一种含苯并噻吩嘧啶衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用与流程

1.本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种含苯并噻吩嘧啶衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是当今世界危及人类生命健康最常见、最严重的疾病。近年来，通过科学家们的不懈努力,已有许多治疗肿瘤的药物上市，这些药物在很大程度上改善了肿瘤病人的生存质量，使肿瘤治疗取得很大的进步。但传统的化疗药物仍存在疗效差、毒副作用强、易产生耐药性等缺陷。因此，寻找或发现高效、低毒、抗耐药的靶向抗肿瘤药物成为目前医学研究的重要课题。蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，ptk)是信号传递过程中的重要因子，能催化多种底物蛋白质酪氨酸残基磷酸化，从而传递信号，在细胞增殖、分化、迁移和凋亡中起重要作用。酪氨酸激酶的异常表达将导致细胞增殖调节发生紊乱，还与肿瘤的侵袭与转移、肿瘤新生血管的生成、肿瘤的化疗抗性密切相关。


技术实现要素：

3.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种含苯并噻吩嘧啶衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用，制备得到的含苯并噻吩嘧啶衍生物具有优异的体内抗肿瘤活性，体内抑瘤率tgi值为90.24％。
4.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
5.一种含苯并噻吩嘧啶衍生物，其化学结构式如下：
[0006][0007]
其中，r1为h或f；r2为仲胺、硫醇、烷基哌嗪或哌啶。
[0008]
进一步地，r2为为
[0009]
进一步地，r1为h，r2为为
[0010]
进一步地，r1为f，r2为
[0011]
上述含苯并噻吩嘧啶衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0012]
(1)苯并噻吩-3-硼酸和(2,4-二氯嘧啶)-2b(2,4-二氯-6-氟嘧啶)经铃木反应；
[0013]
(2)在酸性条件下使4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺与步骤(1)所得产物发生芳香亲核反应；
[0014]
(3)在碱性条件下使步骤(2)所得产物与r2h或其盐酸盐反应；
[0015]
(4)将步骤(3)所得产物与氯化铵和还原剂混合溶解，反应结束后再经硝基还原和酰化反应制备得到该含苯并噻吩嘧啶衍生物。
[0016]
反应流程如下：
[0017][0018]
进一步地，步骤(2)中芳香亲核反应的具体过程为：将4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺
和步骤(1)所得产物溶解，并升温至80～100℃过夜即可。
[0019]
进一步地，4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺的用量为1～1.5eq。
[0020]
进一步地，步骤(3)中所述r2为仲胺时：将步骤(2)所得产物溶解，然后加入r2h或其盐酸盐以及dipea，于80～90℃反应10～15h。
[0021]
进一步地，步骤(3)中所述r2为硫醇或醇时：将r2h溶解，于0℃添加nah，搅拌10～20min后，加入步骤(2)所得产物，搅拌使反应液升温至室温，然后反应过夜即可。
[0022]
上述含苯并噻吩嘧啶衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0023]
进一步地，肿瘤为非小细胞肺癌。
[0024]
本发明的有益效果：
[0025]
本发明设计并合成了13个新结构的嘧啶衍生物。研究结果表明优选化合物6a(
ⅵ‑
1)对egfr l858r/t790m高表达激酶和egfr l858r/t790m高表达细胞h1975均具有良好的抑制作用，ic50值分别为0.26nm和2.2nm。机制研究表明6a可以时间-剂量依赖性的抑制egfr和akt磷酸化蛋白的表达，从而诱导h1975细胞凋亡。此外，6a对三种人正常细胞株均表现出较小的细胞毒性，并且优于阳性对照药物奥希替尼。进一步研究表明，6a具有良好的药代动力学特性。最后，体内活性研究显示化合物6a有很好的体内抗肿瘤活性，其体内抑瘤率tgi值为90.24％。上述结果表明6a在非小细胞肺癌(nsclc)治疗中值得进一步研究。
附图说明
[0026]
图1为6a与afatinib、osimitinib对egfr酪氨酸激酶抑制能力的比较。
具体实施方式
[0027]
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
[0028]
实施例1目标化合物
ⅵ‑
1～
ⅵ‑
13的合成
[0029]
目标化合物
ⅵ‑
1～
ⅵ‑
13的合成路线如下：
[0030][0031]
1、中间体3a-3b的合成通法：
[0032]
2,4-二氯嘧啶/2,4-二氯-6-氟嘧啶(2.47ml,20mmol)、双三苯基膦二氯化钯(701.9mg,1mmol)溶于60ml甲苯中，再加入碳酸钠(4.24g,40mmol)的水溶液(20ml)、3-羟甲基苯硼酸(3.34g,22mmol)的甲醇(20ml)溶液，氩气保护，90℃反应12h，tlc检测反应完全后，将反应液冷却到室温，硅藻土过滤，滤液用乙酸乙酯(100ml
×
3)萃取，合并有机相、无水硫酸钠干燥、过滤，减压悬干后柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝10:1～3:1)得到目标中间体3a-3b。
[0033]
3a:红色固体，产率：62％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ8.61(s,2h),8.32(s,1h),8.25(m,1h),7.50
–
7.40(m,2h),4.74(s,2h).
[0034]
3b:白色固体，产率：60.5％；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.83(d,j＝8.2hz,1h),8.53(d,j＝3.0hz,1h),8.40(d,j＝1.3hz,1h),7.91(d,j＝8.1hz,1h),7.53(m,1h),7.45(m,1h).
[0035]
2、中间体4a-4b的合成通法：
[0036]
将原料3a或3b与4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(1.05eq)溶于正丁醇中，向反应液中加入2-3滴浓盐酸，然后将反应液逐渐升温到80℃过夜，tlc检测反应完全后，冷却到室温、过滤，乙酸乙酯洗涤滤饼，放置到真空干燥箱中干燥后得到目标中间体4a-4b。
[0037]
4a:黄色固体，产率：73％；1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ9.14(bs,1h),8.82(d,j＝8.3hz,1h),8.77(s,1h),8.69(d,j＝8.0hz,1h),8.59(d,j＝5.5hz,1h),8.09(d,j＝8.0hz,1h),7.53(d,j＝5.5hz,1h),7.49
–
7.32(m,3h).
[0038]
4b：灰色固体，产率：50％；1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ8.85(bs,1h),8.76(d,j＝8.3hz,1h),8.72(d,j＝3.0hz,1h),8.57
–
8.50(m,2h),8.11(d,j＝8.0hz,1h),7.47(t,j＝7.5hz,1h),7.43
–
7.35(m,2h),4.00(s,3h).
[0039]
3、中间体5aa-5al,5ba的合成通法
[0040]
(1)当r2为仲胺类结构时，合成方法如下：
[0041]
化合物4a或4b(1eq)溶于dma中，然后依次加入r2h或其盐酸盐(1.2eq)、dipea(2eq)，将反应液置于85℃反应12h，tlc检测反应完全后，冷却到室温，饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取，合并有机相、无水硫酸钠干燥、过滤，减压悬干后过柱得到中间体。
[0042]
(2)当r2为硫醇或醇类结构时，合成方法如下：
[0043]
化合物r2h(1.5eq)溶于无水dmf中,0℃条件下缓慢加入nah(3eq)，搅拌10-20min后，缓慢滴加4a或4b(1eq)的dmf溶液，滴加完毕后将反应液缓慢升到室温，反应过夜，tlc检测反应完全后，加入饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取，合并有机相、无水硫酸钠干燥、过滤，减压悬干后过柱得到中间体。
[0044]
4、中间体6aa-6al,6ba的合成通法：
[0045]
将中间体5aa-5al,5ba(1eq)、铁粉(6eq)和氯化铵(5eq)溶于meoh:h2o＝4:1的混合溶剂中，80℃反应4h后，tlc检测反应完成后，将反应液趁热过滤，二氯甲烷萃取，合并有机相、无水硫酸钠干燥、过滤，减压悬干后过柱得到中间体。
[0046]
5、目标化合物的合成通法：
[0047]
将化合物6aa-6al,6ba(1eq)溶于无水四氢呋喃中，冰浴条件下依次加入三乙胺(1.2eq)和丙烯酰氯(1.1eq)，继续于0℃条件下反应10min，tlc检测反应完全后，加入饱和碳酸氢钠溶液将反应淬灭，二氯甲烷萃取，合并有机相、无水硫酸钠干燥、过滤，减压悬干后
过柱得到目标产物。
[0048]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-2-((2-(dimethyl-amino)-ethyl)(methyl)amino)-4-methoxyphenyl)acrylamide(
ⅵ‑
1)
[0049]
黄色固体，产率：44％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ10.09(bs,1h),9.74(s,1h),8.61(bs,1h),8.56(d,j＝4.9hz,1h),8.42(d,j＝8.0hz,1h),7.90(d,j＝7.9hz,1h),7.71(s,1h),7.44(t,j＝7.5hz,1h),7.38(t,j＝7.4hz,1h),7.15(d,j＝4.9hz,1h),3.88(s,3h),2.86(t,j＝5.0hz 2h),2.70(s,3h),2.32
–
2.19(m,8h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ163.12,161.62,160.14,158.56,144.79,141.18,136.65,135.72,134.53,132.37,131.47,129.53,126.68,125.88,124.74,124.45,123.64,122.90,111.30,110.08,104.65,57.43,56.56,56.07,45.50,43.56.hrms(esi)calculated for c
27h30
n6o2s[m h]

:503.2224,found:503.2213.purity:99.9％(by hplc).n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-2-((2-(diethyl-amino)-ethyl)(methyl)amino)-4-methoxyphenyl)acrylamide(
ⅵ‑
2)
[0050]
黄色固体，产率：35％；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.72(s,1h),9.63(s,1h),8.59(s,1h),8.55(d,j＝5.1hz,1h),8.42(d,j＝8.0hz,1h),7.89(d,j＝7.9hz,1h),7.70(s,1h),7.43(t,j＝7.4hz,1h),7.37(t,j＝7.4hz,1h),7.14(d,j＝5.1hz,1h),6.77(s,1h),6.47(m,2h),5.70(d,j＝11.2hz,1h),3.87(s,3h),2.90(m,2h),2.66(s,3h),2.61(t,j＝7.1hz,4h),2.48(m,2h),1.02(t,j＝7.1hz,6h).
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ163.12,161.63,160.14,158.60,144.80,141.17,136.64,136.02,134.53,132.30,131.45,128.74,126.41,126.20,124.78,124.49,123.67,122.91,111.55,110.09,104.18,56.09,50.53,47.50,43.13,10.98.hrms(esi)calculated for c
29h34
n6o2s[m h]

:531.2537,found:531.2561.purity:99.7％(by hplc).
[0051]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-2-((3-(dimethyl-amino)-propyl)(methyl)amino)-4-methoxyphenyl)acrylamide(
ⅵ‑
3)
[0052]
黄绿色固体，产率：47％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ9.70(s,1h),8.72(s,1h),8.55(d,j＝5.1hz,2h),8.42(d,j＝8.1hz,1h),7.90(d,j＝8.0hz,1h),7.70(s,1h),7.44(t,j＝7.6hz,1h),7.38(t,j＝7.5hz,1h),7.15(d,j＝5.1hz,1h),6.76(s,1h),6.43(d,j＝16.8hz,1h),6.33(dd,j＝16.8,10.0hz,1h),5.74(d,j＝9.9hz,1h),3.88(s,3h),2.89(t,j＝7.2hz,2h),2.62(s,3h),2.34(t,j＝7.2hz,4h),2.23(s,6h),1.69
–
1.59(m,2h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ162.80,161.67,160.09,158.57,144.87,141.17,136.63,135.38,134.53,132.11,131.32,128.03,126.60,126.52,124.79,124.53,123.67,122.92,110.88,110.20,103.95,57.43,56.11,55.15,45.27,43.64,25.64.hrms(esi)calculated for c
28h32
n6o2s[m h]

:517.2380,found:517.2396.purity:98.3％(by hplc).
[0053]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-4-methoxy-2-(4-methyl-piperazin-1-yl)phenyl)acrylamide(
ⅵ‑
4)
[0054]
黄色固体，产率：40.8％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ9.68(s,1h),8.66
–
8.49(m,3h),8.42(d,j＝8.0hz,1h),7.91(d,j＝8.0hz,1h),7.69(s,1h),7.44(t,j＝7.6hz,1h),7.38(t,j＝7.5hz,1h),7.15(d,j＝5.1hz,1h),6.79(s,1h),6.43(d,j＝16.9hz,1h),6.29(dd,j＝16.8,10.2hz,1h),5.76(d,j＝10.1hz,1h),3.87(s,3h),2.91(t,j＝5.0hz,4h),2.61(m,
4h),2.39(s,3h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ162.61,161.65,160.10,158.57,144.83,141.16,136.63,135.22,134.54,132.16,131.27,126.92,126.49,126.45,124.79,124.52,123.68,122.92,111.04,110.20,103.50,56.04,52.45,46.19.hrms(esi)calculated for c
27h28
n6o2s[m h]

:501.2067,found:501.2072.purity:97.4％(by hplc).
[0055]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-2-(4-ethyl-piperazin-1-yl)-4-methoxyphenyl)acrylamide(
ⅵ‑
5)
[0056]
黄色固体，产率：58％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ9.68(s,1h),8.61(s,1h),8.55(d,j＝5.0hz,2h),8.42(d,j＝8.0hz,1h),7.90(d,j＝8.0hz,1h),7.69(s,1h),7.44(t,j＝7.6hz,1h),7.38(t,j＝7.5hz,1h),7.15(d,j＝5.1hz,1h),6.81(s,1h),6.42(d,j＝16.9hz,1h),6.29(dd,j＝16.8,10.2hz,1h),5.75(d,j＝10.1hz,1h),3.86(s,3h),2.92(t,j＝4.3hz,4h),2.63(m,4h),2.51(q,j＝7.2hz,2h),1.15(t,j＝7.2hz,3h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ162.62,161.65,160.10,158.57,144.82,141.16,136.63,135.31,134.54,132.18,131.29,126.95,126.45,126.43,124.79,124.52,123.69,122.92,111.00,110.19,103.55,56.00,53.75,52.55,52.43,12.14.hrms(esi)calculated for c
28h30
n6o2s[m h]

:515.2224,found:515.2239.purity:99.9％(by hplc).
[0057]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-2-(4-isopropyl-piperazin-1-yl)-4-methoxyphenyl)acrylamide(
ⅵ‑
6)
[0058]
白色固体，产率：49％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ9.69(s,1h),8.65(s,1h),8.57(d,j＝5.0hz,2h),8.45(d,j＝8.0hz,1h),7.92(d,j＝8.0hz,1h),7.71(s,1h),7.46(t,j＝7.6hz,1h),7.40(t,j＝7.5hz,1h),7.17(d,j＝5.1hz,1h),6.84(s,1h),6.45(d,j＝16.9hz,1h),6.32(dd,j＝16.8,10.2hz,1h),5.78(d,j＝10.1hz,1h),3.88(s,3h),2.94(t,j＝4.4hz,4h),2.83
–
2.60(m,5h),1.14(d,j＝6.5hz,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ162.60,161.63,160.10,158.55,144.82,141.15,136.62,135.41,134.53,132.18,131.26,126.92,126.41,126.37,124.77,124.50,123.68,122.90,111.00,110.16,103.59,55.98,54.59,52.90,49.63,18.70.hrms(esi)calculated for c
29h32
n6o2s[m h]

:529.2380,found:529.2364.purity:97.2％(by hplc).n-(2-(4-acetylpiperazin-1-yl)-5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)-amino)-4-methoxyphenyl)acrylamide(
ⅵ‑
7)
[0059]
黄色固体，产率：48.8％；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.69(s,1h),8.56(d,j＝5.1hz,2h),8.50
–
8.37(m,2h),7.91(d,j＝7.8hz,1h),7.72(s,1h),7.52
–
7.34(m,2h),7.17(d,j＝5.2hz,1h),6.71(s,1h),6.43(d,j＝16.7hz,1h),6.28(dd,j＝16.9,10.1hz,1h),5.77(d,j＝10.1hz,1h),3.88(s,3h),3.79(s,2h),3.69
–
3.56(m,2h),2.86(t,j＝4.8hz,4h),2.15(s,3h).
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ169.27,162.76,161.78,160.12,158.67,144.94,141.27,136.70,134.59,132.05,131.47,127.08,126.93,124.92,124.67,123.75,123.06,111.38,110.45,103.36,56.20,52.97,52.27,47.22,42.32,21.53.hrms(esi)calculated for c
28h28
n6o3s[m h]

:529.2016,found:529.2007.purity:98.6％(by hplc).
[0060]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-4-methoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)phenyl)acrylamide(
ⅵ‑
8)
[0061]
黄色固体，产率：42％；1h nmr(400mhz,cdcl3)δ9.59(s,1h),8.85(s,1h),8.54(d,j＝5.1hz,2h),8.43(d,j＝8.0hz,1h),7.90(d,j＝7.7hz,1h),7.67(s,1h),7.49
–
7.41(m,
1h),7.41
–
7.32(m,1h),7.14(d,j＝5.2hz,1h),6.76(s,1h),6.50
–
6.29(m,2h),5.75(d,j＝9.8hz,1h),3.87(s,3h),3.19
–
3.07(m,4h),2.84
–
2.72(m,4h),2.47(s,3h),1.97(m,2h).
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ162.86,161.66,160.12,158.57,145.00,141.15,137.94,136.63,134.56,132.16,131.25,126.96,126.48,126.09,124.80,124.53,123.71,122.91,111.44,110.15,105.17,59.48,57.08,56.07,55.61,54.90,47.41,28.77.hrms(esi)calculated for c
28h30
n6o2s[m h]

:515.2224,found:515.2199.purity:99.4％(by hplc).
[0062]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-2-(4-(dimethyl-amino)-piperidin-1-yl)-4-methoxyphenyl)acrylamide(
ⅵ‑
9)
[0063]
黄色固体，产率：54％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ9.63(s,1h),8.54(d,j＝4.9hz,2h),8.48(s,1h),8.42(d,j＝8.0hz,1h),7.91(d,j＝8.0hz,1h),7.68(s,1h),7.44(t,j＝7.5hz,1h),7.38(t,j＝7.4hz,1h),7.15(d,j＝5.1hz,1h),6.72(s,1h),6.42(d,j＝16.8hz,1h),6.30(dd,j＝16.8,10.1hz,1h),5.75(d,j＝10.0hz,1h),3.88(s,3h),3.06(d,j＝11.5hz,2h),2.71(t,j＝11.5hz,2h),2.46(m,7h),2.08(d,j＝11.9hz,2h),1.76(m,2h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ162.75,161.64,160.07,158.57,144.82,141.15,136.60,135.67,134.50,132.08,131.31,126.66,126.62,126.32,124.81,124.55,123.68,122.93,111.35,110.20,103.15,62.25,56.10,52.11,41.54,29.37.hrms(esi)calculated for c
29h32
n6o2s[m h]

:529.2380,found:529.2375.purity:97.3％(by hplc).
[0064]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-4-methoxy-2-(4-(4-methylpiperazin-1-yl)piperidin-1-yl)phenyl)acrylamide(
ⅵ‑
10)
[0065]
黄绿色固体，产率：41.5％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ9.65(s,1h),8.63
–
8.46(m,3h),8.42(d,j＝8.0hz,1h),7.90(d,j＝8.0hz,1h),7.68(s,1h),7.44(t,j＝7.6hz,1h),7.38(t,j＝7.5hz,1h),7.15(d,j＝5.1hz,1h),6.74(s,1h),6.42(d,j＝16.9hz,1h),6.27(dd,j＝16.8,10.2hz,1h),5.75(d,j＝10.1hz,1h),3.88(s,3h),3.04(d,j＝11.4hz,2h),2.72(t,j＝11.7hz,4h),2.65
–
2.35(m,5h),2.34(m,4h),2.23(m,1h),2.06(d,j＝11.8hz,2h),1.66(q,j＝11.6hz,2h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ162.68,161.64,160.10,158.56,144.80,141.16,136.62,135.95,134.53,132.10,131.29,126.73,126.53,126.20,124.78,124.51,123.69,122.91,111.20,110.15,103.16,61.44,56.08,55.35,52.59,49.43,45.97,29.92.hrms(esi)calculated for c
32h37
n7o2s[m h]

:584.2802,found:584.2802.purity:99.8％(by hplc).
[0066]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-2-((2-(dimethyl-amino)-ethyl)-thio)-4-methoxyphenyl)acrylamide(
ⅵ‑
11)
[0067]
黄色固体，产率68.1％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ10.19(s,1h),9.73(s,1h),8.62(bs,1h),8.58(d,j＝5.1hz,1h),8.40(d,j＝8.1hz,1h),7.96
–
7.90(m,2h),7.46(t,j＝7.6hz,1h),7.39(t,j＝7.5hz,1h),7.20(d,j＝5.1hz,1h),7.10(s,1h),6.50(d,j＝16.9hz,1h),6.31(dd,j＝16.9,10.2hz,1h),5.75(d,j＝10.2hz,1h),3.92(s,3h),2.84(t,j＝6.0hz,2h),2.31(t,j＝6.0hz,2h),2.24(s,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ163.25,161.63,159.82,158.58,144.32,141.19,136.56,136.06,134.36,132.09,131.76,131.11,126.57,124.85,124.55,123.50,122.99,117.58,113.42,111.54,110.62,56.31,56.10,44.75,35.43.hrms(esi)calculated for c
26h27
n5o2s2[m h]

:506.1679,found:
506.1659.purity:97.5％(by hplc).
[0068]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)-4-methoxy-2-(2-mor-pholinoethoxy)phenyl)acrylamide(
ⅵ‑
12)
[0069]
黄色固体，产率：38.7％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ9.57(s,1h),8.56
–
8.47(m,2h),8.44(m,2h),7.90(d,j＝8.0hz,1h),7.58(s,1h),7.43(t,j＝7.5hz,1h),7.38(t,j＝7.4hz,1h),7.12(d,j＝5.0hz,1h),6.60(s,1h),6.47(d,j＝16.8hz,1h),6.37(dd,j＝16.8,10.0hz,1h),5.76(d,j＝9.9hz,1h),4.17(t,j＝5.1hz,2h),3.87(s,3h),3.75(m,4h),2.69(t,j＝4.9hz,2h),2.54(m,4h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ162.91,161.70,160.20,158.55,145.39,142.75,141.12,136.64,134.60,131.88,131.07,126.93,124.78,124.54,123.79,123.73,122.90,122.52,112.98,110.04,99.30,67.82,66.76,57.70,56.17,53.78.hrms(esi)calculated for c
28h29
n5o4s[m h]

:532.2013,found:532.2006.purity:99.8％(by hplc).
[0070]
n-(5-((4-(benzo[b]thiophen-3-yl)-5-fluoropyrimidin-2-yl)amino)-2-((2-(dimethyl-amino)ethyl)(methyl)amino)-4-methoxyphenyl)acrylamide(
ⅵ‑
13)
[0071]
黄色固体，产率：32％；1h nmr(500mhz,cdcl3)δ10.11(s,1h),9.55(s,1h),8.50(m,2h),8.40(s,1h),7.90(d,j＝7.9hz,1h),7.64(s,1h),7.41(m,2h),6.79(s,1h),6.43(d,j＝16.9hz,1h),6.31(dd,j＝16.9,10.1hz,1h),5.69(d,j＝10.1hz,1h),3.88(s,3h),2.88(t,j＝5.3hz,2h),2.70(s,3h),2.29(t,j＝5.3hz,3h),2.26(s,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ163.30,156.41,150.08(1j＝252.5hz),149.63(3j＝11.25hz),146.34(2j＝25.0hz),144.95,140.08,136.98,136.04,132.97(3j＝10.0hz),132.28,129.41,128.92,128.88,126.52,126.02,124.85,124.82,124.80,124.76,122.46,111.22,104.63,57.38,56.48,56.04,45.48,43.52.hrms(esi)calculated for c
27h29
fn6o2s[m h]

:521.2129,found:521.2122.purity:98.3％(by hplc).
[0072]
实施例2激酶测试实验
[0073]
为了确定6a的靶向性并评估其抗肿瘤潜力，我们进行了体外酶学检测。以afatinib和osimertinib作为阳性对照。如图1所示，图1(a)为6a诱导了egfr磷酸化的剂量依赖性抑制；(b)为afatinib和osimertinib诱导了egfr磷酸化的剂量依赖性抑制。数据以三次重复独立实验的平均值
±
标准差表示。
[0074]
其中，6a在纳米摩尔浓度水平上表现出较强的抑制活性，且呈剂量依赖性(egfr-l858r的ic50＝1.33
±
0.02nm)，与阳性对照afatinib的ic50＝1.03
±
0.03nm相似。对于egfr t790m/l858r突变，6a的抑制作用(ic50＝0.26
±
0.01nm)略强于osimertinib(ic50＝0.37
±
0.04nm)，说明6a具有克服egfr突变抗性的潜力。
[0075]
实施例3苯并噻吩嘧啶衍生物的抗肿瘤活性研究
[0076]
以osimertinib为阳性对照，测定合成的13个化合物对h1975,pc9,h229细胞的体外抗增殖活性，具体过程为：
[0077]
收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，以5
×
103个/孔接种到96孔板中，置37℃、5％的二氧化碳培养箱孵育12-24h。待细胞贴壁后，吸弃旧培养基，加入不含有fbs的培养基；每一化合物设六个浓度梯度(10、1、0.1、0.05、0.01、0.001μm)，每一浓度设三组复孔，加入后，培养48h然后每孔避光加入cck8溶液，放入二氧化碳培养箱继续孵育2-4h。在酶标仪
在450nm的发射波长下测定各孔光的吸光度(od值)。最后进行数据统计，根据下列公式算得各浓度下的抑制率：
[0078][0079]
然后利用软件graphpad prism 5.02计算半数抑制量(ic
50
)，每一组实验独立重复三次并取平均值获取最终数据。具体实验结果如表1所示。
[0080]
表1
ⅵ‑
1～
ⅵ‑
13抗肿瘤活性
[0081][0082][0083]
a.egfr激酶l858r/t790m双突变细胞；b.egfr激酶l858r单突变细胞；c.egfr激酶野生型细胞。
[0084]
体外抗增殖实验结果表明：化合物
ⅵ‑
1对h1975细胞的抗增殖活性为2.2nm，是阳性药osimertinib的1.58倍；同时化合物
ⅵ‑
1与阳性药相比，对双突变的h1975细胞具有更高的选择性。化合物
ⅵ‑
2～
ⅵ‑
12和
ⅵ‑
13体外抗增殖活性均弱于
ⅵ‑
1。
[0085]
对13个osimertinib衍生物的体外抗增殖活性研究结果表明，将n-甲基吲哚环用疏水性较大的杂环取代，有利于抗增殖活性的增加，说明该部分结构与靶点的结合需要疏水作用，另外，化合物
ⅵ‑
1对h1975细胞的高选择性，进一步验证了该类化合物的毒性有一
部分来源于n-甲基吲哚的去甲基化反应；对r2部分的结构修饰，无论是改变链的体积、电性或脂溶性，均使活性降低，这可能由于改变了分子的空间构象，使小分子不能与靶蛋白有效的结合，也说明侧链结构具有较高的保守性；将r1用氟原子取代后，抗增殖活性降低，可能由于该处与靶点的结合位点较小，体积增大后不能有效的与靶蛋白结合。