通过血脑屏障的抗人转铁蛋白受体抗体的制作方法

通过血脑屏障的抗人转铁蛋白受体抗体
1.本技术是申请号为201680036554.4(国际申请号为pct/jp2016/068738)、中国国家阶段进入日为2017年12月21日(国际申请日为2016年6月24日)、发明名称为“通过血脑屏障的抗人转铁蛋白受体抗体”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及为了使给药于血中而应在中枢神经系统(cns)中起作用的化合物(蛋白质、低分子化合物等)能够通过血脑屏障而与这些化合物结合、使用的抗人转铁蛋白受体抗体、其制造法及其使用方法。


背景技术：

3.对除包括脑室周围器官(松果体、脑垂体、最后区等)在内的几个区域以外的大部分脑组织供给血液的毛细血管与存在于肌肉等其它组织中的毛细血管不同，形成其内皮的内皮细胞彼此通过牢固的细胞间接合而紧密结合。因此会妨碍物质从血液向脑部的被动转运，虽然也有例外，但除了脂溶性高的物质或分子量小(200～500道尔顿以下)且在生理ph附近为电中性的物质以外，均难以从毛细血管向脑中迁移。这种通过脑内的毛细血管内皮来限制血液与脑组织液之间的物质交换的机制被称为血脑屏障(blood-brain barrier，bbb)。此外，血脑屏障不仅限制脑的组织液与血液之间的物质交换，而且还限制包括脑和脊髓在内的中枢神经系统的组织液与血液之间的物质交换。
4.由于血脑屏障的存在，中枢神经系统的大部分细胞不会受到血中的激素、淋巴因子等物质的浓度变动等的影响，从而能保持其生化学的稳态。
5.但是，血脑屏障的存在在药剂开发上引起问题。例如，对起因于α-l-艾杜糖醛酸酶缺损的遗传性代谢疾病-粘多糖症i型(hurler综合症)，正在进行静脉内补充重组α-l-艾杜糖醛酸酶的酶补充疗法来作为该疾病的治疗法，但对于hurler综合症中观察到的显著的中枢神经系统(cns)异常，由于酶不能通过血脑屏障而无效。
6.关于用于使应在中枢神经系统中起作用的这种蛋白质等高分子物质通过血脑屏障的方法，已经开发出各种方法。例如，在神经生长因子的情况下，尝试了通过使包封有神经生长因子的脂质体与脑内毛细血管的内皮细胞的细胞膜融合而使其通过血脑屏障的方法，但未达到实用化(非专利文献1)。在α-l-艾杜糖醛酸酶的情况下，进行了通过增加每次给药的酶量来提高其血药浓度、从而提高血脑屏障中的酶的被动转运的尝试，并且示出了使用hurler综合症的动物模型通过该方法缓解了中枢神经系统(cns)的异常(非专利文献2)。
7.此外，为了避开血脑屏障，还进行了将高分子物质直接给药于髓腔内或脑内的尝试。例如报道了：向hurler综合症(粘多糖症i型)的患者的髓腔内给药人α-l-艾杜糖醛酸酶的方法(专利文献1)、向niemann-pick病的患者的脑室内给药人酸性鞘磷脂酶的方法(专利文献2)、向hunter综合症的模型动物的脑室内给药艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(i2s)的方法(专利文献3)。认为根据这样的方法可以切实地使药剂作用于中枢神经系统，但另一方面存在
侵入性极高的问题。
8.作为使高分子物质通过血脑屏障而到达脑内的方法，报道了多种按照与存在于脑内毛细血管的内皮细胞上的膜蛋白具有亲和性的方式来修饰高分子物质的方法。作为存在于脑内毛细血管的内皮细胞上的膜蛋白，可以列举胰岛素、转铁蛋白、胰岛素样生长因子(igf-i，igf-ii)、ldl、来普汀(leptin)等化合物的受体。
9.例如报道了如下技术：将神经生长因子(ngf)以与胰岛素的融合蛋白的形态合成，通过与胰岛素受体的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4～6)。此外报道了如下技术：将神经生长因子(ngf)以与抗胰岛素受体抗体的融合蛋白的形态合成，通过与胰岛素受体的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4和7)。此外，报道了如下技术：将神经生长因子(ngf)以与转铁蛋白的融合蛋白的形态合成，通过与转铁蛋白受体(tfr)的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献8)。此外报道了如下技术：将神经生长因子(ngf)以与抗转铁蛋白受体抗体(抗tfr抗体)的融合蛋白的形态合成，通过与tfr的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4和9)。
10.报道了：对使用抗tfr抗体的技术进行进一步审视，在通过与抗tfr抗体结合而使药剂通过血脑屏障的技术中，可以使用单链抗体(非专利文献3)。此外报道了：与htfr的解离常数较大的抗htfr抗体(低亲和性抗htfr抗体)可以制成药剂在通过血脑屏障的技术中适当利用(专利文献10和11，非专利文献4)。进一步报道了：与htfr的亲和性依赖于ph而变化的抗tfr抗体可以作为用于使药剂通过血脑屏障的载体使用(专利文献12，非专利文献5)。
11.现有技术文献
12.专利文献
13.专利文献1:日本特表2007-504166号公报
14.专利文献2:日本特表2009-525963号公报
15.专利文献3:日本特开2012-62312号公报
16.专利文献4:美国专利5154924号公报
17.专利文献5:日本特开2011-144178号公报
18.专利文献6:美国专利2004/0101904号公报
19.专利文献7:日本特表2006-511516号公报
20.专利文献8:日本特开h06-228199号公报
21.专利文献9:美国专利5977307号公报
22.专利文献10:wo2012/075037
23.专利文献11:wo2013/177062
24.专利文献12:wo2012/143379
25.非专利文献
26.非专利文献1:xie y.et al.,j control release.105.106-19(2005)
27.非专利文献2:ou l.et al.,mol genet metab.111.116-22(2014)
28.非专利文献3:li jy.protein engineering.12.787-96(1999)
29.非专利文献4:bien-ly n.et al.,j exp med.211.233-44(2014)
30.非专利文献5:sada h.plos one.9.e96340(2014)


技术实现要素：

31.发明所要解决的问题
32.在上述背景下，本发明的目的在于，提供为了使给药于血中而应在中枢神经系统中起作用的化合物(蛋白质、低分子化合物等)能够通过血脑屏障而能够与这些化合物结合、使用的抗tfr抗体、其制造方法和使用方法。
33.用于解决问题的方法
34.在面对上述目的的研究中，本发明人反复进行了深入研究，结果发现：对于通过本说明书中详述的抗体制作方法得到的识别htfr的胞外区的抗人转铁蛋白受体抗体(抗htfr抗体)，在将其给药于生物体内时高效地通过血脑屏障，从而完成了本发明。即，本发明提供以下方案。
35.1.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
36.(1)cdr1中含有序列号6或序列号7的氨基酸序列、cdr2中含有序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列trp-thr-ser、且cdr3中含有序列号10的氨基酸序列的氨基酸序列；
37.(2)cdr1中含有序列号11或序列号12的氨基酸序列、cdr2中含有序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、且cdr3中含有序列号15的氨基酸序列的氨基酸序列；
38.(3)cdr1中含有序列号16或序列号17的氨基酸序列、cdr2中含有序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列lys-val-ser、且cdr3中含有序列号20的氨基酸序列的氨基酸序列；
39.(4)cdr1中含有序列号21或序列号22的氨基酸序列、cdr2中含有序列号23或序列号24的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、且cdr3中含有序列号25的氨基酸序列的氨基酸序列；
40.(5)cdr1中含有序列号26或序列号27的氨基酸序列、cdr2中含有序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、且cdr3中含有序列号30的氨基酸序列的氨基酸序列；
41.(6)cdr1中含有序列号31或序列号32的氨基酸序列、cdr2中含有序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列ala-ala-ser、且cdr3中含有序列号35的氨基酸序列的氨基酸序列；
42.(7)cdr1中含有序列号36或序列号37的氨基酸序列、cdr2中含有序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列gln-thr-ser、且cdr3中含有序列号40的氨基酸序列的氨基酸序列；
43.(8)cdr1中含有序列号41或序列号42的氨基酸序列、cdr2中含有序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列gly-thr-ser、且cdr3中含有序列号45的氨基酸序列的氨基酸序列；
44.(9)cdr1中含有序列号46或序列号47的氨基酸序列、cdr2中含有序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列phe-thr-ser、且cdr3中含有序列号50的氨基酸序列的氨基酸序列；
45.(10)cdr1中含有序列号51或序列号52的氨基酸序列、cdr2中含有序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列ala-ala-ser、且cdr3中含有序列号55的氨基酸序列的氨基酸序列；
46.(11)cdr1中含有序列号56或序列号57的氨基酸序列、cdr2中含有序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、且cdr3中含有序列号60的氨基酸序列的氨基酸序列；
47.(12)cdr1中含有序列号61或序列号62的氨基酸序列、cdr2中含有序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列trp-ser-ser、且cdr3中含有序列号65的氨基酸序列的氨基酸序列；
48.(13)cdr1中含有序列号66或序列号67的氨基酸序列、cdr2中含有序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、且cdr3中含有序列号70的氨基酸序列的氨基酸序列；
49.(14)cdr1中含有序列号71或序列号72的氨基酸序列、cdr2中含有序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、且cdr3中含有序列号75的氨基酸序列的氨基酸序列。
50.2.根据上述1的抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该抗体的轻链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
51.(1)cdr1中含有序列号6的氨基酸序列、cdr2中含有序列号8的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号10的氨基酸序列的氨基酸序列；
52.(2)cdr1中含有序列号11的氨基酸序列、cdr2中含有序列号13的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号15的氨基酸序列的氨基酸序列；
53.(3)cdr1中含有序列号16的氨基酸序列、cdr2中含有序列号18的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号20的氨基酸序列的氨基酸序列；
54.(4)cdr1中含有序列号21的氨基酸序列、cdr2中含有序列号23的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号25的氨基酸序列的氨基酸序列；
55.(5)cdr1中含有序列号26的氨基酸序列、cdr2中含有序列号28的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号30的氨基酸序列的氨基酸序列；
56.(6)cdr1中含有序列号31的氨基酸序列、cdr2中含有序列号33的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号35的氨基酸序列的氨基酸序列；
57.(7)cdr1中含有序列号36的氨基酸序列、cdr2中含有序列号38的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号40的氨基酸序列的氨基酸序列；
58.(8)cdr1中含有序列号41的氨基酸序列、cdr2中含有序列号43的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号45的氨基酸序列的氨基酸序列；
59.(9)cdr1中含有序列号46的氨基酸序列、cdr2中含有序列号48的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号50的氨基酸序列的氨基酸序列；
60.(10)cdr1中含有序列号51的氨基酸序列、cdr2中含有序列号53的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号55的氨基酸序列的氨基酸序列；
61.(11)cdr1中含有序列号56的氨基酸序列、cdr2中含有序列号58的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号60的氨基酸序列的氨基酸序列；
62.(12)cdr1中含有序列号61的氨基酸序列、cdr2中含有序列号63的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号65的氨基酸序列的氨基酸序列；
63.(13)cdr1中含有序列号66的氨基酸序列、cdr2中含有序列号68的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号70的氨基酸序列的氨基酸序列；和
64.(14)cdr1中含有序列号71的氨基酸序列、cdr2中含有序列号73的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号75的氨基酸序列的氨基酸序列。
65.3.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其轻链的可变区的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列与上述1或2中的任一轻链的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列分别具有80％以上的同源性。
66.4.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其轻链的可变区的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列与上述1或2中的任一轻链的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列分别具有90％以上的同源性。
67.5.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述1或2的任一轻链的cdr的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～5个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗人转铁蛋白受体抗体。
68.6.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述1或2的任一轻链的cdr的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗人转铁蛋白受体抗体。
69.7.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该抗体的重链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
70.(1)cdr1中含有序列号76或序列号77的氨基酸序列、cdr2中含有序列号78或序列号79的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号80或序列号81的氨基酸序列的氨基酸序列；
71.(2)cdr1中含有序列号82或序列号83的氨基酸序列、cdr2中含有序列号84或序列号85的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号86或序列号87的氨基酸序列的氨基酸序列；
72.(3)cdr1中含有序列号88或序列号89的氨基酸序列、cdr2中含有序列号90或序列号91的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号92或序列号93的氨基酸序列的氨基酸序列；
73.(4)cdr1中含有序列号94或序列号95的氨基酸序列、cdr2中含有序列号96或序列号97的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号98或序列号99的氨基酸序列的氨基酸序列；
74.(5)cdr1中含有序列号100或序列号101的氨基酸序列、cdr2中含有序列号102或序列号103的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号104或序列号105的氨基酸序列的氨基酸序列；
75.(6)cdr1中含有序列号106或序列号107的氨基酸序列、cdr2中含有序列号108的氨基酸序列或序列号278的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号109或序列号110的氨基酸序列的氨基酸序列；
76.(7)cdr1中含有序列号111或序列号112的氨基酸序列、cdr2中含有序列号113或序列号114的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号115或序列号116的氨基酸序列的氨基酸序列；
77.(8)cdr1中含有序列号117或序列号118的氨基酸序列、cdr2中含有序列号119的氨基酸序列或序列号279的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号120或序列号121的氨基酸序列的氨基酸序列；
78.(9)cdr1中含有序列号122或序列号123的氨基酸序列、cdr2中含有序列号124或序列号125的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号126或序列号127的氨基酸序列的氨基酸序列；
79.(10)cdr1中含有序列号128或序列号129的氨基酸序列、cdr2中含有序列号130或
序列号131的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号132或序列号133的氨基酸序列的氨基酸序列；
80.(11)cdr1中含有序列号134或序列号135的氨基酸序列、cdr2中含有序列号136或序列号137的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号138或序列号139的氨基酸序列的氨基酸序列；
81.(12)cdr1中含有序列号140或序列号141的氨基酸序列、cdr2中含有序列号142或序列号143的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号144或序列号145的氨基酸序列的氨基酸序列；
82.(13)cdr1中含有序列号146或序列号147的氨基酸序列、cdr2中含有序列号148或序列号149的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号150或序列号151的氨基酸序列的氨基酸序列；和
83.(14)cdr1中含有序列号152或序列号153的氨基酸序列、cdr2中含有序列号154或序列号155的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号156或序列号157的氨基酸序列的氨基酸序列。
84.8.根据上述7的抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该抗体的重链的可变区的氨基酸序列选自由以下的(1)～(14)组成的组：
85.(1)cdr1中含有序列号76的氨基酸序列、cdr2中含有序列号78的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号80的氨基酸序列的氨基酸序列；
86.(2)cdr1中含有序列号82的氨基酸序列、cdr2中含有序列号84的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号86的氨基酸序列的氨基酸序列；
87.(3)cdr1中含有序列号88的氨基酸序列、cdr2中含有序列号90的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号92的氨基酸序列的氨基酸序列；
88.(4)cdr1中含有序列号94的氨基酸序列、cdr2中含有序列号96的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号98的氨基酸序列的氨基酸序列；
89.(5)cdr1中含有序列号100的氨基酸序列、cdr2中含有序列号102的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号104的氨基酸序列的氨基酸序列；
90.(6)cdr1中含有序列号106的氨基酸序列、cdr2中含有序列号108的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号109的氨基酸序列的氨基酸序列；
91.(7)cdr1中含有序列号111的氨基酸序列、cdr2中含有序列号113的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号115的氨基酸序列的氨基酸序列；
92.(8)cdr1中含有序列号117的氨基酸序列、cdr2中含有序列号119的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号120的氨基酸序列的氨基酸序列；
93.(9)cdr1中含有序列号122的氨基酸序列、cdr2中含有序列号124的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号126的氨基酸序列的氨基酸序列；
94.(10)cdr1中含有序列号128的氨基酸序列、cdr2中含有序列号130的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号132的氨基酸序列的氨基酸序列；
95.(11)cdr1中含有序列号134的氨基酸序列、cdr2中含有序列号136的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号138的氨基酸序列的氨基酸序列；
96.(12)cdr1中含有序列号140的氨基酸序列、cdr2中含有序列号142的氨基酸序列、
且cdr3中含有序列号144的氨基酸序列的氨基酸序列；
97.(13)cdr1中含有序列号146的氨基酸序列、cdr2中含有序列号148的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号150的氨基酸序列的氨基酸序列；和
98.(14)cdr1中含有序列号152的氨基酸序列、cdr2中含有序列号154的氨基酸序列、且cdr3中含有序列号156的氨基酸序列的氨基酸序列。
99.9.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其重链的可变区的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列与上述7或8中的任一重链的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列分别具有80％以上的同源性。
100.10.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其重链的可变区的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列与上述7或8中的任一重链的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列分别具有90％以上的同源性。
101.11.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述7或8的任一重链的cdr的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～5个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗人转铁蛋白受体抗体。
102.12.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述7或8的任一重链的cdr的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗人转铁蛋白受体抗体。
103.13.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该抗体的轻链的可变区和重链的可变区选自由以下的(1)～(14)组成的组：
104.(1)轻链的可变区的cdr1中含有序列号6或序列号7的氨基酸序列、cdr2中含有序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列trp-thr-ser、以及cdr3中含有序列号10的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号76或序列号77的氨基酸序列、cdr2中含有序列号78或序列号79的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号80或序列号81的氨基酸序列；
105.(2)轻链的可变区的cdr1中含有序列号11或序列号12的氨基酸序列、cdr2中含有序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、以及cdr3中含有序列号15的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号82或序列号83的氨基酸序列、cdr2中含有序列号84或序列号85的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号86或序列号87的氨基酸序列；
106.(3)轻链的可变区的cdr1中含有序列号16或序列号17的氨基酸序列、cdr2中含有序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列lys-val-ser、以及cdr3中含有序列号20的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号88或序列号89的氨基酸序列、cdr2中含有序列号90或序列号91的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号92或序列号93的氨基酸序列；
107.(4)轻链的可变区的cdr1中含有序列号21或序列号22的氨基酸序列、cdr2中含有序列号23或序列号24的氨基酸序列或asp-thr-ser、以及cdr3中含有序列号25的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号94或序列号95的氨基酸序列、cdr2中含有序列号96或序列号97的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号98或序列号99的氨基酸序列；
108.(5)轻链的可变区的cdr1中含有序列号26或序列号27的氨基酸序列、cdr2中含有序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、以及cdr3中含有序列号30的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号100或序列号101的氨基酸序列、cdr2中含有序列号102或序列号103的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号104或序列号105的氨
基酸序列；
109.(6)轻链的可变区的cdr1中含有序列号31或序列号32的氨基酸序列、cdr2中含有序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列ala-ala-ser、以及cdr3中含有序列号35的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号106或序列号107的氨基酸序列、cdr2中含有序列号108的氨基酸序列或序列号278的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号109或序列号110的氨基酸序列；
110.(7)轻链的可变区的cdr1中含有序列号36或序列号37的氨基酸序列、cdr2中含有序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列gln-thr-ser、以及cdr3中含有序列号40的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号111或序列号112的氨基酸序列、cdr2中含有序列号113或序列号114的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号115或序列号116的氨基酸序列；
111.(8)轻链的可变区的cdr1中含有序列号41或序列号42的氨基酸序列、cdr2中含有序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列gly-thr-ser、以及cdr3中含有序列号45的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号117或序列号118的氨基酸序列、cdr2中含有序列号119的氨基酸序列或序列号279的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号120或序列号121的氨基酸序列；
112.(9)轻链的可变区的cdr1中含有序列号46或序列号47的氨基酸序列、cdr2中含有序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列phe-thr-ser、以及cdr3中含有序列号50的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号122或序列号123的氨基酸序列、cdr2中含有序列号124或序列号125的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号126或序列号127的氨基酸序列；
113.(10)轻链的可变区的cdr1中含有序列号51或序列号52的氨基酸序列、cdr2中含有序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列ala-ala-ser、以及cdr3中含有序列号55的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号128或序列号129的氨基酸序列、cdr2中含有序列号130或序列号131的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号132或序列号133的氨基酸序列；
114.(11)轻链的可变区的cdr1中含有序列号56或序列号57的氨基酸序列、cdr2中含有序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、以及cdr3中含有序列号60的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号134或序列号135的氨基酸序列、cdr2中含有序列号136或序列号137的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号138或序列号139的氨基酸序列；
115.(12)轻链的可变区的cdr1中含有序列号61或序列号62的氨基酸序列、cdr2中含有序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列trp-ser-ser、以及cdr3中含有序列号65的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号140或序列号141的氨基酸序列、cdr2中含有序列号142或序列号143的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号144或序列号145的氨基酸序列；
116.(13)轻链的可变区的cdr1中含有序列号66或序列号67的氨基酸序列、cdr2中含有序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、以及cdr3中含有序列号70的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号146或序列号147的氨基酸序列、cdr2
中含有序列号148或序列号149的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号150或序列号151的氨基酸序列；和
117.(14)轻链的可变区的cdr1中含有序列号71或序列号72的氨基酸序列、cdr2中含有序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、以及cdr3中含有序列号75的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号152或序列号153的氨基酸序列、cdr2中含有序列号154或序列号155的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号156或序列号157的氨基酸序列。
118.14.根据上述13的抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该抗体的轻链的可变区和重链的可变区选自由以下的(1)～(14)组成的组：
119.(1)轻链的可变区的cdr1中含有序列号6的氨基酸序列、cdr2中含有序列号8的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号10的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号76的氨基酸序列、cdr2中含有序列号78的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号80的氨基酸序列；
120.(2)轻链的可变区的cdr1中含有序列号11的氨基酸序列、cdr2中含有序列号13的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号15的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号82的氨基酸序列、cdr2中含有序列号84的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号86的氨基酸序列；
121.(3)轻链的可变区的cdr1中含有序列号16的氨基酸序列、cdr2中含有序列号18的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号20的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号88的氨基酸序列、cdr2中含有序列号90的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号92的氨基酸序列；
122.(4)轻链的可变区的cdr1中含有序列号21的氨基酸序列、cdr2中含有序列号23的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号25的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号94的氨基酸序列、cdr2中含有序列号96的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号98的氨基酸序列；
123.(5)轻链的可变区的cdr1中含有序列号26的氨基酸序列、cdr2中含有序列号28的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号30的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号100的氨基酸序列、cdr2中含有序列号102的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号104的氨基酸序列；
124.(6)轻链的可变区的cdr1中含有序列号31的氨基酸序列、cdr2中含有序列号33的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号35的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号106的氨基酸序列、cdr2中含有序列号108的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号109的氨基酸序列；
125.(7)轻链的可变区的cdr1中含有序列号36的氨基酸序列、cdr2中含有序列号38的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号40的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号111的氨基酸序列、cdr2中含有序列号113的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号115的氨基酸序列；
126.(8)轻链的可变区的cdr1中含有序列号41的氨基酸序列、cdr2中含有序列号43的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号45的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序
列号117的氨基酸序列、cdr2中含有序列号119的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号120的氨基酸序列；
127.(9)轻链的可变区的cdr1中含有序列号46的氨基酸序列、cdr2中含有序列号48的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号50的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号122的氨基酸序列、cdr2中含有序列号124的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号126的氨基酸序列；
128.(10)轻链的可变区的cdr1中含有序列号51的氨基酸序列、cdr2中含有序列号53的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号55的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号128的氨基酸序列、cdr2中含有序列号130的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号132的氨基酸序列；
129.(11)轻链的可变区的cdr1中含有序列号56的氨基酸序列、cdr2中含有序列号58的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号60的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号134的氨基酸序列、cdr2中含有序列号136的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号138的氨基酸序列；
130.(12)轻链的可变区的cdr1中含有序列号61的氨基酸序列、cdr2中含有序列号63的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号65的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号140的氨基酸序列、cdr2中含有序列号142的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号144的氨基酸序列；
131.(13)轻链的可变区的cdr1中含有序列号66的氨基酸序列、cdr2中含有序列号68的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号70的氨基酸序列，且重链的可变区的cdr1中含有序列号146的氨基酸序列、cdr2中含有序列号148的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号150的氨基酸序列；和
132.(14)轻链的可变区的cdr1中含有序列号71的氨基酸序列、cdr2中含有序列号73的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号75的氨基酸序列，并且，重链的可变区的cdr1中含有序列号152的氨基酸序列、cdr2中含有序列号154的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号156的氨基酸序列。
133.15.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其轻链和重链各自的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列与上述13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列具有80％以上的同源性。
134.16.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其轻链和重链各自的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列与上述13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的cdr1、cdr2和cdr3的各氨基酸序列具有90％以上的同源性。
135.17.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的cdr的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～5个发生了置换、缺失或添加的抗人转铁蛋白受体抗体。
136.18.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述13或14的轻链与重链的组合中的任一组合中的轻链和重链各自的cdr的至少1个中、构成其的氨基酸序列中1～3个发生了置换、缺失或添加的抗人转铁蛋白受体抗体。
137.19.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该抗体的轻链的可变区含有选自由序列号
158、序列号159、序列号160、序列号161、序列号162和序列号163的氨基酸序列组成的组中任一氨基酸序列，且该抗体的重链的可变区含有选自由序列号166、序列号167、序列号168、序列号169、序列号170和序列号171的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列。
138.20.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该抗体的轻链的可变区含有选自由序列号174、序列号175、序列号176、序列号177、序列号178和序列号179的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列，且该抗体的重链的可变区含有选自由序列号182、序列号183、序列号184、序列号185、序列号186和序列号187的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列。
139.21.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该抗体的轻链的可变区含有选自由序列号190、序列号191、序列号192、序列号193、序列号194和序列号195的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列，且该抗体的重链的可变区含有选自由序列号204、序列号205、序列号206、序列号207、序列号208和序列号209的氨基酸序列组成的组中的任一氨基酸序列。
140.22.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其选自由以下的(1)～(6)组成的组：
141.(1)该抗体的轻链的可变区含有序列号163的氨基酸序列、且该抗体的重链的可变区含有序列号171的氨基酸序列的抗体，
142.(2)该抗体的轻链的可变区含有序列号179的氨基酸序列、且该抗体的重链的可变区含有序列号187的氨基酸序列的抗体，
143.(3)该抗体的轻链的可变区含有序列号191的氨基酸序列、且该抗体的重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的抗体，
144.(4)该抗体的轻链的可变区含有序列号193的氨基酸序列、且该抗体的重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的抗体，
145.(5)该抗体的轻链的可变区含有序列号194的氨基酸序列、且该抗体的重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的抗体，和
146.(6)该抗体的轻链的可变区含有序列号195的氨基酸序列、且该抗体的重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的抗体。
147.23.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其选自由以下的(1)～(10)组成的组：
148.(1)该抗体的轻链含有序列号164的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号172的氨基酸序列的抗体，
149.(2)该抗体的轻链含有序列号180的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号188的氨基酸序列的抗体，
150.(3)该抗体的轻链含有序列号196的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号210的氨基酸序列的抗体，
151.(4)该抗体的轻链含有序列号198的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号210的氨基酸序列的抗体，
152.(5)该抗体的轻链含有序列号200的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号210的氨基酸序列的抗体，
153.(6)该抗体的轻链含有序列号202的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号210的氨基酸序列的抗体，
154.(7)该抗体的轻链含有序列号196的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号212的氨基酸序列的抗体，
155.(8)该抗体的轻链含有序列号198的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号212的氨基酸序列的抗体，
156.(9)该抗体的轻链含有序列号200的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号212的氨基酸序列的抗体，和
157.(10)该抗体的轻链含有序列号202的氨基酸序列、且该抗体的重链含有序列号212的氨基酸序列的抗体。
158.24.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其与上述19～23中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体之间，轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列分别具有80％以上的同源性。
159.25.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其与上述19～23中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体之间，轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列分别具有90％以上的同源性。
160.26.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述19～23中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体的构成轻链的可变区的氨基酸序列的氨基酸序列中、1～10个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗体。
161.27.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述19～23中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体的构成轻链的可变区的氨基酸序列的氨基酸序列中、1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗体。
162.28.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述19～23中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体的构成重链的可变区的氨基酸序列的氨基酸序列中、1～10个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗人转铁蛋白受体抗体。
163.29.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述19～23中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体的构成重链的可变区的氨基酸序列的氨基酸序列中、1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗体。
164.30.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述19～23中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体的构成轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列各自的氨基酸序列中、分别有1～10个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗体。
165.31.一种抗人转铁蛋白受体抗体，其为上述19～23中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体的构成轻链的可变区的氨基酸序列和重链的可变区的氨基酸序列各自的氨基酸序列中、分别有1～3个氨基酸发生了置换、缺失或添加的抗体。
166.32.根据上述1～31中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体，其与人转铁蛋白受体的胞外区和猴转铁蛋白受体的胞外区这两者具有亲和性。
167.33.根据上述32的抗人转铁蛋白受体抗体，其与人转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为1
×
10-8
m以下，与猴转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为5
×
10-8
m以下。
168.34.根据上述1～33中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体，其为fab抗体、f(ab’)2抗体或f(ab’)抗体。
169.35.根据上述1～33中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体，其为选自由scfab、scf(ab’)、scf(ab’)2和scfv组成的组中的单链抗体。
170.36.根据上述35的抗人转铁蛋白受体抗体，其中，其轻链和重链通过接头序列而结
合。
171.37.根据上述35的抗人转铁蛋白受体抗体，其中，其轻链和重链在轻链的c末端侧通过接头序列而结合。
172.38.根据上述35的抗人转铁蛋白受体抗体，其中，其重链和轻链在重链的c末端侧通过接头序列而结合。
173.39.根据上述36～38中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该接头序列由8～50个氨基酸残基构成。
174.40.根据上述39的抗人转铁蛋白受体抗体，其中，该接头序列选自由氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly、序列号3、序列号4和序列号5的各氨基酸序列以及与3个序列号3的氨基酸序列连接而成的氨基酸序列相当的氨基酸序列组成的组。
175.41.一种融合蛋白，其含有上述1～40中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体和结合于其轻链的c末端侧或n末端侧的其它蛋白质a的氨基酸序列。
176.42.一种融合蛋白，其为抗人转铁蛋白受体抗体与其它蛋白质a的融合蛋白，
177.该抗人转铁蛋白受体抗体为上述1～40中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体，
178.该其它蛋白质a结合于该抗人转铁蛋白受体抗体的轻链的c末端侧或n末端侧。
179.43.根据上述41或42的融合蛋白，其中，该其它蛋白质a通过接头序列结合在该轻链的c末端侧或n末端侧。
180.44.根据上述43的融合蛋白，其中，该接头序列由1～50个氨基酸残基构成。
181.45.根据上述44的融合蛋白，其中，该接头序列含有选自由1个甘氨酸、1个丝氨酸、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、序列号3的氨基酸序列、序列号4的氨基酸序列、序列号5的氨基酸序列和1～10个这些氨基酸序列连接而成的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列。
182.46.一种融合蛋白，其含有上述1～40中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体、和结合于其重链的c末端侧或n末端侧的其它蛋白质a的氨基酸序列。
183.47.一种融合蛋白，其为抗人转铁蛋白受体抗体与其它蛋白质a的融合蛋白，
184.该抗人转铁蛋白受体抗体为、上述1～40中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体，
185.该其它蛋白质a结合于该抗人转铁蛋白受体抗体的重链的c末端侧或n末端侧。
186.48.根据上述46或47的融合蛋白，其中，该其它蛋白质a通过接头序列结合在该重链的c末端侧或n末端侧。
187.49.根据上述48的融合蛋白，其中，该接头序列由1～50个氨基酸残基构成。
188.50.根据上述48的融合蛋白，其中，该接头序列含有选自由1个甘氨酸、1个丝氨酸、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、序列号3的氨基酸序列、序列号4的氨基酸序列、序列号5的氨基酸序列和1～10个这些氨基酸序列连接而成的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列。
189.51.根据上述41～50中任一项的融合蛋白，其中，该其它蛋白质a为源自人的蛋白质。
190.52.根据上述41～51中任一项的融合蛋白，其中，该其它蛋白质a选自由以下物质组成的组：神经生长因子(ngf)、溶酶体酶、睫状神经营养因子(cntf)、胶质细胞系的神经营
养因子(gdnf)、神经营养因子3、神经营养因子4/5、神经营养因子6、神经调节蛋白1、促红细胞生成素、达贝泊汀、活化素、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、成纤维细胞生长因子2(fgf2)、表皮生长因子(egf)、血管内皮生长因子(vegf)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、各种细胞因子、肿瘤坏死因子α受体(tnf-α受体)、pd-1配体、具有β淀粉样蛋白分解活性的酶、抗β淀粉样蛋白抗体、抗bace抗体、抗egfr抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗her2抗体、抗tnf-α抗体以及其它抗体药物。
191.53.根据上述41～51中任一项的融合蛋白，其中，该其它蛋白质a为溶酶体酶，该溶酶体酶选自由以下物质组成的组：α-l-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、gm2激活蛋白、β-氨基己糖苷酶a、β-氨基己糖苷酶b、n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、鞘脂激活蛋白c、芳基硫酸酯酶a、α-l-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-n-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶a、β-葡萄糖醛酸酶、乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰辅酶aα-氨基葡糖苷n-乙酰转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、棕榈酰蛋白硫酯酶-1、三肽基肽酶-1、透明质酸酶-1、cln1和cln2。
192.54.根据上述41～51中任一项的融合蛋白，其中，该其它蛋白质a为艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。
193.55.根据上述50的融合蛋白，其中，该其它蛋白质a为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，且该融合蛋白选自以下的(1)～(3)：
194.(1)该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号164的氨基酸序列、该人源化抗htfr抗体的重链以其c末端侧通过接头序列gly-ser与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且整体具有序列号247所示的氨基酸序列的融合蛋白；
195.(2)该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号180的氨基酸序列、该人源化抗htfr抗体的重链以其c末端侧通过接头序列gly-ser与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且整体具有序列号249所示的氨基酸序列的融合蛋白；和
196.(3)该人源化抗htfr抗体的轻链具有序列号196的氨基酸序列、该人源化抗htfr抗体的重链以其c末端侧通过接头序列gly-ser与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶结合且整体具有序列号251所示的氨基酸序列的融合蛋白。
197.56.根据上述50的融合蛋白，其中，该其它蛋白质a为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，且该融合蛋白选自以下的(1)～(3)：
198.(1)含有具有序列号164的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链、和在具有序列号172的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有序列号246所示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的结构的融合蛋白；
199.(2)含有具有序列号180的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链、和在具有序列号188的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有序列号246所示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的结构的融合蛋白；和
200.(3)含有具有序列号196的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的轻链、和在具有序列号210的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有序
列号246所示的人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的结构的融合蛋白。
201.57.根据上述50的融合蛋白，其中，该其它蛋白质a为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，且所述融合蛋白选自以下的(1)～(3)：
202.(1)由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶通过接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而成的结构和轻链构成的融合蛋白，前者的氨基酸序列如序列号247所示，后者的氨基酸序列如序列号164所示，
203.(2)由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶通过接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而成的结构和轻链构成的融合蛋白，前者的氨基酸序列如序列号249所示，后者的氨基酸序列如序列号180所示，和
204.(3)由该人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶通过接头序列gly-ser结合在重链的c末端侧而成的结构和轻链构成的融合蛋白，前者的氨基酸序列如序列号251所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
205.58.一种dna片段，其编码上述1～40中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体的氨基酸序列。
206.59.一种dna片段，其编码上述41～57中任一项的融合蛋白的氨基酸序列。
207.60.一种表达载体，其整合有上述58或59的dna片段。
208.61.一种哺乳动物细胞，其用上述60的表达载体进行了转化。
209.62.一种抗人转铁蛋白受体抗体-药理活性物质复合物，其为在上述1～40中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体该的轻链和/或重链中的任一者上结合应通过血脑屏障而在脑内发挥作用的低分子量的药理活性物质而成的物质。
210.63.根据上述62的抗人转铁蛋白受体抗体-药理活性物质复合物，该药理活性物质选自由下述物质组成的组：抗癌剂、阿尔茨海默病治疗剂、帕金森病治疗剂、亨延顿氏舞蹈病治疗剂、精神分裂症治疗剂、抑郁症治疗剂、多发性硬化症治疗剂、肌萎缩性侧索硬化症治疗剂、包括脑肿瘤在内的中枢神经系统肿瘤的治疗剂、脑病所伴随的溶酶体病的治疗剂、糖原贮积病治疗剂、肌营养不良症治疗剂、脑缺血治疗剂、朊病毒病治疗剂、外伤性中枢神经系统障碍的治疗剂、针对病毒性和细菌性的中枢神经系统疾病的治疗剂、用于脑外科手术后恢复的药剂、用于脊椎外科手术后恢复的药剂、sirna、反义dna和肽。
211.64.上述1～40中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体在使其它蛋白质a或低分子量的药理活性物质通过血脑屏障而在脑内发挥作用中的应用。
212.65.上述1～40中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体通过与针对中枢神经系统的疾病状态的生理活性蛋白质或药理活性低分子化合物的分子结合而在制造用于治疗该疾病状态的血中给药用药剂中的应用。
213.66.一种中枢神经系统的疾病的治疗方法，其含有如下步骤：将治疗上有效量的针对该疾病的生理活性蛋白质或药理活性低分子化合物以与上述1～40中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体分子的结合体的形态血中给药于具有该疾病的患者。
214.67.上述54～57中任一项的抗人转铁蛋白受体抗体在使人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶通过血脑屏障而在脑内发挥作用中的应用。
215.68.上述54～57中任一项的融合蛋白在制造用来治疗hunter综合症所伴随的中枢神经系统的疾病状态的血中给药用药剂中的应用。
216.69.一种hunter综合症所伴随的中枢神经系统的疾病的治疗方法，其含有如下步骤：将治疗上有效量的上述54～57中任一项的融合蛋白血中给药于具有该疾病的患者。
217.发明效果
218.对于作为具有生理活性、药理活性的蛋白质、低分子量的物质但几乎不能或完全不能通过血脑屏障、因此以往不能通过血中给药来利用的诸多物质，本发明能够使它们形成能够通过血脑屏障的形态，因此，能够形成用于治疗中枢神经系统的疾病状态的、血中给药用新的药剂。
附图说明
219.图1是示出单次静脉内给药抗htfr抗体后的食蟹猴的大脑皮层的针对抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)：未给药抗htfr抗体，(b)：给药抗htfr抗体号1，(c)：给药抗htfr抗体号2，(d)：给药抗htfr抗体号3。各照片的右下方的线条为表示50μm的标尺。
220.图2是示出单次静脉内给药抗htfr抗体后的食蟹猴的海马的针对抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)：未给药抗htfr抗体，(b)：给药抗htfr抗体号1，(c)：给药抗htfr抗体号2，(d)：给药抗htfr抗体号3。各照片的右下方的线条为表示50μm的标尺。
221.图3是示出单次静脉内给药抗htfr抗体后的食蟹猴的小脑的针对抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)：未给药抗htfr抗体，(b)：给药抗htfr抗体号1，(c)：给药抗htfr抗体号2，(d)：给药抗htfr抗体号3。各照片的右下方的线条为表示50μm的标尺。
222.图4是示出人源化抗htfr抗体在单次静脉内给药后的食蟹猴的脑以外的各种脏器中的累积量的图。纵轴表示各脏器的单位湿重中的人源化抗htfr抗体的量(μg/g湿重)。白柱从左侧起依次表示给药人源化抗htfr抗体号3、人源化抗htfr抗体号3-2、人源化抗htfr抗体号3(igg4)和人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)的猴的各脏器中的累积量，黑柱表示给药曲妥珠单抗(herceptin(赫赛汀)
tm
)的猴的各脏器中的累积量。nd表示未测定。
223.图5是示出单次静脉内给药后的食蟹猴的大脑皮层的针对人源化抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)：给药herceptin，(b)：给药人源化抗htfr抗体号3，(c)：给药人源化抗htfr抗体号3-2，(d)：给药人源化抗htfr抗体号3(igg4)，(e)：给药人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)。各照片的右下方的线条为表示20μm的标尺。
224.图6是示出单次静脉内给药后的食蟹猴的海马的针对人源化抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)：给药herceptin，(b)：给药人源化抗htfr抗体号3，(c)：给药人源化抗htfr抗体号3-2，(d)：给药人源化抗htfr抗体号3(igg4)，(e)：给药人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)。各照片的右下方的线条为表示20μm的标尺。
225.图7是示出单次静脉内给药后的食蟹猴的小脑的针对人源化抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)：给药herceptin，(b)：给药人源化抗htfr抗体号3，(c)：给药人源化抗htfr抗体号3-2，(d)：给药人源化抗htfr抗体号3(igg4)，(e)：给药人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)。各照片的右下方的线条为表示20μm的标尺。
226.图8是示出单次静脉内给药后的食蟹猴的延髓的针对人源化抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)：给药herceptin，(b)：给药人源化抗htfr抗体号3，(c)：给药人
源化抗htfr抗体号3-2，(d)：给药人源化抗htfr抗体号3(igg4)，(e)：给药人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)。各照片的右下方的线条为表示20μm的标尺。
227.图9是示出对食蟹猴进行单次静脉内给药后的、脑组织中的i2s-抗htfr抗体和rhi2s累积量的图。纵轴表示脑组织的单位湿重中的i2s-抗htfr抗体和rhi2s的量(μg/g湿重)。网点柱表示食蟹猴的脑组织中的rhi2s的累积量。横线柱表示食蟹猴的脑组织中的i2s-抗htfr抗体的累积量。纵线段表示标准偏差。
228.图10是示出静脉注射了人源化抗htfr抗体或rhi2s的i2s基因敲除小鼠(i2s-ko小鼠)的各种脏器中的糖胺聚糖(gag)的量的图。(a)：脑，(b)：肝脏，(c)：肺，(d)：心脏。各图中，柱从左侧起均依次为野生型小鼠(wt)、对照组(未给药组)、0.5mg/kg给药组、1.0mg/kg给药组和2.0mg/kg给药组。纵轴表示各脏器的单位干重中的gag量(μg/g干重)。此外，纵线段表示标准偏差，**表示在以对照组为对照的dunnet检验中p＜0.01。
具体实施方式
229.在本发明中，“抗体”这一术语主要是指人抗体、小鼠抗体、人源化抗体、人抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体和小鼠抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体，但只要具有与特定的抗原特异性结合的性质则不限于这些抗体，此外，对抗体的动物种属也没有特别限制。
230.在本发明中，“人抗体”这一术语是指其蛋白质全体由源自人的基因编码的抗体。出于提升基因的表达效率等目的而在不使原始的氨基酸序列发生改变的条件下在原始的人的基因中导入了变异的基因所编码的抗体也包含在“人抗体”中。此外，将编码人抗体的2个以上的基因组合、将某一人抗体的一部分置换为另一人抗体的一部分的抗体也包含在“人抗体”中。人抗体具有免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(cdr：complementary determining region的简称)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(cdr)。免疫球蛋白轻链的3个cdr从位于n末端侧的cdr起依次称为cdr1、cdr2和cdr3。免疫球蛋白重链的3个cdr也从位于n末端侧的cdr起依次称为cdr1、cdr2和cdr3。通过将某一人抗体的cdr置换为另一人抗体的cdr而改变了人抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也包含在人抗体中。
231.在本发明中，通过改变原始的人抗体的基因而在原始的抗体的氨基酸序列中导入置换、缺失、添加等变异的抗体也包含在“人抗体”中。在用其它氨基酸置换原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。在使原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，缺失的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。此外，导入了组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异的抗体也为人抗体。在添加氨基酸的情况下，在原始的抗体的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～20个、更优选1～5个、进一步优选1～3个氨基酸。导入了组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异的抗体也为人抗体。导入了变异的抗体的氨基酸序列与原始的抗体的氨基酸序列优选显示80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性，更进一步优选显示98％以上的同源性。因此，在本发明中述及“源自人的基因”时，除了源自人的原始的基因以外，还包含通过对其施加改变而得到的基因。
232.关于原始的抗体的氨基酸序列与导入了变异的抗体的氨基酸序列的同源性，可以
使用公知的同源性计算算法容易地算出。例如，作为这种算法，有blast(altschul sf.j mol.biol.215.403-10,(1990))，pearson以及lipman的类似性检索法(proc.natl.acad.sci.usa.85.2444(1988))，smith以及waterman的局部同源性算法(adv.appl.math.2.482-9(1981))等。
233.在述及“小鼠抗体”时，是指由与其蛋白质全部由源自小鼠的基因编码的抗体一致的氨基酸序列构成的抗体。因此，出于提升基因的表达效率等目的而在不使原始的氨基酸序列发生改变的条件下在原始的小鼠的基因中导入了变异的基因所编码的抗体也包含在“小鼠抗体”中。此外，将编码小鼠抗体的2个以上基因的组合、将某一小鼠抗体的一部分置换为另一小鼠抗体的一部分的抗体也包含在小鼠抗体中。小鼠抗体具有免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(cdr)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(cdr)。免疫球蛋白轻链的3个cdr从位于n末端侧的cdr起依次称为cdr1、cdr2和cdr3。免疫球蛋白重链的3个cdr从位于n末端侧的cdr起依次称为cdr1、cdr2和cdr3。例如，通过将某一小鼠抗体的cdr置换为另一小鼠抗体的cdr而改变了小鼠抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也包含在小鼠抗体中。
234.在本发明中，通过改变原始的小鼠抗体的基因而在原始的抗体的氨基酸序列导入了置换、缺失、添加等变异的抗体也包含在“小鼠抗体”中。在用其它氨基酸置换原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。使原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。此外，导入了组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异的抗体也为“小鼠抗体”。在添加氨基酸的情况下，在原始的抗体的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～20个、更优选1～5个、进一步优选1～3个氨基酸。导入了组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异的抗体也为小鼠抗体。导入了变异的抗体的氨基酸序列与原始的抗体的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性，更进一步优选显示98％以上的同源性。因此，在本发明中述及“源自小鼠的基因”时，除了源自小鼠的原始的基因以外，还包含通过对其施加改变而得到的基因。
235.在本发明中，“人源化抗体”这一术语是指：可变区的一部分(例如，特别是cdr的全部或一部分)的氨基酸序列源自人以外的哺乳动物、除此以外的区域源自人的抗体。例如，作为人源化抗体，可以列举通过将构成人抗体的免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(cdr)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(cdr)被其它哺乳动物的cdr置换而制作的抗体。成为被移植到人抗体的合适位置的cdr的来源的其它哺乳动物的生物种属，只要为人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选为小鼠和大鼠，例如小鼠。
236.在本发明中，“嵌合抗体”这一术语是指：来自2个以上的不同种属的、2个以上的不同的抗体片段连接成的抗体。
237.人抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指：人抗体的一部分被置换为人以外的哺乳动物的抗体的一部分而得到的抗体。抗体由以下说明的fc区、fab区和铰链区构成。作为这样的嵌合抗体的具体例子，可以列举fc区源自人抗体而fab区源自其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体。铰链区源自人抗体或其它哺乳动物的抗体中的任意一者。相反地，可以列举fc区源自其它哺乳动物而fab区源自人抗体的嵌合抗体。铰链区可以源自人抗体或其它
哺乳动物的抗体中的任意一者。相反地，可以列举fc区源自其它哺乳动物而fab区源自人抗体的嵌合抗体。这种情况下，铰链区也可以源自人抗体或其它哺乳动物的抗体中的任意一者。
238.此外，也可以说抗体由可变区和恒定区构成。作为嵌合抗体的其他具体例子，可以列举重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(c
l
)源自人抗体而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(v
l
)源自其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体，相反地，可以列举重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(c
l
)源自其它哺乳动物的抗体而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(v
l
)源自人抗体的嵌合抗体。在此，其它哺乳动物的生物种属只要为人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选小鼠。
239.小鼠抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指：小鼠抗体的一部分被置换为小鼠以外的哺乳动物的抗体的一部分而得到的抗体。作为这样的嵌合抗体的具体例子，可以列举fc区源自小鼠抗体而fab区源自其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体，相反地，可以列举fc区源自其它哺乳动物而fab区源自小鼠抗体的嵌合抗体。在此，其它哺乳动物的生物种属只要为小鼠以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为大鼠、兔、马、人以外的灵长类，更优选为人。
240.人抗体与小鼠抗体的嵌合抗体特指“人/小鼠嵌合抗体”。人/小鼠嵌合抗体中，可以列举fc区源自人抗体而fab区源自小鼠抗体的嵌合抗体，相反地，可以列举fc区源自小鼠抗体而fab区源自人抗体的嵌合抗体。铰链区源自人抗体或小鼠抗体中的任意一者。作为人/小鼠嵌合抗体的其他具体例子，可以列举重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(c
l
)源自人抗体而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(v
l
)源自小鼠抗体的人/小鼠嵌合抗体，相反地，可以列举重链的恒定区(ch)和轻链的恒定区(c
l
)源自小鼠抗体而重链的可变区(vh)和轻链的可变区(v
l
)源自人抗体的人/小鼠嵌合抗体。
241.抗体原本具有由2条免疫球蛋白轻链和2条免疫球蛋白重链共计4条多肽链构成的基本结构。但是，在本发明中，述及“抗体”时，不仅包含具有该基本结构的抗体，
242.(1)由1条免疫球蛋白轻链和1条免疫球蛋白重链共计2条多肽链构成的抗体，以及如以下详述的
243.(2)在免疫球蛋白轻链的c末端侧结合接头序列、并且进一步在其c末端侧结合免疫球蛋白重链而成的单链抗体，和
244.(3)在免疫球蛋白重链的c末端侧结合接头序列、并且进一步在其c末端侧结合免疫球蛋白轻链而成的单链抗体。而且，
245.(4)从本来意义上的抗体的基本结构中缺失了fc区的由fab区构成的抗体以及由fab区和铰链区的全部或一部分构成的抗体(包括fab、f(ab’)和f(ab’)2)也包含在本发明的“抗体”中。
246.在此，fab是指：含有可变区和c
l
区域(轻链的恒定区)的一条轻链以及含有可变区和ch1区域(重链的恒定区的部分1)的一条重链以各自中存在的半胱氨酸残基彼此通过二硫键结合而得到的分子。在fab中，重链除了可变区和ch1区域(重链的恒定区的部分1)以外可以进一步含有铰链区的一部分，但此时的铰链区缺失了存在于铰链区且使抗体的重链彼此结合的半胱氨酸残基。在fab中，轻链和重链通过二硫键结合，所述二硫键形成于存在于轻链的恒定区(c
l
区域)的半胱氨酸残基和存在于重链的恒定区(ch1区域)或铰链区的半胱
氨酸残基之间。fab缺失了存在于铰链区且使抗体的重链彼此结合的半胱氨酸残基，因此由1条轻链和1条重链构成。构成fab的轻链含有可变区和c
l
区域。构成fab的重链可以由可变区和ch1区域构成，也可以除了可变区、ch1区域以外还含有铰链区的一部分。但是，这种情况下，铰链区按照不含使重链间结合的半胱氨酸残基的方式来选择，从而不会通过铰链区在2条重链之间形成二硫键。在f(ab’)中，其重链除了可变区和ch1区域以外还含有具有使重链彼此结合的半胱氨酸残基的铰链区的全部或一部分。f(ab’)2是指；2个f(ab’)以存在于相互的铰链区中的半胱氨酸残基彼此通过二硫键结合而得到的分子。此外，多个抗体直接或通过接头结合而得到的二聚体、三聚体等聚合物也是抗体。进而，不限于这些，含有免疫球蛋白分子的一部分且具有与抗原特异性结合的性质的物质均包含在本发明所述的“抗体”中。即，在本发明中，述及免疫球蛋白轻链时，包含源自免疫球蛋白轻链的具有其可变区的全部或一部分氨基酸序列物质。此外，述及免疫球蛋白重链时，含有源自免疫球蛋白重链的具有其可变区的全部或一部分氨基酸序列的物质。因此，只要具有可变区的全部或一部分氨基酸序列，则例如fc区缺失的物质也是免疫球蛋白重链。
247.此外，在此，fc或fc区是指：抗体分子中的、含有由ch2区域(重链的恒定区的部分2)和ch3区域(重链的恒定区的部分3)构成的片段的区域。
248.进而，在本发明中，在述及“抗体”时，还包含：
249.(5)将构成上述(4)所示的fab、f(ab’)或f(ab’)2的轻链和重链通过接头序列结合而分别形成的单链抗体的scfab、scf(ab’)和scf(ab’)2。在此，就scfab、scf(ab’)和scf(ab’)2而言，可以在轻链的c末端侧结合接头序列、并且进一步使其c末端侧结合重链，此外，也可以在重链的c末端侧结合接头序列、并且进一步使其c末端侧结合轻链。进而，使轻链的可变区和重链的可变区通过接头序列结合而形成的单链抗体的scfv也包含在本发明的抗体中。就scfv而言，可以使轻链的可变区的c末端侧结合接头序列、并且进一步使其c末端侧结合重链的可变区，此外，也可以使重链的可变区的c末端侧结合接头序列、并且进一步使其c末端侧结合轻链的可变区。
250.进而，本说明书中所述的“抗体”，除了全长抗体、上述(1)～(5)所示的抗体以外，还包含比含有上述(4)和(5)更宽的概念的、全长抗体的一部分缺损的抗原结合性片段(抗体片段)的任一形态。
[0251]“抗原结合性片段”这一术语是指保持了与抗原的特异性结合活性的至少一部分的抗体片段。作为结合性片段的例子，除了例如上述(4)和(5)所示的例子以外，还包含：fab、fab’、f(ab’)2、可变区(fv)、以适当的接头将重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)连接而成的单链抗体(scfv)、作为含有重链可变区(vh)和轻链可变区(v
l
)的多肽的二聚体的双链抗体、作为在scfv的重链(h链)上结合有恒定区的一部分(ch3)的肽的二聚体的微抗体(minibody)、其它低分子化抗体等。但是，只要具有与抗原的结合能力则不限于这些分子。此外，这些结合性片段不仅包含将抗体蛋白的全长分子用适当的酶处理而得到的产物，也包含使用经基因工程方法改变后的抗体基因在适当的宿主细胞中产生的蛋白质。
[0252]
在本发明中，在述及“单链抗体”时，是指在含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的c末端侧结合接头序列、进一步在其c末端侧结合含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而成的、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质。例如，上述(2)、(3)和(5)所示的抗体包含在单链抗体中。此外，在含有免疫球蛋白重链
的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的c末端侧结合接头序列、进一步在其c末端侧结合含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部的氨基酸序列而成的、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质也是本发明中的“单链抗体”。就在免疫球蛋白重链的c末端侧通过接头序列结合免疫球蛋白轻链而成的单链抗体而言，通常免疫球蛋白重链的fc区是缺失的。免疫球蛋白轻链的可变区具有3个与抗体的抗原特异性相关的互补性决定区(cdr)。同样，免疫球蛋白重链的可变区也具有3个cdr。这些cdr为决定抗体的抗原特异性的主要区域。因此，优选单链抗体中含有免疫球蛋白重链的全部3个cdr和免疫球蛋白轻链的全部3个cdr。但是，只要可维持抗体的抗原特异性的亲和性，则也可以设为缺失了1个或多个cdr的单链抗体。
[0253]
在单链抗体中，配置于免疫球蛋白的轻链和重链之间的接头序列为由优选2～50个、更优选8～50个、进一步优选10～30个、更进一步优选12～18个或15～25个、例如15个或25个氨基酸残基构成的肽链。就这种接头序列而言，只要用其连接两条链而成的抗htfr抗体可保持对htfr的亲和性则对其氨基酸序列没有限定，优选仅由甘氨酸构成或由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列，可以列举例如：含有氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)或者这些氨基酸序列重复2～10次或2～5次的序列的接头序列。例如，在由免疫球蛋白重链的可变区的全部区域构成的氨基酸序列的c末端侧通过接头序列结合免疫球蛋白轻链的可变区时，优选含有相当于3个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)连接而成的共计15个氨基酸的接头序列。
[0254]
在本发明中，“人转铁蛋白受体”或“htfr”这一术语是指：具有序列号1所示的氨基酸序列的膜蛋白。本发明的抗htfr抗体在一个实施方式中与序列号1所示的氨基酸序列中从n末端侧起第89位的半胱氨酸残基到c末端的苯丙氨酸为止的部分(htfr的胞外区)特异性结合，但不限于此。此外，在本发明中，“猴转铁蛋白受体”或“猴tfr”这一术语，特指源自食蟹猴(macaca fascicularis)的、具有序列号2所示的氨基酸序列的膜蛋白。本发明的抗htfr抗体在一个实施方式中还与序列号2所示的氨基酸序列中从n末端侧起第89位的半胱氨酸残基到c末端的苯丙氨酸为止的部分(猴tfr的胞外区)结合，但不限于此。
[0255]
作为针对htfr的抗体的制作方法，通常为如下方法：使用导入有整合了htfr基因的表达载体的细胞，制作重组人转铁蛋白受体(rhtfr)，使用该rhtfr免疫小鼠等动物，从而得到。从免疫后的动物中取出产生针对htfr的抗体的细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，从而可以制作具有抗体产生能力的杂交瘤细胞。
[0256]
此外，利用体外免疫法以rhtfr免疫由小鼠等动物得到的免疫系统细胞，由此也可以获得产生针对htfr的抗体的细胞。使用体外免疫法时，对该免疫系统细胞的来源动物种属没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、马和包括人在内的灵长类，更优选为小鼠、大鼠和人，进一步优选为小鼠和人。作为小鼠的免疫系统细胞，例如可以使用由小鼠的脾脏制备的脾细胞。作为人的免疫系统细胞，可以使用由人的外周血、骨髓、脾脏等制备的细胞。在利用体外免疫法免疫人的免疫系统细胞时，可以得到针对htfr的人抗体。
[0257]
利用体外免疫法免疫免疫系统细胞后，使细胞与骨髓瘤细胞融合，从而可以制作具有抗体产生能力的杂交瘤细胞。此外，还可以：从免疫后的细胞中提取mrna并合成cdna，以该cdna为模板通过pcr反应扩增含有编码免疫球蛋白的轻链和重链的基因的dna片段，使
用这些人工再构建抗体基因。
[0258]
利用上述方法得到的状态的杂交瘤细胞中还含有产生将htfr以外的蛋白质识别为抗原的抗体的细胞。此外，产生抗htfr抗体的杂交瘤细胞未必全部都产生对htfr显示高亲和性的抗htfr抗体。
[0259]
同样，人工再构建的抗体基因中还含有编码将htfr以外的蛋白质识别为抗原的抗体的基因。此外，编码抗htfr抗体的基因未必全部具有编码对htfr显示高亲和性的抗htfr抗体等所期望的特性。
[0260]
因此，需要从上述得到的状态的杂交瘤细胞中选择出产生具有所期望的特性(对htfr的高亲和性等)的抗体的杂交瘤细胞的步骤。此外，就人工再构建的抗体基因而言，需要从该抗体基因中选择出编码具有所期望的特性(对htfr的高亲和性等)的抗体的基因的步骤。作为选择产生对htfr显示高亲和性的抗体(高亲和性抗体)的杂交瘤细胞或编码高亲和性抗体的基因的方法，以下详述的方法是有效的。需要说明的是，对htfr显示高亲和性的抗体是指：利用实施例7中记载的方法测定出的与htfr的解离常数(kd)优选为1
×
10-8
m以下的抗体，更优选为1
×
10-9
m以下的抗体，进一步优选为1
×
10-10
m以下抗体，另外进一步优选为1
×
10-11
m以下的抗体。例如，作为优选的例子，可以列举解离常数为1
×
10-13
m～1
×
10-9
m的抗体、1
×
10-13
m～1
×
10-10
m的抗体。
[0261]
例如，在选择产生对htfr为高亲和性的抗体的杂交瘤细胞时可使用以下方法：将重组htfr添加到板中并在其中保持后，添加杂交瘤细胞的培养上清，然后将不与重组htfr结合的抗体从板中除去，测定保持在板中的抗体的量。根据该方法，添加到板中的杂交瘤细胞的培养上清中所含的抗体对htfr的亲和性越高，则保持在板中的抗体的量越多。因此，可以测定板中所保持的抗体的量，选择保持有更多抗体的板所对应的杂交瘤细胞来作为产生对htfr具有相对高的亲和性的抗htfr抗体的细胞株。从这样选择出的细胞株中提取mrna并合成cdna，以该cdna为模板使用pcr法来扩增含有编码抗htfr抗体的基因的dna片段，由此，还可以分离出编码高亲和性抗体的基因。
[0262]
在从上述人工再构建的抗体基因中选择编码具有高亲和性的抗htfr抗体的基因时，暂时将人工再构建的抗体基因整合到表达载体中，将该表达载体导入到宿主细胞中。此时，就作为宿主细胞使用的细胞而言，只要是可以通过导入整合有人工再构建的抗体基因的表达载体而表达抗体基因的细胞，则不论原核细胞、真核细胞均可以，没有特别限定，优选源自人、小鼠、中国仓鼠等哺乳动物的细胞，特别优选源自中国仓鼠卵巣的cho细胞或源自小鼠骨髓瘤的ns/0细胞。此外，用于整合并表达编码抗体基因的基因的表达载体只要是导入到哺乳动物细胞内时表达该基因的载体则可以没有特别限定地使用。整合到表达载体中的该基因被配置于可以在哺乳动物细胞内调节基因转录频率的dna序列(基因表达控制部位)的下游。作为本发明中可以使用的基因表达控制部位，可以列举例如：源自巨细胞病毒的启动子、sv40早期启动子、人延伸因子-1α(ef-1α)启动子、人泛素c启动子等。
[0263]
导入有这样的表达载体的哺乳动物细胞能够表达整合到表达载体中的上述人工再构建的抗体。在从这样得到的表达人工再构建的抗体的细胞中选择产生对htfr具有高亲和性的抗体的细胞时可使用以下方法：将重组htfr添加到板中并在其中保持后，使重组htfr接触细胞的培养上清，然后将不与重组htfr结合的抗体从板中除去，测定保持在板中的抗体的量。根据该方法，细胞的培养上清中所含的抗体对htfr的亲和性越高，则保持在板
中的抗体的量越多。因此，可以测定保持在板中的抗体的量，选择保持有更多抗体的板所对应的细胞来作为产生对htfr具有相对高的亲和性的抗htfr抗体的细胞株，进而，可以选择出编码对htfr具有高亲和性的抗htfr抗体的基因。从这样选择出的细胞株中，将含有编码抗htfr抗体的基因的dna片段用pcr法扩增，从而可以分离出编码高亲和性抗体的基因。
[0264]
关于从上述人工再构建的抗体基因中选择编码具有高亲和性的抗htfr抗体的基因，也可以如下进行：将人工再构建的抗体基因整合到表达载体中，将该表达载体导入到大肠杆菌中，使用培养该大肠杆菌而得到的培养上清或含有使大肠杆菌溶解而得到的抗体的溶液，通过与上述选择杂交瘤细胞时同样的方法来选择具有所期望的基因的大肠杆菌。所选择的大肠杆菌株是表达编码对htfr具有相对高的亲和性的抗htfr抗体的基因的细胞株。可以从该细胞株中选择编码对htfr具有相对高的亲和性的抗htfr抗体的基因。在使抗体分泌到大肠杆菌的培养上清中的情况下，按照在n末端侧结合分泌信号序列的方式将抗体基因整合到表达载体中即可。
[0265]
作为选择编码具有高亲和性的抗htfr抗体的基因的其他方法，有如下方法：使上述人工再构建的抗体基因所编码的抗体保持在噬菌体颗粒上并使其表达。此时，以编码单链抗体的基因的形式进行抗体基因的再构建。使抗体保持在噬菌体颗粒上的方法记载于国际公开公报(wo1997/09436，wo1995/11317)等中，是公知的。在从保持人工再构建的抗体基因所编码的抗体的噬菌体中选择保持对htfr具有高亲和性的抗体的噬菌体时，可使用以下方法：将重组htfr添加到板中并保持后，使其接触噬菌体，然后从板中除去不与重组htfr结合的噬菌体，测定板中所保持的噬菌体的量。根据该方法，保持在噬菌体颗粒上的抗体对htfr的亲和性越高，则板中所保持的噬菌体的量越多。因此，可以测定板中所保持的噬菌体的量，选择保持有更多噬菌体的板所对应的噬菌体颗粒来作为产生对htfr具有相对高的亲和性的抗htfr抗体的噬菌体颗粒，进而，可以选择出编码对htfr具有高亲和性的抗htfr抗体的基因。从这样选择出的噬菌体颗粒中，将含有编码抗htfr抗体的基因的dna片段用pcr法扩增，由此可以分离出编码高亲和性抗体的基因。
[0266]
可以：由产生上述对htfr具有高亲和性的抗体的杂交瘤细胞等细胞、或具有对htfr具有高亲和性的抗体的噬菌体颗粒制备cdna或噬菌体dna，将其作为模板，将含有以下基因的dna片段通过pcr法等扩增、分离，所述基因为编码抗htfr抗体的轻链、抗htfr抗体的重链或作为抗htfr抗体的单链抗体的全部或其一部分的基因。同样地，还可以：将含有编码抗htfr抗体的轻链的可变区的全部或其一部分的基因的dna片段、含有编码抗htfr抗体的重链的可变区的全部或其一部分的基因的dna片段通过pcr法等扩增、分离。
[0267]
将该编码具有高亲和性的抗htfr抗体的轻链和重链的基因的全部或其一部分整合到表达载体中，使用该表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养所得到的转化细胞，从而可以产生具有高亲和性的抗htfr抗体。还可以：由分离出的编码抗htfr抗体的基因的碱基序列翻译出抗htfr抗体的氨基酸序列，人工合成出编码该氨基酸序列的dna片段。在人工合成dna片段时，可以通过选择合适的密码子而使宿主细胞中的抗htfr抗体的表达量增加。
[0268]
为了向原始的抗htfr抗体的氨基酸序列中导入置换、缺失、添加等变异，也可以向分离出的dna片段中所含的编码抗htfr抗体的基因中适宜导入变异。导入变异后的编码抗htfr抗体的基因与原始的基因优选具有80％以上的同源性，更优选具有90％以上的同源
性，但对同源性没有特别限制。通过在氨基酸序列中导入变异，可以改变与抗htfr抗体结合的糖链数、糖链种类，从而增加抗htfr抗体在生物体内的稳定性。
[0269]
在向编码抗htfr抗体的轻链的可变区的全部或其一部分的基因中导入变异时，导入变异后的基因与原始的基因优选具有80％以上的同源性，更优选具有90％以上的同源性，但对同源性没有特别限制。在将轻链的可变区的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使轻链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向轻链的可变区添加氨基酸时，向轻链的可变区的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的轻链的可变区的氨基酸序列与原始的轻链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。特别是在将cdr的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个。在使cdr的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在添加氨基酸时，向该氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的各cdr各自的氨基酸序列与原始的各cdr的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0270]
在向编码抗htfr抗体的重链的可变区的全部或其一部分的基因中导入变异时，导入变异后的基因与原始的基因优选具有80％以上的同源性，更优选具有90％以上的同源性，但对同源性没有特别限制。在将重链的可变区的氨基酸序列置换为其它氨基酸的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使重链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向重链的可变区添加氨基酸时，向重链的可变区的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的重链的可变区的氨基酸序列与原始的重链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。特别是在将cdr的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个。在使cdr的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在添加氨基酸时，向该氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的各cdr的各自的氨基酸序列与原始的各cdr的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上
的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0271]
还可以将对上述抗htfr抗体的轻链的可变区的变异和对上述抗htfr抗体的重链的可变区的变异组合，在抗htfr抗体的轻链和重链的可变区这两者中导入变异。
[0272]
作为上述抗htfr抗体的轻链和重链的氨基酸序列中的氨基酸向其它氨基酸的置换，可以列举例如：作为酸性氨基酸的天冬氨酸与谷氨酸的相互置换、作为酰胺型氨基酸的天冬酰胺与谷氨酰胺的相互置换、作为碱基性氨基酸的赖氨酸与精氨酸的相互置换、作为支链氨基酸的缬氨酸和亮氨酸和异亮氨酸的相互置换、作为脂肪族氨基酸的甘氨酸与丙氨酸的相互置换、作为羟基氨基酸的丝氨酸与苏氨酸的相互置换、作为芳香族氨基酸的苯丙氨酸与酪氨酸的相互置换等。
[0273]
需要说明的是，在向抗htfr抗体中导入变异而在c末端或n末端添加了氨基酸的情况下，在通过该氨基酸使抗htfr抗体与其它蛋白质a融合时，该氨基酸构成接头的一部分。关于使抗htfr抗体与其它蛋白质a融合时配置在抗htfr抗体与其它蛋白质a之间的接头，将在后文详述。
[0274]
培养利用上述方法等选择出的产生对htfr具有较高亲和性的抗htfr抗体的细胞而得到的抗htfr抗体、以及使编码具有高亲和性的抗htfr抗体的基因表达而得到的抗htfr抗体，也可以通过向其氨基酸序列中导入置换、缺失、添加等变异而改变成具有所期望的特性的抗体。向抗htfr抗体的氨基酸序列中导入变异通过向与其氨基酸序列对应的基因中导入变异而进行。
[0275]
抗htfr抗体可以通过向该抗体的可变区的氨基酸序列中导入置换、缺失、添加等变异而适当调节抗体对htfr的亲和性。例如，在抗体与抗原的亲和性高、在水性溶液中的解离常数显著低的情况下，将其给药于生物体内时，抗体不与抗原解离，其结果是可能产生功能上的不良情况。这种情况下，可通过向抗体的可变区导入变异而将解离常数阶梯性地调整为原始的抗体的2～5倍、5～10倍、10～100倍等，获得与目的相符的最优选的抗体。相反地，还可以通过该变异的导入将解离常数阶梯性地调整为原始的抗体的1/2～1/5倍、1/5～1/10倍、1/10～1/100倍等。
[0276]
向抗htfr抗体的氨基酸序列中导入置换、缺失、添加等变异例如可以如下进行：以编码抗htfr抗体的基因为模板，利用pcr等方法向基因的碱基序列的特定位点导入变异或随机地导入变异。
[0277]
目的在于调整抗体与htfr的亲和性的、向抗htfr抗体的氨基酸序列中导入变异例如可以如下进行：将编码作为单链抗体的抗htfr抗体的基因整合到噬菌粒中，使用该噬菌粒制作在衣壳蛋白表面上表达单链抗体的噬菌体，一边通过使诱变剂等发挥作用而向编码单链抗体的基因上导入变异一边使噬菌体增殖，从增殖后的噬菌体中，利用上述方法选择出表达具有所期望的的解离常数的单链抗体的噬菌体，或者通过在一定条件下使用抗原柱进行纯化而得到表达具有所期望的的解离常数的单链抗体的噬菌体。
[0278]
利用选择出产生上述高亲和性抗体的细胞的方法而得到的、对htfr具有相对高亲和性的抗体，优选利用实施例7中记载的方法测定的与htfr的解离常数(kd)优选为1
×
10-8
m以下，更优选为1
×
10-9
m以下，进一步优选为1
×
10-10
m以下，另外进一步优选为1
×
10-11
m以下。例如，作为优选的例子，可以列举解离常数为1
×
10-13
m～1
×
10-9
m的抗体、为1
×
10-13
m～1
×
10-10
m的抗体。抗体为单链抗体时也同样。对于暂且得到的抗体，可以进行导入变异等适
im.j.fol.biol.227.776-98(1992)”、“cox jpl.eur.j immunol.24:827-836(1994)”等中记载的dna序列和氨基酸序列中选择。
[0285]
如上所述，在人源化抗体中，被移植到原始的人抗体的可变区的非人哺乳动物的抗体的区域通常含有cdr本身或cdr和其周边的fr。但是，与cdr一起被移植的fr也参与cdr的结构保持或与抗原的结合，认为实质上也具有决定抗体的互补性的功能，因此，在本发明中，“cdr”这一术语在制作人源化抗体时是指从非人哺乳动物的抗体中被移植到人源化抗体的区域或可被移植的区域。即，即使是通常被视为fr的区域，只要其参与cdr的结构保持或与抗原的结合而被认为实质上具有决定抗体的互补性的功能，则在本发明中也包含在cdr中。
[0286]
就本发明的抗htfr抗体而言，在通过静脉注射等将其给药于生物体内时，可以与存在于脑内的毛细血管的内皮细胞上的htfr高效地结合。与htfr结合后的抗体通过胞吞作用、转胞吞作用等机制而通过血脑屏障而被摄入脑内。因此，通过使要在脑内发挥作用的蛋白质、低分子化合物等与本发明的抗htfr抗体结合，从而可以使这些物质高效地通过血脑屏障而到达脑内。此外，本发明的抗htfr抗体在通过血脑屏障后可以到达大脑的脑实质、海马的神经元样细胞、小脑的浦肯野细胞等、或者至少到达这些中的任意一者。并且，还有望到达大脑的纹状体的神经元样细胞和中脑的黑质的神经元样细胞。因此，通过使作用于这些组织或细胞的蛋白质、低分子化合物等与本发明的抗htfr抗体结合，可以使其到达这些组织或细胞。
[0287]
在使通常不能通过血脑屏障、因此静脉内给药时在脑内几乎不能或完全不能发挥生理、药理作用的物质(蛋白质、低分子化合物等)从血中到达脑内并在该位置发挥作用方面，本发明的抗htfr抗体可能成为有效的手段。特别是本发明的抗htfr抗体在通过血脑屏障后会到达大脑的脑实质、海马的神经元样细胞、小脑的浦肯野细胞等、或者至少到达这些中的任意一者。并且还有望到达大脑的纹状体的神经元样细胞和中脑的黑质的神经元样细胞。因此，通过将这些物质以与本发明的抗htfr抗体分子结合的形态利用静脉内给药等进行血中给药，能够使它们的功能在这些脑的组织或细胞中发挥、强化。
[0288]
作为使抗htfr抗体与这样的物质(蛋白质、低分子化合物等)结合的方法，有通过非肽接头或肽接头使其结合的方法。作为非肽接头，可以使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、多氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、壳多糖类和透明质酸、或者这些的衍生物，或者将这些组合使用。肽接头为由形成了肽键的1～50个氨基酸构成的肽链或其衍生物，其n末端和c末端分别与抗htfr抗体或蛋白质、低分子化合物等中的任一者形成共价键，从而使抗htfr抗体和蛋白质、低分子化合物等结合。
[0289]
使用作为非肽接头的peg将本发明的抗htfr抗体和期望的其它蛋白质a结合时特别称为抗htfr抗体-peg-蛋白质。抗htfr抗体-peg-蛋白质可以如下制造：使抗htfr抗体与peg结合而制作抗htfr抗体-peg，然后使抗htfr抗体-peg与其它蛋白质a结合，从而制造。或者，抗htfr抗体-peg-蛋白质还可以如下制造：使其它蛋白质a与peg结合而制作蛋白质-peg，然后使蛋白质-peg与抗htfr抗体结合，从而制造。在使peg与抗htfr抗体和其它蛋白质a结合时，使用用碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯或醛等官能团修饰的peg。这些peg中所导入的官能团主要通过与抗htfr
抗体和其它蛋白质a分子内的氨基反应而使peg与htfr抗体和其它蛋白质a形成共价键。对此时使用的peg的分子量和形状没有特别限定，其平均分子量(mw)优选为mw＝500～60000，更优选为mw＝500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的peg可以优选作为非肽接头使用。使抗htfr抗体与期望的低分子化合物结合时也同样。
[0290]
例如，抗htfr抗体-peg可如下得到：将抗htfr抗体与具有醛基作为官能团的聚乙二醇(ald-peg-ald)按照ald-peg-ald相对于该抗体的摩尔比达到11、12.5、15、110、120等的方式混合，向其中添加nacnbh3等还原剂而使其反应，从而得到。然后使抗htfr抗体-peg在nacnbh3等还原剂存在下与其它蛋白质a反应，从而得到抗htfr抗体-peg-蛋白质。相反，通过先使其它蛋白质a与ald-peg-ald结合而制作蛋白质-peg、然后使蛋白质-peg与抗htfr抗体结合也可以得到抗htfr抗体-peg-蛋白质。
[0291]
抗htfr抗体与其它蛋白质a也可以在抗htfr抗体的重链或轻链的c末端侧或n末端侧通过接头序列或直接地通过肽键分别结合其它蛋白质a的n末端或c末端。这样将抗htfr抗体和其它蛋白质a结合而成的融合蛋白可以如下得到：在编码抗htfr抗体的重链或轻链的cdna的3’末端侧或5’末端侧直接或夹着编码接头序列的dna片段以框内方式配置编码其它蛋白质a的cdna，将该dna片段整合到哺乳动物细胞用表达载体中并培养导入了该表达载体的哺乳动物细胞，从而得到。对于该哺乳动物细胞，在编码其它蛋白质a的dna片段与重链结合时，将整合有编码抗htfr抗体的轻链的cdna片段的哺乳动物细胞用表达载体也导入到同一宿主细胞中，此外，在编码其它蛋白质a的dna片段与轻链结合时，将整合有编码抗htfr抗体的重链的cdna片段的哺乳动物细胞用表达载体也导入到同一宿主细胞中。在抗htfr抗体为单链抗体时，抗htfr抗体与其它蛋白质a结合而成的融合蛋白可以如下得到：将在编码其它蛋白质a的cdna的5’末端侧或3’末端侧直接或夹着编码接头序列的dna片段连接有编码单链抗htfr抗体的cdna的dna片段，整合到(哺乳动物细胞，酵母等真核生物或大肠杆菌等原核生物细胞用)表达载体中，使其在导入了该表达载体的这些细胞中表达，从而得到。
[0292]
就在抗htfr抗体的轻链的c末端侧结合有其它蛋白质a的类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列、和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，其它蛋白质a结合在该抗人转铁蛋白受体抗体的轻链的c末端侧。在此，抗htfr抗体的轻链和其它蛋白质a既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0293]
就在抗htfr抗体的重链的c末端侧结合有其它蛋白质a的类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列、和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，其它蛋白质a结合在该抗人转铁蛋白受体抗体的重链的c末端侧。在此，抗htfr抗体的重链和其它蛋白质a既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0294]
就在抗htfr抗体的轻链的n末端侧结合有其它蛋白质a的类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列、和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，其它蛋白质a结合在该抗人转铁蛋白受体抗体的轻链的n末端侧。在此，抗htfr抗体的轻链和其它蛋白质a既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0295]
就在抗htfr抗体的重链的n末端侧结合有其它蛋白质a的类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列、和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，其它蛋白质a结合在该抗人转铁蛋白受体抗体的重链的n末端侧。在此，抗htfr抗体的重链和其它蛋白质a既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0296]
此时，配置在抗htfr抗体和其它蛋白质a之间的接头序列为由优选1～50个、更优选1～17个、进一步优选1～10个、更进一步优选1～5个氨基酸构成的肽链，可以根据应结合到抗htfr抗体上的其它蛋白质a，将构成接头序列的氨基酸的个数适当调整为1个、2个、3个、1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个、27个等。这种接头序列只要被其连接的抗htfr抗体保持与htfr的亲和性、且被该接头序列连接的其它蛋白质a在生理条件下可以发挥该蛋白质的生理活性，则对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成。可以列举例如：含有由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)；或者1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的序列的接头序列。为具有由1～50个氨基酸构成的序列的接头序列，为具有由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或27个氨基酸构成的序列等的接头序列。例如，可以优选使用含有氨基酸序列gly-ser的序列作为接头序列。此外，可以优选使用由含有在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸的序列作为接头序列。
[0297]
在抗htfr抗体与其它蛋白质a的融合蛋白中、抗htfr抗体为单链抗体时，含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列与含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列通常通过接头序列而结合。此时，只要抗htfr抗体可保持对htfr的亲和性，则既可以在源自轻链的氨基酸序列的c末端侧结合接头序列、进而在其c末端侧结合源自重链的氨基酸序列，此外也可以与此相反，在源自重链的氨基酸序列的c末端侧结合接头序列、进而在其c末端侧结合源自轻链的氨基酸序列。
[0298]
配置在免疫球蛋白的轻链和重链之间的接头序列是由优选2～50个、更优选8～50个、进一步优选10～30个、更进一步优选12～18个或15～25个、例如15个或25个氨基酸构成的肽链。这种接头序列只要用其连接两条链而成的抗htfr抗体与htfr保持亲和性且该抗体上所结合的其它蛋白质a在生理条件下可以发挥其生理活性，则对其氨基酸序列没有限定，优选为由甘氨酸构成或由甘氨酸与丝氨酸构成，例如含有氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly)(序列号5)或2～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的序列。作为接头序列的一优选形态，可以列举含有由3个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)连接而成的15个氨基酸构成的序列的接头序列。
[0299]
作为抗htfr抗体为单链抗体时的、本发明的人源化抗htfr抗体与其它蛋白质a的融合蛋白的具体形态的一例，可以例示如下形态：在其它蛋白质a的c末端侧通过第1接头序列结合有单链抗体的形态，其中，所述第1接头序列由在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个
氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。在此，作为所使用的单链抗体的一优选形态，可以列举如下形态：在具有序列号205中记载的氨基酸序列的抗htfr抗体重链的可变区的c末端，通过由3个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)连接而成的共计15个氨基酸构成的第1接头序列结合有具有序列号191中记载的氨基酸序列的抗htfr抗体轻链的可变区、即具有序列号277中记载的氨基酸序列的形态。
[0300]
抗htfr抗体为单链抗体时的这种融合蛋白例如可以如下制造：用整合有具有编码融合蛋白的碱基序列的dna片段的表达载体，转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞，从而制造。
[0301]
需要说明的是，在本发明中，1个肽链含有多个接头序列时，为了方便，各接头序列从n末端侧起依次命名为第1接头序列、第2接头序列。
[0302]
作为抗htfr抗体为fab时的、本发明的人源化抗htfr抗体与其它蛋白质a的融合蛋白的具体形态的一例，可以列举如下形态：在其它蛋白质a的c末端侧通过由在gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成的接头序列融合有含有抗htfr抗体重链的可变区和ch1区域的区域的形态。此时除了ch1区域以外还可以含有铰链区的一部分，但该铰链区不含用于在重链间形成二硫键的半胱氨酸残基。
[0303]
对于应与抗htfr抗体结合的其它蛋白质a没有特别限定，是可在生物体内发挥生理活性的物质，特别是尽管应该到达脑内发挥其作用、但其原状态下不能通过血脑屏障而无法期待通过静脉内给药在脑内发挥作用的蛋白质。作为这种蛋白质，可以列举例如：神经生长因子(ngf)、α-l-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶、β-半乳糖苷酶、gm2激活蛋白、β-氨基己糖苷酶a、β-氨基己糖苷酶b、n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、鞘脂激活蛋白c、芳基硫酸酯酶a、α-l-岩藻糖苷酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-n-乙酰氨基半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶、α-半乳糖苷酶a、β-葡萄糖醛酸酶、乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰辅酶aα-氨基葡糖苷n-乙酰转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神经酰胺酶、淀粉-1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(ppt1)、三肽基肽酶-1、透明质酸酶-1、cln1、cln2等溶酶体酶。
[0304]
与抗htfr抗体结合的神经生长因子(ngf)可以作为阿尔茨海默病的痴呆症治疗药使用，与抗htfr抗体融合的α-l-艾杜糖醛酸酶可以作为hurler综合症或hurler-scheie综合症的中枢神经障碍治疗剂使用，与抗htfr抗体融合的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可以作为hunter综合症的中枢神经障碍治疗剂使用，葡糖脑苷脂酶可以作为高歇氏病的中枢神经障碍治疗剂使用，β半乳糖苷酶可以作为gm1-神经节苷脂沉积症1～3型的中枢神经障碍治疗剂使用，gm2激活蛋白可以作为gm2-神经节苷脂沉积症ab变异型的中枢神经障碍治疗剂使用，β-氨基己糖苷酶a可以作为桑德霍夫病和泰-萨克斯病的中枢神经障碍治疗剂使用，β-氨基己糖苷酶b可以作为桑德霍夫病的中枢神经障碍治疗剂使用，n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶可以作为i-细胞病的中枢神经障碍治疗剂使用，α-甘露糖苷酶可以作为α-甘露糖苷过多症的中枢神经障碍治疗剂使用，β-甘露糖苷酶可以作为β-甘露糖苷过多症的中枢神经障碍治疗剂使用，半乳糖神经酰胺酶可以作为克拉贝病的中枢神经障碍治疗剂使用，鞘脂激活蛋白c可以作为高歇氏病样累积症的中枢神经障碍治疗剂使用，芳基硫酸酯酶a可以作为异染性白质退化(异染性白质营养不良)的中枢神经障碍治疗剂使用，α-l-岩藻糖苷酶可以
作为岩藻糖代谢病的中枢神经障碍治疗剂使用，天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶可以作为天冬氨酰葡糖胺尿症症的中枢神经障碍治疗剂使用，α-n-乙酰氨基半乳糖苷酶可以作为schindler病和川崎病的中枢神经障碍治疗剂使用，酸性鞘磷脂酶可以作为尼曼皮克氏病的中枢神经障碍治疗剂使用，α-半乳糖苷酶a可以作为法布里氏病的中枢神经障碍治疗剂使用，β-葡萄糖醛酸酶可以作为sly综合症的中枢神经障碍治疗剂使用，乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰辅酶aα-氨基葡糖苷n-乙酰转移酶和n-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸硫酸酯酶可以作为sanfilippo综合症的中枢神经障碍治疗剂使用，酸性神经酰胺酶可以作为farber病的中枢神经障碍治疗剂使用，淀粉-1,6-葡萄糖苷酶可以作为cori病(forbes-cori病)的中枢神经障碍治疗剂使用，唾液酸酶可以作为唾液酸酶缺损症的中枢神经障碍治疗剂使用，天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶可以作为天冬氨酰葡糖胺尿症症的中枢神经障碍治疗剂使用，棕榈酰蛋白硫酯酶-1(ppt-1)可以作为神经元蜡样脂褐质沉积症或santavuori-haltia病的中枢神经障碍治疗剂使用，三肽基肽酶-1(tpp-1)可以作为神经元蜡样脂褐质沉积症或jansky-bielschowsky病的中枢神经障碍治疗剂使用，透明质酸酶-1可以作为透明质酸酶缺损症的中枢神经障碍治疗剂使用，cln1和2可以作为batten病的中枢神经障碍治疗剂使用。特别是，本发明的抗htfr抗体预期在通过血脑屏障后到达大脑的脑实质、海马的神经元样细胞、小脑的浦肯野细胞等，或者还到达大脑的纹状体的神经元样细胞和中脑的黑质的神经元样细胞，因此通过与应在这些组织或细胞中发挥药效的蛋白质融合，从而可强化该蛋白质的药效。但是，药物用途不限于这些疾病。
[0305]
作为此外的与抗htfr抗体结合而可以发挥药效的蛋白质，可以列举：溶酶体酶、睫状神经营养因子(cntf)、来自胶质细胞系的神经营养因子(gdnf)、神经营养因子3、神经营养因子4/5、神经营养因子6、神经调节蛋白1、促红细胞生成素、达贝泊汀、活化素、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、成纤维细胞生长因子2(fgf2)、表皮生长因子(egf)、血管内皮生长因子(vegf)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素6、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、各种细胞因子、肿瘤坏死因子α受体(tnf-α受体)、pd-1配体、具有β淀粉样蛋白分解活性的酶、抗β淀粉样蛋白抗体、抗bace抗体、抗egfr抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗her2抗体、抗tnf-α抗体、及其它抗体药物等。
[0306]
与抗htfr抗体结合的溶酶体酶可以作为溶酶体病的中枢神经障碍治疗剂使用，cntf可以作为肌萎缩性侧索硬化症的治疗剂使用，gdnf、神经营养因子3和神经营养因子4/5可以作为脑缺血的治疗剂使用，gdnf可以作为帕金森病的治疗剂使用，神经调节蛋白1可以作为精神分裂症的治疗剂使用，促红细胞生成素和达贝泊汀可以作为脑缺血的治疗剂使用，bfgf和fgf2可以用于外伤性中枢神经系统障碍的治疗剂、脑外科手术、脊椎外科手术后的恢复，具有β淀粉样蛋白分解活性的酶、抗β淀粉样蛋白抗体和抗bace抗体可以作为阿尔茨海默病的治疗剂使用，抗egfr抗体、抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和抗her2抗体可以作为包括脑肿瘤在内的中枢神经系统肿瘤的治疗剂使用，tnfαr-抗htfr抗体可以作为脑缺血和脑炎症性疾病的治疗剂使用。
[0307]
阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏舞蹈病等神经变性疾病、精神分裂症、抑郁症等精神障碍、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、包括脑肿瘤在内的中枢神经系统肿瘤、脑病所伴随的溶酶体病、糖原贮积病、肌营养不良症、脑缺血、脑炎症性疾病、朊病毒病、外
伤性中枢神经系统障碍等疾病的治疗剂大多可作为要与抗htfr抗体融合的其它蛋白质a。此外，针对病毒性和细菌性的中枢神经系统疾病的治疗剂大多也可作为要与抗htfr抗体融合的其它蛋白质a。进而，可以用于脑外科手术、脊椎外科手术后的恢复的药剂大多也可作为应与抗htfr抗体融合的其它蛋白质a。
[0308]
作为应与抗htfr抗体结合的其它蛋白质a，除了上述蛋白质的天然型(野生型)以外，天然型(野生型)的这些蛋白质中的1个或多个氨基酸被置换为其它氨基酸、发生缺失等而得的类似物只要完全或部分具有这些蛋白质的功能，则也包含在这些蛋白质中。将氨基酸置换为其它氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。此外，将这些氨基酸的置换和缺失组合也可以形成期望的类似物。进而，在天然型(野生型)的蛋白质或其类似物的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加1个或多个氨基酸的物质只要完全或部分具有这些蛋白质的功能，则也包含在这些蛋白质中。此时添加的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。将这些氨基酸的添加、置换和缺失组合也可以形成期望的这些蛋白质的类似物。
[0309]
需要说明的是，向这些其它蛋白质a中导入变异、在c末端或n末端添加氨基酸时，该添加的氨基酸在将这些蛋白质与抗htfr抗体融合位于这些蛋白质和抗htfr抗体之间的情况下，该添加的氨基酸构成接头的一部分。
[0310]
天然型的人i2s(hi2s)是序列号246所示的由525个氨基酸构成的溶酶体酶的一种。作为本发明的、抗htfr抗体与其它蛋白质a的融合蛋白的具体形态的一例，可以列举如下类型：在抗htfr抗体重链的c末端通过作为接头序列的氨基酸序列gly-ser融合有天然型的人i2s的融合蛋白。作为这样的融合蛋白，可以例示：
[0311]
(1)轻链由序列号164中记载的氨基酸序列构成、且在c末端侧通过肽键借助接头序列gly-ser结合有人i2s的重链由序列号247中记载的氨基酸序列构成的融合蛋白，
[0312]
(2)轻链由序列号180中记载的氨基酸序列构成、且在c末端侧通过肽键借助接头序列gly-ser结合有人i2s的重链由序列号249中记载的氨基酸序列构成的融合蛋白和
[0313]
(3)轻链由序列号196中记载的氨基酸序列构成、且在c末端侧通过肽键借助接头序列gly-ser结合有人i2s的重链由序列号251中记载的氨基酸序列构成的融合蛋白。
[0314]
在本发明中，“人i2s”或“hi2s”这一术语，特别是指具有与天然型的hi2s一致的氨基酸序列的hi2s，但不限于此，只要具有i2s活性则向天然型的hi2s的氨基酸序列中导入置换、缺失、添加等变异的物质也包含在hi2s中。在将hi2s的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。hi2s的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。向hi2s中添加氨基酸时，在hi2s的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的hi2s的氨基酸序列与原始的hi2s的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0315]
需要说明的是，在此述及hi2s具有i2s活性时是指：与抗htfr抗体融合时，相对于
天然型的hi2s本来具有的活性具有3％以上的活性。但是，该活性相对于天然型的hi2s本来具有的活性优选为10％以上，更优选为20％以上，进一步优选为50％以上，更进一步优选为80％以上。在与抗htfr抗体融合的hi2s中导入有变异时也同样。
[0316]
抗htfr抗体与人i2s的融合蛋白例如可以如下制造：用整合有具有编码序列号249所示的氨基酸序列的序列号250所示的碱基序列的dna片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号180所示的氨基酸序列的抗htfr抗体轻链的序列号181所示的碱基序列的dna片段的表达载体，转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞，从而制造。所制造的融合蛋白可作为hunter病的治疗剂、特别是hunter病的中枢神经障碍治疗剂使用。
[0317]
需要说明的是，在向抗htfr抗体或人i2s中导入变异、在c末端或n末端添加氨基酸时，该添加的氨基酸被配置在抗htfr抗体和人i2s之间时，该添加的氨基酸构成接头的一部分。
[0318]
如上所述例示了抗htfr抗体与人i2s的融合蛋白，但在抗htfr抗体与人i2s的融合蛋白的优选实施方式中，抗htfr抗体的重链和轻链的cdr的氨基酸序列只要使抗体具有对htfr的特异性的亲和性则没有特别限制。但是，本发明的抗htfr抗体优选利用实施例7中记载的方法测定的与htfr的解离常数(kd)优选为1
×
10-8
m以下，更优选为1
×
10-9
m以下，进一步优选为1
×
10-10
m以下。例如，作为优选的例子，可以列举：解离常数为1
×
10-13
m～1
×
10-9
m的抗体、为1
×
10-13
m～1
×
10-10
m的抗体。抗体为单链抗体时也同样。此外，本发明的抗htfr抗体对猴tfr也具有亲和性时，利用实施例7中记载的方法测定的抗htfr抗体与猴tfr的解离常数优选为5
×
10-8
m以下，更优选为2
×
10-8
m以下，进一步优选为1
×
10-8
m以下。例如作为优选的例子，可以列举：解离常数为1
×
10-13
m～2
×
10-8
m的抗体、为1
×
10-13
m～2
×
10-8
m的抗体。抗体为单链抗体时也同样。
[0319]
还可以通过与在抗htfr抗体上结合其它蛋白质a的方法相同的方法，在抗htfr抗体上结合较短的肽链。应结合在抗htfr抗体上的肽链只要该肽链具有期望的生理活性则没有限定，可以列举例如：具有各种蛋白质的发挥生理活性的区域的氨基酸序列的肽链。对肽链的链长没有特别限定，优选由2～200个氨基酸构成，例如由5～50个氨基酸构成。
[0320]
在使低分子物质与抗htfr抗体结合时，对成为候补的低分子物质没有特别限定，是尽管应使其到达脑内并发挥其作用、但在原状态下不能通过血脑屏障而无法期待通过静脉内给药在脑内发挥作用的低分子物质。例如，作为所述低分子物质，可以列举：环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、白消安、塞替派、尼莫司汀、雷莫司汀、氮烯咪胺、甲基苄肼、替莫唑胺、卡莫司汀、链脲霉素、苯达莫司汀、顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、5-氟尿嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、氨甲喋呤、甲氧苄啶、乙胺嘧啶、氟尿嘧啶、氟胞嘧啶、硫唑嘌呤、喷司他丁、羟基脲、氟达拉滨、阿糖胞苷、吉西他滨、伊立替康、阿霉素、依托泊苷、左氧氟沙星、环丙沙星、长春花碱、长春新碱、紫杉醇、多西他赛、丝裂霉素c、多柔比星、表柔比星等抗癌剂。作为其它的要与抗htfr抗体结合的低分子物质，可以列举sirna、反义dna、短肽。
[0321]
将抗htfr抗体和低分子物质结合时，低分子物质可以仅结合在轻链或重链中的任一者上，此外，也可以分别结合在轻链和重链上。此外，抗htfr抗体只要具有对htfr的亲和性则可以包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和/或含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列。
[0322]
阿尔茨海默病、帕金森病、亨延顿氏舞蹈病等的神经变性疾病、精神分裂症、抑郁
症等的精神障碍、多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、包括脑肿瘤在内的中枢神经系统肿瘤、脑病所伴随的溶酶体病、糖原贮积病、肌营养不良症、脑缺血、脑炎症性疾病、朊病毒病、外伤性中枢神经系统障碍等疾病的治疗剂通常可成为应与抗htfr抗体融合的低分子物质的候补。此外，针对病毒性和细菌性的中枢神经系统疾病的治疗剂通常也可成为应与抗htfr抗体融合的低分子物质的候补。进而，可以用于脑外科手术、脊椎外科手术后的恢复的药剂通常也可以成为应与抗htfr抗体融合的低分子物质的候补。
[0323]
抗htfr抗体为人以外的动物的抗体时，在将其给药于人时，非常担心激起针对该抗体的抗原抗体反应而产生不期望的副作用。人以外的动物的抗体通过形成人源化抗体可以减少这种抗原性，可以抑制给药于人时起因于抗原抗体反应的副作用的发生。此外，据报道，根据使用猴的实验，人源化抗体与小鼠抗体相比在血中更为稳定，认为可以使治疗效果相应地持续长时间。也可以通过使用人抗体作为抗htfr抗体来抑制起因于抗原抗体反应的副作用的发生。
[0324]
以下更详细地说明抗htfr抗体为人源化抗体或人抗体的情况。人抗体的轻链有λ链和κ链。构成抗htfr抗体的轻链可以为λ链和κ链中的任意一者。此外，人抗体的重链有γ链、μ链、α链、σ链和ε链，分别对应于igg、igm、iga、igd和ige。构成抗htfr抗体的重链可以为γ链、μ链、α链、σ链和ε链中的任意一者，优选为γ链。进而，人抗体的重链的γ链有γ1链、γ2链、γ3链和γ4链，分别对应于igg1、igg2、igg3和igg4。构成抗htfr抗体的重链为γ链时，该γ链可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一者，优选为γ1链或γ4链。抗htfr抗体为人源化抗体或人抗体且为igg时，人抗体的轻链也可以为λ链和κ链中的任意一者，人抗体的重链也可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一者，优选为γ1链或γ4链。例如，作为优选的抗htfr抗体的一个实施方式，可以列举轻链为λ链、重链为γ1链的抗htfr抗体。
[0325]
在抗htfr抗体为人源化抗体或人抗体时，可以通过在抗htfr抗体的重链或轻链的n末端(或c末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合其它蛋白a的c末端(或n末端)。在使其它蛋白a结合于抗htfr抗体的重链的n末端侧(或c末端侧)时，在抗htfr抗体的γ链、μ链、α链、σ链或ε链的n末端(或c末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合其它蛋白a的c末端(或n末端)。在抗htfr抗体的轻链的n末端侧(或c末端侧)结合其它蛋白a时，在抗htfr抗体的λ链和κ链的n末端(或c末端)通过接头序列或直接利用肽键分别结合其它蛋白a的c末端(或n末端)。但是，在抗htfr抗体为由fab区构成的抗体或由fab区和铰链区的全部或一部分构成的抗体(fab、f(ab’)2和f(ab’))的情况下，可以在构成fab、f(ab’)2和f(ab’)的重链或轻链的n末端(或c末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合其它蛋白a的c末端(或n末端)。
[0326]
就作为人源化抗体或人抗体的抗htfr抗体的轻链的c末端侧结合有其它蛋白a的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列。在此，抗htfr抗体的轻链与其它蛋白a既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0327]
就作为人源化抗体或人抗体的抗htfr抗体的重链的c末端侧结合有其它蛋白a的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列。在此，抗htfr抗体的重链与其它蛋
白a既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0328]
就作为人源化抗体或人抗体的抗htfr抗体的轻链的n末端侧结合有其它蛋白a的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列。在此，抗htfr抗体的轻链与其它蛋白a既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0329]
就作为人源化抗体或人抗体的抗htfr抗体的重链的n末端侧结合有其它蛋白a的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列。在此，抗htfr抗体的重链与其它蛋白a既可以直接结合也可以通过接头结合。
[0330]
在抗htfr抗体和其它蛋白质a之间配置接头序列时，配置在抗htfr抗体和其它蛋白质a之间的接头序列优选为由1～50个氨基酸构成的肽链，根据要与抗htfr抗体结合的其它蛋白质a将构成接头序列的氨基酸的个数适当调整为1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个等。这种接头序列只要被该接头序列连接的抗htfr抗体和其它蛋白质a保持各自的功能(对htfr的亲和性和生理条件下的活性或功能)则对其氨基酸序列没有限定，优选为由甘氨酸和丝氨酸构成的序列，例如，为含有由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的氨基酸序列、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)；或者1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的序列的接头序列。例如，含有在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸的氨基酸序列可以优选作为接头序列使用。
[0331]
需要说明的是，在此述及与抗htfr抗体融合的其它蛋白质a保持该其它蛋白质a在生理条件下的活性或功能时或仅述及具有活性时，是指相对于天然型的其它蛋白质a本来具有的活性保持3％以上的活性或功能。但是，其活性或功能相对于天然型的其它蛋白质a本来具有的活性优选为10％以上，更优选为20％以上，进一步优选为50％以上，更进一步优选为80％以上。在与抗htfr抗体融合的其它蛋白质a导入有变异时也同样。
[0332]
作为本发明的、人源化抗htfr抗体与其它蛋白质a的融合蛋白的更具体形态的一例，可以列举如下形态：在抗htfr抗体重链的c末端侧通过由在gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成的接头序列融合有其它蛋白质a。
[0333]
作为抗htfr抗体为fab时的、本发明的人源化抗htfr抗体与其它蛋白质a的融合蛋白的具体形态的一例，可以列举如下形态：在其它蛋白质a的c末端侧通过由在gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成的接头序列融合有含有抗htfr抗体重链的可变区和ch1区域的区域的形态。此时除了ch1区域以外还可以含有铰链区的一部分，但该铰链区不含用于形成重链间的二硫键的半胱氨酸残基。
[0334]
抗htfr抗体对htfr的特异性亲和性主要依赖于抗htfr抗体的重链和轻链的cdr的氨基酸序列。这些cdr的氨基酸序列只要使抗htfr抗体具有对htfr的特异性的亲和性则没有特别限制。但是，本发明的抗htfr抗体优选为利用实施例7中记载的方法测定的与htfr的解离常数(kd)优选为1
×
10-8
m以下的抗体、更优选为1
×
10-9
m以下的抗体、进一步优选为1
×
10-10
m以下的抗体、另外进一步优选为1
×
10-11
m以下的抗体。例如作为优选的例子，可以列举：解离常数为1
×
10-13
m～1
×
10-9
m的抗体、为1
×
10-13
m～1
×
10-10
m的抗体。抗体为单链抗体时也同样。此外，在本发明的抗htfr抗体对猴tfr也具有亲和性时，利用实施例7中记载的方法测定的抗htfr抗体与猴tfr的解离常数优选为5
×
10-8
m以下，更优选为2
×
10-8
m以下，进一步优选为1
×
10-8
m以下。例如作为优选的例子，可以列举：解离常数为1
×
10-13
m～2
×
10-8
m的抗体、为1
×
10-13
m～2
×
10-8
m的抗体。抗体为单链抗体时也同样。
[0335]
作为对htfr具有亲和性的抗体的优选实施方式，可以例示抗体的轻链的cdr具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的抗体。即，
[0336]
(1)cdr1为序列号6或序列号7的氨基酸序列、cdr2为序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列trp-thr-ser、以及cdr3为序列号10的氨基酸序列，
[0337]
(2)cdr1为序列号11或序列号12的氨基酸序列、cdr2为序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、以及cdr3为序列号15的氨基酸序列，
[0338]
(3)cdr1为序列号16或序列号17的氨基酸序列、cdr2为序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列lys-val-ser、以及cdr3为序列号20的氨基酸序列，
[0339]
(4)cdr1为序列号21或序列号22的氨基酸序列、cdr2为序列号23或序列号24的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、以及cdr3为序列号25的氨基酸序列，
[0340]
(5)cdr1为序列号26或序列号27的氨基酸序列、cdr2为序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、以及cdr3为序列号30的氨基酸序列，
[0341]
(6)cdr1为序列号31或序列号32的氨基酸序列、cdr2为序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列ala-ala-ser、以及cdr3为序列号35的氨基酸序列，
[0342]
(7)cdr1为序列号36或序列号37的氨基酸序列、cdr2为序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列gln-thr-ser、以及cdr3为序列号40的氨基酸序列，
[0343]
(8)cdr1为序列号41或序列号42的氨基酸序列、cdr2为序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列gly-thr-ser、以及cdr3为序列号45的氨基酸序列，
[0344]
(9)具有cdr1为序列号46或序列号47的氨基酸序列、cdr2为序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列phe-thr-ser、以及cdr3为序列号50的氨基酸序列的轻链，
[0345]
(10)cdr1为序列号51或序列号52的氨基酸序列、cdr2为序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列ala-ala-ser、以及cdr3为序列号55的氨基酸序列，
[0346]
(11)cdr1为序列号56或序列号57的氨基酸序列、cdr2为序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、以及cdr3为序列号60的氨基酸序列，
[0347]
(12)cdr1为序列号61或序列号62的氨基酸序列、cdr2为序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列trp-ser-ser、以及cdr3为序列号65的氨基酸序列，
[0348]
(13)cdr1为序列号66或序列号67的氨基酸序列、cdr2为序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、以及cdr3为序列号70的氨基酸序列，
[0349]
(14)cdr1为序列号71或序列号72的氨基酸序列、cdr2为序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、以及cdr3为序列号75的氨基酸序列。
[0350]
作为对htfr具有亲和性的抗体的更具体的实施方式，可以例示抗体的轻链的cdr具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的抗体。即，
[0351]
(1)cdr1为序列号6记载的氨基酸序列，cdr2为序列号8记载的氨基酸序列，以及
cdr3为10记载的氨基酸序列，
[0352]
(2)cdr1为序列号11记载的氨基酸序列，cdr2为序列号13记载的氨基酸序列，以及cdr3为15记载的氨基酸序列，
[0353]
(3)cdr1为序列号16记载的氨基酸序列，cdr2为序列号18记载的氨基酸序列，以及cdr3为20记载的氨基酸序列，
[0354]
(4)cdr1为序列号21记载的氨基酸序列，cdr2为序列号23记载的氨基酸序列，以及cdr3为25记载的氨基酸序列，
[0355]
(5)cdr1为序列号26记载的氨基酸序列，cdr2为序列号28记载的氨基酸序列，以及cdr3为30记载的氨基酸序列，
[0356]
(6)cdr1为序列号31记载的氨基酸序列，cdr2为序列号33记载的氨基酸序列，以及cdr3为35记载的氨基酸序列，
[0357]
(7)cdr1为序列号36记载的氨基酸序列，cdr2为序列号38记载的氨基酸序列，以及cdr3为40记载的氨基酸序列，
[0358]
(8)cdr1为序列号41记载的氨基酸序列，cdr2为序列号43记载的氨基酸序列，以及cdr3为45记载的氨基酸序列，
[0359]
(9)cdr1为序列号46记载的氨基酸序列，cdr2为序列号48记载的氨基酸序列，以及cdr3为50记载的氨基酸序列，
[0360]
(10)cdr1为序列号51记载的氨基酸序列，cdr2为序列号53记载的氨基酸序列，以及cdr3为55记载的氨基酸序列，
[0361]
(11)cdr1为序列号56记载的氨基酸序列，cdr2为序列号58记载的氨基酸序列，以及cdr3为60记载的氨基酸序列，
[0362]
(12)cdr1为序列号61记载的氨基酸序列，cdr2为序列号63记载的氨基酸序列，以及cdr3为65记载的氨基酸序列，
[0363]
(13)cdr1为序列号66记载的氨基酸序列，cdr2为序列号68记载的氨基酸序列，以及cdr3为70记载的氨基酸序列，
[0364]
(14)cdr1为序列号71记载的氨基酸序列，cdr2为序列号73记载的氨基酸序列，以及cdr3为75记载的氨基酸序列。
[0365]
作为对htfr具有亲和性的抗体的优选实施方式，可以例示抗体的重链的cdr具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的抗体。即，
[0366]
(1)cdr1为序列号76或序列号77的氨基酸序列，cdr2为序列号78或序列号79的氨基酸序列，以及cdr3为80或序列号81的氨基酸序列，
[0367]
(2)cdr1为序列号82或序列号83的氨基酸序列，cdr2为序列号84或序列号85的氨基酸序列，以及cdr3为86或序列号87的氨基酸序列，
[0368]
(3)cdr1为序列号88或序列号89的氨基酸序列，cdr2为序列号90或序列号91的氨基酸序列，以及cdr3为92或序列号93的氨基酸序列，
[0369]
(4)cdr1为序列号94或序列号95的氨基酸序列，cdr2为序列号96或序列号97的氨基酸序列，以及cdr3为98或序列号99的氨基酸序列，
[0370]
(5)cdr1为序列号100或序列号101的氨基酸序列，cdr2为序列号102或序列号103的氨基酸序列，以及cdr3为104或序列号105的氨基酸序列，
[0371]
(6)cdr1为序列号106或序列号107的氨基酸序列，cdr2为序列号108的氨基酸序列或序列号278的氨基酸序列，以及cdr3为109或序列号110的氨基酸序列，
[0372]
(7)cdr1为序列号111或序列号112的氨基酸序列，cdr2为序列号113或序列号114的氨基酸序列，以及cdr3为115或序列号116的氨基酸序列，
[0373]
(8)cdr1为序列号117或序列号118的氨基酸序列，cdr2为序列号119的氨基酸序列或序列号279的氨基酸序列，以及cdr3为120或序列号121的氨基酸序列，
[0374]
(9)cdr1为序列号122或序列号123的氨基酸序列，cdr2为序列号124或序列号125的氨基酸序列，以及cdr3为126或序列号127的氨基酸序列，
[0375]
(10)cdr1为序列号128或序列号129的氨基酸序列，cdr2为序列号130或序列号131的氨基酸序列，以及cdr3为132或序列号133的氨基酸序列，
[0376]
(11)cdr1为序列号134或序列号135的氨基酸序列，cdr2为序列号136或序列号137的氨基酸序列，以及cdr3为138或序列号139的氨基酸序列，
[0377]
(12)cdr1为序列号140或序列号141的氨基酸序列，cdr2为序列号142或序列号143的氨基酸序列，以及cdr3为144或序列号145的氨基酸序列，
[0378]
(13)cdr1为序列号146或序列号147的氨基酸序列，cdr2为序列号148或序列号149的氨基酸序列，以及cdr3为150或序列号151记载的氨基酸序列和
[0379]
(14)cdr1为序列号152或序列号153的氨基酸序列，cdr2为序列号154或序列号155的氨基酸序列，以及cdr3为156或序列号157的氨基酸序列。
[0380]
作为对htfr具有亲和性的抗体的更具体的实施方式，可以例示抗体的重链的cdr具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的抗体。即，
[0381]
(1)cdr1为序列号76记载的氨基酸序列，cdr2为序列号78记载的氨基酸序列，以及cdr3为80记载的氨基酸序列，
[0382]
(2)cdr1为序列号82记载的氨基酸序列，cdr2为序列号84记载的氨基酸序列，以及cdr3为86记载的氨基酸序列，
[0383]
(3)cdr1为序列号88记载的氨基酸序列，cdr2为序列号90记载的氨基酸序列，以及cdr3为92记载的氨基酸序列，
[0384]
(4)cdr1为序列号94记载的氨基酸序列，cdr2为序列号96记载的氨基酸序列，以及cdr3为98记载的氨基酸序列，
[0385]
(5)cdr1为序列号100记载的氨基酸序列，cdr2为序列号102记载的氨基酸序列，以及cdr3为104记载的氨基酸序列，
[0386]
(6)cdr1为序列号106记载的氨基酸序列，cdr2为序列号108记载的氨基酸序列，以及cdr3为109记载的氨基酸序列，
[0387]
(7)cdr1为序列号111记载的氨基酸序列，cdr2为序列号113记载的氨基酸序列，以及cdr3为115记载的氨基酸序列，
[0388]
(8)cdr1为序列号117记载的氨基酸序列，cdr2为序列号119记载的氨基酸序列，以及cdr3为120记载的氨基酸序列，
[0389]
(9)cdr1为序列号122记载的氨基酸序列，cdr2为序列号124记载的氨基酸序列，以及cdr3为126记载的氨基酸序列，
[0390]
(10)cdr1为序列号128记载的氨基酸序列，cdr2为序列号130记载的氨基酸序列，
以及cdr3为132记载的氨基酸序列，
[0391]
(11)cdr1为序列号134记载的氨基酸序列，cdr2为序列号136记载的氨基酸序列，以及cdr3为138记载的氨基酸序列，
[0392]
(12)cdr1为序列号140记载的氨基酸序列，cdr2为序列号142记载的氨基酸序列，以及cdr3为144记载的氨基酸序列，
[0393]
(13)cdr1为序列号146记载的氨基酸序列，cdr2为序列号148记载的氨基酸序列，以及cdr3为150记载的氨基酸序列、和
[0394]
(14)cdr1为序列号152记载的氨基酸序列，cdr2为序列号154记载的氨基酸序列，以及cdr3为156记载的氨基酸序列。
[0395]
作为对htfr具有亲和性的抗体的优选的轻链与重链的组合，可以例示cdr具有以下所示的(1)～(14)记载的氨基酸序列的组合。即，
[0396]
(1)cdr1具有序列号6或序列号7的氨基酸序列、cdr2具有序列号8或序列号9的氨基酸序列或氨基酸序列trp-thr-ser、以及cdr3具有序列号10的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号76或序列号77的氨基酸序列、cdr2具有序列号78或序列号79的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号80或序列号81的氨基酸序列的重链的组合，
[0397]
(2)cdr1具有序列号11或序列号12的氨基酸序列、cdr2具有序列号13或序列号14的氨基酸序列或氨基酸序列(tyr ala ser)、以及cdr3具有序列号15的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号82或序列号83的氨基酸序列、cdr2具有序列号84或序列号85的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号86或序列号87的氨基酸序列的重链的组合，
[0398]
(3)cdr1具有序列号16或序列号17的氨基酸序列、cdr2具有序列号18或序列号19的氨基酸序列或氨基酸序列lys-val-ser、以及cdr3具有序列号20的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号88或序列号89的氨基酸序列、cdr2具有序列号90或序列号91的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号92或序列号93的氨基酸序列的重链的组合，
[0399]
(4)cdr1具有序列号21或序列号22的氨基酸序列、cdr2具有序列号23或序列号24的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、以及cdr3具有序列号25的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号94或序列号95的氨基酸序列、cdr2具有序列号96或序列号97的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号98或序列号99的氨基酸序列的重链的组合，
[0400]
(5)cdr1具有序列号26或序列号27的氨基酸序列、cdr2具有序列号28或序列号29的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、以及cdr3具有序列号30的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号100或序列号101的氨基酸序列、cdr2具有序列号102或序列号103的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号104或序列号105的氨基酸序列的重链的组合，
[0401]
(6)cdr1具有序列号31或序列号32的氨基酸序列、cdr2具有序列号33或序列号34的氨基酸序列或氨基酸序列ala-ala-ser、以及cdr3具有序列号35的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号106或序列号107的氨基酸序列、cdr2具有序列号108或序列号278的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号109或序列号110的氨基酸序列的重链的组合，
[0402]
(7)cdr1具有序列号36或序列号37的氨基酸序列、cdr2具有序列号38或序列号39的氨基酸序列或氨基酸序列gln-thr-ser、以及cdr3具有序列号40的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号111或序列号112的氨基酸序列、cdr2具有序列号113或序列号114的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号115或序列号116的氨基酸序列的重链的组合，
[0403]
(8)cdr1具有序列号41或序列号42的氨基酸序列、cdr2具有序列号43或序列号44的氨基酸序列或氨基酸序列gly-thr-ser、以及cdr3具有序列号45的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号117或序列号118的氨基酸序列、cdr2具有序列号119的氨基酸序列或序列号279的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号120或序列号121的氨基酸序列的重链的组合，
[0404]
(9)cdr1具有序列号46或序列号47的氨基酸序列、cdr2具有序列号48或序列号49的氨基酸序列或氨基酸序列phe-thr-ser、以及cdr3具有序列号50的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号122或序列号123的氨基酸序列、cdr2具有序列号124或序列号125的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号126或序列号127的氨基酸序列的重链的组合，
[0405]
(10)cdr1具有序列号51或序列号52的氨基酸序列、cdr2具有序列号53或序列号54的氨基酸序列或氨基酸序列ala-ala-ser、以及cdr3具有序列号55的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号128或序列号129的氨基酸序列、cdr2具有序列号130或序列号131的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号132或序列号133的氨基酸序列的重链的组合，
[0406]
(11)cdr1具有序列号56或序列号57的氨基酸序列、cdr2具有序列号58或序列号59的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、以及cdr3具有序列号60的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号134或序列号135的氨基酸序列、cdr2具有序列号136或序列号137的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号138或序列号139的氨基酸序列的重链的组合，
[0407]
(12)cdr1具有序列号61或序列号62的氨基酸序列、cdr2具有序列号63或序列号64的氨基酸序列或氨基酸序列trp-ser-ser、以及cdr3具有序列号65的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号140或序列号141的氨基酸序列、cdr2具有序列号142或序列号143的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号144或序列号145的氨基酸序列的重链的组合，
[0408]
(13)cdr1具有序列号66或序列号67的氨基酸序列、cdr2具有序列号68或序列号69的氨基酸序列或氨基酸序列tyr-ala-ser、以及cdr3具有序列号70的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号146或序列号147的氨基酸序列、cdr2具有序列号148或序列号149的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号150或序列号151的氨基酸序列的重链的组合、和
[0409]
(14)cdr1具有序列号71或序列号72的氨基酸序列、cdr2具有序列号73或序列号74的氨基酸序列或氨基酸序列asp-thr-ser、以及cdr3具有序列号75的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号152或序列号153的氨基酸序列、cdr2具有序列号154或序列号155的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号156或序列号157的氨基酸序列的重链的组合。
[0410]
作为对htfr具有亲和性的抗体的轻链与重链的组合的具体形态，可以例示cdr具有以下所示的(1)～(14)中记载的氨基酸序列的形态。即，
[0411]
(1)cdr1具有序列号6记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号8记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号10的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号76记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号78记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号80的氨基酸序列的重链的组合，
[0412]
(2)cdr1具有序列号11记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号13记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号15的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号82记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号84记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号86的氨基酸序列的重链的组合，
[0413]
(3)cdr1具有序列号16记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号18记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号20的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号88记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号90记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号92的氨基酸序列的重链的组合，
[0414]
(4)cdr1具有序列号21记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号23记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号25的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号94记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号96记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号98的氨基酸序列的重链的组合，
[0415]
(5)cdr1具有序列号26记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号28记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号30的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号100记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号102记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号104的氨基酸序列的重链的组合，
[0416]
(6)cdr1具有序列号31记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号33记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号35的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号106记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号108记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号109的氨基酸序列的重链的组合，
[0417]
(7)cdr1具有序列号36记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号38记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号40的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号111记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号113记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号115的氨基酸序列的重链的组合，
[0418]
(8)cdr1具有序列号41记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号43记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号45的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号117记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号119记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号120的氨基酸序列的重链的组合，
[0419]
(9)cdr1具有序列号46记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号48记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号50的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号122记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号124记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号126的氨基酸序列的重链的组合，
[0420]
(10)cdr1具有序列号51记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号53记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号55的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号128记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号130记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号132的氨基酸序列的重链的组合，
[0421]
(11)cdr1具有序列号56记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号58记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号60的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号134记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号136记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号138的氨基酸序列的重链的组合，
[0422]
(12)cdr1具有序列号61记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号63记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号65的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号140记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号142记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号144的氨基酸序列的重链的组合，
[0423]
(13)cdr1具有序列号66记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号68记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号70的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号146记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号148记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号150的氨基酸序列的重链的组合和
[0424]
(14)cdr1具有序列号71记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号73记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号75的氨基酸序列的轻链与cdr1具有序列号152记载的氨基酸序列、cdr2具有序列号154记载的氨基酸序列、以及cdr3具有序列号156的氨基酸序列的重链的组合。
[0425]
作为对htfr具有亲和性的人源化抗体的优选实施方式，可以列举使用序列号218～序列号245所示的小鼠抗人tfr抗体的轻链和重链的可变区的氨基酸序列作为cdr而制作的人源化抗体。人源化抗体通过将这些小鼠抗人tfr抗体的轻链和重链的可变区的cdr的氨基酸序列置换为人抗体的合适位置而制作。
[0426]
例如，可以用序列号218中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第34位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第56位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第89位～第97位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号219中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第105位的任意的连续的3个以上或7个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0427]
此外，例如可以用序列号220中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第34位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第56位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第89位～第97位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号221中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第112位的任意的连续的3个以上或14个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0428]
进而，例如可以用序列号222中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第39位的任意的连续的3个以上或11个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第55位～第61位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第94位～第102位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号223中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第107位的任意的连续的3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0429]
进而，例如可以用序列号224中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第33
位的任意的连续的3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第49位～第55位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第88位～第96位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号225中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第51位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第111位的任意的连续的3个以上或13个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0430]
进而，例如可以用序列号226中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第33位的任意的连续的3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第49位～第55位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第88位～第95位的任意的连续的3个以上或7个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号227中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第51位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第107位的任意的连续的3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0431]
进而，例如可以用序列号228中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第34位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第56位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第89位～第97位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号229中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第65位的任意的连续的3个以上或7个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第96位～第101位的任意的连续的3个以上或4个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0432]
进而，例如可以用序列号230中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第33位的任意的连续的3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第49位～第55位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第88位～第96位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号231中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第51位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第109位的任意的连续的3个以上或11个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0433]
进而，例如可以用序列号232中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第33位的任意的连续的3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第49位～第55位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第88位～第96位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号233中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第65位的任意的连续的3个以上或7个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第96位～第101位的任意的连续的3个以上或4个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0434]
进而，例如可以用序列号234中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第33位的任意的连续的3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第49位～第55位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第88位～第96位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号235中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第51位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第106位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0435]
进而，例如可以用序列号236中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第34位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第56位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第89位～第97位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号237中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第51位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第109位的任意的连续的3个以上或11个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0436]
进而，例如可以用序列号238中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第34位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第56位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第89位～第97位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号239中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第51位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第107位的任意的连续的3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的
重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0437]
进而，例如可以用序列号240中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第34位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第56位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第89位～第97位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号241中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第51位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第108位的任意的连续的3个以上或10个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0438]
进而，例如可以用序列号242中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第34位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第50位～第56位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第89位～第97位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号243中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第51位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第107位的任意的连续的3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0439]
进而，例如可以用序列号244中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第24位～第33位的任意的连续的3个以上或5个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第49位～第55位的任意的连续的3个以上或6个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第88位～第96位的任意的连续的3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的轻链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的轻链，可以用序列号245中记载的氨基酸序列中、作为cdr1的由第26位～第35位的任意的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列、作为cdr2的由第51位～第66位的任意的连续的3个以上或8个以上氨基酸构成的氨基酸序列和作为cdr3的由第97位～第107位的任意的连续的3个以上或9个以上氨基酸构成的氨基酸序列，置换人抗体的重链的对应cdr的氨基酸序列，将所述产物作为人源化抗体的重链。可以将由此得到的人源化抗体的轻链和重链组合，制作人源化抗体。
[0440]
作为对htfr具有亲和性的人源化抗体的优选实施方式，可以例示具有以下所示的(1)～(3)中记载的氨基酸序列的人源化抗体。即：
[0441]
(1)一种抗htfr抗体，其中，轻链的可变区含有选自由序列号158、序列号159、序列号160、序列号161、序列号162和序列号163所示的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列，重链的可变区含有选自由序列号166、序列号167、序列号168、序列号169、序列号170和序列号171所示的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列；
[0442]
(2)一种抗htfr抗体，其中，轻链的可变区含有序列号174、序列号175、序列号176、序列号177、序列号178和序列号179中的任一氨基酸序列，重链的可变区含有序列号182、序
列号183、序列号184、序列号185、序列号186和序列号187中的任一氨基酸序列；
[0443]
(3)一种抗htfr抗体，其中，轻链的可变区含有选自由序列号190、序列号191、序列号192、序列号193、序列号194和序列号195所示的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列，重链的可变区含有选自由序列号204、序列号205、序列号206、序列号207、序列号208和序列号209所示的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列。
[0444]
序列号158、序列号159、序列号160、序列号161、序列号162和序列号163中记载的轻链的可变区的氨基酸序列的cdr1中含有序列号6或7的氨基酸序列、cdr2中含有序列号8或9的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号10的氨基酸序列。但是在述及序列号158～162中记载的轻链的可变区的氨基酸序列的cdr时，cdr的序列不限于这些，含有这些cdr的氨基酸序列的区域、含有这些cdr的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为cdr。
[0445]
序列号166、序列号167、序列号168、序列号169、序列号170和序列号171中记载的重链的可变区的氨基酸序列的cdr1中含有序列号76或77的氨基酸序列、cdr2中含有序列号78或79的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号80或81的氨基酸序列。但是在述及序列号166～171中记载的重链的可变区的氨基酸序列的cdr时，cdr的序列不限于这些，含有这些cdr的氨基酸序列的区域、含有这些cdr的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为cdr。
[0446]
序列号174、序列号175、序列号176、序列号177、序列号178和序列号179中记载的轻链的可变区的氨基酸序列的cdr1中含有序列号11或12的氨基酸序列、cdr2中含有序列号13或14的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号15的氨基酸序列。但是在述及序列号174～179中记载的轻链的可变区的氨基酸序列中的cdr时，cdr的序列不限于这些，含有这些cdr的氨基酸序列的区域、含有这些cdr的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为cdr。
[0447]
序列号182、序列号183、序列号184、序列号185、序列号186和序列号187中记载的重链的可变区的氨基酸序列的cdr1中含有序列号82或83的氨基酸序列、cdr2中含有序列号84或85的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号86或87的氨基酸序列。但是在述及序列号182～187中记载的重链的可变区的氨基酸序列中的cdr时，cdr的序列不限于这些，含有这些cdr的氨基酸序列的区域、含有这些cdr的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为cdr。
[0448]
序列号190、序列号191、序列号192、序列号193、序列号194和序列号195中记载的轻链的可变区的氨基酸序列的cdr1中含有序列号16或17的氨基酸序列、cdr2中含有序列号18或19的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号20的氨基酸序列。但是在述及序列号190～195中记载的轻链的可变区的氨基酸序列中的cdr时，cdr的序列不限于这些，含有这些cdr的氨基酸序列的区域、含有这些cdr的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为cdr。
[0449]
序列号204、序列号205、序列号206、序列号207、序列号208和序列号209中记载的重链的可变区的氨基酸序列的cdr1中含有序列号88或89的氨基酸序列、cdr2中含有序列号90或91的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号92或93的氨基酸序列。但是在述及序列号204～209中记载的重链的可变区的氨基酸序列中的cdr时，cdr的序列不限于这些，含有这些
cdr的氨基酸序列的区域、含有这些cdr的氨基酸序列的任意的连续3个以上氨基酸的氨基酸序列也可作为cdr。
[0450]
作为对htfr具有亲和性的人源化抗体的更具体的实施方式，可以列举：
[0451]
轻链的可变区含有序列号163的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号171的氨基酸序列的人源化抗体，
[0452]
轻链的可变区含有序列号179的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号187的氨基酸序列的人源化抗体，
[0453]
轻链的可变区含有序列号191的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的人源化抗体，
[0454]
轻链的可变区含有序列号193的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的人源化抗体，
[0455]
轻链的可变区含有序列号194的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的人源化抗体，和
[0456]
轻链的可变区含有序列号195的氨基酸序列且重链的可变区含有序列号205的氨基酸序列的人源化抗体。
[0457]
作为对htfr具有亲和性的人源化抗体的更具体的实施方式，可以列举：
[0458]
轻链含有序列号164的氨基酸序列且重链含有序列号172的氨基酸序列的人源化抗体，
[0459]
轻链含有序列号180的氨基酸序列且重链含有序列号188的氨基酸序列的人源化抗体，
[0460]
轻链含有序列号196的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的人源化抗体，
[0461]
轻链含有序列号198的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的人源化抗体，
[0462]
轻链含有序列号200的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的人源化抗体，
[0463]
轻链含有序列号202的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的人源化抗体，
[0464]
轻链含有序列号196的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的人源化抗体，
[0465]
轻链含有序列号198的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的人源化抗体，
[0466]
轻链含有序列号200的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的人源化抗体，和
[0467]
轻链含有序列号202的氨基酸序列且重链含有序列号212的氨基酸序列的人源化抗体。
[0468]
如上所述地例示出对htfr具有亲和性抗体的优选实施方式。就这些抗htfr抗体的轻链和重链而言，可以出于将抗htfr抗体与htfr的亲和性调整至期望程度等目的，向其可变区的氨基酸序列中适当导入置换、缺失、添加等变异。
[0469]
在将轻链的可变区的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使轻链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
[0470]
在轻链的可变区添加氨基酸时，在轻链的可变区的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的轻链的可变区的氨基酸序列与原始的轻链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0471]
特别是将轻链的各cdr各自的氨基酸序列中的氨基酸置换为其它氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。在使各cdr各自的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
[0472]
向轻链的各cdr各自的氨基酸序列中添加氨基酸时，在该氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的各cdr各自的氨基酸序列与原始的各cdr的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0473]
将重链的可变区的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。使重链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
[0474]
向重链的可变区添加氨基酸时，在重链的可变区的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的重链的可变区的氨基酸序列与原始的重链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0475]
特别是，将重链的各cdr各自的氨基酸序列中的氨基酸置换为其它氨基酸时，置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。使各cdr各自的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
[0476]
向重链的各cdr各自的氨基酸序列中添加氨基酸时，向该氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个、更进一步优选1个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的各cdr各自的氨基酸序列与原始的各cdr的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的
同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0477]
作为上述抗htfr抗体的可变区的氨基酸序列中的氨基酸向其它氨基酸的置换，可以列举例如：作为酸性氨基酸的天冬氨酸与谷氨酸的相互置换、作为酰胺型氨基酸的天冬酰胺与谷氨酰胺的相互置换、作为碱基性氨基酸的赖氨酸与精氨酸的相互置换、作为支链氨基酸的缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸的相互置换、作为脂肪族氨基酸的甘氨酸与丙氨酸的相互置换、作为羟基氨基酸的丝氨酸与苏氨酸的相互置换、作为芳香族氨基酸的苯丙氨酸与酪氨酸的相互置换等。
[0478]
需要说明的是，向抗htfr抗体中导入变异而在c末端或n末端添加了氨基酸的情况下，该添加的氨基酸在使抗htfr抗体与其它蛋白质a融合时位于抗htfr抗体和其它蛋白质a之间的情况下，该添加的氨基酸构成接头的一部分。
[0479]
上述例示的对htfr具有亲和性的包括人源化抗体在内的抗体的优选实施方式中，抗htfr抗体的重链和轻链的cdr的氨基酸序列只要抗体具有对htfr的特异性的亲和性，则没有特别限制。但是，本发明的抗htfr抗体优选利用实施例7中记载的方法测定的与htfr的解离常数(kd)优选为1
×
10-8
m以下，更优选为1
×
10-9
m以下，进一步优选为1
×
10-9
m以下，另外进一步优选为1
×
10-9
m以下。例如作为优选的例子，可以列举解离常数为1
×
10-13
m～1
×
10-9
m的抗体、为1
×
10-13
m～1
×
10-10
m的抗体。抗体为单链抗体时也同样。此外，在本发明的抗htfr抗体对猴tfr也具有亲和性时，利用实施例7中记载的方法测定的抗htfr抗体与猴tfr的解离常数优选为5
×
10-8
m以下，更优选为2
×
10-8
m以下，进一步优选为1
×
10-8
m以下。例如作为优选的例子，可以列举解离常数为1
×
10-13
m～2
×
10-8
m的抗体、为1
×
10-13
m～2
×
10-8
m的抗体。抗体为单链抗体时也同样。
[0480]
作为上述以具体实施方式形式示出的对htfr具有亲和性的人源化抗体与其它蛋白质a的融合蛋白的具体实施方式，可以列举：其它蛋白质a为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hi2s)、人促红细胞生成素(hepo)、人芳基硫酸酯酶a(harsa)、人ppt-1(hppt-1)、人tpp-1(htpp-1)、人α-l-艾杜糖醛酸酶(hidua)、人tnfα受体(htnfαr)和人乙酰肝素n-硫酸酯酶(hsgsh)的融合蛋白。
[0481]
作为其它蛋白质a为hi2s的融合蛋白的具体实施例，可例示出以下融合蛋白：
[0482]
(1)由hi2s通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，且前者的氨基酸序列如序列号247所示，后者的氨基酸序列如序列号164所示，
[0483]
(2)由hi2s通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，且前者的氨基酸序列如序列号249所示，后者的氨基酸序列如序列号180所示，和
[0484]
(3)由hi2s通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，且前者的氨基酸序列如序列号251所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0485]
在此，上述(1)中的序列号247中所含的htfr的重链的氨基酸序列为序列号172所示的氨基酸序列。即，上述(1)的融合蛋白中，人源化抗体包含轻链含有序列号164的氨基酸序列且重链含有序列号172的氨基酸序列的序列。上述(2)中的序列号249中所含的htfr的重链的氨基酸序列为序列号188所示的氨基酸序列。即，上述(2)的融合蛋白中，人源化抗体
包含轻链含有序列号180的氨基酸序列且重链含有序列号188的氨基酸序列的序列。上述(3)中的序列号251中所含的htfr的重链的氨基酸序列为序列号210所示的氨基酸序列。即，上述(3)的融合蛋白中，人源化抗体包含轻链含有序列号196的氨基酸序列且重链含有序列号210的氨基酸序列的序列。
[0486]
作为其它蛋白质a为人促红细胞生成素(hepo)的融合蛋白的具体实施例，可例示出以下融合蛋白：
[0487]
(1)由hepo通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号172所示，后者的氨基酸序列如序列号164所示，
[0488]
(2)由hepo通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号188所示，后者的氨基酸序列如序列号180所示，和
[0489]
(3)由hepo通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号210所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0490]
在此，在上述(1)～(3)的任一项中，hepo和htfr的重链可以直接形成肽键或通过接头序列形成肽键。即，在上述(1)～(3)的任一项中，“通过肽键”这一术语与“直接或通过接头序列”含义相同。在此，使用的接头序列由1～50个氨基酸残基构成。对其氨基酸序列没有限定，优选为由甘氨酸和丝氨酸构成的序列，例如为含有由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)、或者由1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或27个氨基酸构成的序列等的接头序列。例如，可以优选使用含有氨基酸序列gly-ser的序列作为接头序列。此外，可以优选使用含有在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸的序列作为接头序列。
[0491]
作为人源化抗体与hepo的更具体的实施方式，可例示出：由hepo通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，且前者的氨基酸序列如序列号257所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0492]
需要说明的是，在本发明中，“人epo”或“hepo”这一术语特指具有与序列号256所示的天然型的hepo一致的氨基酸序列的hepo，但不限于此，只要具有epo活性则在天然型的hepo的氨基酸序列中导入了置换、缺失、添加等变异的物质也包含在hepo中。在将hepo的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使hepo的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向hepo中添加氨基酸时，在hepo的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的hepo的氨基酸序列与原始的hepo的氨基酸序列优选
具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。作为在天然型的hepo中导入了变异的物质，可以列举达贝泊汀。
[0493]
作为其它蛋白质a为人芳基硫酸酯酶a(harsa)的融合蛋白的具体实施例，可例示出以下融合蛋白：
[0494]
(1)由harsa通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号172所示，后者的氨基酸序列如序列号164所示，
[0495]
(2)由harsa通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号188所示，后者的氨基酸序列如序列号180所示，和
[0496]
(3)由harsa通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号210所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0497]
在上述(1)～(3)的任一项中，harsa和htfr的重链可以直接形成肽键或通过接头序列形成肽键。即，在上述(1)～(3)的任一项中，”通过肽键”这一术语与“直接或通过接头序列”含义相同。在此，使用的接头序列由1～50个氨基酸残基构成。对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如为：含有由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)、或者由1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或27个氨基酸构成的序列等的接头序列。例如，可以优选使用含有氨基酸序列gly-ser的序列作为接头序列。此外，可以优选使用含有在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸的序列作为接头序列。
[0498]
作为人源化抗体与harsa的更具体的实施方式，可例示出：由harsa通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的氨基酸序列如序列号260所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0499]
需要说明的是，在本发明中，“人arsa”或“harsa”这一术语特指具有与序列号259所示的天然型的harsa一致的氨基酸序列的harsa，但不限于此，只要具有arsa活性，则在天然型的harsa的氨基酸序列中导入了置换、缺失、添加等变异的物质也包含在harsa中。在将harsa的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使harsa的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向harsa中添加氨基酸时，在harsa的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的harsa的氨基酸序列与原始的harsa的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0500]
作为其它蛋白质a为人ppt-1(hppt-1)的融合蛋白的具体实施例，可例示出以下融合蛋白：
[0501]
(1)由hppt-1通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号172所示，后者的氨基酸序列如序列号164所示，
[0502]
(2)由hppt-1通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号188所示，后者的氨基酸序列如序列号180所示，和
[0503]
(3)由hppt-1通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号210所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0504]
在上述(1)～(3)的任一项中，hppt-1和htfr的重链可以直接形成肽键或通过接头序列形成肽键。即，在上述(1)～(3)的任一项中，”通过肽键”这一术语与“直接或通过接头序列”含义相同。在此，使用的接头序列由1～50个氨基酸残基构成。对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如为含有由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)、或者由1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或27个氨基酸构成的序列等的接头序列。例如，可以优选使用含有氨基酸序列gly-ser的序列作为接头序列。此外，可以优选使用含有在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸的序列作为接头序列。
[0505]
作为人源化抗体与hppt-1的更具体的实施方式，可例示出：由hppt-1通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的氨基酸序列如序列号263所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0506]
需要说明的是，在本发明中，“人ppt-1”或“hppt-1”这一术语特指具有与序列号262所示的天然型的hppt-1一致的氨基酸序列的hppt-1，但不限于此，只要具有ppt-1活性则在天然型的hppt-1的氨基酸序列中导入了置换、缺失、添加等变异的物质也包含在hppt-1中。在将hppt-1的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使hppt-1的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向hppt-1中添加氨基酸时，在hppt-1的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的hppt-1的氨基酸序列与原始的hppt-1的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0507]
作为其它蛋白质a为人tpp-1(htpp-1)的融合蛋白的具体实施例，可例示出以下融合蛋白：
[0508]
(1)由htpp-1通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号172所示，后者的氨基酸序列如序列号164所示，
[0509]
(2)由htpp-1通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号188所示，后者的氨基酸序列如序列号180所示，和
[0510]
(3)由htpp-1通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号210所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0511]
在上述(1)～(3)的任一项中，htpp-1和htfr的重链可以直接形成肽键或通过接头序列形成肽键。即，在上述(1)～(3)的任一项中，”通过肽键”这一术语与“直接或通过接头序列”含义相同。在此，使用的接头序列由1～50个氨基酸残基构成。对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如为含有由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)、或者由1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或27个氨基酸构成的序列等的接头序列。例如，可以优选使用含有氨基酸序列gly-ser的序列作为接头序列。此外，可以优选使用含有在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸的序列作为接头序列。
[0512]
作为人源化抗体与htpp-1的更具体的实施方式，可例示出：由htpp-1通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的氨基酸序列如序列号266所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0513]
需要说明的是，在本发明中，“人tpp-1”或“htpp-1”这一术语特指具有与序列号265所示的天然型的htpp-1一致的氨基酸序列的htpp-1，但不限于此，只要具有tpp-1活性则在天然型的htpp-1的氨基酸序列中导入了置换、缺失、添加等变异的物质也包含在htpp-1中。在将htpp-1的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使htpp-1的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向htpp-1中添加氨基酸时，在htpp-1的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的htpp-1的氨基酸序列与原始的htpp-1的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0514]
作为其它蛋白质a为人α-l-艾杜糖醛酸酶(hidua)的融合蛋白的具体实施例，可例示出以下融合蛋白：
[0515]
(1)由hidua通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号172所示，后者的氨基酸序列如序列
号164所示，
[0516]
(2)由hidua通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号188所示，后者的氨基酸序列如序列号180所示，和
[0517]
(3)由hidua通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号210所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0518]
在上述(1)～(3)的任一项中，hidua和htfr的重链可以直接形成肽键或通过接头序列形成肽键。即，在上述(1)～(3)的任一项中，”通过肽键”这一术语与“直接或通过接头序列”含义相同。在此，使用的接头序列由1～50个氨基酸残基构成。对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如为含有由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)、或者由1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或27个氨基酸构成的序列等的接头序列。例如，可以优选使用含有氨基酸序列gly-ser的序列作为接头序列。此外，可以优选使用含有在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸的序列作为接头序列。
[0519]
作为人源化抗体与hidua的更具体的实施方式，可例示出：由hidua通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的氨基酸序列如序列号269所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0520]
需要说明的是，在本发明中，“人idua”或“hidua”这一术语特指具有与序列号268所示的天然型的hidua一致的氨基酸序列的hidua，但不限于此，只要具有idua活性则在天然型的hidua的氨基酸序列中导入了置换、缺失、添加等变异的物质也包含在hidua中。在将hidua的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使hidua的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向hidua中添加氨基酸时，在hidua的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的hidua的氨基酸序列与原始的hidua的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0521]
作为其它蛋白质a为人tnfα受体(htnfαr)的融合蛋白的具体实施例，可例示出以下融合蛋白：
[0522]
(1)由htnfαr通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号172所示，后者的氨基酸序列如序列号164所示，
[0523]
(2)由htnfαr通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构
成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号188所示，后者的氨基酸序列如序列号180所示，和
[0524]
(3)由htnfαr通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号210所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0525]
在上述(1)～(3)的任一项中，htnfαr和htfr的重链可以直接形成肽键或通过接头序列形成肽键。即，在上述(1)～(3)的任一项中，”通过肽键”这一术语与“直接或通过接头序列”含义相同。在此，使用的接头序列由1～50个氨基酸残基构成。对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如为含有由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)、或者由1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或27个氨基酸构成的序列等的接头序列。例如，可以优选使用含有氨基酸序列gly-ser的序列作为接头序列。此外，可以优选使用含有在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸的序列作为接头序列。
[0526]
作为人源化抗体与htnfαr的更具体的实施方式，可例示出：由htnfαr通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的氨基酸序列如序列号272所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0527]
需要说明的是，在本发明中，“人tnfαr”或“htnfαr”这一术语特指具有与序列号271所示的天然型的htnfαr一致的氨基酸序列的htnfαr，但不限于此，只要具有作为htnfαr的活性或功能在在天然型的htnfαr的氨基酸序列中导入了置换、缺失、添加等变异的物质也包含在htnfαr中。在将htnfαr的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使htnfαr的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向htnfαr中添加氨基酸时，在htnfαr的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的htnfαr的氨基酸序列与原始的htnfαr的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0528]
作为其它蛋白质a为人乙酰肝素n-硫酸酯酶(hsgsh)的融合蛋白的具体实施例，可例示出以下融合蛋白：
[0529]
(1)由hsgsh通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号172所示，后者的氨基酸序列如序列号164所示，
[0530]
(2)由hsgsh通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号188所示，后者的氨基酸序列如序列号180所示，和
[0531]
(3)由hsgsh通过肽键结合在htfr的重链的c末端侧而成的结构和htfr的轻链构成的融合蛋白，前者的htfr的重链的氨基酸序列如序列号210所示，后者的氨基酸序列如序列号196所示。
[0532]
在上述(1)～(3)的任一项中，hsgsh和htfr的重链可以直接形成肽键或通过接头序列形成肽键。即，在上述(1)～(3)的任一项中，”通过肽键”这一术语与“直接或通过接头序列”含义相同。在此，使用的接头序列由1～50个氨基酸残基构成。对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成，例如为含有由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列gly-ser、氨基酸序列gly-gly-ser、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)、氨基酸序列gly-gly-gly-gly-gly-ser(序列号4)、氨基酸序列ser-gly-gly-gly-gly-gly(序列号5)、或者由1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的1～50个氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或27个氨基酸构成的序列等的接头序列。例如，可以优选使用含有氨基酸序列gly-ser的序列作为接头序列。此外，可以优选使用含有在氨基酸序列gly-ser之后连接有5个氨基酸序列gly-gly-gly-gly-ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸的序列作为接头序列。
[0533]
作为人源化抗体与hsgsh的更具体的实施方式，看例示出；由hsgsh通过接头序列gly-ser结合在htfr的重链的c末端侧的结构和htfr的轻链构成、且前者的氨基酸序列如序列号275所示、后者的氨基酸序列如序列号196所示的融合蛋白。
[0534]
需要说明的是，在本发明中，“人sgsh”或“hsgsh”这一术语特指具有与序列号274所示的天然型的hsgsh一致的氨基酸序列的hsgsh，但不限于此，只要具有sgsh活性则在天然型的hsgsh的氨基酸序列中导入了置换、缺失、添加等变异的物质也包含在hsgsh中。在将hsgsh的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使hsgsh的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以导入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向hsgsh中添加氨基酸时，在hsgsh的氨基酸序列中或n末端侧或c末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以导入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。导入了变异的hsgsh的氨基酸序列与原始的hsgsh的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
[0535]
需要说明的是，在此，当与抗htfr抗体融合的其它蛋白质a为人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hi2s)、人促红细胞生成素(hepo)、人芳基硫酸酯酶a(harsa)、人ppt-1(hppt-1)、人tpp-1(htpp-1)、人α-l-艾杜糖醛酸酶(hidua)、人tnfα受体(htnfαr)和人乙酰肝素n-硫酸酯酶(hsgsh)中的任意一种时，在述及与抗htfr抗体融合的其它蛋白质a保持该其它蛋白质a在生理条件下的活性或功能时或仅述及具有活性或功能时，是指相对于对应的天然型的这些蛋白质本来具有的活性或功能保持3％以上的活性或功能。但是，其活性或功能相对于对应的天然型的这些其它蛋白质a本来具有的活性或功能优选为10％以上，更优选为20％以上，进一步优选为50％以上，更进一步优选为80％以上。在与抗htfr抗体融合的这些其它蛋白质a导入有变异时也同样。
[0536]
通过使本发明的抗htfr抗体与生理活性蛋白或药理活性低分子化合物的分子结
合，从而能够用于制造用来治疗中枢神经系统的疾病状态的血中给药用药剂。此外，与生理活性蛋白或药理活性低分子化合物的分子结合的抗htfr抗体可以在含有以下步骤的治疗方法中使用，所述步骤为：将治疗上有效量的生理活性蛋白或药理活性低分子化合物血中给药(包括点滴静脉注射等静脉注射)于中枢神经系统疾病的患者。经血中给药的与生理活性蛋白或药理活性低分子化合物的分子结合的抗htfr抗体除了能够到达脑内，还能够到达表达htfr的其它脏器和器官。
[0537]
特别是，通过使本发明的抗htfr抗体与人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hi2s)结合，从而能够使hi2s通过血脑屏障而在脑内发挥作用，因此可以用于制造用来治疗hunter综合症所伴随的中枢神经系统的疾病状态的血中给药用药剂。此外，与hi2s结合的抗htfr抗体可以用于含有以下步骤的治疗方法，所述步骤为：将hunter综合症所伴随的中枢神经系统的疾病状态的治疗上的有效量血中给药(包括点滴静脉注射等静脉注射)于hunter综合症患者。被血中给药的与hi2s结合的抗htfr抗体除了能够到达脑内，还能够到达表达htfr的其它脏器和器官。
[0538]
此外，通过使本发明的抗htfr抗体与人促红细胞生成素(hepo)结合，从而能够使hepo通过血脑屏障而在脑内发挥作用，因此可以用于制造用来治疗脑缺血所伴随的中枢神经系统的血中给药用药剂。此外，与hepo结合的抗htfr抗体可以用于含有以下步骤的治疗方法，所述步骤为：将脑缺血所伴随的中枢神经系统的疾病状态的治疗上的有效量血中给药(包括点滴静脉注射等静脉注射)于脑缺血的患者。被血中给药的与hepo结合的抗htfr抗体除了能够到达脑内，还能够到达表达htfr的其它脏器和器官。可以说，将人促红细胞生成素替换为人达贝泊汀也同样。
[0539]
此外，通过使本发明的抗htfr抗体与人芳基硫酸酯酶a(harsa)结合，从而能够使harsa通过血脑屏障而在脑内发挥作用，因此可以用于制造用来治疗异染性白质退化(异染性白质营养不良)所伴随的中枢神经系统的疾病状态的血中给药用药剂。此外，与harsa结合的抗htfr抗体可以用于含有以下步骤的治疗方法，所述步骤为：将异染性白质退化(异染性白质营养不良)所伴随的中枢神经系统的疾病状态的治疗上的有效量血中给药(包括点滴静脉注射等静脉注射)于该疾病的患者。被血中给药的与harsa结合的抗htfr抗体除了能够到达脑内，还能够到达表达htfr的其它脏器和器官。
[0540]
此外，通过使本发明的抗htfr抗体与人ppt-1(hppt-1)结合，从而能够使hppt-1通过血脑屏障而在脑内发挥作用，因此可以用于制造用来治疗神经元蜡样脂褐质沉积症或santavuori-haltia病所伴随的中枢神经系统的疾病状态的血中给药用药剂。此外，与hppt-1结合的抗htfr抗体可以用于含有以下步骤的治疗方法，所述步骤为：将神经元蜡样脂褐质沉积症或santavuori-haltia病所伴随的中枢神经系统的疾病状态的治疗上的有效量血中给药(包括点滴静脉注射等静脉注射)于这些的疾病的患者。被血中给药的与hppt-1结合的抗htfr抗体除了能够到达脑内，还能够到达表达htfr的其它脏器和器官。
[0541]
此外，通过使本发明的抗htfr抗体与人tpp-1(htpp-1)结合，从而能够使htpp-1通过血脑屏障而在脑内发挥作用，因此可以用于制造用来治疗神经元蜡样脂褐质沉积症或jansky-bielschowsky病所伴随的中枢神经系统的疾病状态的血中给药用药剂。此外，与hppt-1结合的抗htfr抗体可以用于含有以下步骤的治疗方法，所述步骤为：将神经元蜡样脂褐质沉积症或jansky-bielschowsky病所伴随的中枢神经系统的疾病状态的治疗上的有
效量血中给药(包括点滴静脉注射等静脉注射)于这些的疾病的患者。被血中给药的与htpp-1结合的抗htfr抗体除了能够到达脑内，还能够到达表达htfr的其它脏器和器官。
[0542]
此外，通过使本发明的抗htfr抗体与人α-l-艾杜糖醛酸酶(hidua)结合，从而能够使hidua通过血脑屏障而在脑内发挥作用，因此可以用于制造用来治疗hurler综合症或hurler
·
scheie综合症所伴随的中枢神经系统的疾病状态的血中给药用药剂。此外，与hidua结合的抗htfr抗体可以用于含有以下步骤的治疗方法，所述步骤为：将hurler综合症或hurler
·
scheie综合症所伴随的中枢神经系统的疾病状态的治疗上的有效量血中给药(包括点滴静脉注射等静脉注射)于这些的疾病的患者。被血中给药的与hidua结合的抗htfr抗体除了能够到达脑内，还能够到达表达htfr的其它脏器和器官。
[0543]
此外，通过使本发明的抗htfr抗体与人tnfα受体(htnfαr)结合，从而能够使htnfαr通过血脑屏障而在脑内发挥作用，因此可以用于制造用来治疗脑缺血或脑炎症性疾病所伴随的中枢神经系统的疾病状态的血中给药用药剂。此外，与htnfαr结合的抗htfr抗体可以用于含有以下步骤的治疗方法，所述步骤为：将脑缺血或脑炎症性疾病所伴随的中枢神经系统的疾病状态的治疗上的有效量血中给药(包括点滴静脉注射等静脉注射)于这些疾病的患者。被血中给药的与htnfαr结合的抗htfr抗体除了能够到达脑内，还能够到达表达htfr的其它脏器和器官。
[0544]
此外，通过使本发明的抗htfr抗体与人乙酰肝素n-硫酸酯酶(hsgsh)结合，从而能够使hsgsh通过血脑屏障而在脑内发挥作用，因此可以用于制造用来治疗sanfilippo综合症所伴随的中枢神经系统的疾病状态的血中给药用药剂。此外，与hsgsh结合的抗htfr抗体可以用于含有以下步骤的治疗方法，所述步骤为：将sanfilippo综合症所伴随的中枢神经系统的疾病状态的治疗上的有效量血中给药(包括点滴静脉注射等静脉注射)于这些疾病的患者。被血中给药的与hsgsh结合的抗htfr抗体除了能够到达脑内，还能够到达表达htfr的其它脏器和器官。
[0545]
本发明的与抗htfr抗体结合的蛋白质、低分子化合物等可以作为要给药于血中并在中枢神经系统(cns)中发挥药效的药剂使用。所述药剂通常通过基于点滴静脉注射等的静脉注射、皮下注射、肌肉注射给药于患者，对给药途径没有特别限定。
[0546]
就本发明的与抗htfr抗体结合的蛋白质、低分子化合物等而言，作为药剂可以以冷冻干燥品或水性液剂等形态提供给医疗机构。在水性液剂的情况下，可以将药剂预先溶解于含有稳定剂、缓冲剂、等渗剂的溶液中并密封在药瓶或注射器中的制剂形式来提供。密封在注射器中的制剂通常被称为预填充注射器制剂。通过制成预填充注射器制剂，可以由患者本人容易地进行药剂的给药。
[0547]
在以水性液剂形式来提供时，水性液剂中所含的与抗htfr抗体结合的蛋白质、低分子化合物等的浓度应根据用法用量来适当调整，为例如1～4mg/ml。此外，水性液剂中所含的稳定剂只要是药剂学上允许的稳定剂则没有特别限定，可以优选使用非离子型表面活性剂。作为这样的非离子型表面活性剂，可以单独使用聚山梨醇酯、泊洛沙姆等或将这些组合使用。作为聚山梨醇酯，特别优选聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，作为泊洛沙姆，特别优选泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)。此外、水性液剂中所含的非离子型表面活性剂的浓度优选为0.01～1mg/ml，更优选为0.01～0.5mg/ml，进一步优选为0.1～0.5mg/ml。作为稳定剂，还可以使用组氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸等氨基酸。作为稳定剂使用
时的、水性液剂中所含的氨基酸的浓度优选为0.1～40mg/ml，更优选为0.2～5mg/ml，进一步优选为0.5～4mg/ml。水性液剂中所含的缓冲剂只要是药剂学上允许的缓冲剂则没有特别限定，优选磷酸盐缓冲剂，特别优选磷酸钠缓冲剂。作为缓冲剂使用磷酸钠缓冲剂时的、磷酸钠的浓度优选为0.01～0.04m。此外，用缓冲剂调整的水性液剂的ph优选为5.5～7.2。水性液剂中所含的等渗剂只要是药剂学上允许的等渗剂则没有特别限定，可以优选单独使用氯化钠、甘露醇或将它们组合作为等渗剂。
[0548]
实施例
[0549]
以下参照实施例更详细地说明本发明，但并不意味者本发明受实施例限定。
[0550]
〔实施例1〕htfr表达用载体的构建
[0551]
以人脾脏quick clone cdna(clontech公司)为模板，用引物htfr5’(序列号214)和引物htfr3’(序列号215)通过pcr扩增编码人转铁蛋白受体(htfr)的基因片段。将扩增出的编码htfr的基因片段用mlui和noti消化，并插入到pci-neo载体(promega公司)的mlui和noti之间。将得到的载体命名为pci-neo(htfr)。然后将该载体用mlui和noti消化，切出编码htfr的基因片段，将其整合到国际公开公报(wo2012/063799)中记载的表达载体pe-mires-gs-puro的mlui和noti之间，从而构建htfr表达用载体pe-mires-gs-puro(htfr)。
[0552]
〔实施例2〕重组htfr的制作
[0553]
利用电穿孔法向cho-k1细胞中导入pe-mires-gs-puro(htfr)后，用含有甲硫氨酸砜亚胺(msx)和嘌呤霉素的cd opticho
tm
培养基(invitrogen公司)进行细胞的选择培养，得到重组htfr表达细胞。培养该重组htfr表达细胞来制备重组htfr。
[0554]
〔实施例3〕使用重组htfr免疫小鼠
[0555]
使用实施例2中制备的重组htfr作为抗原来免疫小鼠。将抗原静脉内给药或腹腔内给药于小鼠来进行免疫。
[0556]
〔实施例4〕杂交瘤的制作
[0557]
在最后给药细胞之日起约1周后，摘出小鼠的脾脏并均质化，分离脾细胞。用聚乙二醇法将得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株(p3.x63.ag8.653)进行细胞融合。在细胞融合结束后，将细胞悬浮于含有(1
×
)hat补充剂(life technologies公司)和10％ultra low igg胎牛血清(life technologies公司)的rpmi1640培养基中，将细胞悬浮液以200μl/孔分注到20块96孔板中。用二氧化碳培养箱(37℃，5％co2)将细胞培养10天后，在显微镜下观察各孔，选择存在单一集落的孔。
[0558]
在各孔的细胞达到几乎汇合的时刻回收培养上清，将其作为杂交瘤的培养上清，供于以下的筛选。
[0559]
〔实施例5〕高亲和性抗体产生细胞株的筛选
[0560]
将重组htfr溶液(sino biologics公司)用50mm碳酸钠缓冲液(ph9.5～9.6)稀释而调整为5μg/ml的浓度，将其作为固相溶液。将固相溶液向nunc maxisorp
tm flat-bottom 96孔板(基材：聚苯乙烯，nunc公司制)的各孔中分别添加50μl后，将板在室温下静置1小时，使重组htfr吸附、固定于板。弃去固相溶液，将各孔用250μl洗涤液(含有0.05％tween20的pbs)洗涤3次后，向各孔中添加200μl封闭液(含有1％bsa的pbs)，将板在室温下静置1小时。
[0561]
弃去封闭液，将各孔用250μl洗涤液(含有0.05％tween20的pbs)洗涤3次后，向各孔中分别添加50μl杂交瘤的培养上清，将板在室温下静置1小时，使培养上清中所含的小鼠
抗htfr抗体与重组htfr结合。此时，作为对照，设置在孔中添加50μl不产生小鼠抗htfr抗体的杂交瘤的培养上清的例子。此外，设置在加入了各培养上清的孔的横向的孔中添加50μl杂交瘤的培养用培养基的例子，将其作为空白对照孔(mock well)。测定以n＝2来实施。然后弃去溶液，将各孔用250μl洗涤液(含有0.05％tween20的pbs)洗涤3次。
[0562]
在上述各孔中添加100μl的hrp标记山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体溶液(promega公司)，将板在室温下静置1分钟。然后弃去溶液，将各孔用250μl的洗涤液(含有0.05％tween20的pbs)洗涤3次。然后向各孔中添加50μl的显色用底物液tmb stabilized substrate for horseradish peroxidase(promega公司)，在室温下静置10～20分钟。然后向各孔中添加100μl的终止液(2n硫酸)后，用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。对各培养上清和对照各取2个孔的平均值，从这些平均值中分别减去各培养上清和对照各自设置的2个空白对照孔的平均值，将结果作为测定值。
[0563]
选择显示高测定值的孔中所添加的培养上清所对应的14种杂交瘤细胞，作为产生对htfr显示高亲和性的抗体(高亲和性抗htfr抗体)的细胞株(高亲和性抗体产生细胞株)。将这14种细胞株编号为克隆1株～克隆14株。此外，将克隆1株～克隆14株所产生的抗htfr抗体分别设为抗htfr抗体号1～抗htfr抗体号14。
[0564]
〔实施例6〕高亲和性抗htfr抗体的可变区的氨基酸序列的分析
[0565]
由实施例5中选择出的克隆1株～克隆14株制备cdna，以这些cdna为模板，扩增编码抗体的轻链和重链的基因。对扩增出的基因的碱基序列进行翻译，对于各细胞株所产生的抗htfr抗体号1～抗htfr抗体号14的抗体分别确定轻链和重链的可变区的氨基酸序列。
[0566]
抗htfr抗体号1是轻链的可变区含有序列号218中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号219中记载的氨基酸序列的抗体。此外，轻链的可变区中，cdr1中含有序列号6或7中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号8或9中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号10中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号76或77中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号78或79中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号80或81中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0567]
抗htfr抗体号2是轻链的可变区含有序列号220中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号221中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号11或12中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号13或14中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号15中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号82或83中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号84或85中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号86或87中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0568]
抗htfr抗体号3是轻链的可变区含有序列号222中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号223中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号16或17中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号18或19中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号20中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号88或89、cdr2中含有序列号90或91、以及cdr3中含有序列号92或93的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于
上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0569]
抗htfr抗体号4是轻链的可变区含有序列号224中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号225中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号21或22中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号23或24中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号25的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号94或95中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号96或97中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号98或99中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0570]
抗htfr抗体号5是轻链的可变区含有序列号226中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号227中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号26或27中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号28或29中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号30中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号100或101中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号102或103中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号104或105中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0571]
抗htfr抗体号6是轻链的可变区含有序列号228中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号229中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号31或32中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号33或34中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号35中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号106或107中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号108或278中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号109或110中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0572]
抗htfr抗体号7是轻链的可变区含有序列号230中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号231中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号36或37中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号38或39中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号40中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号111或112中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号113或114中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号115或116中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0573]
抗htfr抗体号8是轻链的可变区含有序列号232中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号233中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号41或42中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号43或44中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号45中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号117或118中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号119或279中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序
列号120或121中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0574]
抗htfr抗体号9是轻链的可变区含有序列号234中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号235中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号46或47中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号48或49中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号50中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号122或123中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号124或125中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号126或127中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0575]
抗htfr抗体号10是轻链的可变区含有序列号236中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号237中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号51或52中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号53或54中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号55中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号128或129中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号130或131中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号132或133中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0576]
抗htfr抗体号11是轻链的可变区含有序列号238中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号239中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号56或57中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号58或59中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号60中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号134或135中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号136或137中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号138或139中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0577]
抗htfr抗体号12是轻链的可变区含有序列号240中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号241中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号61或62中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号63或64中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号65中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号140或141中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号142或143中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号144或145中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0578]
抗htfr抗体号13是轻链的可变区含有序列号242中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号243中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号66或67中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号68或69中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号70中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号146或
147中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号148或149中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号150或151中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0579]
抗htfr抗体号14是轻链的可变区含有序列号244中记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号245中记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，cdr1中含有序列号71或72中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号73或74中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号75中记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，cdr1中含有序列号152或153中记载的氨基酸序列、cdr2中含有序列号154或155中记载的氨基酸序列、以及cdr3中含有序列号156或157中记载的氨基酸序列。但是，认为cdr不限于上述氨基酸序列，含有这些氨基酸序列的区域、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为cdr。
[0580]
将抗htfr抗体号1～抗htfr抗体号14的轻链和重链的可变区中所含的氨基酸序列的序列号汇总示于表1。
[0581]
表1抗htfr抗体号1～14的轻链和重链的可变区所含的氨基酸序列的序列号
[0582]
抗体号轻链的可变区重链的可变区1218219222022132222234224225522622762282297230231823223392342351023623711238239122402411324224314244245
[0583]
将抗htfr抗体号1～抗htfr抗体号14的轻链的可变区的cdr1～3和重链的可变区的cdr1～3中所含的氨基酸序列的序列号汇总示于表2。其中，表2例示出各cdr的氨基酸序列，但各cdr的氨基酸序列不限于表2中记载的氨基酸序列，认为含有这些氨基酸序列的区域的氨基酸序列、由含有这些氨基酸序列的一部分的连续的3个以上氨基酸构成的氨基酸序列也可作为cdr。
[0584]
表2抗htfr抗体号1～14的轻链和重链的可变区的cdr1～3所含的氨基酸序列的序列号(各cdr的氨基酸序列的例示)
[0585][0586]
〔实施例7〕抗htfr抗体与人tfr和猴tfr的亲和性的测定
[0587]
抗htfr抗体与人tfr和猴tfr的亲和性的测定用octetred96(fortebio公司，pall公司的一个部门)来实施，所述octetred96为利用生物膜层干涉法(biolayer interferometry：bli)的生物分子相互作用分析系统。对生物膜层干涉法的基本原理进行简单说明。对固定有传感器芯片表面的生物分子层(layer)投射特定波长的光时，光被生物分子层和作为内部参照的层的两个表面反射，产生光的干涉波。测定试样中的分子与传感器芯片表面的生物分子结合而使传感器前端的层的厚度增加，使干涉波产生波长偏移。通过测定该波长偏移的变化，可以实时进行固定于传感器芯片表面的生物分子所结合的分子数的定量和动力学分析。测定大体上按照octetred96所附的操作手册来实施。作为人tfr，使用n末端添加有组氨酸标签的、具有序列号1所示的氨基酸序列中的从n末端侧起第89位的半胱氨酸残基到c末端的苯丙氨酸为止的htfr的胞外区的氨基酸序列的重组人tfr(r人tfr：sino biological公司)。作为猴tfr，使用n末端添加有组氨酸标签的、具有序列号2所示的氨基酸序列中的从n末端侧起第89位的半胱氨酸残基到c末端的苯丙氨酸为止的食蟹猴的tfr的胞外区的氨基酸序列的重组猴tfr(r猴tfr：sino biological公司)。
[0588]
将实施例5中选择出的克隆1株～克隆14株分别按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用含有(1
×
)hat补充剂(life technologies公司)和10％ultra low igg胎牛血清(life technologies公司)的rpmi1640培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在含有5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养上清，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。将回收的培养上清上样到预先用含有150mm nacl的为柱体积3倍体积的20mm tris缓冲液(ph8.0)平衡化的protein g柱(柱体积：1ml，ge healthcare公司)。然后用柱体积的5倍体积的同一缓冲液洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的抗体，收集洗脱级分。对洗脱级分添加1m tris缓冲液(ph8.0)将ph调整为7.0。将其作为抗htfr抗体号1～抗htfr抗体号14的纯化品用于以下的实验。
[0589]
将纯化后的各抗体(抗htfr抗体号1～抗htfr抗体号14)分别用hbs-p (含有150mm nacl、50μm edta和0.05％表面活性剂p20的10mm hepes)进行2级稀释，制备0.78125～50nm(0.117～7.5μg/ml)的7级浓度的抗体溶液。将该抗体溶液作为样品溶液。将r人tfr和r猴tfr分别用hbs-p 稀释，制备25μg/ml的溶液，分别作为r人tfr-ecd(histag，组氨酸标签)溶
液和r猴tfr-ecd(histag)溶液。
[0590]
将上述进行2级稀释而制备的样品溶液以200μl/孔添加至96孔板，黑色(greiner bio-one公司)中。此外，将上述制备的r人tfr-ecd(histag)溶液和r猴tfr-ecd(histag)溶液以200μl/孔添加至规定的孔中。向基线、解离用和洗涤用的孔中以200μl/孔添加hbs-p 。向再生用的孔中以200μl/孔添加10mm甘氨酸-hcl，ph1.7。向活性化用的孔中以200μl/孔添加0.5mm nicl2溶液。将该板和生物传感器(biosensor/ni-nta：fortebio公司，pall公司的一个部门)设置在octetred96的规定位置。
[0591]
使octetred96在下述表3所示的条件下工作，在取得数据后，用octetred96附带的分析软件将结合反应曲线拟合为1：1结合模型或2：1结合模型，测定抗htfr抗体与r人tfr和r猴tfr的缔合速率常数(k
on
)和解离速率常数(k
off
)，算出解离常数(kd)。需要说明的是，测定在25～30℃的温度下实施。
[0592]
表3 octetred96的工作条件
[0593][0594]
表4中示出抗htfr抗体号1～14(表中，分别对应于抗体号1～14)与人tfr的缔合速率常数(k
on
)和解离速率常数(k
off
)的测定结果和解离常数(kd)。
[0595]
表4抗htfr抗体对人tfr的亲和性
[0596] kon(m-1
s-1
)koff(s-1
)k0(m)15.00
×
1052.55
×
10-6
5.09
×
10-12
21.11
×
1061.23
×
10-5
1.12
×
10-11
36.53
×
105＜1.0
×
10-7
＜1.0
×
10-12
41.91
×
1062.29
×
10-4
1.20
×
10-10
56.71
×
1052.44
×
10-5
3.64
×
10-11
67.54
×
1057.23
×
10-4
9.58
×
10-10
73.69
×
1053.03
×
10-5
8.22
×
10-11
86.96
×
105《1.0
×
10-7
《1.0
×
10-12
97.82
×
1059.46
×
10-5
1.21
×
10-10
106.79
×
1057.66
×
10-4
1.13
×
10-9
112.72
×
1052.28
×
10-5
8.37
×
10-11
127.54
×
1057.23
×
10-4
4.32
×
10-10
138.35
×
105＜1.0
×
10-7
＜1.0
×
10-12
149.61
×
105＜1.0
×
10-7
＜1.0
×
10-12
[0597]
表5中示出抗htfr抗体号1～14(表中，分别对应于抗体号1～14)与猴tfr的缔合速率常数(k
on
)和解离速率常数(koff)的测定结果和解离常数(kd)。
[0598]
表5抗htfr抗体对猴tfr的亲和性
[0599]
抗体号kon(m-1
s-1
)koff(s-1
)k0(m)12.80
×
105＜1.0
×
10-7
＜1.0
×
10-12
24.18
×
1051.75
×
10-6
4.18
×
10-11
33.89
×
105《1.0
×
10-7
《1.0
×
10-12
47.54
×
1051.21
×
10-4
1.61
×
10-10
55.19
×
1057.58
×
10-4
1.46
×
10-9
64.95
×
1052.36
×
10-4
1.23
×
10-10
72.66
×
1054.54
×
10-6
1.71
×
10-11
85.52
×
1055.07
×
10-3
9.18
×
10-9
96.99
×
1051.47
×
10-4
2.10
×
10-9
103.87
×
1051.22
×
10-2
3.16
×
10-8
111.24
×
1054.21
×
10-4
3.38
×
10-9
125.05
×
1051.26
×
10-4
2.4g
×
10-10
135.91
×
1057.29
×
10-5
1.23
×
10-10
147.00
×
1053.61
×
10-5
5.16
×
10-11
[0600]
抗htfr抗体对人tfr的亲和性的测定结果，全部抗体与人tfr的解离常数为1
×
10-8
m以下，除抗体号10以外的13种抗体与人tfr的解离常数为1
×
10-9
m以下，特别是抗体号3、8、13和14与人tfr的解离常数为1
×
10-12
m以下(表4)。这些结果表明14种抗体全部为与人tfr具有高亲和性的抗体。然后观察抗htfr抗体对猴tfr的亲和性的测定结果，全部抗体与猴tfr的解离常数为5
×
10-8
m以下，特别是抗体号1和3与猴tfr的解离常数为1
×
10-12
m以下(表5)。这些结果表明14种抗体不仅全部为与人tfr具有高亲和性的抗体，而且全部为与猴tfr也具有高亲和性的抗体。
[0601]
〔实施例7-2〕抗htfr抗体的使用小鼠的脑迁移评价
[0602]
然后，对于抗htfr抗体号1～9和11～14这13种抗体，使用将编码小鼠转铁蛋白受体的胞外区的基因置换为编码人转铁蛋白受体基因的胞外区的基因的htfr敲入小鼠(htfr-ki小鼠)，来评价各抗体通过bbb迁移到脑内的情况。htfr-ki小鼠大体上通过下述方法来制作。此外，作为抗htfr抗体，使用实施例7中记载的抗体的纯化品。
[0603]
化学合成具有序列号253所示的碱基序列的dna片段，所述序列号253所示的碱基序列为如下序列：在编码胞内区为小鼠htfr的氨基酸序列、胞外区为人htfr的氨基酸序列的嵌合htfr的cdna的3’侧配置有被loxp序列夹入的新霉素抗性基因。通过常规方法将该dna片段整合到具有作为5’臂序列的序列号254所示的碱基序列、作为3’臂序列的序列号255所示的碱基序列的打靶载体中，利用电穿孔法将其导入到小鼠es细胞中。在新霉素存在下对基因导入后的小鼠es细胞进行选择培养，选择打靶载体已通过同源重组整合到染色体的小鼠es细胞。将得到的基因重组小鼠es细胞注入到icr小鼠的8细胞期胚(宿主胚)，移植到通过与进行了输精管结扎的小鼠交配而得到的假孕小鼠(受体小鼠)。对于得到的鼠仔
(嵌合小鼠)进行毛色判定，选择es细胞在生物体的形成中有高效贡献的个体、即白色毛相对于整体毛色所占的比率高的个体。将该嵌合小鼠个体与icr小鼠交配，得到f1小鼠。选出白色的f1小鼠，对从尾部组织提取的dna进行分析，将染色体上小鼠转铁蛋白受体基因被置换为嵌合htfr的小鼠作为htfr-ki小鼠。
[0604]
用荧光素标记试剂盒-nh2(同仁化学研究所)按照所附的操作手册通过异硫氰酸荧光素(fitc)对上述13种抗htfr抗体进行荧光标记。分别制备含有该fitc荧光标记的13种抗htfr抗体的pbs溶液。将该抗体溶液按照给药的抗htfr抗体的用量达到3mg/kg的方式分别对1只htfr-ki小鼠(雄，10～12周龄)进行静脉注射。此外，作为对照。将同样制备的含有fitc荧光标记小鼠igg1(西格玛公司)的pbs溶液以3mg/kg的用量对1只htfr-ki小鼠(雄，10～12周龄)进行静脉注射。在静脉注射起约8小时后、用生理盐水进行全身灌注，摘取脑(含有大脑和小脑的部分)。测定所摘出的脑的重量(湿重)后，添加含有蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司)的t-per(thermo fisher scientific公司)，将脑组织制成匀浆液。将匀浆液离心并回收上清，用以下方法测定上清中所含的fitc荧光标记的抗体的量。首先，将抗fitc抗体(bethyl公司)向high bind plate(高结合板)(meso scale diagnostics公司)的各孔中各添加10μl，静置1小时，使其固定于板。然后向各孔中添加superblock blocking buffer in pbs(superblock(pbs)封闭缓冲液)(thermo fisher scientific公司)各150μl，振荡1小时，对板进行封闭。然后向各孔中添加脑组织的匀浆液的上清各25μl，振荡1小时。然后向各孔中添加sulfo-taganti-mouse antibody(goat)(sulfo标记的抗小鼠抗体(山羊))(meso scale diagnostics公司)各25μl，振荡1小时。然后向各孔中添加read buffer t(meso scale diagnostics公司)各150μl，用sector
tm imager 6000 reader测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的fitc荧光标记的抗htfr抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被检体的测定值内插到标准曲线中，从而计算出每克脑重量(湿重)中所含的抗体量(脑组织中的抗htfr抗体的浓度)。将其结果示于表5-2。
[0605]
与对照相比，抗htfr抗体号1～9和11～14的抗体在脑组织中的浓度均为25倍以上。对于抗htfr抗体号5和6而言，其浓度与对照相比为100倍以上，特别是抗htfr抗体号6达到了约160倍。这些结果表明：抗htfr抗体号1～9和11～14的抗体具有积极通过bbb迁移到脑内的性质。
[0606]
表5-2脑组织中的抗htfr抗体的浓度
[0607][0608]
〔实施例8〕抗htfr抗体的使用猴的药物动力学分析
[0609]
将抗htfr抗体号1～3的抗体分别以5.0mg/kg的用量分别对雄性食蟹猴进行单次静脉内给药，给药8小时后用生理盐水实施全身灌注。此外，作为阴性对照，对未给药抗htfr抗体的1只个体同样地进行全身灌注。灌注后，摘出包括延髓在内的脑组织。使用该脑组织，进行以下抗htfr抗体的浓度测定和免疫组织化学染色。此外，作为抗htfr抗体，使用实施例7中记载的抗体的纯化品。
[0610]
脑组织中的抗htfr抗体的浓度测定大体上按照以下步骤进行。对于所采集的组织，将脑组织分成大脑、小脑、海马和延髓后，分别用含有蛋白酶抑制剂混合物(sigma-aldrich公司)的ripa缓冲液(和光纯药工业株式会社)制成匀浆液离心，回收上清。将亲和纯化山羊抗小鼠igg fcγpab(jackson immunoresearch公司)向高结合板(meso scale diagnostics公司)的各孔中添加各10μl，静置1小时，将其固定于板。然后向各孔中添加superblock blocking buffer in pbs(thermo fisher scientific公司)各150μl，振荡1小时，将板封闭。然后向各孔中添加脑组织的匀浆液的上清各25μl，振荡1小时。然后向各孔中添加亲和纯化山羊抗小鼠igg fab-生物素(jackson immunoresearch公司)各25μl，振荡1小时。然后向各孔中添加sulfo-tag-streptavidin(sulfo标记的链霉亲和素)(meso scale diagnostics公司)各25μl，振荡0.5小时。向各孔中添加read buffer t(meso scale diagnostics公司)各150μl，用sector
tm imager 6000 reader(meso scale diagnostics公司)测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的抗htfr抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被检体的测定值内插到标准曲线中，从而计算出各脑组织的每克重量(湿重)中所含的抗体的量(脑组织中的抗htfr抗体的浓度)。
[0611]
将脑组织中的抗htfr抗体的浓度测定的结果示于表6。抗htfr抗体号1～抗htfr抗
体号3的抗体均确认到在大脑、小脑、海马和延髓中的累积，关于其量，抗htfr抗体号1《抗htfr抗体号3《抗htfr抗体号2，抗htfr抗体号1最少，抗htfr抗体号2最多。htfr抗体号2与抗htfr抗体号1相比，确认到在大脑中为约4.3倍、在小脑中为约6.6倍、在海马中为约4.6倍、在延髓中为约2倍的抗体累积。这些结果表明这3种抗体具有通过血脑屏障、在脑组织中累积的性质，表明通过使应在脑组织内发挥作用的药剂与这些抗体结合、从而可以使该药剂高效地在脑组织中累积。
[0612]
表6脑组织中的抗htfr抗体的浓度(μg/g湿重)
[0613]
抗体号大脑小脑海马延髓10.180.150.120.2220.780.990.560.4330.720.60.330.31
[0614]
脑组织中的抗htfr抗体的免疫组织化学染色大体上按照以下步骤进行。用tissue tek cryo 3dm(sakura finetek株式会社)将采集的组织快速冷冻到-80℃，制作组织的冷冻块。将该冷冻块薄切成4μm后，贴合于mas涂层载玻片(松浪硝子株式会社)。使组织薄片与4％多聚甲醛(和光纯药工业株式会社)在4℃下反应5分钟，将组织薄片固定在载玻片上。然后，使组织薄片与含有0.3％双氧水的甲醇溶液(和光纯药工业株式会社)反应30分钟，使内源性过氧化物酶失活。然后使载玻片与superblock blocking buffer in pbs在室温下反应30分钟，进行封闭。然后使组织薄片与小鼠igg-重链和轻链抗体(bethyl laboratories公司)在室温下反应1小时。将组织薄片用dab底物(3,3
’‑
二氨基联苯胺，vector laboratories公司)显色，用mayer’s苏木精(merck公司)进行对比染色，脱水，透明后密封，用光学显微镜观察。
[0615]
图1示出大脑皮层的抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果。给药抗htfr抗体号1～抗htfr抗体号3的猴的大脑皮层中，确认到血管的特异性染色(分别如图1b～d)。特别是给药抗htfr抗体号2的猴和给药抗htfr抗体号3的猴的大脑皮层(分别如图1c和图1d)中，在脑血管外的脑实质区域也广泛确认到特异性染色。需要说明的是，作为对照的未给药抗htfr抗体的猴的大脑皮层中未确认到染色，表明几乎不存在背景的染色(图1a)。
[0616]
图2示出海马的抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果。给药抗htfr抗体号1～抗htfr抗体号3的猴的大脑中，确认到血管的特异性染色(分别如图2b～d)。特别是给药抗htfr抗体号2的猴和给药抗htfr抗体号3的猴的海马(分别如图2c和图2d)中，神经元样细胞也确认到特异性染色，进而在脑血管外的脑实质区域也广泛确认到特异性染色。需要说明的是，作为对照的未给药抗htfr抗体的猴的海马中未确认到染色，表明几乎不存在背景的染色(图2a)。
[0617]
图3示出小脑的抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果。给药抗htfr抗体号1～抗htfr抗体号3的猴的小脑中，确认到血管的特异性染色(分别如图3b～d)。特别是给药抗htfr抗体号2的猴和给药抗htfr抗体号3的猴的小脑(分别如图3c和图3d)中，浦肯野细胞也确认到特异性染色。需要说明的是，作为对照的未给药抗htfr抗体的猴的小脑中未确认到染色，表明几乎不存在背景的染色(图3a)。
[0618]
根据以上的大脑、海马和小脑的免疫组织化学染色的结果，可认为：抗htfr抗体号1可以与存在于脑血管内皮表面的htfr结合，但与抗htfr抗体号2和3相比，向脑实质的迁移
量较少。另一方面可知：抗htfr抗体号2和3可以与存在于脑血管内皮表面的htfr结合，且在与htfr结合后，通过血脑屏障向脑实质内迁移，进而在海马中从脑实质内被摄入到神经元样细胞中，在小脑中被摄入到浦肯野细胞中。
[0619]
〔实施例9〕人源化抗htfr抗体的制作
[0620]
尝试了表1所示的抗htfr抗体号1～3的轻链和重链的可变区中所含的氨基酸序列的人源化。对于抗htfr抗体号1，得到具有序列号158～序列号163所示的氨基酸序列的人源化的轻链的可变区、和具有序列号166～序列号171所示的氨基酸序列的人源化的重链的可变区。对于抗htfr抗体号2，得到具有序列号174～序列号179所示的氨基酸序列的人源化的轻链的可变区、和具有序列号182～序列号187所示的氨基酸序列的人源化的重链的可变区。对于抗htfr抗体号3，得到具有序列号190～序列号195所示的氨基酸序列的人源化的轻链的可变区、和具有序列号204～序列号209所示的氨基酸序列的人源化的重链的可变区。
[0621]
〔实施例10〕编码人源化抗htfr抗体的基因的构建
[0622]
对于上述抗htfr抗体号1～3，人工合成了含有如下基因的dna片段，所述基因为编码分别包含人源化抗htfr抗体的轻链和重链的可变区的轻链和重链的全长的基因。此时，在编码轻链的全长的基因的5’侧，从5’端起依次导入mlui序列和编码前导肽的序列，在3’侧导入noti序列。此外，在编码重链的全长的基因的5’侧，从5’端起依次导入mlui序列和编码前导肽的序列，在3’侧导入noti序列。需要说明的是，在此，所导入的前导肽发挥分泌信号的作用，即，使人源化抗体的轻链和重链在作为宿主细胞的哺乳动物细胞中表达时，使轻链和重链被分泌到细胞外。
[0623]
对于抗htfr抗体号1的轻链，合成了含有如下基因的dna片段(序列号165)，所述基因编码可变区具有序列号163所示的氨基酸序列的序列号164所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗htfr抗体号1的轻链)的全长。对于抗htfr抗体号1的重链，合成了含有如下基因的dna片段(序列号173)，所述基因编码可变区具有序列号171所示的氨基酸序列的序列号172所示的氨基酸序列的重链(人源化抗htfr抗体号1的重链)的全长。序列号173所示的dna片段所编码的人源化抗htfr抗体的重链为igg1。
[0624]
对于抗htfr抗体号2的轻链，合成了含有如下基因的dna片段(序列号181)，所述基因编码可变区具有序列号179所示的氨基酸序列的序列号180所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗htfr抗体号2的轻链)的全长。对于抗htfr抗体号2的重链，合成了含有如下基因的dna片段(序列号189)，所述基因编码可变区具有序列号187所示的氨基酸序列的序列号188所示的氨基酸序列的重链(人源化抗htfr抗体号2的重链)的全长。序列号189所示的dna片段所编码的人源化抗htfr抗体的重链为igg1。
[0625]
对于抗htfr抗体号3的轻链，合成了编码可变区具有序列号191所示的氨基酸序列的序列号196所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗htfr抗体号3的轻链)的全长的dna片段(序列号197)。对于抗htfr抗体号3的重链，合成了编码可变区具有序列号205所示的氨基酸序列的序列号210所示的氨基酸序列的重链(人源化抗htfr抗体号3的重链)的全长的dna片段(序列号211)。序列号211所示的dna片段所编码的人源化抗htfr抗体的重链为igg1。
[0626]
对于抗htfr抗体号3的轻链，还合成了：编码可变区具有序列号193所示的氨基酸序列的序列号198所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗htfr抗体号3-2的轻链)的全长的dna片段(序列号199)、编码可变区具有序列号194所示的氨基酸序列的序列号200所示的氨基
酸序列的轻链(人源化抗htfr抗体号3-3的轻链)的全长的dna片段(序列号201)、和编码可变区具有序列号195所示的氨基酸序列的序列号202所示的氨基酸序列的轻链(人源化抗htfr抗体号3-4的轻链)的全长的dna片段(序列号203)。
[0627]
进而，对于抗htfr抗体号3的重链，合成了编码可变区具有序列号205所示的氨基酸序列的序列号212所示的氨基酸序列的重链(人源化抗htfr抗体号3的重链igg4)的全长的dna片段(序列号213)。该序列号213所示的dna片段所编码的人源化抗htfr抗体的重链为igg4。
[0628]
〔实施例11〕人源化抗htfr抗体表达载体的构建
[0629]
将pef/myc/nuc载体(invitrogen公司)用kpni和ncoi消化，切出含有ef-1α启动子及其第一内含子的区域，将其用t4 dna聚合酶进行平末端化处理。将pci-neo(invitrogen公司)用bglii和ecori消化，切出含有cmv的增强子/启动子和内含子的区域后，用t4 dna聚合酶进行平末端化处理。向其中插入上述含有ef-1α启动子及其第一内含子的区域，构建pe-neo载体。将pe-neo载体用sfii和bstxi消化，切出含有新霉素抗性基因的约1kbp的区域。以pcdna3.1/hygro( )(invitrogen公司)为模板用引物hyg-sfi5’(序列号216)和引物hyg-bstx3’(序列号217)通过pcr反应扩增潮霉素基因。将扩增出的潮霉素基因用sfii和bstxi消化，插入到上述切除了新霉素抗性基因的pe-neo载体中，构建pe-hygr载体。
[0630]
将pe-hygr载体和pe-neo载体分别用mlui和noti消化。将实施例10中合成的编码人源化抗htfr抗体号1的轻链的dna片段(序列号165)和编码重链的dna片段(序列号173)用mlui和noti消化，分别插入到pe-hygr载体和pe-neo载体的mlui-noti之间。将得到的载体分别作为人源化抗htfr抗体号1的轻链表达用载体pe-hygr(lc1)和人源化抗htfr抗体号1的重链表达用载体pe-neo(hc1)用于以下实验。
[0631]
同样，将实施例10中合成的编码人源化抗htfr抗体号2的轻链的dna片段(序列号181)和编码重链的dna片段(序列号189)用mlui和noti消化，分别插入到pe-hygr载体和pe-neo载体的mlui-noti之间。将得到的载体分别作为人源化抗htfr抗体号2的轻链表达用载体pe-hygr(lc2)、人源化抗htfr抗体号2的重链表达用载体pe-neo(hc2)用于以下实验。
[0632]
进而，同样地将实施例10中合成的编码人源化抗htfr抗体号3的轻链的dna片段(序列号197)和编码重链的dna片段(序列号211)用mlui和noti消化，分别插入到pe-hygr载体和pe-neo载体的mlui-noti之间。将得到的载体分别作为人源化抗htfr抗体号3的轻链表达用载体pe-hygr(lc3)、人源化抗htfr抗体号3的重链表达用载体pe-neo(hc3)用于以下实验。
[0633]
进而，对于抗htfr抗体号3的轻链，将实施例10中合成的编码人源化抗htfr抗体号3-2的轻链的dna片段(序列号199)、编码人源化抗htfr抗体号3-3的轻链的dna片段(序列号201)和编码人源化抗htfr抗体号3-4的轻链的dna片段(序列号203)用mlui和noti消化，插入到pe-hygr载体的mlui-noti之间，分别构建人源化抗htfr抗体号3-2的轻链表达用载体pe-hygr(lc3-2)、人源化抗htfr抗体号3-3的轻链表达用载体pe-hygr(lc3-3)和人源化抗htfr抗体号3-4的轻链表达用载体pe-hygr(lc3-4)。
[0634]
进而，同样地对于抗htfr抗体号3的重链，将实施例10中合成的编码人源化抗htfr抗体号3的重链igg4的dna片段(序列号213)用mlui和noti消化，插入到pe-neo载体的mlui-noti之间，构建人源化抗htfr抗体号3的重链igg4表达用载体pe-neo(hc3-igg4)。
[0635]
〔实施例12〕人源化抗htfr抗体表达用细胞的构建
[0636]
利用下述方法，用genepulser(bio-rad公司)通过实施例11中构建的轻链表达用载体pe-hygr(lc1)和重链表达用载体pe-neo(hc1)转化cho细胞(cho-k1：由美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)获得)。细胞的转化为大体上按照以下方法进行。将5
×
105个cho-k1细胞接种到添加有cd opticho
tm
培养基(life technology inc.)的3.5cm培养盘中，在37℃、5％co2的条件下培养一晚。将培养基交换为opti-mem
tm i培养基(life technology inc.)，按照达到5
×
106细胞/ml的密度使细胞悬浮。取细胞悬浮液100μl，向其中添加用opti-mem
tm i培养基稀释成100μg/ml的pe-hygr(lc1)和pe-neo(hc1)质粒dna溶液各5μl。用genepulser(bio-rad公司)实施电穿孔，向细胞中导入质粒。将细胞在37℃、5％co2的条件下培养一晚后，用添加有0.5mg/ml的潮霉素和0.8mg/ml的g418的cd opticho
tm
培养基进行选择培养。
[0637]
然后，利用有限稀释法按照每1孔中接种1个以下细胞的方式在96孔板上接种通过选择培养所选出的细胞，按照使各细胞形成单克隆集落的方式培养约10天。采集形成了单克隆集落的孔的培养上清，通过elisa法考察培养上清中的人源化抗体含量，选择人源化抗体高表达细胞株。
[0638]
该时的elisa法大体上通过以下的方法实施。向96孔微量滴定板(nunc公司)的各孔中，添加将山羊抗人igg多克隆抗体溶液用0.05m碳酸氢盐缓冲液(ph9.6)稀释成4μg/ml的溶液各100μl，在室温下至少静置1小时，使抗体吸附于板。然后用在磷酸缓冲生理盐水(ph7.4)中添加有0.05％tween 20的溶液(pbs-t)将各孔洗涤3次后，将starting block(pbs)blocking buffer(thermo fisher scientific公司)向各孔中添加各200μl，将板在室温下静置30分钟。将各孔用pbs-t洗涤3次后，将用在pbs中添加有0.5％bsa和0.05％tween 20的溶液(pbs-bt)稀释成合适浓度的培养上清或人igg标准品向各孔中添加各100μl，将板在室温下至少静置1小时。将板用pbs-t洗涤3次后，将用pbs-bt稀释的hrp标记抗人igg多克隆抗体溶液向各孔中添加各100μl，将板在室温下至少静置1小时。用pbs-t将各孔洗涤3次后，将含有磷酸-柠檬酸缓冲液(ph 5.0)的0.4mg/ml邻苯二胺向各孔中添加各100μl，在室温下静置8～20分钟。然后，将1mol/l硫酸向各孔中添加各100μl，使反应停止，用96孔板酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度。将与显示高测定值的孔对应的细胞作为人源化抗htfr抗体号1的高表达细胞株。将其作为抗体号1表达株。
[0639]
同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pe-hygr(lc2)和重链表达用载体pe-neo(hc2)转化cho细胞，得到人源化抗htfr抗体号2的高表达细胞株。将其作为抗体号2表达株。
[0640]
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pe-hygr(lc3)和重链表达用载体pe-neo(hc3)转化cho细胞，得到人源化抗htfr抗体号3的高表达细胞株。将其作为抗体号3表达株。
[0641]
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pe-hygr(lc3-2)和重链表达用载体pe-neo(hc3)转化cho细胞，得到人源化抗htfr抗体号3-2的高表达细胞株。将其作为抗体号3-2表达株。
[0642]
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pe-hygr(lc3-3)和重链表达用载体pe-neo(hc3)转化cho细胞，得到人源化抗htfr抗体号3-3的高表达细胞株。将其作为抗体
号3-3表达株。
[0643]
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pe-hygr(lc3-4)和重链表达用载体pe-neo(hc3)转化cho细胞，得到人源化抗htfr抗体号3-4的高表达细胞株。将其作为抗体号3-4表达株。
[0644]
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pe-hygr(lc3)和重链表达用载体pe-neo(hc3-igg4)转化cho细胞，得到人源化抗htfr抗体号3(igg4)的高表达细胞株。将其作为抗体号3(igg4)表达株。
[0645]
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pe-hygr(lc3-2)和重链表达用载体pe-neo(hc3-igg4)转化cho细胞，得到人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)的高表达细胞株。将其作为抗体号3-2(igg4)表达株。
[0646]
〔实施例13〕人源化抗htfr抗体的纯化
[0647]
将实施例12中得到的抗体号1表达株、抗体号2表达株、抗体号3表达株、抗体号3-2表达株、抗体号3-3表达株和抗体号3-4表达株分别按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用cd opticho
tm
培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在含有5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养上清，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加含有150mm nacl的5倍体积的20mm tris缓冲液(ph8.0)，上样到预先用含有150mm nacl的为柱体积3倍体积的20mm tris缓冲液(ph8.0)平衡化的蛋白a柱(柱体积：1ml，bio-rad公司)中。然后用柱体积的5倍体积的同一缓冲液洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的人源化抗体，收集洗脱级分，向洗脱级分中添加1m tris缓冲液(ph8.0)进行中和，将其作为抗体的纯化品。
[0648]
在此，将从抗体号1表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗htfr抗体号1。将从抗体号2表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗htfr抗体号2。将从抗体号3表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗htfr抗体号3。将从抗体号3-2表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗htfr抗体号3-2。将从抗体号3-3表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗htfr抗体号3-3。此外，将从抗体号3-4表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗htfr抗体号3-4。
[0649]
此外，对于实施例12中得到的抗体号3(igg4)表达株和抗体号3-2(igg4)表达株，也与上述同样地进行培养，由其培养上清分别得到纯化的人源化抗htfr抗体号3(igg4)和人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)。这2种抗体用于记载于实施例15的使用猴的药物动力学分析。
[0650]
〔实施例14〕人源化抗htfr抗体与人tfr和猴tfr的亲和性的测定
[0651]
通过实施例7中记载的方法测定了实施例13中得到的人源化抗htfr抗体与人tfr和猴tfr的亲和性。表7中示出人源化抗htfr抗体号1～3-4(表中，分别对应于no.1～3-4)与人tfr的缔合速率常数(k
on
)和解离速率常数(k
off
)的测定结果和解离常数(kd)。
[0652]
表7人源化抗htfr抗体对人tfr的亲和性
[0653]
抗体号kon(m-1
s-1
)koff(s-1
)k0(m)13.93
×
105《1.0
×
10-7
＜1.0
×
10-12
21.97
×
105＜1.0
×
10-7
＜1.0
×
10-12
31.19
×
106＜1.0
×
10-7
＜1，0
×
10-12
3-26.06
×
1051.45
×
10-5
2.39
×
10-11
3-36.00
×
1051.26
×
10-5
2.00
×
10-11
3-41.01
×
106＜1.0
×
10-7
＜1.0
×
10-12
[0654]
表8中示出人源化抗htfr抗体号1～3-4(表中，分别对应于抗体号1～3-4)与猴tfr的缔合速率常数(k
on
)和解离速率常数(k
off
)的测定结果和解离常数(kd)。
[0655]
表8人源化抗htfr抗体对猴tfr的亲和性
[0656]
抗体号kon(m-1
s-1
)koff(s-1
)k0(m)12.53
×
105＜1.0
×
10-7
＜1.0
×
10-12
24.87
×
1053.67
×
10-5
7.55
×
10-11
36.03
×
1056.76
×
10-4
1.12
×
10-9
3-24.95
×
1058.76
×
10-4
1.77
×
10-9
3-34.88
×
1059.32
×
10-4
1.91
×
10-9
3-45.19
×
1051.35
×
10-4
2.60
×
10-10
[0657]
人源化抗htfr抗体号1～3-4与人tfr的亲和性的测定结果是，人源化抗htfr抗体号1、2、3和3-4抗体与人tfr的解离常数小于1
×
10-12
m(表7)。此外，人源化抗htfr抗体号3-2和3-3与人tfr的解离常数分别为2.39
×
10-11
m和2.09
×
10-11
m。另一方面，关于与这些抗体对应的人源化前的抗htfr抗体与人tfr的解离常数，抗体号1为5.09
×
10-12
m，抗体号2为1.12
×
10-11
m，抗体号3小于1
×
10-12
m(表4)。这些结果表明抗htfr抗体与人tfr的高亲和性在抗体人源化的前后得到维持，抗htfr抗体号4～14在进行抗体人源化后也可维持与人tfr的亲和性。
[0658]
然后观察人源化抗htfr抗体与猴tfr的亲和性的测定结果，人源化抗htfr抗体号1在抗体人源化前后解离常数均小于1
×
10-12
m，维持了亲和性，人源化抗htfr抗体号2的人源化前的解离常数为4.18
×
10-11
m，人源化后的解离常数为7.55
×
10-11
m，也维持了亲和性(表5、表8)。另一方面，就人源化抗htfr抗体号3～3-4而言，与人源化前的这些抗体对应的抗htfr抗体号3与猴tfr的解离常数小于1
×
10-12
m，但人源化后为2.60
×
10-10
m～1.91
×
10-9
m，观察到与猴tfr的亲和性降低。虽然对于人源化抗htfr抗体号3观察到与猴tfr的亲和性降低，但这些结果表明抗htfr抗体与猴tfr的高亲和性在抗体人源化前后并非丧失、而是大体上得到维持，抗htfr抗体号4～14在进行抗体人源化后也可维持与猴tfr的亲和性。
[0659]
〔实施例15〕人源化抗htfr抗体的使用猴的药物动力学分析
[0660]
使用人源化抗htfr抗体号3、人源化抗htfr抗体号3-2、人源化抗htfr抗体号3(igg4)和人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)这4种抗体，进行使用猴的药物动力学分析。需要说明的是，人源化抗htfr抗体号3的重链为igg1，人源化抗htfr抗体号3(igg4)是将人源化抗htfr抗体号3的重链在可变区保持原样的状态下变更为igg4的抗体。此外，人源化抗htfr抗体号3-2的重链为igg1，人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)是将人源化抗htfr抗体号3-2的重链在可变区保持原样的状态下变更为igg4的抗体。将这4种抗体分别以5.0mg/kg的用量分别对雄性食蟹猴进行单次静脉内给药，在给药前、给药后2分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时后采集外周血，采血后实施全身灌注。此外，作为阴性对照，将针对her2蛋白的作为人源化抗体的曲妥珠单抗(herceptin
tm
，中外制药)同样地给药于一只个体，在给药前、给药后
2分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时后采集外周血，采血后实施全身灌注。灌注后，摘出包括延髓在内的脑组织、脊髓组织及其它组织(包括肝脏、心脏、脾脏和骨髓)。使用该脑组织、脊髓组织及其它组织进行以下的人源化抗htfr抗体的浓度测定和免疫组织化学染色。
[0661]
组织中和外周血中的人源化抗htfr抗体的浓度测定大体上按照以下步骤进行。需要说明的是，对于脑，将所采集的组织分成大脑皮层、小脑、海马和延髓后，进行人源化抗htfr抗体的浓度测定。将所采集的组织分别用含有蛋白酶抑制剂混合物(sigma-aldrich公司)的ripa缓冲液(和光纯药工业株式会社)制成匀浆液，离心回收上清。对于外周血，分离出血清。将亲和纯化山羊抗小鼠igg fcγ pab(jackson immunoresearch公司)向高结合板(meso scale diagnostics公司)的各孔中添加各10μl，静置1小时而固相化。然后向各孔中添加superblock blocking buffer in pbs(thermo fisher scientific公司)各150μl，振荡1小时，将板封闭。然后向各孔中添加匀浆液的上清或血清各25μl，振荡1小时。然后向各孔中添加亲和纯化山羊抗小鼠igg fab-生物素(jackson immunoresearch公司)各25μl，振荡1小时。然后向各孔中添加sulfo-tag-streptavidin(meso scale diagnostics公司)各25μl，振荡0.5小时。向各孔中添加read buffer t(meso scale diagnostics公司)各150μl，用sector
tm imager 6000 reader测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的抗htfr抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被检体的测定值内插到标准曲线中，从而计算出各组织中和外周血中所含的抗体的量。浓度的测定对各样品重复进行3次。
[0662]
将脑组织和脊髓组织中的人源化抗htfr抗体的浓度测定的结果示于表9。
[0663]
表9脑组织中的人源化抗htfr抗体的浓度(μg/g湿重)
[0664]
抗体号大脑皮层小脑海马延髓脊髓30.67
±
0.120.61
±
0.020.49
±
0.020.5g
±
0.100.46
±
0.173-21.05
±
0.070.72
±
0.040.72
±
0.070.69
±
0.0a0.46
±
0.023(igg4)0.65
±
0.050.59
±
0.030.56
±
0.020.59
±
0.020.46
±
0.073-2(igg4)0.76
±
0.020.57
±
0.07062
±
0.050.73
±
0.160.48
±
0.03阴性对照0.0082
±
0.00320.0090
±
0.00670.0053
±
0.00090.011
±
0.0030.15
±
0.04
[0665]
人源化抗htfr抗体号3、人源化抗htfr抗体号3-2、人源化抗htfr抗体号3(igg4)和人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)的抗体均确认到在大脑皮层、小脑、海马、延髓和脊髓中的累积(表9)。关于其量，人源化抗htfr抗体号3与阴性对照的曲妥珠单抗(herceptin
tm
)相比，大脑皮层中为约82倍，小脑中为约68倍，海马中为约92倍，延髓中为约54倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗htfr抗体号3-2与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮层中为约128倍，小脑中为约80倍，海马中为约136倍，延髓中为约63倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗htfr抗体号3(igg4)与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮层中为约79倍，小脑中为约66倍，海马中为约106倍，延髓中为约54倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮层中为约93倍，小脑中为约63倍，海马中为约117倍，延髓中为约66倍，脊髓中为约3.2倍(表10)。这些结果表明：这4种人源化抗htfr抗体具有通过血脑屏障、在脑组织中累积的性质，通过使应在脑组织内发挥作用的药剂与这些抗体结合、从而可以使该药剂
[0666]
高效地在脑组织中累积。
[0667]
表10脑组织中的人源化抗htfr抗体的累积量(与阴性对照相比的累积量的倍率)
[0668]
抗体号大脑皮层小脑海马延髓脊髓3826892543.13-212880136633.13(igg4)7966106543.13-2(igg4)9363117663.2阴性对照11111
[0669]
然后，将肝脏、心脏、脾脏和骨髓各组织中的人源化抗htfr抗体的浓度测定的结果示于图4。在肝脏和脾脏中，4种人源化抗htfr抗体和阴性对照曲妥珠单抗均确认到累积，关于其量，人源化抗htfr抗体与曲妥珠单抗同等。心脏中，有人源化抗htfr抗体与阴性对照曲妥珠单抗相比累积量更多的倾向，关于其量，止于阴性对照的1.5倍～2.8倍左右。骨髓中，有人源化抗htfr抗体与阴性对照曲妥珠单抗相比累积量显著多的倾向，关于其量，为阴性对照的3.5～16倍。关于人源化抗htfr抗体向骨髓中的累积，可认为原因在于，在作为造血器官的骨髓中，tfr的表达量多，通过与tfr结合，与阴性对照相比更多的人源化抗htfr抗体累积下来。这些数据表明：这4种人源化抗htfr抗体具有在作为中枢神经系统的大脑、小脑、海马和延髓中特异性累积的性质，表明通过使应在脑组织内发挥作用的药剂与这些抗体结合，可以使该药剂高效地在脑组织中累积。
[0670]
然后，将人源化抗htfr抗体的血药动力学的测定结果示于表11。4种人源化抗htfr抗体与阴性对照曲妥珠单抗同样地在给药后8小时时显示血药浓度为60μg/ml以上的高值，表明在血中是稳定的。
[0671]
表11人源化抗htfr抗体的血药动力学(μg/ml血液)
[0672][0673]
脑组织中的人源化抗htfr抗体的免疫组织化学染色大体上按照以下步骤进行。用tissue tek cryo 3dm(sakura finetek株式会社)，将采集的组织快速冷冻到-80℃，将冷冻块薄切成4μm后，贴合于mas涂层载玻片(松浪硝子株式会社)。使组织薄片与4％多聚甲醛(和光纯药工业株式会社)在4℃下反应5分钟，将组织薄片固定在载玻片上。然后，使组织薄片与含有0.3％双氧水的甲醇溶液(和光纯药工业株式会社)反应30分钟，使内源性过氧化物酶失活。然后使载玻片与superblock blocking buffer in pbs在室温下反应30分钟，进行封闭。然后使组织薄片与小鼠igg-重链和轻链抗体(bethyl laboratories)在室温下反应1小时。将组织薄片用dab底物(3,3
’‑
二氨基联苯胺，vector laboratories公司)显色，用mayer’s苏木精(merck公司)进行对比染色，脱水，透明后密封，用光学显微镜观察。
[0674]
图5示出大脑皮层的人源化抗htfr抗体的免疫组织化学染色的结果。给药人源化抗htfr抗体号3、人源化抗htfr抗体号3-2、人源化抗htfr抗体号3(igg4)和人源化抗htfr抗体号3-2(igg4)的猴的大脑皮层中，确认到血管和神经元样细胞的特异性染色(分别如图5b～e)。特别是给药人源化抗htfr抗体号3-2的猴的大脑皮层(图5c)中，在脑血管外的脑实质
ser)结合有具有序列号246所示的氨基酸序列的hi2s的蛋白质的基因。该dna片段编码具有序列号247所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链上通过接头序列(gly ser)结合有hi2s的蛋白质。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-i2s-1)。
[0683]
人工合成具有序列号250所示的碱基序列的dna片段，所述dna片段含有编码在具有序列号188所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列(gly ser)结合有具有序列号246所示的氨基酸序列的hi2s的蛋白质的基因。该dna片段编码具有序列号249所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链上通过接头序列(gly ser)结合有hi2s的蛋白质。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-i2s-2)。
[0684]
人工合成具有序列号252所示的碱基序列的dna片段，所述dna片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列(gly ser)结合有具有序列号246所示的氨基酸序列的hi2s的蛋白质的基因。该dna片段编码具有序列号251所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链上通过接头序列(gly ser)结合有hi2s的蛋白质。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-i2s-3)。
[0685]
利用实施例12中记载方法用pe-neo(hc-i2s-1)和实施例11中构建的pe-hygr(lc1)转化cho细胞(cho-k1：由美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)获得)，得到表达hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hi2s-抗htfr抗体表达株1。将该细胞株表达的hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为i2s-抗htfr抗体1。
[0686]
同样将cho细胞用pe-neo(hc-i2s-2)和实施例11中构建的pe-hygr(lc2)转化，得到表达hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hi2s-抗htfr抗体表达株2。该细胞株表达的hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为i2s-抗htfr抗体2。
[0687]
进而，同样将cho细胞用pe-neo(hc-i2s-3)和实施例11中构建的pe-hygr(lc3)转化，得到表达hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hi2s-抗htfr抗体表达株3。该细胞株表达的hi2s与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为i2s-抗htfr抗体3。
[0688]
〔实施例17〕i2s-抗htfr抗体的制造
[0689]
通过以下方法制造i2s-抗htfr抗体。将实施例16中得到的hi2s-抗htfr抗体表达株1、2和3分别按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用cd opticho
tm
培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在包含5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养上清，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加柱体积的5倍体积的含有150ml nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)，上样到用柱体积的3倍体积的含有150mm nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)预先平衡化的蛋白a柱(柱体积：1ml，bio-rad公司)中。然后供给柱体积
的5倍体积的同一缓冲液而洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的i2s-抗htfr抗体。添加1m tris缓冲液(ph8.0)而将含有该i2s-抗htfr抗体的洗脱液的ph调整为7.0，然后用amicon ultra 30kda膜(millipore公司)将缓冲液交换成pbs。将其作为i2s-抗htfr抗体的纯化品。
[0690]
如此而制造的i2s-抗htfr抗体对人tfr和猴tfr的亲和性例如可以利用实施例7中记载的方法进行测定。此外，静脉内给药时的i2s-抗htfr抗体的药物动力学分析例如可以利用实施例8中记载的方法进行测定。此外，i2s-抗htfr抗体的药效例如可以如下评价：使实施例7-2中记载的htfr-ki小鼠与作为hunter综合症的模型小鼠的艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶基因敲除小鼠(i2s-ko小鼠)交配，对得到的i2s-ko/htfr ki小鼠静脉注射i2s-抗htfr抗体，测定脑内累积的糖胺聚糖的减少量，从而进行评价。
[0691]
〔实施例18〕i2s-抗htfr抗体的脑迁移评价1
[0692]
将实施例17中制造的i2s-抗htfr抗体3的纯化品以1mg/kg的用量对通过实施例7-2中记载的方法制作的htfr-ki小鼠进行静脉注射(i2s-抗htfr抗体给药组)。作为对照，将重组hi2s(rhi2s)以1mg/kg的用量对htfr-ki小鼠进行静脉注射(对照组)。i2s-抗htfr抗体给药组对15只、对照组对3只htfr-ki小鼠(雄性，15～18周龄)进行给药。这里使用的rhi2s基于作为公知方法的国际专利公报(wo2012/102998)中记载的方法来制造。需要说明的是，作为rhi2s，还可以使用作为医疗用药品销售的elaprase(注册商标)。
[0693]
关于i2s-抗htfr抗体给药组，在i2s-抗htfr抗体3给药后15分钟后、1小时后、4小时后、8小时后和24小时后分别用生理盐水对3只小鼠进行全身灌注处理，采集脑(大脑和小脑)。关于对照组，在rhi2s给药1小时后用生理盐水进行全身灌注处理，然后采集脑(大脑和小脑)。测定所摘出的大脑和小脑的重量(湿重)后，将大脑和小脑用含有蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司)的t-per(thermo fisher scientific公司)制成匀浆液，回收离心后的上清。分别通过实施例20和实施例21中记载的ecl法测定i2s-抗htfr抗体给药组的匀浆液上清中所含的i2s-抗htfr抗体的量、对照组的匀浆液上清中所含的rhi2s的量，计算出每克脑重量(g湿重)中所含的i2s-抗htfr抗体的量(脑组织中的i2s-抗htfr抗体的浓度)和rhi2s的量(脑组织中的rhi2s的浓度)。将其结果示于表12。
[0694]
给药1小时后的脑组织中的i2s-抗htfr抗体和rhi2s的浓度分别为0.368
±
0.019μg/g湿重和0.00134
±
0.00232μg/g湿重，i2s-抗htfr抗体的浓度达到rhi2s的浓度的约270倍。该结果表明：通过使通常几乎不通过血脑屏障而不会迁移到脑组织中的rhi2s与抗htfr抗体结合，从而能够通过血脑屏障而迁移到脑组织中。此外，i2s-抗htfr抗体在脑组织中的浓度在给药后仅15分钟时达到0.263
±
0.038μg/g湿重，达到给药1小时后的rhi2s在脑组织中的浓度的约200倍。该结果表明：通过与抗htfr抗体结合，从而能够使hi2s迅速迁移到脑组织中。
[0695]
表12脑组织中的12s-抗htfr抗体和rhi2s的浓度(μg/g湿重d
fisher scientific公司)静置1小时，对板进行封闭。将作为生物素标记抗体的anti-human kappa light chain goat igg biotin(monkey absorbed)(ibl公司)用superblock blocking buffer in pbs稀释成0.5μg/ml的浓度。将sulfo标记抗人i2s抗体用superblock blocking buffer in pbs稀释成1.0μg/ml的浓度。将生物素标记抗体和sulfo标记抗体的稀释溶液各25μl与25μl的各被检体混合，孵育1小时，将其作为抗体反应试样。
[0702]
将封闭后的板的各孔用200μl的pbs-t(西格玛公司)洗涤后，向各孔中添加抗体反应试样各25μl，孵育1小时。孵育后，将板的各孔用200μl的pbs-t洗涤，然后添加read buffer t(meso scale diagnostics公司)，用sector
tm imager 6000(meso scale diagnostics公司)检测来自各孔的发光量。利用浓度已知的i2s-抗htfr抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各试样的测定值内插到标准曲线中，由此对i2s-抗htfr抗体进行定量。
[0703]
需要说明的是，这里使用的抗人i2s抗体是将基于作为公知方法的国际专利公报(wo2012/102998)中记载的方法制造的rhi2s作为抗原并免疫小鼠而得到的单克隆抗体。得到多个单克隆抗体。作为sulfo标记抗人i2s抗体，使用将抗人i2s抗体用msd sulfo-tag nhs-ester(meso scale diagnostics公司)按照附带的操作手册进行sulfo标记而制作的抗体。
[0704]
〔实施例21〕利用ecl法的hi2s的定量
[0705]
向作为被链霉亲和素包被的板的streptavidin gold plate 96well(meso scale diagnostics公司)的各孔中添加150μl的superblock blocking buffer in pbs(thermo fisher scientific公司)，静置1小时，对板进行封闭。将生物素标记抗人i2s抗体用superblock blocking buffer in pbs稀释成0.5μg/ml的浓度。将sulfo标记抗人i2s抗体用superblock blocking buffer in pbs稀释成1.0μg/ml的浓度。将生物素标记抗体和sulfo标记抗体的稀释溶液各25μl与25μl的被检体混合，孵育1小时，将其作为抗体反应试样。
[0706]
将封闭后的板的各孔用200μl的pbs-t(西格玛公司)洗涤后，向各孔中添加抗体反应试样各25μl，孵育1小时。孵育后，将板的各孔用200μl的pbs-t洗涤，然后添加read buffer t(meso scale diagnostics公司)，用sector
tm imager 6000(meso scale diagnostics公司)测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的hi2s的标准试样的测定值制作标准曲线，将各试样的测定值内插到标准曲线中，从而对rhi2s进行定量。
[0707]
需要说明的是，这里使用的抗人i2s抗体是将基于作为公知方法的国际专利公报(wo2012/102998)中记载的方法制造的rhi2s作为抗原并免疫小鼠而得到的单克隆抗体。作为sulfo标记抗人i2s抗体，使用将抗人i2s抗体用msd sulfo-tag nhs-ester(meso scale diagnostics公司)按照附带的操作手册进行sulfo标记而制作的抗体。此外，作为生物素标记抗人i2s抗体，使用将不同于sulfo标记中所用的其他抗人i2s抗体用biotin labelling kit-nh2(同仁化学研究所)按照附带的操作手册进行生物素标记而制作的抗体。
[0708]
〔实施例22〕i2s-抗htfr抗体的药效评价
[0709]
通过测定已知会在遗传性缺失hi2s活性的hunter综合症患者的脏器中累积的糖胺聚糖(gag)的浓度，来评价i2s-抗htfr抗体的药效。将实施例17中制造的i2s-抗htfr抗体3的纯化品以0.5mg/kg、1.0mg/kg和2.0mg/kg的用量对i2s-ko/htfr-ki小鼠进行静脉注射
(0.5mg/kg给药组，1.0mg/kg给药组和2.0mg/kg给药组)。给药以每周1次的频率进行4周，在初次的给药起的第4周，将小鼠在麻醉下放血而进行安乐死，摘出脑、肝脏、肺和心脏。将摘出的各脏器用冷冻干燥机(eyela公司)冷冻干燥并破碎后，测定干重。对各脏器的干燥品添加相对于干重100mg为1ml的0.5m tris缓冲液(ph7.5)，在约100℃下加热10分钟。然后按照相对于干重50mg为1mg的肌动蛋白酶e添加量来添加50mg/ml的肌动蛋白酶e溶液(科研制药公司)，在约60℃下孵育16小时而将蛋白质分解后，以约100℃加热10分钟。以15,000rpm实施10分钟的离心分离，回收上清。用wieslab
tm sgag quantitative kit(euro-diagnostica公司)测定上清中所含的gag的量，计算出各脏器的每克重量(g干重)中所含的gag的量。需要说明的是，设置未给药i2s-抗htfr抗体的i2s-ko/htfr-ki小鼠作为对照组。此外，同时测定野生型小鼠的各脏器中的gag的浓度。此外，对于各测定组各使用3只i2s-ko/htfr-ki小鼠(雄雌，19-25周龄)来进行该实验。此外，对于野生型小鼠，使用雄雌、19-25周龄的小鼠3只。
[0710]
将其结果示于图10。在脑、肝脏、肺和心脏中均观察到gag的浓度依赖于给药的i2s-抗htfr抗体的用量而显著降低(图10的a～d)。
[0711]
对于脑进行观察，对照组的脑组织中的gag的浓度为约2.66μg/g，在0.5mg/kg、1.0mg/kg和2.0mg/kg给药组中，脑组织中的gag的浓度分别为约2.23μg/g、约2.15μg/g、约2.10μgg，用量依赖性地降低(图10的a)。i2s-ko/htfr-ki小鼠的脑组织内的异常的gag量可以设为从对照组的脑组织中的gag的浓度(约2.66μg/g)中减去野生型小鼠的脑组织中的gag的浓度(约1.76μg/g)而得的约0.90μg/g。因此可以说，通过将i2s-抗htfr抗体以0.5mg/kg、1.0mg/kg和2.0mg/kg的用量进行给药，在i2s-ko/htfr-ki小鼠的脑组织中异常累积的gag的分别约48％、约57％和约62％被i2s-抗htfr抗体分解。该结果表明：通过对hunter综合症患者给药i2s-抗htfr抗体，从而可以将患者的脑组织中异常累积的gag分解、除去，表明i2s-抗htfr抗体(特别是，i2s-抗htfr抗体3)可以发挥如下效果：可预测和治疗原因在于gag或其片段的累积等的hunter综合症患者中可见的脑病变。
[0712]
对肝脏进行观察，对照组的肝脏组织中的gag的浓度为约10.3μg/g，在0.5mg/kg、1.0mg/kg和2.0mg/kg给药组中，肝脏组织中的gag的浓度分别为约2.2μg/g、约2.0μg/g、约1.9μg/g，用量依赖性地降低(图10的b)。i2s-ko/htfr-ki小鼠的肝脏组织内的异常的gag量可以设为从对照组的肝脏组织中的gag的浓度(约10.3μg/g)中减去野生型小鼠的肝脏组织中的gag的浓度(约0.3μg/g)而得的约10μg/g。因此可以说，通过将i2s-抗htfr抗体以0.5～2.0mg/kg的用量进行给药，在i2s-ko/htfr-ki小鼠的肝脏组织中异常累积的gag的80％以上被i2s-抗htfr抗体分解。
[0713]
对肺进行观察，对照组的肺组织中的gag的浓度为约10.5μg/g，在0.5mg/kg，1.0mg/kg和2.0mg/kg给药组中，肺组织中的gag的浓度分别为约7.8μg/g、约6.7μg/g、约5.7μg/g，用量依赖性地降低(图10c)。i2s-ko/htfr-ki小鼠的肺组织内的异常的gag量可以设为从对照组的肺组织中的gag的浓度(约10.5μg/g)中减去野生型小鼠的肺组织中的gag的浓度(约1.5μg/g)而得的约9.0μg/g。因此可以说，通过将i2s-抗htfr抗体以0.5mg/kg、1.0mg/kg和2.0mg/kg的用量进行给药，在i2s-ko/htfr-ki小鼠的肺组织中异常累积的gag的分别约30％、约42％和约53％被i2s-抗htfr抗体分解。
[0714]
对心脏进行观察，对照组的心脏组织中的gag的浓度为约4.6μg/g，在0.5mg/kg，
1.0mg/kg和2.0mg/kg给药组中，心脏组织中的gag的浓度分别为约2.2μg/g、约2.0μg/g、约1.5μg/g，用量依赖性降低(图10的d)。i2s-ko/htfr-ki小鼠的心脏组织中的异常的gag量可以设为从对照组的心脏组织中的gag的浓度(约4.6μg/g)减去野生型小鼠的心脏组织中的gag的浓度(约0.8μg/g)而得的约3.8μg/g。因此可以说，通过将i2s-抗htfr抗体以0.5mg/kg、1.0mg/kg和2.0mg/kg的用量进行给药，在i2s-ko/htfr-ki小鼠的心脏组织中异常累积的gag的分别约63％、约70％和约81％被i2s-抗htfr抗体分解。
[0715]
上述关于肝脏、肺和心脏的结果表明：i2s-抗htfr抗体除了将脑组织内的gag分解以外，还将其它脏器、器官中累积的gag分解。即表明：在将i2s-抗htfr抗体(特别是，i2s-抗htfr抗体3)作为hunter症患者的酶补充疗法的药剂来给药时，可以对患者的包括脑在内的全身的脏器、器官补充酶。表明i2s-抗htfr抗体通过静脉内给药可以对包括脑在内的全身的脏器、器官补充酶。
[0716]
〔实施例23〕gag的测定法
[0717]
gag的测定使用wieslab
tm sgag quantitative kit(euro-diagnostica公司)按照附带的操作手册大体上按照以下方法来实施。将被检体、或标准液(空白为水)各50μl分别取至1.5ml管中。将guhcl溶液向各管中加入各50μl，在室温下反应15分钟。将sat溶液向各管中各加入50μl，在室温下反应15分钟。制备水：sat溶液：阿辛蓝储备液＝9：5：1的混合液，将制备的混合液向各管中各加入750μl，在室温下反应15分钟。将该反应液以12500g离心15分钟，除去上清。将dmso在各管中各加入500μl，在室温下振荡15分钟而混和后，以12500g离心分离15分钟并除去上清。将gu-prop溶液向各管中各加入500μl，在室温下振荡15分钟而混和。将该混和后的溶液向96孔板的各孔中各分注200μl，用酶标仪测定各孔在600nm处的吸光度。根据已知浓度的gag溶液的测定值制作标准曲线，将各试样的测定值内插到标准曲线中，从而对gag浓度进行定量。
[0718]
〔实施例24〕人源化抗htfr抗体与各种生理活性肽的融合蛋白的制造
[0719]
截至以上的实施例22为止的实验表明：与人源化抗htfr抗体结合的人i2s通过血脑屏障到达脑组织中，在脑内发挥i2s活性。在此制作人源化抗htfr抗体与各种生理活性肽的融合蛋白，研究这些融合蛋白是否可通过bbb到达脑组织内。在此，作为生理活性肽，选择人促红细胞生成素、人芳基硫酸酯酶a、人ppt-1、人tpp-1、人α-l-艾杜糖醛酸酶、人tnfα受体和人乙酰肝素n-硫酸酯酶(n-sulphoglucosamine sulphohydrolase)作为与人源化抗htfr抗体结合的生理活性肽。用于表达人源化抗htfr抗体与各个生理活性肽的融合蛋白的表达载体和这些融合蛋白按照以下的实施例25～31中记载的方法制备。
[0720]
〔实施例25〕人源化抗htfr抗体与人促红细胞生成素的融合蛋白的制造法
[0721]
人工合成具有序列号258所示的碱基序列的dna片段，所述dna片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有具有序列号256所示的氨基酸序列的人促红细胞生成素(hepo)的蛋白质的cdna。该dna片段编码具有序列号257所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有hepo的蛋白质。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-hepo)。
[0722]
利用实施例12中记载的方法用pe-neo(hc-hepo)和实施例11中构建的pe-hygr
(lc3)转化cho细胞，得到表达hepo与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hepo-抗htfr抗体表达株。将该细胞株表达的hepo与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为epo-抗htfr抗体。
[0723]
将hepo-抗htfr抗体表达株按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用cd opticho
tm
培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在包含5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养液，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加柱体积的5倍体积的含有150ml nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)，上样到用柱体积的3倍体积的含有150mm nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)预先平衡化的蛋白a柱(柱体积1ml：bio-rad公司)中。然后供给柱体积的5倍体积的同一缓冲液而洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的epo-抗htfr。对于含有该epo-抗htfr抗体的洗脱液的ph，添加1mtris缓冲液(ph8.0)而将ph调整为7.0，然后用amicon ultra 30kda膜(millipore公司)将缓冲液交换为pbs。将其作为epo-抗htfr抗体的纯化品。
[0724]
〔实施例26〕人源化抗htfr抗体与人芳基硫酸酯酶a的融合蛋白的制造法
[0725]
人工合成具有序列号261所示的碱基序列的dna片段，所述dna片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有具有序列号259所示的氨基酸序列的人芳基硫酸酯酶a(harsa)的蛋白质的cdna。该dna片段编码具有序列号260所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有harsa的蛋白质。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-harsa)。
[0726]
利用实施例12中记载的方法用pe-neo(hc-harsa)和实施例11中构建的pe-hygr(lc3)转化cho细胞，得到表达harsa与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为harsa-抗htfr抗体表达株。将该细胞株表达的harsa与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为arsa-抗htfr抗体。
[0727]
将harsa-抗htfr抗体表达株按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用cd opticho
tm
培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在包含5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养液，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加柱体积的5倍体积的含有150ml nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)，上样到用柱体积的3倍体积的含有150mm nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)预先平衡化的蛋白a柱(柱体积1ml：bio-rad公司)中。然后供给柱体积的5倍体积的同一缓冲液而洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的arsa-抗htfr。对于含有该arsa-抗htfr抗体的洗脱液的ph，添加1m tris缓冲液(ph8.0)而将ph调整为7.0，然后用amicon ultra 30kda膜(millipore公司)缓冲液交换为pbs。将其作为arsa-抗htfr抗体的纯化品。
[0728]
〔实施例27〕人源化抗htfr抗体与人ppt-1的融合蛋白的制造法
[0729]
人工合成具有序列号264所示的碱基序列的dna片段，所述dna片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有具有序列号262所示的氨基酸序列的人ppt-1(hppt-1)的蛋白质的cdna。该dna片
段编码具有序列号263所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有hppt-1的蛋白质。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-hppt-1)。
[0730]
利用实施例12中记载的方法用pe-neo(hc-hppt-1)和实施例11中构建的pe-hygr(lc3)转化cho细胞，得到表达hppt-1与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hppt-1-抗htfr抗体表达株。将该细胞株表达的hppt-1与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为ppt-1-抗htfr抗体。
[0731]
将hppt-1-抗htfr抗体表达株按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用cd opticho
tm
培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在包含5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养上清，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加柱体积的5倍体积的含有150ml nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)，上样到用柱体积的3倍体积的含有150mm nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)预先平衡化的蛋白a柱(柱体积1ml：bio-rad公司)中。然后供给柱体积的5倍体积的同一缓冲液而洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的ppt-1-抗htfr。对于含有该ppt-1-抗htfr抗体的洗脱液的ph，添加1m tris缓冲液(ph8.0)而将ph调整为7.0，然后用amicon ultra 30kda膜(millipore公司)将缓冲液交换为pbs。将其作为ppt-1-抗htfr抗体的纯化品。
[0732]
〔实施例28〕人源化抗htfr抗体与人tpp-1的融合蛋白的制造法
[0733]
人工合成具有序列号267所示的碱基序列的dna片段，所述dna片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有具有序列号265所示的氨基酸序列的人tpp-1(htpp-1)的蛋白质的cdna。该dna片段编码具有序列号266所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有htpp-1的融合蛋白。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-htpp-1)。
[0734]
利用实施例12中记载的方法用pe-neo(hc-htpp-1)和实施例11中构建的pe-hygr(lc3)转化cho细胞，得到表达htpp-1与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为htpp-1-抗htfr抗体表达株。将该细胞株表达的htpp-1与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为tpp-1-抗htfr抗体。
[0735]
将htpp-1-抗htfr抗体表达株按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用cd opticho
tm
培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在包含5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养液，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加柱体积的5倍体积的含有150ml nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)，上样到用柱体积的3倍体积的含有150mm nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)预先平衡化的蛋白a柱(柱体积1ml：bio-rad公司)中。然后供给柱体积的5倍体积的同一缓冲液而洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的tpp-1-抗htfr。对于含有该tpp-1-抗
htfr抗体的洗脱液的ph，添加1m tris缓冲液(ph8.0)而将ph调整为7.0，然后用amicon ultra 30kda膜(millipore公司)将缓冲液交换为pbs。将其作为tpp-1-抗htfr抗体的纯化品。
[0736]
〔实施例29〕人源化抗htfr抗体与人α-l-艾杜糖醛酸酶的融合蛋白的制造法
[0737]
人工合成具有序列号270所示的碱基序列的dna片段，所述dna片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有具有序列号268所示的氨基酸序列的人α-l-艾杜糖醛酸酶(hidua)的蛋白质的cdna。该dna片段编码具有序列号269所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有hidua的融合蛋白。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-hidua)。
[0738]
利用实施例12中记载的方法用pe-neo(hc-hidua)和实施例11中构建的pe-hygr(lc3)转化cho细胞，得到表达hidua与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hidua-抗htfr抗体表达株。将该细胞株表达的hidua与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为idua-抗htfr抗体。
[0739]
将hidua-抗htfr抗体表达株按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用cd opticho
tm
培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在包含5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养液，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加柱体积的5倍体积的含有150ml nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)，上样到用柱体积的3倍体积的含有150mm nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)预先平衡化的蛋白a柱(柱体积1ml：bio-rad公司)中。然后供给柱体积的5倍体积的同一缓冲液而洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的idua-抗htfr。对于含有该idua-抗htfr抗体的洗脱液的ph，添加1m tris缓冲液(ph8.0)而将ph调整为7.0，然后用amicon ultra 30kda膜(millipore公司)将缓冲液交换为pbs。将其作为idua-抗htfr抗体的纯化品。
[0740]
〔实施例30〕人源化抗htfr抗体与人tnfα受体的融合蛋白的制造法
[0741]
人工合成具有序列号273所示的碱基序列的dna片段，所述dna片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有具有序列号271所示的氨基酸序列的人tnfα受体(htnfαr)的蛋白质的cdna。该dna片段编码具有序列号272所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有htnfαr的蛋白质。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-htnfαr)。
[0742]
利用实施例12中记载的方法用pe-neo(hc-htnfαr)和实施例11中构建的pe-hygr(lc3)转化cho细胞，得到表达htnfαr与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为htnfαr-抗htfr抗体表达株。将该细胞株表达的htnfαr与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为tnfαr-抗htfr抗体。
[0743]
将htnfαr-抗htfr抗体表达株按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用cd opticho
tm
培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在包含5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养液，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加柱体积的5倍体积的含有150ml nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)，上样到用柱体积的3倍体积的含有150mm nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)预先平衡化的蛋白a柱(柱体积1ml：bio-rad公司)中。然后供给柱体积的5倍体积的同一缓冲液而洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的htnfαr-抗htfr。对于含有该tnfαr-抗htfr抗体的洗脱液的ph，添加1m tris缓冲液(ph8.0)而将ph调整为7.0，然后用amicon ultra30kda膜(millipore公司)将缓冲液交换为pbs。将其作为tnfαr-抗htfr抗体的纯化品。
[0744]
〔实施例31〕人源化抗htfr抗体与人乙酰肝素n-硫酸酯酶的融合蛋白的制造法
[0745]
人工合成具有序列号276所示的碱基序列的dna片段，所述dna片段含有编码在具有序列号210所示的氨基酸序列的人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有具有序列号274所示的氨基酸序列的人乙酰肝素n-硫酸酯酶(hsgsh)的蛋白质的cdna。该dna片段编码具有序列号275所示的氨基酸序列的在人源化抗htfr抗体的重链的c末端侧通过接头序列gly-ser结合有hsgsh的融合蛋白。此外，该dna片段在5’侧从5’端起依次具有mlui序列和编码作为分泌信号发挥作用的前导肽的序列，3’侧具有noti序列。将该dna片段用mlui和noti消化，并整合到pe-neo载体的mlui和noti之间，构建pe-neo(hc-hsgsh)。
[0746]
利用实施例12中记载的方法用pe-neo(hc-hsgsh)和实施例11中构建的pe-hygr(lc3)转化cho细胞，得到表达hsgsh与人源化抗htfr抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株作为hsgsh-抗htfr抗体表达株。将该细胞株表达的hsgsh与人源化抗htfr抗体的融合蛋白作为sgsh-抗htfr抗体。
[0747]
将hsgsh-抗htfr抗体表达株按照细胞浓度达到约2
×
105个/ml的方式用cd opticho
tm
培养基稀释，向1l的三角烧瓶中加入200ml的细胞悬浮液，在37℃下在包含5％co2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养液，用0.22μm过滤器(millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加柱体积的5倍体积的含有150ml nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)，上样到用柱体积的3倍体积的含有150mm nacl的20mm tris缓冲液(ph8.0)预先平衡化的蛋白a柱(柱体积1ml：bio-rad公司)中。然后供给柱体积的5倍体积的同一缓冲液而洗涤柱后，用含有150mm nacl的柱体积的4倍体积的50mm甘氨酸缓冲液(ph2.8)洗脱所吸附的sgsh-抗htfr。对于含有该sgsh-抗htfr的洗脱液的ph，添加1m tris缓冲液(ph8.0)而将ph调整为7.0，然后用amicon ultra 30kda膜(millipore公司)将缓冲液交换为pbs进行。将其作为sgsh-抗htfr抗体的纯化品。
[0748]
〔实施例32〕人源化抗htfr抗体与各种生理活性肽的融合蛋白的脑迁移评价
[0749]
将实施例25～实施例31中得到的epo-抗htfr抗体、arsa-抗htfr抗体、ppt-1-抗htfr抗体、tpp-1-抗htfr抗体、idua-抗htfr抗体、tnfαr-抗htfr抗体和sgsh-抗htfr抗体的纯化品分别以3mg/kg的用量对htfr-ki小鼠进行单次静脉内给药。此外，作为对照，将人免疫球蛋白制剂(人免疫球蛋白球蛋白肌注
“ベネシス”
，田边三菱制药株式会社)以3mg/kg的
用量对htfr-ki小鼠(17-28周龄)进行单次静脉注射。关于各融合蛋白和对照的给药，各使用1只htfr-ki小鼠(雄雌，17-28周龄)。
[0750]
从静脉注射给药起8小时后，用生理盐水实施全身灌注，灌注后摘出各小鼠的脑组织。然后将摘出的脑组织用含有蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司)的t-per(thermo fisher scientific公司)制成匀浆液，回收离心后的上清。通过以下所述的方法测定回收的匀浆液的上清中所含的融合蛋白的浓度。需要说明的是，生物素标记化山羊抗人igg fc多克隆抗体使用了将山羊抗人igg fc多克隆抗体(bethyl公司)用生物素labelling kit-nh2(同仁化学研究所)按照附带的操作手册生物素标记而制作的抗体。此外，sulfo标记化山羊抗人igg fc多克隆抗体使用了将山羊抗人igg fc多克隆抗体(bethyl公司)用msd sulfo-tag nhs-ester(meso scale diagnostics公司)按照附带的操作手册sulfo进行标记而制作的抗体。
[0751]
向streptavidin gold plate 96 well(meso scale diagnostics公司)的各孔中添加150μl的superblock blocking buffer in pbs(thermo fisher scientific公司)，静置1小时，将板封闭。将生物素标记化山羊抗人igg fc多克隆抗体用superblock blocking buffer in pbs稀释成0.5μg/ml的浓度。将sulfo标记化山羊抗人igg fc多克隆抗体用superblock blocking buffer in pbs稀释成1.0μg/ml的浓度。将生物素标记抗体和sulfo标记抗体的稀释溶液各25μl与25μl的各被检体混合，孵育1小时，将其作为抗体反应试样。
[0752]
将封闭后的板的各孔用200μl的pbs-t(西格玛公司)洗涤后，向各孔中添加抗体反应试样各25μl，孵育1小时。孵育后，将板的各孔用200μl的pbs-t洗涤，然后添加read buffer t(meso scale diagnostics公司)，用sector
tm imager 6000(meso scale diagnostics公司)测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的标准试样的测定值制作标准曲线，将各试样的测定值内插到标准曲线中，从而计算出脑组织的每克种类(g湿重)中所含的各融合蛋白的量(脑组织中的各融合蛋白的浓度)。将其结果示于表13。
[0753]
在将作为对照的人免疫球蛋白的脑组织中的浓度设为1时，脑组织中的epo-抗htfr抗体、arsa-抗htfr抗体、ppt-1-抗htfr抗体、tpp-1-抗htfr抗体、idua-抗htfr抗体、tnfαr-抗htfr抗体和sgsh-抗htfr抗体的浓度的相对值分别为4.33、3.39、4.87、6.48、5.62、7.44和2.24，表明与抗htfr抗体结合的这些生理活性肽积极地向脑组织中迁移。即，这些结果表明：通过与抗htfr抗体进行融合，能够使通常不通过血脑屏障的这些生理活性蛋白通过血脑屏障而到达脑组织中。
[0754]
即，表明：epo-抗htfr抗体可以作为脑缺血的治疗剂使用，arsa-抗htfr抗体、芳基硫酸酯酶a可以作为异染性白质退化(异染性白质营养不良)中的中枢神经障碍治疗剂使用，ppt-1-抗htfr抗体可以作为神经元蜡样脂褐质沉积症或santavuori-haltia病的中枢神经障碍治疗剂使用，tpp-1-抗htfr抗体可以作为神经元蜡样脂褐质沉积症或jansky-bielschowsky病的中枢神经障碍治疗剂使用，idua-抗htfr抗体可以作为hurler综合症或hurler-scheie综合症的中枢神经障碍治疗剂使用，sgsh-抗htfr抗体可以作为sanfilippo综合症的中枢神经障碍治疗剂使用，idua-抗htfr抗体可以作为hurler综合症或hurler-scheie综合症的中枢神经障碍治疗剂使用，tnfαr-抗htfr抗体可以作为脑缺血和脑炎症性疾病的治疗剂使用。此外表明：不限于这些，通过与抗htfr抗体进行融合能够使通常不能通过血脑屏障的期望的生理活性蛋白通过血脑屏障而到达脑组织中。
[0755]
表13脑组织中的各种融合蛋白的浓度(μg/g湿重)
[0756][0757]
产业上的可利用能性
[0758]
本发明的抗htfr抗体能够通过与期望的生理活性蛋白、低分子物质等融合而使该期望的生理活性蛋白、低分子物质等通过血脑屏障，因此作为提供将应在中枢神经系统中发挥作用的生理活性蛋白、低分子物质等送达到脑内的方法的有用性高。
[0759]
符号说明
[0760]
1 血管
[0761]
2 脑实质
[0762]
3 神经元样细胞
[0763]
4 浦肯野细胞
[0764]
序列表自由文本
[0765]
序列号3：接头例1的氨基酸序列
[0766]
序列号4：接头例2的氨基酸序列
[0767]
序列号5：接头例3的氨基酸序列
[0768]
序列号6：小鼠抗htfr抗体号1的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0769]
序列号7：小鼠抗htfr抗体号1的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0770]
序列号8：小鼠抗htfr抗体号1的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0771]
序列号9：小鼠抗htfr抗体号1的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0772]
序列号10：小鼠抗htfr抗体号1的轻链cdr3的氨基酸序列
[0773]
序列号11：小鼠抗htfr抗体号2的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0774]
序列号12：小鼠抗htfr抗体号2的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0775]
序列号13：小鼠抗htfr抗体号2的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0776]
序列号14：小鼠抗htfr抗体号2的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0777]
序列号15：小鼠抗htfr抗体号2的轻链cdr3的氨基酸序列
[0778]
序列号16：小鼠抗htfr抗体号3的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0779]
序列号17：小鼠抗htfr抗体号3的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0780]
序列号18：小鼠抗htfr抗体号3的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0781]
序列号19：小鼠抗htfr抗体号3的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0782]
序列号20：小鼠抗htfr抗体号3的轻链cdr3的氨基酸序列
[0783]
序列号21：小鼠抗htfr抗体号4的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0784]
序列号22：小鼠抗htfr抗体号4的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0785]
序列号23：小鼠抗htfr抗体号4的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0786]
序列号24：小鼠抗htfr抗体号4的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0787]
序列号25：小鼠抗htfr抗体号4的轻链cdr3的氨基酸序列
[0788]
序列号26：小鼠抗htfr抗体号5的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0789]
序列号27：小鼠抗htfr抗体号5的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0790]
序列号28：小鼠抗htfr抗体号5的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0791]
序列号29：小鼠抗htfr抗体号5的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0792]
序列号30：小鼠抗htfr抗体号5的轻链cdr3的氨基酸序列
[0793]
序列号31：小鼠抗htfr抗体号6的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0794]
序列号32：小鼠抗htfr抗体号6的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0795]
序列号33：小鼠抗htfr抗体号6的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0796]
序列号34：小鼠抗htfr抗体号6的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0797]
序列号35：小鼠抗htfr抗体号6的轻链cdr3的氨基酸序列
[0798]
序列号36：小鼠抗htfr抗体号7的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0799]
序列号37：小鼠抗htfr抗体号7的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0800]
序列号38：小鼠抗htfr抗体号7的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0801]
序列号39：小鼠抗htfr抗体号7的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0802]
序列号40：小鼠抗htfr抗体号7的轻链cdr3的氨基酸序列
[0803]
序列号41：小鼠抗htfr抗体号8的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0804]
序列号42：小鼠抗htfr抗体号8的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0805]
序列号43：小鼠抗htfr抗体号8的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0806]
序列号44：小鼠抗htfr抗体号8的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0807]
序列号45：小鼠抗htfr抗体号8的轻链cdr3的氨基酸序列
[0808]
序列号46：小鼠抗htfr抗体号9的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0809]
序列号47：小鼠抗htfr抗体号9的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0810]
序列号48：小鼠抗htfr抗体号9的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0811]
序列号49：小鼠抗htfr抗体号9的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0812]
序列号50：小鼠抗htfr抗体号9的轻链cdr3的氨基酸序列
[0813]
序列号51：小鼠抗htfr抗体号10的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0814]
序列号52：小鼠抗htfr抗体号10的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0815]
序列号53：小鼠抗htfr抗体号10的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0816]
序列号54：小鼠抗htfr抗体号10的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0817]
序列号55：小鼠抗htfr抗体号10的轻链cdr3的氨基酸序列
[0818]
序列号56：小鼠抗htfr抗体号11的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0819]
序列号57：小鼠抗htfr抗体号11的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0820]
序列号58：小鼠抗htfr抗体号11的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0821]
序列号59：小鼠抗htfr抗体号11的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0822]
序列号60：小鼠抗htfr抗体号11的轻链cdr3的氨基酸序列
[0823]
序列号61：小鼠抗htfr抗体号12的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0824]
序列号62：小鼠抗htfr抗体号12的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0825]
序列号63：小鼠抗htfr抗体号12的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0826]
序列号64：小鼠抗htfr抗体号12的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0827]
序列号65：小鼠抗htfr抗体号12的轻链cdr3的氨基酸序列
[0828]
序列号66：小鼠抗htfr抗体号13的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0829]
序列号67：小鼠抗htfr抗体号13的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0830]
序列号68：小鼠抗htfr抗体号13的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0831]
序列号69：小鼠抗htfr抗体号13的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0832]
序列号70：小鼠抗htfr抗体号13的轻链cdr3的氨基酸序列
[0833]
序列号71：小鼠抗htfr抗体号14的轻链cdr1的氨基酸序列1
[0834]
序列号72：小鼠抗htfr抗体号14的轻链cdr1的氨基酸序列2
[0835]
序列号73：小鼠抗htfr抗体号14的轻链cdr2的氨基酸序列1
[0836]
序列号74：小鼠抗htfr抗体号14的轻链cdr2的氨基酸序列2
[0837]
序列号75：小鼠抗htfr抗体号14的轻链cdr3的氨基酸序列
[0838]
序列号76：小鼠抗htfr抗体号1的重链cdr1的氨基酸序列1
[0839]
序列号77：小鼠抗htfr抗体号1的重链cdr1的氨基酸序列2
[0840]
序列号78：小鼠抗htfr抗体号1的重链cdr2的氨基酸序列1
[0841]
序列号79：小鼠抗htfr抗体号1的重链cdr2的氨基酸序列2
[0842]
序列号80：小鼠抗htfr抗体号1的重链cdr3的氨基酸序列1
[0843]
序列号81：小鼠抗htfr抗体号1的重链cdr3的氨基酸序列2
[0844]
序列号82：小鼠抗htfr抗体号2的重链cdr1的氨基酸序列1
[0845]
序列号83：小鼠抗htfr抗体号2的重链cdr1的氨基酸序列2
[0846]
序列号84：小鼠抗htfr抗体号2的重链cdr2的氨基酸序列1
[0847]
序列号85：小鼠抗htfr抗体号2的重链cdr2的氨基酸序列2
[0848]
序列号86：小鼠抗htfr抗体号2的重链cdr3的氨基酸序列1
[0849]
序列号87：小鼠抗htfr抗体号2的重链cdr3的氨基酸序列2
[0850]
序列号88：小鼠抗htfr抗体号3的重链cdr1的氨基酸序列1
[0851]
序列号89：小鼠抗htfr抗体号3的重链cdr1的氨基酸序列2
[0852]
序列号90：小鼠抗htfr抗体号3的重链cdr2的氨基酸序列1
[0853]
序列号91：小鼠抗htfr抗体号3的重链cdr2的氨基酸序列2
[0854]
序列号92：小鼠抗htfr抗体号3的重链cdr3的氨基酸序列1
[0855]
序列号93：小鼠抗htfr抗体号3的重链cdr3的氨基酸序列2
[0856]
序列号94：小鼠抗htfr抗体号4的重链cdr1的氨基酸序列1
[0857]
序列号95：小鼠抗htfr抗体号4的重链cdr1的氨基酸序列2
[0858]
序列号96：小鼠抗htfr抗体号4的重链cdr2的氨基酸序列1
[0859]
序列号97：小鼠抗htfr抗体号4的重链cdr2的氨基酸序列2
[0860]
序列号98：小鼠抗htfr抗体号4的重链cdr3的氨基酸序列1
[0861]
序列号99：小鼠抗htfr抗体号4的重链cdr3的氨基酸序列2
[0862]
序列号100：小鼠抗htfr抗体号5的重链cdr1的氨基酸序列1
[0863]
序列号101：小鼠抗htfr抗体号5的重链cdr1的氨基酸序列2
[0864]
序列号102：小鼠抗htfr抗体号5的重链cdr2的氨基酸序列1
[0865]
序列号103：小鼠抗htfr抗体号5的重链cdr2的氨基酸序列2
[0866]
序列号104：小鼠抗htfr抗体号5的重链cdr3的氨基酸序列1
[0867]
序列号105：小鼠抗htfr抗体号5的重链cdr3的氨基酸序列2
[0868]
序列号106：小鼠抗htfr抗体号6的重链cdr1的氨基酸序列1
[0869]
序列号107：小鼠抗htfr抗体号6的重链cdr1的氨基酸序列2
[0870]
序列号108：小鼠抗htfr抗体号6的重链cdr2的氨基酸序列
[0871]
序列号109：小鼠抗htfr抗体号6的重链cdr3的氨基酸序列1
[0872]
序列号110：小鼠抗htfr抗体号6的重链cdr3的氨基酸序列2
[0873]
序列号111：小鼠抗htfr抗体号7的重链cdr1的氨基酸序列1
[0874]
序列号112：小鼠抗htfr抗体号7的重链cdr1的氨基酸序列2
[0875]
序列号113：小鼠抗htfr抗体号7的重链cdr2的氨基酸序列1
[0876]
序列号114：小鼠抗htfr抗体号7的重链cdr2的氨基酸序列2
[0877]
序列号115：小鼠抗htfr抗体号7的重链cdr3的氨基酸序列1
[0878]
序列号116：小鼠抗htfr抗体号7的重链cdr3的氨基酸序列2
[0879]
序列号117：小鼠抗htfr抗体号8的重链cdr1的氨基酸序列1
[0880]
序列号118：小鼠抗htfr抗体号8的重链cdr1的氨基酸序列2
[0881]
序列号119：小鼠抗htfr抗体号8的重链cdr2的氨基酸序列
[0882]
序列号120：小鼠抗htfr抗体号8的重链cdr3的氨基酸序列1
[0883]
序列号121：小鼠抗htfr抗体号8的重链cdr3的氨基酸序列2
[0884]
序列号122：小鼠抗htfr抗体号9的重链cdr1的氨基酸序列1
[0885]
序列号123：小鼠抗htfr抗体号9的重链cdr1的氨基酸序列2
[0886]
序列号124：小鼠抗htfr抗体号9的重链cdr2的氨基酸序列1
[0887]
序列号125：小鼠抗htfr抗体号9的重链cdr2的氨基酸序列2
[0888]
序列号126：小鼠抗htfr抗体号9的重链cdr3的氨基酸序列1
[0889]
序列号127：小鼠抗htfr抗体号9的重链cdr3的氨基酸序列2
[0890]
序列号128：小鼠抗htfr抗体号10的重链cdr1的氨基酸序列1
[0891]
序列号129：小鼠抗htfr抗体号10的重链cdr1的氨基酸序列2
[0892]
序列号130：小鼠抗htfr抗体号10的重链cdr2的氨基酸序列1
[0893]
序列号131：小鼠抗htfr抗体号10的重链cdr2的氨基酸序列2
[0894]
序列号132：小鼠抗htfr抗体号10的重链cdr3的氨基酸序列1
[0895]
序列号133：小鼠抗htfr抗体号10的重链cdr3的氨基酸序列2
[0896]
序列号134：小鼠抗htfr抗体号11的重链cdr1的氨基酸序列1
[0897]
序列号135：小鼠抗htfr抗体号11的重链cdr1的氨基酸序列2
[0898]
序列号136：小鼠抗htfr抗体号11的重链cdr2的氨基酸序列1
[0899]
序列号137：小鼠抗htfr抗体号11的重链cdr2的氨基酸序列2
[0900]
序列号138：小鼠抗htfr抗体号11的重链cdr3的氨基酸序列1
[0901]
序列号139：小鼠抗htfr抗体号11的重链cdr3的氨基酸序列2
[0902]
序列号140：小鼠抗htfr抗体号12的重链cdr1的氨基酸序列1
[0903]
序列号141：小鼠抗htfr抗体号12的重链cdr1的氨基酸序列2
[0904]
序列号142：小鼠抗htfr抗体号12的重链cdr2的氨基酸序列1
[0905]
序列号143：小鼠抗htfr抗体号12的重链cdr2的氨基酸序列2
[0906]
序列号144：小鼠抗htfr抗体号12的重链cdr3的氨基酸序列1
[0907]
序列号145：小鼠抗htfr抗体号12的重链cdr3的氨基酸序列2
[0908]
序列号146：小鼠抗htfr抗体号13的重链cdr1的氨基酸序列1
[0909]
序列号147：小鼠抗htfr抗体号13的重链cdr1的氨基酸序列2
[0910]
序列号148：小鼠抗htfr抗体号13的重链cdr2的氨基酸序列1
[0911]
序列号149：小鼠抗htfr抗体号13的重链cdr2的氨基酸序列2
[0912]
序列号150：小鼠抗htfr抗体号13的重链cdr3的氨基酸序列1
[0913]
序列号151：小鼠抗htfr抗体号13的重链cdr3的氨基酸序列2
[0914]
序列号152：小鼠抗htfr抗体号14的重链cdr1的氨基酸序列1
[0915]
序列号153：小鼠抗htfr抗体号14的重链cdr1的氨基酸序列2
[0916]
序列号154：小鼠抗htfr抗体号14的重链cdr2的氨基酸序列1
[0917]
序列号155：小鼠抗htfr抗体号14的重链cdr2的氨基酸序列2
[0918]
序列号156：小鼠抗htfr抗体号14的重链cdr3的氨基酸序列1
[0919]
序列号157：小鼠抗htfr抗体号14的重链cdr3的氨基酸序列2
[0920]
序列号158：人源化抗htfr抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列1
[0921]
序列号159：人源化抗htfr抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列2
[0922]
序列号160：人源化抗htfr抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列3
[0923]
序列号161：人源化抗htfr抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列4
[0924]
序列号162：人源化抗htfr抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列5
[0925]
序列号163：人源化抗htfr抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列6
[0926]
序列号164：人源化抗htfr抗体号1的、可变区含有氨基酸序列6的轻链的氨基酸序列，合成序列
[0927]
序列号165：编码人源化抗htfr抗体号1的、可变区含有氨基酸序列6的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0928]
序列号166：人源化抗htfr抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列1
[0929]
序列号167：人源化抗htfr抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列2
[0930]
序列号168：人源化抗htfr抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列3
[0931]
序列号169：人源化抗htfr抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列4
[0932]
序列号170：人源化抗htfr抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列5
[0933]
序列号171：人源化抗htfr抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列6
[0934]
序列号172：人源化抗htfr抗体号1的、可变区含有氨基酸序列6的重链的氨基酸序列
[0935]
序列号173：编码人源化抗htfr抗体号1的重链的可变区含有氨基酸序列6的重链
的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0936]
序列号174：人源化抗htfr抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列1
[0937]
序列号175：人源化抗htfr抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列2
[0938]
序列号176：人源化抗htfr抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列3
[0939]
序列号177：人源化抗htfr抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列4
[0940]
序列号178：人源化抗htfr抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列5
[0941]
序列号179：人源化抗htfr抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列6
[0942]
序列号180：人源化抗htfr抗体号2的、可变区含有氨基酸序列6的轻链的氨基酸序列
[0943]
序列号181：含有编码人源化抗htfr抗体号2的、可变区含有氨基酸序列6的轻链的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列，合成序列
[0944]
序列号182：人源化抗htfr抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列1
[0945]
序列号183：人源化抗htfr抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列2
[0946]
序列号184：人源化抗htfr抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列3
[0947]
序列号185：人源化抗htfr抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列4
[0948]
序列号186：人源化抗htfr抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列5
[0949]
序列号187：人源化抗htfr抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列6
[0950]
序列号188：人源化抗htfr抗体号2的、可变区含有氨基酸序列6的重链的氨基酸序列
[0951]
序列号189：含有编码人源化抗htfr抗体号2的、可变区含有氨基酸序列6的重链的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列，合成序列
[0952]
序列号190：人源化抗htfr抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列1
[0953]
序列号191：人源化抗htfr抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列2
[0954]
序列号192：人源化抗htfr抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列3
[0955]
序列号193：人源化抗htfr抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列4
[0956]
序列号194：人源化抗htfr抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列5
[0957]
序列号195：人源化抗htfr抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列6
[0958]
序列号196：人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的轻链的氨基酸序列
[0959]
序列号197：编码人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0960]
序列号198：人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列4的轻链的氨基酸序列
[0961]
序列号199：编码人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列4的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0962]
序列号200：人源化抗htfr抗体号3的轻链的可变区含有氨基酸序列5的轻链的氨基酸序列
[0963]
序列号201：编码人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列5的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0964]
序列号202：人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列6的可变区
[0965]
序列号203：编码人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列6的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0966]
序列号204：人源化抗htfr抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列1
[0967]
序列号205：人源化抗htfr抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列2
[0968]
序列号206：人源化抗htfr抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列3
[0969]
序列号207：人源化抗htfr抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列4
[0970]
序列号208：人源化抗htfr抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列5
[0971]
序列号209：人源化抗htfr抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列6
[0972]
序列号210：人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的重链的氨基酸序列
[0973]
序列号211：编码人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的重链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0974]
序列号212：人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的重链(igg4)的氨基酸序列
[0975]
序列号213：编码人源化抗htfr抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的重链(igg4)的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[0976]
序列号214：引物htfr5’，合成序列
[0977]
序列号215：引物htfr3’，合成序列
[0978]
序列号216：引物hyg-sfi5’，合成序列
[0979]
序列号217：引物hyg-bstx3’，合成序列
[0980]
序列号218：小鼠抗htfr抗体号1的轻链的可变区的氨基酸序列
[0981]
序列号219：小鼠抗htfr抗体号1的重链的可变区的氨基酸序列
[0982]
序列号220：小鼠抗htfr抗体号2的轻链的可变区的氨基酸序列
[0983]
序列号221：小鼠抗htfr抗体号2的重链的可变区的氨基酸序列
[0984]
序列号222：小鼠抗htfr抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列
[0985]
序列号223：小鼠抗htfr抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列
[0986]
序列号224：小鼠抗htfr抗体号4的轻链的可变区的氨基酸序列
[0987]
序列号225：小鼠抗htfr抗体号4的重链的可变区的氨基酸序列
[0988]
序列号226：小鼠抗htfr抗体号5的轻链的可变区的氨基酸序列
[0989]
序列号227：小鼠抗htfr抗体号5的重链的可变区的氨基酸序列
[0990]
序列号228：小鼠抗htfr抗体号6的轻链的可变区的氨基酸序列
[0991]
序列号229：小鼠抗htfr抗体号6的重链的可变区的氨基酸序列
[0992]
序列号230：小鼠抗htfr抗体号7的轻链的可变区的氨基酸序列
[0993]
序列号231：小鼠抗htfr抗体号7的重链的可变区的氨基酸序列
[0994]
序列号232：小鼠抗htfr抗体号8的轻链的可变区的氨基酸序列
[0995]
序列号233：小鼠抗htfr抗体号8的重链的可变区的氨基酸序列
[0996]
序列号234：小鼠抗htfr抗体号9的轻链的可变区的氨基酸序列
[0997]
序列号235：小鼠抗htfr抗体号9的重链的可变区的氨基酸序列
[0998]
序列号236：小鼠抗htfr抗体号10的轻链的可变区的氨基酸序列
[0999]
序列号237：小鼠抗htfr抗体号10的重链的可变区的氨基酸序列
[1000]
序列号238：小鼠抗htfr抗体号11的轻链的可变区的氨基酸序列
[1001]
序列号239：小鼠抗htfr抗体号11的重链的可变区的氨基酸序列
[1002]
序列号240：小鼠抗htfr抗体号12的轻链的可变区的氨基酸序列
[1003]
序列号241：小鼠抗htfr抗体号12的重链的可变区的氨基酸序列
[1004]
序列号242：小鼠抗htfr抗体号13的轻链的可变区的氨基酸序列
[1005]
序列号243：小鼠抗htfr抗体号13的重链的可变区的氨基酸序列
[1006]
序列号244：小鼠抗htfr抗体号14的轻链的可变区的氨基酸序列
[1007]
序列号245：小鼠抗htfr抗体号14的重链的可变区的氨基酸序列
[1008]
序列号247：抗htfr抗体号1的重链(人源化6)与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列
[1009]
序列号248：编码抗htfr抗体号1的重链(人源化6)与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1010]
序列号249：抗htfr抗体号2的重链(人源化6)与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列
[1011]
序列号250：编码抗htfr抗体号2的重链(人源化6)与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1012]
序列号251：抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列
[1013]
序列号252：编码抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hi2s的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1014]
序列号253：在编码嵌合htfr的cdna的3’侧配置有被loxp序列夹持的新霉素抗性基因的dna的碱基序列，合成序列
[1015]
序列号254：打靶载体的5’臂的碱基序列，合成序列
[1016]
序列号255：打靶载体的3’臂的碱基序列，合成序列
[1017]
序列号257：抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hepo的融合蛋白的氨基酸序列
[1018]
序列号258：编码抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hepo的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1019]
序列号260：抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与harsa的融合蛋白的氨基酸序列
[1020]
序列号261：编码抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与harsa的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1021]
序列号263：抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hppt-1的融合蛋白的氨基酸序列
[1022]
序列号264：编码抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hppt-1的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1023]
序列号266：抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与htpp-1的融合蛋白的氨基酸序列
[1024]
序列号267：编码抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与htpp-1的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1025]
序列号269：抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hidua的融合蛋白的氨基酸序列
[1026]
序列号270：编码抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hidua的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1027]
序列号272：抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与htnfαr的融合蛋白的氨基酸序列
[1028]
序列号273：编码抗htfrα抗体号3的重链(人源化2)和htnfαr的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1029]
序列号275：抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hsgsh的融合蛋白的氨基酸序列
[1030]
序列号276：编码抗htfr抗体号3的重链(人源化2)与hsgsh的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
[1031]
序列号277：单链抗htfr抗体的氨基酸序列
[1032]
序列号278：小鼠抗htfr抗体号6的重链cdr2的氨基酸序列2
[1033]
序列号279：小鼠抗htfr抗体号8的重链cdr2的氨基酸序列2。