗体复合物的半衰期/清除率等。改变抗体的效应子功能的方法是本领域已知的，例如通过在fc区引入突变来完成。
[0592]
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)”是指一种细胞毒性形式，抗体作为一种桥联形式，通过与免疫细胞或细胞毒性细胞(例如nk细胞、中性粒细胞或巨噬细胞)上存在的fcr结合，使这些细胞毒性效应细胞特异性结合到抗体附着的靶细胞上，然后通过分泌细胞毒素杀死靶细胞。检测抗体的adcc活性的方法是本领域已知的，例如可通过测定待测抗体与fcr(例如cd16a)之间的结合活性来评价。
[0593]
术语“抗体依赖细胞介导的吞噬作用(adcp)”指一种细胞介导的反应，在该反应中，表达fcγr的非特异性细胞毒活性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起该靶细胞的吞噬。
[0594]
术语“补体依赖的细胞毒性(cdc)”是指通过使补体成分c1q与抗体fc结合来激活补体级联的细胞毒性形式。检测抗体的cdc活性的方法是本领域已知的，例如可通过测定待测抗体与fc受体(例如c1q)之间的结合活性来评价。
[0595]
单克隆抗体制备
[0596]
本发明的单克隆抗体(mab)可以通过多种技术进行制备，包括常规单克隆抗体方法学，例如kohler和milstein,nature,1975；256:495中所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交规程，但是原则上也可以使用制备单克隆抗体的其它方法，例如b淋巴细胞的病毒或致癌转化。
[0597]
用于制备杂交瘤的优选动物系统为鼠科动物系统。在小鼠中制备杂交瘤是非常完善的规程。分离用于融合的经免疫的脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合规程也是已知的。
[0598]
为表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如pcr扩增或使用表达目标抗体的杂交瘤的cdna克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的dna，并且可以将dna插入到表达载体中，从而使得目的基因与转录和翻译调控序列可操作的连接，转染宿主细胞进行表达，表达宿主优选真核表达载体，更优选哺乳动物细胞，例如cho及其衍生细胞系。
[0599]
抗体可通过公知的技术，例如使用蛋白a或蛋白g的亲和层析纯化。随后或备选地，可将特异性抗原或其表位固定在柱上以通过免疫亲和层析而纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化例如由d.wilkinson论述(the scientist,由the scientist,inc.,philadelphia pa,vol.14,no.8(2000年4月17日),25-28页公布)。
[0600]
本发明的嵌合或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的序列进行制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的dna可以从目标鼠杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为创造嵌合抗体，可使用本领域已知的方法将鼠可变区连接至人恒定区(参见例如cabilly等人的美国专利no.4,816,567)。通过将编码vh的dna可操作的连接至编码重链恒定区(ch1、ch2和ch3)的另一dna分子可以将编码vh区的分离的dna转变为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如kabat,e.a.等人,1991,sequences of proteins of immunological interest,fifth edition,u.s.department of health and human services,nih publication no.91-3242)，包含这些区的dna片段可以通过标准pcr扩增获得。重链恒定区可以是igg1、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，但是最优选为igg1或igg4恒定区。
[0601]
为创造人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠cdr区插入人源框架序列(参见winter的美国专利no.5,225,539及queen等人的美国专利nos.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。还可以利用转基因动物，例如，humab小鼠(medarex,inc.)含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微型基因座(miniloci)，加之使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如lonberg等人(1994)nature 368(6474):856-859)；或携带人重链转基因和人轻链转染色体的“km小鼠
tm”(参见
专利wo02/43478)进行抗体人源化改造。其他抗体人源化改造的方法包括噬菌体展示技术。
[0602]
通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应解释为进一步限制。在此将整篇申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和已公开专利申请的内容明确收入本文作为参考。
附图说明
[0603]
图1、纯化的鼠源抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331以及mo2a2351与人cd47抗原的结合能力测定。
[0604]
图2-1、纯化的鼠源抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331以及mo2a2351与小鼠cd47抗原的交叉反应性测定。
[0605]
图2-2、纯化的鼠源抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331以及mo2a2351与食蟹猴cd47抗原的交叉反应性测定。
[0606]
图3-1、鼠源单抗mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331以及mo2a2351与对照抗体ab12w1竞争结合人cd47的能力。
[0607]
图3-2、鼠源单抗mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331以及mo2a2351与对照抗体ab12w2竞争结合人cd47的能力。
[0608]
图3-3、鼠源单抗mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331以及mo2a2351与人sirpα竞争结合人cd47的能力。
[0609]
图4-1、流式细胞术检测cd47候选鼠源单抗mo2a11971和mo2a21331与ccrf-cem细胞的结合能力。
[0610]
图4-2、流式细胞术检测cd47候选鼠源单抗mo2a11971和mo2a21331与raji细胞的结合能力。
[0611]
图5、人源化抗体ab12w3和ab12w6与人cd47抗原的结合能力测定。
[0612]
图6、人源化抗体ab12w3和ab12w6阻断cd47与受体sirpα结合的能力。
[0613]
图7-1、人源化抗体ab12w3、ab12w4和ab12w6与淋巴瘤细胞jurkat的结合能力测定。
[0614]
图7-2、人源化抗体ab12w3、ab12w4和ab12w6与淋巴瘤细胞raji的结合能力测定。
[0615]
图7-3、人源化抗体ab12w9与人急性淋巴白血病细胞ccrf-cem的结合能力测定。
[0616]
图8-1、人源化抗体ab12w3和ab12w6与cho/k1-hcd47稳定细胞株的结合能力测定。
[0617]
图8-2、人源化抗体ab12w9与cho/k1-hcd47稳定细胞株的结合能力测定。
[0618]
图9、人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w5和ab12w6的cdc活性测定。
[0619]
图10、人源化抗体ab12w3、ab12w4和ab12w6介导巨噬细胞对肿瘤细胞的ccrf-cem的吞噬作用。
[0620]
图11、人源化抗体ab12w3和ab12w4介导的巨噬细胞对红细胞rbc的吞噬能力测定。
[0621]
图12、人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w5、ab12w6、ab12w8、ab12w9和ab12w10促进红细胞凝集活性测定。
[0622]
图13、cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w5和ab12w6在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下移植瘤模型中的抑瘤作用。
[0623]
图14、cd47人源化抗体ab12w6、ab12w9和ab12w10在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下
移植瘤模型中的抑瘤作用。
[0624]
图15、cd47人源化抗体ab12w8和ab12w9单用或与rituxan联用在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下移植瘤模型中的抑瘤作用。
[0625]
图16、cd47人源化抗体ab12w9单用或与rituxan联用在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下移植瘤模型中的抑瘤作用。
具体实施方式
[0626]
实施例1：抗人cd47鼠源单克隆抗体的制备
[0627]
将人cd47抗原50μg(北京义翘神州生物技术有限公司)以完全弗氏佐剂充分乳化后，采用多点免疫方式免疫雄性balb/c小鼠，免疫周期为三周一次。在第3次免疫后第10天，通过眼窝取血，elisa测试血浆抗人cd47抗体滴度以监测小鼠免疫应答程度，然后在融合前3天，对产生抗人cd47抗体滴度最高的小鼠加强免疫一次。3天后，处死小鼠并取出该小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤sp2/0细胞株融合。混合2
×
108sp2/0细胞与2
×
108脾细胞在50％聚乙二醇(分子量为1450)和5％二甲基亚砜(dmso)溶液中融合。用iscove培养基(含有10％胎牛血清，100单位/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.1mm次黄嘌呤，0.4μm氨基蝶呤和16μm胸苷)来调整脾脏细胞数至5
×
105/ml，以0.3ml加入96孔培养板孔内，并置于37℃，5％co2培养箱内。培养10天后，采用高通量elisa法分别检测上清中抗体与hrp标记的人sirpα竞争结合cd47的能力，以此筛选出与人sirpα竞争的阳性孔(方法参见实施例2.3)。再将上述含有能够抑制hrp标记sirpα与人cd47结合的单克隆抗体的孔内融合细胞进行亚克隆，同样以竞争elisa方法筛选得到3个表达高亲和力鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别是#2a1621、#2a11971、#2a21331和#2a2351。
[0628]
在补充10％fcs的rpmi 1640培养基中培养产生特异性抗体的克隆。当细胞密度达到大约5
×
105个细胞/ml时，用无血清培养基替换该培养基。2至4天后，将培养过的培养基离心，收集培养上清液。用蛋白g柱纯化抗体，然后用150mm nacl透析单克隆抗体洗脱液。通过0.2μm滤器将透析的溶液过滤除菌，以获得待测试的纯化的鼠单克隆抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331和mo2a2351。
[0629]
实施例2、抗人cd47鼠源单克隆抗体的功能鉴定
[0630]
2.1 elisa法测定鼠源抗体与人cd47抗原的结合能力
[0631]
以人cd47(北京义翘神州生物技术有限公司)包被酶标板，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在pbs缓冲液的脱脂奶粉封闭0.5h，用pbst(ph7.4，pbs含0.05％吐温20)洗板3～4次。然后每孔分别加入50μl纯化的抗人cd47鼠源抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331和mo2a2351及针对cd47的人源化抗体ab12w1和ab12w2作为阳性对照(ab12w1来源于forty-seven公司开发的抗人cd47人源化抗体hu5f9-g4，其vh和vl序列参见美国专利us9017675b2，分别如本文seq id no：1和2所示；ab12w2的可变区序列来源于celgene公司开发的抗人cd47人源化抗体cc-90002，其vh和vl序列参见中国专利cn104271757b，分别如本文seq id no：3和4所示)，室温孵育1h，用含有0.05％吐温(tween)20的pbs洗孔，然后每孔加入50μl hrp标记的羊抗鼠或羊抗人igg多克隆抗体(jackson laboratory)作为检测抗体，再以pbst洗板3～4次、加入底物tmb显色10分钟、然后加入0.2m h2so4终止反应，后读取吸光度值(od值)，其结果示于图1。
[0632]
2.2 抗cd47鼠源抗体种属交叉反应测定
[0633]
对获得的鼠源单抗mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331和mo2a2351与小鼠和食蟹猴的cd47的结合能力进行了测定。
[0634]
用pbs缓冲液将食蟹猴cd47(北京义翘神州生物技术有限公司)及小鼠cd47抗原(北京义翘神州生物技术有限公司)，稀释至0.1μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，4℃放置16～20h。吸掉上清，用pbst缓冲液洗板1次后，每孔加入200μl含1％脱脂奶粉的pbst(pbst/1％脱脂奶粉)，室温孵育1h封闭。移去封闭液，用pbst缓冲液洗板3次后，加入待测抗cd47抗体，100μl/孔，室温孵育1.5h。移去反应体系，pbst洗板3次后，50μl/孔加入1：4000稀释的hrp标记的羊抗鼠igg二抗(the jackson laboratory)，室温孵育1h。再以pbst洗板3次后，每孔加入100μl tmb，室温孵育5-10min。最后，每孔加入50μl 0.2m h2so4终止反应，并用酶标仪在双波长450/620nm处读取od值。
[0635]
如图2-1所示，mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331以及mo2a2351与鼠cd47均不能特异结合。图2-2中显示mo2a21331与食蟹猴cd47的结合能力最强，mo2a1621和mo2a11971与食蟹猴cd47的结合能力相对较弱，而mo2a2351几乎不与食蟹猴cd47结合。
[0636]
2.3 elisa法测定鼠源抗体的相对亲和力
[0637]
用pbs缓冲液将人cd47抗原(北京义翘神州生物技术有限公司)稀释至0.1μg/ml，以100μl/孔加于96孔板中，室温过夜。弃去包被溶液，每孔加入200μl pbst/1％脱脂奶粉，室温孵育1h进行封闭。移去封闭液，用pbst缓冲液洗板3次后，然后每孔加入50μl生长培养基(dmem 5％fbs)与50μl以辣根过氧化物酶(hrp)标记的对照抗体ab12w1或ab12w2，分别以pbs洗去未结合的hrp标记的ab12w1或ab12w2。然后分别加入抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331和mo2a2351；以培养基作为空白对照。充分孵育后以pbs洗去未结合的hrp标记的ab12w1或ab12w2，然后用酶标仪在双波长450/620nm处读取od值。
[0638]
另外，还测定了抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331和mo2a2351与hrp标记的人sirpα(北京义翘神州生物技术有限公司，货号11612-h08h)竞争结合人cd47的能力，同样以抗体ab12w1和ab12w2作为阳性对照，方法同上。
[0639]
结果如图3-1和图3-2所示，抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331和mo2a2351都能显著地竞争性阻断ab12w1或ab12w2与人cd47的结合。
[0640]
图3-3中显示，抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331和mo2a2351同对照抗体ab12w1和ab12w2一样，都能与人sirpα竞争结合cd47，即通过阻断cd47和sirpα的结合发挥功能。
[0641]
2.4 流式细胞术测定鼠源抗体与cd47表达阳性细胞的结合能力
[0642]
用流式细胞术(facs)检测cd47候选鼠抗与两株cd47高表达肿瘤细胞的结合能力。分别培养人burkitt's淋巴瘤细胞raji-luc(北京百奥赛图基因生物技术有限公司)和人急性淋巴白血病细胞ccrf-cem(中科院上海细胞所)，离心收集细胞。将收集的细胞用1％pbsb重悬，调整细胞密度为2
×
106/ml，铺于96孔板中，每孔100μl(2
×
105个细胞)，4℃封闭0.5h。同时稀释cd47鼠源抗体mo2a11971和mo2a21331以及对照抗体ab12w2，从10μg/ml开始，5倍梯度稀释，得到7个浓度梯度，备用。封闭后的细胞离心弃上清，加入稀释好的cd47人源化抗体，4℃孵育1h；离心去上清，用1％pbsb洗3遍，加入稀释好的f4647标记的山羊抗人igg多抗(the jackson laboratory，货号109-605-088)，4℃避光孵育1h；离心去上清，1％pbsb洗2
遍，每孔再用100μl 1％pf重悬，上机检测(bd accuri c6)。再以平均荧光强度，通过软件originpro 8.0进行分析，计算cd47人源化抗体与这2株肿瘤细胞结合的ec
50
值，并比较cd47鼠源抗体mo2a11971和mo2a33和对照抗体ab12w2的结合活性。
[0643]
图4-1和图4-2结果显示，候选鼠抗mo2a11971和对照抗体ab12w2与这两株细胞表面的cd47结合能力相当，mo2a21331结合能力相对较弱。
[0644]
2.5 生物薄膜干涉技术测定抗cd47鼠源抗体的动力学常数和亲和力
[0645]
采用生物薄膜干涉技术(bli)对纯化的鼠源抗体mo2a1621、mo2a11971、mo2a21331和mo2a2351以及对照抗体ab12w1和ab12w2与抗原的结合亲和力常数进行测定(ge，biacore t200)。测定时，将待测cd47鼠源抗体固定在series s protein a传感芯片(ge，货号29-1275-56)表面，用重组人cd47蛋白(his-tag)(acro biosystems，货号cd-h5227)作为流动相，抗原被捕获到芯片表面。处理数据，并用biacore t200的分析软件1：1结合的模型进行拟合，拟合数据与实验数据基本重叠，得到结合和解离速率常数ka和kd，用kd除ka得到平衡解离常数kd(见表1)。结果显示，获得的人源化抗体亲和力没有明显损失，鼠源抗体mo2a1621、mo2a11971和mo2a21331与人cd47的结合亲和力与对照抗体ab12w1和ab12w2相当，kd值均达到pm级。
[0646]
表1、抗体的亲和力测定结果
[0647][0648]
实施例3、抗cd47鼠源单抗的亚型鉴定及可变区扩增
[0649]
抗体亚型鉴定：取杂交瘤细胞培养上清液，采用isostrip
tm
小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(santa cruz biotechnology，货号sc-24958)鉴定抗体亚型。鼠单抗mo2a21331、mo2a1621、mo2a11971和mo2a2351的亚型经鉴定都为igg1(kappa)型。
[0650]
抗体可变区扩增：将候选杂交瘤细胞#2a21331、#2a1621、#2a11971和#2a2351分别培养至总量约107个细胞，1000rpm离心10min收集细胞，并以trizol试剂盒(invitrogen)提取总rna，用反转录试剂盒smarter race合成第一链cdna，以第一链cdna为后续模板扩增杂交瘤细胞所对应的抗体可变区dna序列。根据亚型鉴定结果，获取该抗体亚型的重链和轻链恒定区序列，设计特异性的巢式pcr引物，该扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区和恒定区互补。采用常规pcr方法扩增目的基因，将扩增产物测序后，分别得到杂交瘤克隆#2a21331分泌抗体mo2a21331、#2a1621分泌抗体mo2a1621、#2a11971分泌抗体mo2a11971以及#2a2351分泌抗体mo2a2351的重链可变区序列和轻链可变区序列，如表2所示。
[0651]
表2、人源化抗体可变区氨基酸序列
[0652][0653]
实施例4、抗cd47鼠单克隆抗体的人源化
[0654]
根据上述获得的mo2a21331、mo2a1621、mo2a11971和mo2a2351鼠源抗体可变区序列，利用计算机辅助抗体三维建模以及结构分析进行抗体人源化改造。本发明人采用两种方法进行鼠源抗体的人源化改造，一种是cdr移植，另一种是表明重塑。其中，cdr移植(cdr-grafting)是一种常见的抗体人源化方法，是通过将人源抗体的fr替换鼠源抗体的fr来达到保持活性、降低免疫原性的目的。结合discovery studio分析工具进行cdr移植抗体人源化改造的方法主要包括以下步骤：(1)抗体三维结构建模；(2)关键残基分析。利用分子对接分析可变区及其周边的框架氨基酸序列，考察其空间立体结合方式以确定对于保持cdr区构象至关重要的关键残基，主要有三类：1、位于vl和vh结合界面上的残基，对于两个结构域的折叠起到关键作用；2、靠近cdr区并且包埋于蛋白内部的残基；3、与cdr区有直接相互作用的残基，相互作用包括：疏水相互作用/氢键/盐桥；(3)人源模板选择。须同时满足下面两个条件：首先，把各杂交瘤细胞分泌的抗体氨基酸序列与人胚胎系抗体氨基酸序列进行比对，找出同源性高的序列；其次，选择其中与mhc ii(hla-dr)亲和力低的人胚胎系(germline)抗体框架序列，以降低其免疫原性；(4)基于关键残基分析的反向嫁接，获得人源化抗体序列。
[0655]
表面重塑抗体是利用计算机辅助的分子设计和表面残基替换法进行鼠源抗体的人源化设计。该方法的原则是仅替换与人源抗体表面氨基酸差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换；人源化改造过程涉及以下步骤：1、把各杂交瘤细胞分泌的抗体的氨基酸序列与人胚胎系抗体氨基酸序列进行比对，找出同源性高的序列；2、对于影响侧链大小、电荷、疏水性或可能形成氢键从而影响到抗体cdr构象的残基尽量保留；3、利用计算机模拟技术，选择溶剂可及性(solvent accessibility)大于30％时，暴露的表面氨基酸替换成人胚胎系抗体氨基酸。
[0656]
共获得16株人源化抗体，其中由鼠源亲本抗体mo2a21331衍生获得的人源化抗体为ab12w5、ab12w6、ab12w9、ab12q1和ab12q2；由鼠源亲本抗体mo2a1621衍生获得的人源化抗体为ab12w3、ab12q3、ab12q4和ab12q5；由鼠源亲本抗体mo2a11971衍生获得的人源化抗体为ab12w4、ab12w7、ab12w8、ab12q6、ab12q7和ab12q8；由鼠源亲本抗体mo2a2351衍生获得的人源化抗体为ab12w10；上述人源化抗体中，除ab12w5、ab12q3、ab12q6和ab12w10是采用cdr移植法获得的，其余抗体均由表面重塑法进行人源化改造而获得。上述人源化抗体的可变区氨基酸序列如表3所示。
[0657]
表3、人源化抗体可变区氨基酸序列
[0658][0659]
本发明制备的鼠源单抗mo2a21331、mo2a1621、mo2a11971和mo2a2351及其衍生的16个人源化抗体的cdr区的氨基酸序列如表4-1至表4-4所示，其中抗体可变区所包含的cdr的氨基酸序列分别采用kabat和imgt方法来定义。
[0660]
表4-1、关于示例性的抗cd47抗体mo2a21331及其衍生的人源化抗体的cdr区序列
[0661]
[0662]
[0663]
[0664][0665]
表4-2、关于示例性的抗cd47抗体mo2a1621及其衍生的人源化抗体的cdr区序列
[0666]
[0667]
[0668][0669]
表4-3、关于示例性的抗cd47抗体mo2a11971及其衍生的人源化抗体的cdr区序列
[0670]
[0671]
[0672]
[0673][0674]
表4-4、关于示例性的抗cd47抗体mo2a2351及其衍生的人源化抗体的cdr区序列
[0675]
[0676][0677]
为了获得由两条重链和两条轻链组成的全长抗体序列，将表3中所示vh和vl序列的与抗体重链恒定区(优选自人igg1、igg2或igg4)和轻链恒定区(优选自人κ轻链)序列采用常规技术进行拼接或组装。更优选地，抗体重链恒定区序列是修饰的且非裂解性的，并显示出极小的fc-介导adcc和cdc效应。例如，在一种实施方案中，抗cd47抗体分子包含野生型人igg1的重链恒定区和人κ轻链恒定区。或采用修饰的人igg1恒定区序列，例如在一种实施方案中，如表5所示，人igg1在根据eu编号的第297位包含取代(例如asn取代为ala)；在另一种实施方案中，如表5所示，人igg1在根据eu编号的第265位包含取代、在根据eu编号的第329位包含取代或包含这两种取代(例如在第265位asp取代为ala和/或在第329位pro取代为ala)；在又一种实施方案中，如表5所示，人igg1在根据eu编号的第234位包含取代、在根据eu编号的第235位包含取代或包含这两种取代(例如在第234位leu取代为ala和/或在第235位leu取代为ala)。在又一种实施方案中，如表5所示，人igg1在根据eu编号的第297、250和428位包含取代(例如，asn被ala取代，thr被gln取代、met被leu取代)。在另一种实施方案中，抗cd47抗体分子包含表5中所示的野生型人igg2的重链恒定区和人κ轻链恒定区。或采用修饰的人igg2恒定区序列；在一种实施方案中，如表5所示，抗cd47抗体分子包括在根据eu编号的第331位突变(例如p变为s)的人igg2。在另一种实施方案中，抗cd47抗体分子包含表5中所示的野生型人igg4的重链恒定区和人κ轻链恒定区。或采用修饰的人igg4恒定区序列；在一种实施方案中，如表5所示，抗cd47抗体分子包括在根据eu编号的第228位突变(例如s变为p)的人igg4；在另一种实施方案中，如表5所示，抗cd47抗体分子包括在根据eu编号的第228位ser取代为pro和第235位leu取代为glu的人igg4。
[0678]
表5、人igg重链和人κ轻链的恒定区氨基酸序列
[0679]
[0680]
[0681]
[0682][0683]
实施例5、人源化抗体表达载体的构建和蛋白表达
[0684]
用上述方法中获得的cd47人源化抗体的重链和轻链的编码cdna插入到pcdna3.1或其衍生质粒，或其它真核表达载体中，构建人源化抗体表达载体。优选地，使用的载体质粒应含有在哺乳动物细胞中高水平表达所需的巨细胞病毒早期基因启动因子-增强子。同时，载体质粒中含有可选择标记基因，从而在细菌中赋予氨苄青霉素抗性，而在哺乳动物细胞中赋予g418抗性。另外，载体质粒中含有dhfr基因，在合适的宿主细胞中，能以氨甲喋呤(methotrexate,mtx,sigma)共扩增人源化抗体基因和dhfr基因(例如，参见专利cn103333917b)。
[0685]
将上述已构建的重组表达载体质粒转染入哺乳动物宿主细胞系，以表达人源化抗体。为了稳定高水平的表达，优选的宿主细胞系是二氢叶酸还原酶(dhfr)缺陷型的中国仓鼠卵巢(cho)细胞(参见，例如chasin,l.等人的美国专利4818679号)。优选的转染方法是电穿孔，也可以使用其他方法，包括磷酸钙共沉降，脂转染和原生质融合等。在电穿孔中，用设为250v电场和960μfd电容的gene pulser(bio-rad laboratories)，在比色杯内加入2
×
107个细胞悬浮在0.8ml的pbs中，并含有10μg用pvui(takara)线性化的表达载体质粒dna。转染2天后，加入含有0.2mg/ml g418以及200nm氨甲喋呤(methotrexate或mtx)。为了实现较高水平的表达，用受mtx药物抑制的dhfr基因共扩增转染的人源化抗体基因。用极限稀释亚克隆转染子及elisa的方法测定各细胞系的分泌率，选出高水平表达人源化抗体的细胞株。收集人源化抗体的条件培养基，用于测定其体外和体内生物学活性。
[0686]
例如，将表6所示编码人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w5、ab12w6、ab12w7、ab12w8、ab12w9和ab12w10的重链和轻链的核苷酸序列插入上述构建的表达载体中，经过加
压筛选、亚克隆稳定、高表达目的抗体的细胞株，再经培养、纯化得到各目的抗体。
[0687]
表6、人源化抗体重链和轻链的氨基酸序列及其编码核苷酸序列
[0688]
抗体编号hc核苷酸序列hc氨基酸序列lc核苷酸序列lc氨基酸序列ab12w3seq id no：106seq id no：107seq id no：108seq id no：109ab12w4seq id no：110seq id no：111seq id no：112seq id no：113ab12w5seq id no：114seq id no：115seq id no：116seq id no：117ab12w6seq id no：118seq id no：119seq id no：120seq id no：121ab12w7seq id no：122seq id no：123seq id no：124seq id no：125ab12w8seq id no：126seq id no：127seq id no：128seq id no：129ab12w9seq id no：130seq id no：131seq id no：132seq id no：133ab12w10seq id no：134seq id no：135seq id no：136seq id no：137
[0689]
实施例6、cd47人源化抗体的定性
[0690]
6.1 cd47人源化抗体与人cd47的结合能力的测定
[0691]
用0.2μg/ml的人cd47(北京义翘神州生物技术有限公司，货号12283-hcch)包被酶标板，室温过夜。弃去包被溶液，每孔加入300μl含2％脱脂奶粉的pbst(pbst/2％脱脂奶粉)封闭，置于室温孵育2h。然后每孔加入300μl pbst洗涤，重复3～4次。待测抗体ab12w3和ab12w6及对照抗体ab12w1和ab12w2分别用pbst/2％脱脂奶粉进行梯度稀释，以100μl/孔加入酶标板中，室温孵育1.5h，再用pbst洗板4～5次。然后加入以pbst/2％脱脂奶粉稀释的hrp-羊抗人igg(l h)酶联二抗(jackson laboratory，货号109-035-003)，100μl/孔，置室温孵育1.5h，再以pbst洗板4～5次，每孔加入100μl的tmb底物室温显色10min，用1m hcl终止显色，最后在350nm处读取od值。数据用graphpadprism5软件分析，以浓度对数(lgc)为横坐标，od值为纵坐标作图。
[0692]
结果见图5，人源化抗体ab12w3和ab12w6同对照抗体ab12w1和ab12w2一样，都能特异地结合人cd47抗原。ab12w3和ab12w6结合人cd47的ec
50
值分别为11.18ng/ml和12.83ng/ml，与对照抗体ab12w2的ec
50
值(9.197ng/ml)相当，但低于ab12w1的ec
50
值(26.66ng/ml)。
[0693]
6.2 cd47人源化抗体阻断人cd47与受体sirpα结合实验
[0694]
以生物素标记的重组人sirpα(北京义翘神州生物技术有限公司，货号11612-h08h-b)作为试剂。用pbs缓冲液将重组人cd47(北京义翘神州生物技术有限公司，货号12283-hcch)稀释至2.0μg/ml，以100μl/孔的体积加于96孔板中，于4℃孵育过夜。弃去包被溶液，每孔加入300μl pbst/2％脱脂奶粉，室温孵育2h封闭。移去封闭液，用pbst缓冲液洗板3次后，然后每孔加入50μl以pbst/2％脱脂奶粉梯度稀释的抗cd47人源化抗体ab12w3和ab12w6以及对照抗体ab12w1和ab12w2，然后每孔再加入50μl以pbst/2％脱脂奶粉稀释至0.2μg/ml的生物素标记的重组人sirpα，充分孵育后以pbst洗去未结合的抗体及生物素标记的sirpα。然后加入1：1000倍稀释的streptavidin-hrp(pierce，货号21132)，100μl/孔，充分孵育后以pbst洗去未结合的streptavidin-hrp，每孔加入100μl的tmb显色液，室温显色10分钟。用1m的hcl终止显色反应，以酶标仪在波长350nm处读取od值。在graphpadprism5软件中，以浓度对数(lgc)为横坐标，od值为纵坐标做非线性回归可变斜率方程。
[0695]
如图6中所示，人源化抗体ab12w3和ab12w6以及对照抗体ab12w1和ab12w2都能特异地阻断cd47与sirpα的结合，其中ab12w3和ab12w6与对照抗体ab12w2的ec
50
值相当，分别
为1173ng/ml、1288ng/ml和1023ng/ml，阻断能力都显著高于对照抗体ab12w1(ec
50
＝3022ng/ml)。
[0696]
6.3 利用facs检测cd47人源化抗体与淋巴瘤细胞的结合活性
[0697]
用facs检测cd47人源化抗体与cd47高表达肿瘤细胞的结合能力。培养淋巴瘤细胞系raji-luc(北京百奥赛图基因生物技术有限公司)和jurkat(中科院上海细胞库)细胞，离心收集细胞。将收集的细胞用1％pbsb重悬，调整细胞密度为2
×
106/ml，铺于96孔板中，每孔100μl(2
×
105个细胞)，4℃封闭0.5h。同时稀释cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w6以及对照抗体ab12w2，从10μg/ml开始，5倍梯度稀释，得到7个浓度梯度，备用。封闭后的细胞离心弃上清，加入稀释好的cd47人源化抗体，4℃孵育1h；离心去上清，用1％pbsb洗3次，加入稀释的f4647标记的山羊抗人igg多抗(jackson，货号109-605-088)，4℃避光孵育1h；离心去上清，再以1％pbsb洗两次，用100μl 1％pf重悬，上机检测(bd accuri c6)。再以平均荧光强度(mfi)，通过软件originpro 8.0进行分析，计算cd47人源化抗体与淋巴瘤细胞结合的ec
50
值，并比较cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w6和对照抗体ab12w2的结合活性。
[0698]
结果显示，cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w6与两株淋巴瘤细胞均具有良好的结合活性(图7-1和图7-2)。在同种细胞系中横向比较各人源化抗体与淋巴瘤细胞的结合能力发现，ab12w6与两株细胞的结合力最强，ec
50
值比对照抗体低了50％，ab12w4与对照抗体相当，ab12w3与两株淋巴瘤细胞的结合能力最弱(表7)。
[0699]
表7、cd47人源化抗体与淋巴瘤细胞系结合的ec50值
[0700][0701]
同时还测定了人源化抗体ab12w9以及对照抗体ab12w1、ab12w2和人急性淋巴白血病细胞ccrf-cem(中科院上海细胞所)的结合能力，待测样品准备及测试方法同上。结果如图7-3所示，ab12w9与ccrf-cem的结合能力与对照抗体ab12w2相当(ec
50
值分别为0.1615μg/ml和0.1568μg/ml)，显著强于另一个对照抗体ab12w1(ec
50
值为1.078μg/ml)。
[0702]
6.4 facs测定人源化抗体与cd47过表达细胞的结合能力
[0703]
消化并收集稳定过表达cd47的细胞株cho/k1-hcd47(genscript，货号：m00581)，于800rpm离心3min，弃上清，用实验缓冲液(含1％灭活胎牛血清的dpbs培养基)重悬细胞，以台盼蓝染色法对细胞进行计数，用实验缓冲液调整细胞密度为1
×
106/ml，按每孔50μl接种于“u”型底的96孔板中。用上述实验缓冲液配制不同浓度的待测抗体ab12w3、ab12w6和ab12w9，同时设置阳性对照组ab12w1以及阴性同型对照组(isotype control)，按每孔50μl加入96孔板中，充分混匀后静置于5％co2的培养箱中，37℃孵育1h。离心收集细胞，吸弃上清，用实验缓冲液洗涤细胞3次，弃上清。配制适当浓度的f4647标记的山羊抗人igg多抗(jackson，货号109-605-088)，按照每孔100μl重悬细胞，室温避光孵育1h。离心收集细胞，吸弃上清，用实验缓冲液洗涤细胞3次，弃上清。用100μl实验缓冲液重悬细胞，上机检测(bd accuri c6)，分析数据，以浓度对数(lgc)为横坐标，以mfi为纵坐标作图。
[0704]
如图8-1和图8-2所示，cd47人源化抗体ab12w6、ab12w3和ab12w9都能与过表达cd47的cho/k1-hcd47细胞特异性结合，并且结合能力都强于对照抗体ab12w1，它们的ec
50
值分别为0.2167μg/ml、0.4608μg/ml、0.2515μg/ml和0.6926μg/ml。
[0705]
6.5 cd47人源化抗体的cdc活性测定
[0706]
使用cd47表达阳性的源于burkitt淋巴瘤的细胞系raji细胞(atcc：ccl-86)，检测cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w5和ab12w6的cdc活性测定，四种人源化抗体的重链恒定区都是含有s228p/l235e突变的人igg4亚型。为做方法验证，以rituxan作为阳性对照抗体，检测其对raji细胞(cd20阳性)的cdc杀伤作用，同时设置同型对照组。
[0707]
消化并收集raji细胞，于800rpm离心3min，弃上清，用实验缓冲液(含1％灭活胎牛血清的无酚红mem培养基)重悬细胞，以台盼蓝染色法对细胞进行计数，并用含15％正常人血清(nhs)的无酚红mem培养基调整细胞密度为1
×
106/ml，按每孔50μl接种于96孔板中。用上述实验缓冲液配制不同浓度的待测抗体，按每孔50μl加入96孔板中，充分混匀后静置于5％co2的培养箱中，37℃孵育4h。孵育结束后，每孔加入100μl celltiter-glo
tm
细胞活性检测试剂(promega)，室温孵育10min，用多功能酶标仪(biotek neo2)检测并分析数据，以浓度对数(lgc)为横坐标，以细胞裂解百分比(％)为纵坐标作图。
[0708]
如图9所示，cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w5和ab12w6对靶细胞raji都不具有cdc细胞毒作用。含野生型人igg4 fc片段的抗体本身介导较弱的adcc和cdc效应，而本发明人源化抗体所含的igg4 fc片段将l235突变为e，使其adcc效应进一步去除，试验证实它们对靶细胞同样不具有显著的cdc杀伤作用。提示本发明提供的针对cd47的人源化抗体具有良好的安全性，不会介导其基于阻断作用杀伤肿瘤细胞之外所不必要的adcc和cdc等细胞毒作用，从而对表达cd47的正常细胞起到保护作用，减少不必要的临床副反应。
[0709]
6.6 抗cd47人源化抗体动力学参数和亲和力测定
[0710]
对cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w6和ab12w10的亲和力测定也是利用bli技术，根据仪器biacore t200的说明书进行操作，方法参照实施例2.5。
[0711]
结果显示，获得的人源化抗体亲和力没有明显损失，候选抗体ab12w3、ab12w4和ab12w6与人cd47的结合亲和力与对照抗体ab12w1和ab12w2相当，ab12w10的结合亲和力低一个数量级，人源化抗体较好地保留了亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，大大降低了其免疫原性。
[0712]
6.7 抗cd47人源化抗体介导巨噬细胞的吞噬作用
[0713]
(1)对肿瘤细胞ccrf-cem吞噬作用
[0714]
抽取的人外周血，利用梯度离心法收集的pbmc细胞，利用人单核细胞分离试剂盒(美天旎生物科技公司)，分离并收集单核细胞。将分离的单核细胞按照1
×
106/ml的细胞密度接种到培养皿中，分别在接种后第5天、第8天和第11天换液，第13天后细胞即分化成为巨噬细胞(m2型)，可肉眼观察到细胞形态为不规则贴壁。也可用facs检测细胞表面的标志物，一般包括cd11b、cd14、cd45、cd64、cd163和cd206。
[0715]
将用pe荧光染色的ccrf-cem(中科院上海细胞所)接种于96孔板，每孔50μl，约2.5
×
105个细胞。将待测抗体ab12w3、ab12w4和ab12w6用pbs稀释至200μg/ml，3倍梯度稀释至11个浓度点，同时设置ab12w1阳性对照组和同型抗体阴性对照组。然后将不同浓度梯度的待测抗体，铺于上述96孔板中，每孔50μl。37℃，5％co2培养箱中静置1h，使抗体与靶细胞充
分结合。然后加入上述制备的m2型巨噬细胞，每孔100μl，约5
×
104个细胞，混匀。37℃，5％co2培养箱放置1h。收集所有细胞，以cd11b-apc荧光抗体(invitrogen)标记。按照常规流式方法洗板，洗掉未结合的荧光抗体。上机检测，取样本总数为1
×
104个细胞，其中靶细胞为pe荧光，巨噬细胞为apc荧光，发生吞噬作用的为pe apc双荧光。读取荧光值，分析数据，以浓度对数(lgc)为横坐标，以吞噬百分比(％)为纵坐标作图。
[0716]
如图10所示，cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4和ab12w6都能介导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞ccrf-cem，并且呈剂量依赖性，与对照抗体ab12w1的ec
50
值相当。
[0717]
(2)对红细胞rbc的吞噬作用
[0718]
cd47也高表达于红细胞表面，当cd47抗体结合红细胞表面的cd47后，打破红细胞表面的“别吃我”信号，导致巨噬细胞清除红细胞，可能诱发贫血症状。临床i期试验中，cd47抗体治疗后，发生红细胞枯竭，造成短暂性的贫血是其主要的不良反应。因此，我们测定cd47人源化抗体ab12w3、和ab12w4介导的巨噬细胞对红细胞的吞噬作用大小，来评价本发明提供的cd47人源化抗体在临床应用中的潜在副作用。红细胞采用常规方法制备，并以pe荧光染色，巨噬细胞以cd11b-apc荧光抗体标记，待测抗体样品稀释方法及测定步骤同上。分析数据，以浓度对数(lgc)为横坐标，以吞噬百分比(％)为纵坐标作图。
[0719]
如图11所示，与同型对照相比，对照抗体ab12w1能够介导较强的红细胞吞噬能力，而人源化抗体ab12w3和ab12w4几乎不引起红细胞吞噬，与同型对照抗体相比无显著性差异。
[0720]
6.8 抗cd47人源化抗体促进红细胞凝集活性测定
[0721]
利用红细胞凝集反应对候选cd47人源化抗体是否引发血凝反应进行评估。通过对存在cd47抗体时的rbc斑点面积与不存在cd47抗体时(即零血凝反应条件下)的rbc斑点面积进行比较，rbc斑点面积越大表明血凝反应的水平越高，也可使用rbc斑点的密度分析对血凝反应进行定量。
[0722]
检测方法如下：采集新鲜人外周血，离心并洗涤沉淀，分离人红细胞，将细胞重悬至密度为2
×
108/ml。将50μl人红细胞悬液与50μl待测抗体(最高浓度为200μg/ml，3倍梯度稀释，总共8个点)加入96孔板中，阴性对照组(nc)加入等体积的pbs缓冲液，在37℃孵育30min，反应结束后用扫描仪对96孔板进行拍照并判断结果。结果判定标准为如果红细胞沉于孔底，平铺呈网状，则发生了红细胞凝集反应(参见图12中ab12w1的结果)，如果红细胞未发生凝集反应，则红细胞将呈点状沉于孔底(参见图12中nc的结果)，根据沉降的红细胞团面积，可以初步判定抗体对红细胞凝集作用的强弱。
[0723]
由图12可见，cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w5、ab12w6、ab12w8、ab12w9和ab12w10同阴性对照组一样都不会引起明显的红细胞凝集反应，而对照抗体ab12w1在高浓度下呈现明显的细胞凝集现象。提示本发明提供的cd47抗体具有显著降低的促血细胞凝集作用，预期其临床应用中的相关副反应也会极大程度的降低甚至消除。
[0724]
实施例7、cd47人源化抗体的体内药效学研究
[0725]
7.1 ab12w3、ab12w4、ab12w5和ab12w6在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下移植瘤模型中的药效学研究
[0726]
选取7～8周龄的雌性nod/scid小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，收集处于对数生长期的raji细胞(中科院细胞库)，将4
×
106个raji细胞和等体积matrigel混合，接种于nod/scid小鼠右侧背部皮下。待小鼠肿瘤体积生长到平均87mm3左右，小鼠按肿瘤体积和体重随机分为7组，每组6只，给药组分别腹腔给予ab12w3、ab12w4、ab12w5和ab12w6以及对照抗体ab12w1和ab12w2，阴性对照组相应给予等体积的pbs。所有给药组均为每周给药两次，给药组的剂量均为5mg/kg。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(d)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm3)＝[d
×
d2]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率tgi(％)＝(1-给药组rtv/对照组rtv)
×
100％；其中，相对肿瘤体积(rtv)为每一次测量(即dn)所得肿瘤体积vn与分组给药时(即d0)测量所得肿瘤体积v0的比值。
[0727]
如图13所示，在给药后第21天，pbs对照组平均肿瘤体积为1001.17
±
38.43mm3；ab12w1给药组的平均肿瘤体积为554.07
±
122.11mm3，tgi为44.12％，相对于对照组具有非常显著性差异(p《0.01)；ab12w2给药组的平均肿瘤体积为181.39
±
54.07mm3，tgi为82.74％，相对于对照组具有非常显著性差异(p《0.0001)；ab12w3给药组的平均肿瘤体积为544.04
±
61.44mm3，tgi为47.56％，相对于对照组具有非常显著性差异(p《0.01)；ab12w4给药组的平均肿瘤体积为429.30
±
66.15mm3，tgi为59.35％，相对于对照组具有非常显著性差异(p《0.0001)；ab12w5给药组的平均肿瘤体积为194.89
±
33.71mm3，tgi为80.76％，相对于对照组具有非常显著性差异(p《0.0001)；ab12w6给药组的平均肿瘤体积为180.74
±
77.36mm3，tgi为83.13％，相对于对照组具有非常显著性差异(p《0.0001)。
[0728]
以上结果表明，抗cd47人源化抗体ab12w3、ab12w4、ab12w5和ab12w6都显示出良好的抗肿瘤效果，抑瘤效果均优于对照抗体ab12w1，其中ab12w5和ab12w6的tgi同对照抗体ab12w2相当，均高于80％。
[0729]
7.2 ab12w6、ab12w9和ab12w10在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下移植瘤模型中的药效学研究
[0730]
选取7～8周龄的雌性nod/scid小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，收集处于对数生长期的raji细胞(中科院细胞库)，将5
×
106个raji细胞和等体积matrigel混合，接种于nod/scid小鼠右侧背部皮下。待小鼠肿瘤体积生长到平均85mm3左右，小鼠按肿瘤体积和体重随机分为8组，每组6只，分别腹腔给予相应药物。所有给药组均为每周给药两次，ab12w6、ab12w9、ab12w10、对照抗体ab12w2以及cd20单抗rituxan的给药剂量均为5mg/kg，阴性对照组相应给予等体积的pbs。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(d)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm3)＝[d
×
d2]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率tgi(％)＝(1-给药组rtv/对照组rtv)
×
100％；其中，相对肿瘤体积(rtv)为每一次测量(即dn)所得肿瘤体积vn与分组给药时(即d0)测量所得肿瘤体积v0的比值。
[0731]
如图14所示，在给药后第15天，pbs对照组平均肿瘤体积为1881.04
±
198.74；rituxan给药组的平均肿瘤体积为806.79
±
206.63mm3，tgi为51.18％；ab12w2给药组的平均肿瘤体积为309.58
±
54.62mm3，tgi为84.21％；ab12w6给药组的平均肿瘤体积为370.54
±
116.72mm3，tgi为82.19％；ab12w9给药组的平均肿瘤体积分别为343.52
±
145.65mm3，tgi为83.94％；ab12w10给药组的平均肿瘤体积为380.37
±
111.84mm3，tgi为81.65％。所有给
药组相对于对照组均有非常显著性差异(p《0.01)。
[0732]
以上结果表明，抗cd47人源化抗体ab12w6、ab12w9和ab12w10同对照抗体ab12w2都显示出良好的抗肿瘤效果，抑瘤率均高于80％，显著优于rituxan给药组。
[0733]
7.3 ab12w8或ab12w9与rituxan联用在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下移植瘤模型中的药效学研究
[0734]
选取7～8周龄的雌性nod/scid小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，收集处于对数生长期的raji细胞(购自中科院上海细胞库)，将5
×
106个raji细胞和等体积matrigel混合，接种于nod/scid小鼠右侧背部皮下。待小鼠肿瘤体积生长到平均112mm3左右，小鼠按肿瘤体积和体重随机分为8组，每组6只，分别腹腔给予相应药物。所有给药组均为每周给药两次，给药组的剂量均为5mg/kg，分组情况及给药方案见表8。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(d)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm3)＝[d
×
d2]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率tgi(％)＝(1-给药组rtv/对照组rtv)
×
100％；其中，相对肿瘤体积(rtv)为每一次测量(即dn)所得肿瘤体积vn与分组给药时(即d0)测量所得肿瘤体积v0的比值。
[0735]
如图15所示，在给药后第21天，pbs阴性对照组平均肿瘤体积为2139.04
±
309.53mm3；rituxan给药组的平均肿瘤体积为1303.69
±
481.03mm3，tgi为43.4％，相对于对照组无显著性差异，但6只小鼠里有1只小鼠的肿瘤完全消退；ab12w1给药组的平均肿瘤体积为859.40
±
241.19mm3，tgi为61.91％；ab12w8给药组的平均肿瘤体积为1838.71
±
263.19mm3，相对于对照组无显著性差异；ab12w9给药组的平均肿瘤体积为555.13
±
189.79mm3，tgi为76.44％；rituxan分别和ab12w1、ab12w8以及ab12w9联合给药组的平均肿瘤体积分别为701.89
±
301.99mm3、915.32
±
409.09mm3和397.32
±
171.98mm3，tgi分别为67.71％、62.18％和82.83％。rituxan和ab12w1或ab12w9联合给药组各有一只小鼠的肿瘤完全消退。另外，整个实验过程中，动物健康状态良好，无动物死亡。实验结束时，各组动物体重均出现增长，ab12m8和ab12w9单用或联用rituxan处理组动物与溶剂对照组动物体重比较无显著性差异(p》0.05)，表明动物对ab12m8和ab12w9耐受良好，未对实验动物产生明显毒性作用。
[0736]
以上结果表明，抗cd47人源化抗体ab12w9具有良好的抗肿瘤作用，单用或与rituxan联用的抑瘤效果均优于对照抗体ab12w1单用或与rituxan联用组；ab12w8单用不具有显著的抑瘤作用，当与rituxan联用时也能显著地抑制肿瘤生长。ab12w8和ab12w9及对照抗体ab12w1与rituxan联用的效果均好于单独给药组。
[0737]
表8、cd47人源化抗体与rituxan联用在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下移植瘤模型中的抑瘤作用
[0738][0739]
7.4 ab12w9单用或与rituxan联用在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下移植瘤模型中的药效学研究
[0740]
选取7～8周龄的雌性nod/scid小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，收集处于对数生长期的raji细胞(中科院上海细胞库)，将5
×
106个raji细胞和等体积matrigel混合，接种于nod/scid小鼠右侧背部皮下。待小鼠肿瘤体积生长到平均110mm3左右，小鼠按肿瘤体积和体重随机分为9组，每组6只，分别腹腔给予相应药物。所有给药组均为每周给药两次，具体分组情况、给药方案及主要实验结果(包括各给药组肿瘤消退情况)见表9。给药当天记为第0天，每周用电子游标卡尺测量肿瘤的最大直径(d)和最小直径(d)，使用以下公式计算肿瘤体积(mm3)＝[d
×
d2]/2，并根据公式计算各给药组的肿瘤生长抑制率tgi(％)＝(1-给药组rtv/对照组rtv)
×
100％；其中，相对肿瘤体积(rtv)为每一次测量(即dn)所得肿瘤体积vn与分组给药时(即d0)测量所得肿瘤体积v0的比值。
[0741]
如图16所示，在给药后第27天，阴性对照组平均肿瘤体积为1711.49
±
540.38mm3；rituxan给药组的平均肿瘤体积为1497.13
±
447.01mm3，tgi为16.59％，相对于阴性对照组无显著性差异；ab12w2给药组的平均肿瘤体积为21.47
±
15.54mm3，tgi为98.78％，相对于阴性对照组具有非常显著性差异(p《0.0001)；ab12w9的1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg三个剂量的平均肿瘤体积分别为770.48
±
218.83mm3、179.76
±
186.32mm3和78.13
±
63.00mm3，tgi分别为55.05％、89.68％和95.53％；所有给药组相对于对照组均有非常显著性差异(p《0.01)；rituxan分别和ab12w9三个剂量联合给药组的平均肿瘤体积分别为389.48
±
360.90mm3、126.00
±
112.53mm3和63.10
±
59.45mm3，tgi分别为78.46％、92.98％和96.39％。另外，整个实验过程中，动物健康状态良好，无动物死亡。实验结束时，各组动物体重均出现增长，ab12w9单用或联用rituxan处理组动物与溶剂对照组动物体重比较无显著性差异(p》0.05)，表明动物对ab12w9耐受良好，未对实验动物产生明显毒性作用。
[0742]
以上结果表明，抗cd47人源化抗体ab12w9单用就具有良好的抗肿瘤作用，且抗肿
瘤作用具有良好的量效关系；ab12w9低剂量1mg/kg与rituxan联用的抑瘤效果优于ab12w9单用和rituxan单用组；ab12w9中、高剂量(3、10mg/kg)因单用药效已经达到最佳抗肿瘤效果，没有提高的余地，故与rituxan联用的效果与单用ab12w9相当。
[0743]
表9、cd47人源化抗体与rituxan联用在人burkkit’s淋巴瘤小鼠皮下移植瘤模型中的抑瘤作用
[0744][0745][0746]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。