一种核酸扩增试剂盒及其制备方法和应用与流程

20。
13.上述的核酸扩增试剂盒中，优选地，在1x的配方中，所述第一保护剂包括终浓度为0.01％～1％的环糊精、0.01％～1％的吐温-20、0.01％～4％的海藻糖和0.01％～4％的聚乙二醇中的一种或多种的组合。
14.上述的核酸扩增试剂盒中，优选地，所述lamp/rt-lamp扩增反应试剂包括tris、mgso4、(nh4)2so4、kcl、dntp和dna聚合酶。
15.上述的核酸扩增试剂盒中，优选地，在1x的配方中，所述lamp/rt-lamp扩增反应试剂包括终浓度为0.1～50mm的tris、1～8mm的mgso4、1～50mm的(nh4)2so4、1～250mm的kcl、0.1～7mm的dntp、0.02u～2u/ul的dna聚合酶。
16.上述的核酸扩增试剂盒中，优选地，所述dna聚合酶包括有链置换活性的dna聚合酶和/或dna/rna聚合酶(例如：bst2.0或bst3.0)。
17.上述的核酸扩增试剂盒中，优选地，当涉及到rt-lamp扩增反应时，所述lamp/rt-lamp扩增反应试剂还选择性的添加逆转录rt酶和/或rna酶抑制剂。
18.上述的核酸扩增试剂盒中，优选地，在1x的配方中，lamp/rt-lamp扩增反应试剂还包括终浓度为0.1u～10u/ul的逆转录rt酶和/或0.1u～10u/ul的rna酶抑制剂。
19.上述的核酸扩增试剂盒中，优选地，所述lamp/rt-lamp扩增反应试剂冻干微球在制备过程中还包括添加第二保护剂，所述第二保护剂包括糖/多元醇类、聚合物类、表面活性剂类、氨基酸类和盐类中的一种或多种的组合。
20.上述的核酸扩增试剂盒中，优选地，所述糖/多元醇类包括海藻糖、右旋糖、乳糖、蔗糖和环糊精中的一种或多种；所述聚合物类包括聚乙二醇；所述表面活性剂包括吐温-20。
21.上述的核酸扩增试剂盒中，优选地，在1x的配方中，所述第二保护剂包括终浓度为0.01％～1％的环糊精、0.01％～1％的吐温-20、0.01％～4％的海藻糖和0.01％～4％的聚乙二醇中的一种或多种的组合。
22.另一方面，本发明还提供上述的核酸扩增试剂盒的制备方法，其包括以下步骤：
23.将引物和保护剂混合配制成高浓度冻干预混液(例如：相对于1x配方的5x、6x、7x、8x、9x、10x)，接着滴入到液氮中进行预冻，得到引物预冻微球；
24.将lamp/rt-lamp扩增反应试剂和保护剂混合配制成高浓度冻干预混液(例如：相对于1x配方的5x、6x、7x、8x、9x、10x)，接着滴入到液氮中进行预冻，得到lamp/rt-lamp扩增反应试剂预冻微球；
25.将引物预冻微球和lamp/rt-lamp扩增反应试剂预冻微球分别装于西林瓶中，置于冻干机中进行真空冷冻干燥，分别得到引物冻干微球和lamp/rt-lamp扩增反应试剂冻干微球；
26.将引物冻干微球和lamp/rt-lamp扩增反应试剂冻干微球包装后得到核酸扩增试剂盒；
27.或者，
28.将引物和保护剂混合配制成高浓度原位烘干预混液(例如：相对于1x配方的5x、6x、7x、8x、9x、10x)，原位烘干得到引物烘干后固体；
29.将lamp/rt-lamp扩增反应试剂和保护剂混合配制成高浓度冻干预混液(例如：相
对于1x配方的5x、6x、7x、8x、9x、10x)，接着滴入到液氮中进行预冻，得到lamp/rt-lamp扩增反应试剂预冻微球；
30.将lamp/rt-lamp扩增反应试剂预冻微球装于西林瓶中，置于冻干机中进行真空冷冻干燥，得到lamp/rt-lamp扩增反应试剂冻干微球；
31.将引物烘干固体和lamp/rt-lamp扩增反应试剂冻干微球包装后得到核酸扩增试剂盒。
32.上述的制备方法中，优选地，所述原位烘干的温度为30～80℃，烘干时间为30min；所述真空冷冻干燥依次包括一次干燥和解析干燥。
33.上述的制备方法中，优选地，所述依次干燥的程序依次为：-45℃480min、-40℃360min、-35℃120min；所述解析干燥的程序依次为：20℃120min、25℃50min。
34.再一方面，本发明还提供上述的核酸扩增试剂盒在rna病毒检测中的应用。
35.本发明的有益效果：
36.本发明通过对扩增反应试剂和引物进行特殊处理的技术方案，将扩增试剂和引物分开单独处理，lamp/rt-lamp恒温扩增试剂冷冻干燥处理时，将引物作为单独部分添加保护剂进行真空冷冻干燥处理或原位烘干处理，在后期和含酶不含引物的冻干球一起加水复溶后扩增，能够有效降低了冷冻干燥技术处理后的lamp/rt-lamp扩增试剂非特异现象，试剂扩增效率不受影响，试剂活性没有下降；处理后的试剂存储稳定、活性正常，且有效提升了试剂扩增的特异性；在单位时间内可区分阴阳性，避免了非特异扩增导致的假阳性现象。
附图说明：
37.为了更清楚的说明本发明实施例或现有的技术中的技术方案，下面将对实施例或者现有技术描述中有关于本发明需要图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的有关本发明的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
38.图1为本发明实施例1中制备的lamp核酸扩增试剂冻干微球与引物冻干微球的处理方式对lamp扩增反应特异性的改进效果对比图；
39.图2为本发明实施例2中制备的rt-lamp核酸扩增试剂冻干微球与引物冻干微球的处理方式对rt-lamp扩增反应特异性的改进效果对比图；
40.图3为本发明实施例3中制备的rt-lamp核酸扩增试剂冻干微球与原位烘干高浓度引物的处理方式对rt-lamp扩增反应特异性的改进效果对比图。
具体实施方式
41.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本发明而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本发明各权利要求所要求保护的技术方案。本发明下述实施例中所采用的原料若无特殊说明，均为常规市售获得，所采用的实验操作若无特殊说明，均为本领域常规操作。
42.实施例1：
43.本实施例提供一种核酸扩增试剂盒，该核酸扩增试剂盒包括引物冻干微球和lamp扩增反应试剂冻干微球。
44.制备所述lamp扩增反应试剂冻干微球的lamp扩增反应试剂配制参见表1所示。
45.表1：lamp扩增反应试剂配制表
46.成份5x预混液终浓度1x使用浓度tris-hcl(mm)5.001.00kcl(mm)250.0050.00(nh4)2so4(mm)50.0010.00mgso4(mm)30.006.00吐温20％(m/v)0.500.10dntps(mm)7.001.40peg 4k％(m/v)10.002.00海藻糖％(m/v)5.001.00环糊精％(m/v)0.500.10bst 3.0酶(u/ul)1.600.32
47.制备所述引物冻干微球的引物配制参见表2所示。
48.表2：引物配制表
49.成份8.3x预混液终浓度1x使用浓度peg 4k％(m/v)5.000.60海藻糖％(m/v)5.000.60环糊精％(m/v)1.000.12gapdh基因-fip(um)13.281.60gapdh基因-bip(um)13.281.60gapdh基因-f3(um)1.660.20gapdh基因-b3(um)1.660.20gapdh基因-lf(um)3.320.40
50.引物核苷酸序列如下：
51.gapdh基因-fip(seq id no：1)：
[0052]5’‑
tcacgccacagtttcccgactcatgaccacagtccat-3’；
[0053]
gapdh基因-bip(seq id no：2)：
[0054]5’‑
cggggctctccagaacatcctcagggatgaccttgcc-3’；
[0055]
gapdh基因-f3(seq id no：3)：
[0056]5’‑
ccatgacaactttggtatcgt-3’；
[0057]
gapdh基因-b3(seq id no：4)：
[0058]5’‑
agtgagcttcccgttcag-3’；
[0059]
gapdh基因-lf(seq id no：5)：
[0060]5’‑
tccacagtcttctgggtg-3’。
[0061]
本实施例还提供该核酸扩增试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：
[0062]
(1)按照引物配制表配置引物冻干前预混液，接着滴入到液氮中进行预冻，得到引
物预冻微球，微球体积为3μl。
[0063]
(2)按照lamp扩增反应试剂配制表配置lamp扩增反应试剂冻干前预混液，接着滴入到液氮中进行预冻，得到lamp扩增反应试剂预冻微球，微球体积为5μl。
[0064]
(3)分别将引物预冻微球和lamp扩增反应试剂预冻微球分别装于西林瓶中，插塞后转入冻干机干燥箱内，进行真空冷冻干燥(冻干机干燥程序为一次干燥：-45℃480min、-40℃360min、-35℃120min；解析干燥：20℃120min、25℃50min)，分别得到引物冻干微球和lamp扩增反应试剂冻干微球；
[0065]
(4)包装后得到核酸扩增试剂盒。
[0066]
将本实施例制备的核酸扩增试剂盒进行反应检测实验：
[0067]
将冻干后的lamp扩增试剂微球、引物微球放入8连管中，加入20ul缓冲液(25ul反应体系终浓度为10mm tris ph8.8，1x eva green)溶解后，阳性样本加入5ul gapdh质粒作为模板，阴性样本加入5ul depc水进行扩增。本测试阴阳性样本各测试3个重复，扩增条件是65℃40分钟。实验结果如图1所示。
[0068]
图1分别制备lamp核酸扩增试剂冻干微球与引物冻干微球的处理方式对lamp扩增反应特异性的改进效果。左图为处理前lamp扩增试剂和引物全冻干在一颗冻干球的扩增数据，阴性和阳性无法区分。右图为本实施例处理后lamp扩增试剂和引物分别制成两颗冻干球的扩增数据，阴性和阳性能有效区分。由此表明，采用本发明核酸扩增试剂盒扩增反应特异性得到显著改善。
[0069]
实施例2：
[0070]
本实施例提供一种核酸扩增试剂盒，该核酸扩增试剂盒包括引物冻干微球和rt-lamp扩增反应试剂冻干微球。
[0071]
制备所述rt-lamp扩增反应试剂冻干微球的rt-lamp扩增反应试剂配制参见表3所示。
[0072]
表3：rt-lamp扩增反应试剂配制表
[0073]
成份5x预混液终浓度1x使用浓度tris-hcl(mm)5.001.00kcl(mm)250.0050.00(nh4)2so4(mm)50.0010.00mgso4(mm)30.006.00吐温20％(m/v)0.500.10dntps(mm)7.001.40peg 4k％(m/v)10.002.00海藻糖％(m/v)5.001.00环糊精％(m/v)0.500.10rna酶抑制剂(u/ul)10.002.00逆转录酶(u/ul)10.002.00bst 3.0酶(u/ul)1.600.32
[0074]
制备所述引物冻干微球的引物配制参见表4所示。
[0075]
表4：引物配制表
[0076][0077][0078]
引物核苷酸序列如下：
[0079]
n基因-fip(seq id no：6)：
[0080]5’‑
cgttgttttgatcgcgccccattacgtttggtggaccctc-3’；
[0081]
n基因-bip(seq id no：7)：
[0082]5’‑
atactgcgtcttggttcaccgcattggaacgccttgtcctc-3’；
[0083]
n基因-f3(seq id no：8)：
[0084]5’‑
tggaccccaaaatcagcg-3’；
[0085]
n基因-b3(seq id no：9)：
[0086]5’‑
agccaatttggtcatctgga-3’；
[0087]
n基因-lf(seq id no：10)：
[0088]5’‑
tgcgttctccattctggttact-3’；
[0089]
n基因-lb(seq id no：11)：
[0090]5’‑
tctcactcaacatggcaaggaa-3’。
[0091]
本实施例还提供该核酸扩增试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：
[0092]
(1)按照引物配制表配置引物冻干前预混液，接着滴入到液氮中进行预冻，得到引物预冻微球，微球体积为3μl。
[0093]
(2)按照rt-lamp扩增反应试剂配制表配置lamp扩增反应试剂冻干前预混液，接着滴入到液氮中进行预冻，得到rt-lamp扩增反应试剂预冻微球，微球体积为5μl。
[0094]
(3)分别将引物预冻微球和rt-lamp扩增反应试剂预冻微球分别装于西林瓶中，插塞后转入冻干机干燥箱内，进行真空冷冻干燥(冻干机干燥程序为一次干燥：-45℃480min、-40℃360min、-35℃120min；解析干燥：20℃120min、25℃50min)，分别得到引物冻干微球和rt-lamp扩增反应试剂冻干微球；
[0095]
(4)包装后得到核酸扩增试剂盒。
[0096]
将本实施例制备的核酸扩增试剂盒进行反应检测实验：
[0097]
将冻干后的rt-lamp扩增试剂微球、引物微球放入8连管中，加入20ul缓冲液(25ul反应体系终浓度为10mm tris ph8.8，1x eva green)溶解后，5ul新冠rna国家标准品进行n基因扩增，阴性样本加入5ul depc水进行扩增。本测试阴阳性样本各测试4个重复，扩增条
件是65℃40分钟。实验结果如图2所示。
[0098]
图2分别制备rt-lamp核酸扩增试剂冻干微球与引物冻干微球的处理方式对rt-lamp扩增反应特异性的改进效果。左图为处理前rt-lamp扩增试剂和引物全冻干在一颗冻干球的扩增数据，阴性和阳性无法区分。右图为处理后rt-lamp扩增试剂和引物分别制成两颗冻干球的扩增数据，阴性和阳性能有效区分。由此表明，采用本发明核酸扩增试剂盒扩增反应特异性得到显著改善。
[0099]
实施例3：
[0100]
本实施例提供一种核酸扩增试剂盒，该核酸扩增试剂盒包括原位烘干引物固体和rt-lamp扩增反应试剂冻干微球。
[0101]
制备所述rt-lamp扩增反应试剂冻干微球的rt-lamp扩增反应试剂配制参见表5所示。
[0102]
表5：rt-lamp扩增反应试剂配制表
[0103][0104][0105]
制备所述原位烘干引物固体的引物配制参见表6所示。
[0106]
表6：引物配制表
[0107]
成份8.3x预混液终浓度1x使用浓度环糊精％(m/v)1.000.12n基因-fip(um)13.281.60n基因-bip(um)13.281.60n基因-f3(um)1.660.20n基因-b3(um)1.660.20n基因-lf(um)3.320.40n基因-lb(um)1.000.12
[0108]
引物核苷酸序列同实施例2。
[0109]
本实施例还提供该核酸扩增试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：
[0110]
(1)按照rt-lamp扩增反应试剂配制表配置rt-lamp扩增反应试剂冻干前预混液，接着滴入到液氮中进行预冻，得到rt-lamp扩增反应试剂预冻微球，微球体积为5μl。
[0111]
(2)将rt-lamp扩增反应试剂预冻微球装于西林瓶中，插塞后转入冻干机干燥箱内，进行真空冷冻干燥(冻干机干燥程序为一次干燥：-45℃480min、-40℃360min、-35℃120min；解析干燥：20℃120min、25℃50min)，得到rt-lamp扩增反应试剂冻干微球。
[0112]
(3)按照引物配制表配置引物烘干前预混液，按照反应体系含量分装3μl于八连管内，在恒温箱中用40℃温度烘干30分钟，得到引物微球。
[0113]
(4)包装后得到核酸扩增试剂盒。
[0114]
将本实施例制备的核酸扩增试剂盒进行反应检测实验：
[0115]
将冻干后的rt-lamp扩增试剂微球放入含原位烘干引物微球的8连管中，加入20ul缓冲液(25ul反应体系终浓度为10mm tris ph8.8，1x eva green)溶解后，阳性样本加入5ul新冠rna国家标准品进行n基因扩增，阴性样本加入5ul depc水进行扩增。本测试阴阳性样本各测试3个重复，扩增条件是65℃40分钟。实验结果如图3所示。
[0116]
图3分别制备rt-lamp核酸扩增试剂冻干微球与原位烘干高浓度引物的处理方式对rt-lamp扩增反应特异性的改进效果。左图为处理前rt-lamp扩增试剂和引物全冻干在一颗冻干球的扩增数据，阴性和阳性无法区分。右图为处理后rt-lamp扩增试剂冻干球和原位干燥高浓度引物分别制备的扩增数据，阴性和阳性能有效区分。由此表明，采用本发明核酸扩增试剂盒扩增反应特异性得到显著改善。
[0117]
最后，需要说明的是，本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。