OMgP抗体及其在脊髓损伤中的应用的制作方法

omgp抗体及其在脊髓损伤中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种omgp抗体及其在脊髓损伤中的应用。


背景技术：

[0002]“脊髓损伤”(spinal cord injury)一词是指由创伤(如撞车)、疾病或退化(如癌症)造成的脊髓损坏。目前没有关于全球患病率的可靠估计，但大多是由创伤造成，尽管非创伤性脊髓损伤的比例呈现上升趋势。脊髓损伤的症状取决于损伤的严重程度和受损脊髓的位置。症状可能包括胳膊、腿和/或身体的感觉功能或运动控制部分或完全丧失。最严重的脊髓损伤会影响调节尿便控制、呼吸、心率和血压的身体系统。大多数脊髓损伤者会经历慢性疼痛，脊髓损伤有引发继发性疾病的危险，这些疾病——如深静脉血栓、尿道感染、肌肉痉挛、骨质疏松、褥疮、慢性疼痛和呼吸道并发症，可能导致衰弱，甚至危及生命。急救护理、康复服务和持续的健康维护对预防和管理这些疾病至关重要。其后果是终身性和毁灭性的，不仅给病人造成极大的痛苦，也给家庭和社会带来沉重的负担。
[0003]
目前认为影响脊髓损伤后再生的不利因素主要有髓鞘相关抑制分子和胶质瘢痕。髓鞘相关糖蛋白(oligdendrocyte-associated myelin glycoprotein,omgp)是髓鞘相关抑制分子中的一种，现有技术表明omgp是脊髓再生的主要抑制因子，现有技术曾有报道采用sirna等方法干扰omgp的表达，但sirna通常利用外泌体、病毒、脂质纳米颗粒和聚合物纳米颗粒等技术递送，且rna分子不稳定，易被降解。
[0004]
有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

[0005]
本发明涉及一种omgp抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列依次如seq id no:1～3所示的重链互补决定区cdr-vh1、cdr-vh2、cdr-vh3，以及氨基酸序列依次如seq id no:4～6所示的轻链互补决定区cdr-vl1、cdr-vl2、cdr-vl3。
[0006]
在本发明中，“抗体”此技术术语是结合特定抗原的蛋白，其泛指包含cdr区的一切蛋白及蛋白片段，特别是全长抗体。“全长抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体，术语“抗原结合片段”是包含抗体cdr的一部分或全部的物质，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合至抗原。此类片段具生物活性，因为其结合至靶抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。在一些实施方式中，抗体功能片段具有特异性识别并结合omgp的作用。在一个方面中，此类片段将包含单个重链和单个轻链，或其部分。所述片段可通过重组核酸技术产生，或可通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解或化学裂解产生。
[0007]
术语“互补性决定区”或“cdr”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，在本发明中采用kabat等人所定义(kabat等人，sequences of proteins of immunological interest,5th ed"us department ofhealth and human services,nih,1991,和后来的版
本)。有三个重链cdr(hcdr)和三个轻链cdr(lcdr)。此处，取决于情况，术语“cdr”和“cdrs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。
[0008]
可选的，如上所述的omgp抗体或其抗原结合片段，其包含seq id no:7所示的重链可变区hcvr和seq id no:8所示的轻链可变区lcvr。
[0009]
抗体或其抗原结合片段的变体也在本发明范围内，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3，以及轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3，以及hcvr和lcvr，其中所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，以及hcvr和lcvr的变体的序列与seq id no:1～8所示序列中的任一个相比，分别包含至多3个氨基酸的突变(例如1个、2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选为具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
[0010]“抗原结合片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括fab、f(ab')2、fd、fv、scfv、抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scfv-fc等，优选地为f(ab')2、fab、scfv。
[0011]
优选的，如上所述的omgp抗体或其抗原结合片段，所述抗体具有恒定区。
[0012]
进一步优选的，重链恒定区序列选自igg、iga、igm、ige、igd任意一种的恒定区序列；其中igg可进一步分成亚类，例如选自igg1、igg2、igg3、igg4。
[0013]
进一步优选的，轻链恒定区为κ或λ链；
[0014]
进一步优选的，所述恒定区的种属来源选自牛、马、猪、羊、鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人。
[0015]
可选的，如上所述的抗体或其抗原结合片段，其为小鼠抗体、人-鼠嵌合抗体或人源化抗体。
[0016]
根据本发明的再一方面，还涉及一种分离的核酸，其编码权利如上所述的omgp抗体或其抗原结合片段。
[0017]
本发明还涉及包含如上所述的核酸的载体。术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(ires)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。
[0018]
本发明还涉及包含如上所述核酸或如上所述载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞优选为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞。
[0019]
本发明还涉及药物组合物，其包含如上所述的omgp抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种。
[0020]
术语“药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的赋形剂、稀释剂或载体，其是本领域公知的，包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
[0021]
本发明还涉及如上所述的omgp抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗脊髓损伤的药物中的应用。
[0022]
有益效果：
[0023]
本发明所制备得到的omgp抗体亲和力高，且特异性好，特别地，该抗体的一个重要优点在于其具有结合并中和omgp的活性和物理稳定性，因而优选可作为抗体药物使用，其在治疗脊髓损伤中具有优秀的应用前景。
具体实施方式
[0024]
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
[0025]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0026]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
[0027]
实施例1抗体的制备
[0028]
1.蛋白设计及表达
[0029]
以oligdendrocyte-associated myelin glycoprotein(人omgp，uniprot号：q16653)作为本发明omgp的模板，设计本发明涉及的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列，在omgp蛋白基础上融合flag-his标签，克隆到ptt5载体上(biovector，cat#:102762)，在293细胞瞬转表达或cho-s稳定表达纯化，获得编码本发明抗原及检测用蛋白。
[0030]
2.蛋白纯化
[0031]
细胞表达液高速离心，收集上清，弃掉沉淀。histrap ff预装柱用磷酸盐缓冲液(pbs)以5～10个柱体积进行平衡。将细胞表达上清按2ml/min的速度上样。用pbs冲洗预装柱直至mau读数将至基线，然后依次用20mm、50mm、250mm ph7.4的咪唑洗脱目的蛋白并收集，最终将300mm咪唑洗脱的目的蛋白液移至浓缩管中，离心，换液，将目的蛋白置换到pbs的溶液中保存，以备后续实验使用。
[0032]
3.抗原免疫及单克隆制备
[0033]
将人omgp与小鼠抗体fc片段(fragment crystallizable)的缀合物腹腔注射balb/c小鼠，每周一次，每次100μg/200μl/只，免疫3周后每周取小鼠尾血并检测血清中
omgp抗体的表达；选择血清中omgp抗体表达量高(dot blot检测)的小鼠取脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合形成融合子。
[0034]
细胞融合方法：
[0035]
用分子量为1450的50％peg作融合剂进行细胞融合，细胞融合按常规方法进行，其操作步骤如下：
[0036]
取1
×
107个sp2/0骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合，用基础培养液重悬，2000r/min，5min洗细胞三次。于超净工作台内取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞与免疫睥细胞混合细胞的50ml离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴。用小铝锅装2/3容积的水，于电炉上加热到37℃后放进超净工作台；从co2培养箱取出温育至37℃的50％peg，用1ml的吸管吸取0.8ml，手持装有混合细胞的50ml离心管，将其放置于37℃水浴小铝锅中，将peg缓缓加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，持续2min后，将离心管插到离心管架上，移走小铝锅，从co2培养箱取出温育至37℃的50ml基础培养液，用吸管吸取10ml缓缓加到融合细胞上边加边轻轻搅拌，使细胞团块分散，先加1ml，再加2ml，再加3ml，最后加完剩下的4ml，加完第一个10ml后，接着沿管壁加完剩下的40ml，加完后，拧紧盖，反复颠倒几次，使细胞混匀。1500r/min，离心5min，弃上清，用重悬有饲养细胞的72ml完全培养液将融合细胞重悬。注：动作要轻，将用吸管将细胞轻轻搅拌起来，不要吹打。将重悬起来的细胞滴加到96孔细胞培养板内，2滴/孔，置co2培养箱培养。融合后第4天即可观察到小集落；第7天补加完全培养液1滴/孔；第10天左右，集落长到占孔底1/4大小，培养液变黄，即可进行抗体检测。
[0037]
杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化：
[0038]
融合后第10～14天，在倒置显微镜下对培养板进行观察，在有集落出现孔的培养板盖上方用记号笔打上小点，标明集落的位置，以便检测时取样以及原始孔的对号入座。
[0039]
选择培养上清中表达omgp抗体的融合子进行单克隆；选择表达omgp抗体的单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养，培养7～10天后收集细胞培养液纯化获得omgp抗体。
[0040]
实施例2抗体测定
[0041]
1)抗体活性的测定
[0042]
1.将表面偶联protein a蛋白的探针在250μl的buffer k(pbs 0.002％吐温20 0.02％bsa)中浸润10分钟；
[0043]
2.将抗体用buffer k配置为5μg/ml的工作液；
[0044]
3.将重组人omgp蛋白用buffer k配置为四个浓度的工作液，浓度分别为10μg/ml，5μg/ml，2.5μg/ml，0μg/ml；
[0045]
4.根据gator非标记分析仪(星童医疗技术，cat#:gator)指示添加试剂，亲和力数据如表1所示，本次对初筛效果较好的9株克隆的抗体进行检测。检测结果显示，其中omgp e4-3号克隆与人omgp蛋白具有最高的亲和力水平，其中，9株抗体中7株抗体的kd处于低纳摩尔范围内(10-9
)属于高亲和力抗体，1株抗体的kd处于10-11
范围内，而6号克隆kd处于皮摩尔范围内(10-12
)，属于亲和力非常高的抗体。
[0046]
表1
[0047]
克隆编号koff(1/s)kon(1/ms)kd(m)omgp a2-14.35e-041.70e 052.56e-09omgp b2-82.71e-042.45e 051.11e-09
omgp c3-19.13e-044.11e 052.22e-09omgp c5-14.61e-046.36e 047.25e-09omgp b7-21.80e-041.56e 051.15e-09omgp e4-34.60e-066.11e 057.53e-12omgp f4-12.36e-047.18e 043.29e-09omgp f10-13.31e-047.19e 044.60e-09omgp h6-35.24e-051.57e 063.34e-11
[0048]
2)抗体的物理稳定性检测
[0049]
利用dsc(differential scanning calorimetry，差示扫描量热法)检测omgp e4-3和omgp h6-3抗体的热稳定性。差示热量扫描仪(dsc)通过升高或降低温度来诱导高分子的改变，从而测量分子相互作用的热力学变化，是表征分子热稳定性的首选技术。
[0050]
将两种抗体稀释至相同浓度，检测依照microcal vp-capillary dsc(malvern)说明书进行。检测前，将各个样品及空白缓冲液用真空脱气器脱气1min～2min。样品板每个孔加入500μl样品或空白缓冲液(仪器上样量为300μl)。最后两对孔板分别加入14％decon 90和ddh2o，以备清洗用，样品板加样完毕后，套上塑料软盖板。扫描温度从25℃开始到100℃结束，扫描速率60℃/h。具体结果如表2所示。
[0051]
表2
[0052][0053]
抗体是蛋白中属于比较稳定的，其tm值基本上在70度左右。但作为药物使用的抗体蛋白其热稳定性越好，则在运输/保存过程中约不易发生降解。从实验结果看，omgp e4-3相较和omgp h6-3表现出了更好的热稳定性。
[0054]
通过sec-hplc监测样品纯度，考察一定浓度条件下周期性稳定性，将样品浓度控制在约1mg/ml，在pbs体系中检测抗体在反复冻融3次(每次冷冻温度-70℃，室温自然解冻)的稳定性情况。利用xbridge protein beh sec 200a(waters)hplc柱子检测抗体纯度。检测结果如表3所示，在pbs中，与omgp h6-3相比，抗体omgp e4-3表现出较好的稳定性。
[0055]
表3
[0056]
omgp e4-3(
△
％)omgp h6-3(
△
％)2.74.9
[0057]
备注：
△
％指hplc纯度下降变化率
[0058]
对omgp e4-3抗体测序重链可变区氨基酸序列vh为seq id no:7所示，轻链可变区氨基酸序列vl为序列seq id no:8所示。抗体类型为igg。
[0059]
heavy chain variable region:(seq id no:7)
[0060]
qvqlqksdaefvkpgasvkisckasgytasaaywvkqnpeqqlekigywspgssdlkssveffkgkatltadksssteyvqlaslvsedsavyfcamsinmaywgwgqgtqvqqvssqq
[0061]
light chain variable region:(seq id no:8)
[0062]
sivmtqtpkfllvsagdrvtitckasqvqsfcntwykqkskpgespkdlvyvyssrdsgvpdrfigsgtagsftftltisslqvedladyfcqqhasspymstmaggklelk
[0063]
实施例3尾静脉注射抗体加快脊髓损伤的康复
[0064]
实验方法如下：
[0065]
1.实验动物
[0066]
实验动物为250g～280g的sd雄性大鼠，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于23℃的恒温环境中，湿度40％，12/12hr的昼夜节律。鼠粮和水充足供应。
[0067]
2.大鼠脊髓打击伤模型的建立。
[0068]
参照wamil等的方法【wamil et al.proc natl acad sci usa，1998；95(22)：13188-13193】按落体致伤原理建立模型。所用装置由撞杆、外周套管、击锤及外固定架等组成。撞杆头端直径2.3mm，高度10mm，击锤重10g，下落高度1.25cm，落体致伤的冲击力为10
×
1.25g
·
cm。室温23℃条件下，动物称重后，用5％水合氯醛(0.75ml/100g)腹腔注射麻醉，固定于大鼠固定架上。沿正中线切开脊髓胸背部皮肤及皮下组织长约4cm，定位t11椎体棘突，钝性分离t11、10、9椎体两旁肌肉，撑开器撑开固定，暴露上述三个椎体，行椎板切开术。将撞杆头端置于t10段脊髓，固定打击外套管，将击锤自1.25cm高度沿外周套管自由落下冲击撞杆，造成t10段脊髓挫伤，术中可见身体向前扑动、甩尾、呼吸暂停表示造模成功。明胶海绵止血，逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤，术后自由进食水，分笼饲养。每日膀胱挤尿4～5次，持续1～2w，直到排尿反射恢复。
[0069]
3.实验分组及抗体给药策略
[0070]
经参考文献(“omgp蛋白在大鼠急性损伤中的表达及其意义”，袁普卫等，chinese j trad med traum&orthop，jun 2008，vol16，no 6)，可知omgp蛋白在急性脊髓损伤后1h表达量升高，在1周时表达量达到峰值。选择在脊髓打击伤模型建立成功24h、3d和7d后尾静脉注射抗体，共注射三次。实验分为如下几组，每组动物8只。
[0071]
control：空白对照组，注射pbs igg，抗体浓度10μg/g；
[0072]
group1，尾静脉注射pbs omgp e4-3抗体，抗体浓度5μg/g(按大鼠体重)；
[0073]
group2，尾静脉注射pbs omgp e4-3抗体，抗体浓度10μg/g；
[0074]
group3，尾静脉注射pbs omgp e4-3抗体，抗体浓度15μg/g；
[0075]
4.疗效评定
[0076]
4.1bbb评分通过双盲实验进行，分别对实验大鼠后肢功能进行评定，包括关节运动、行走能力、协调性和肢体稳定性。脊髓损伤后第30d各组进行bbb评分。
[0077]
统计学分析数据处理采用spss15.0软件，结果以表示。bbb评分和细胞计数采用配对t检验或单因素方差分析(anova)。p《0.05即为有统计学意义。
[0078]
大鼠后肢bbb评分参照表4。
[0079]
表4 bbb运动功能评分表
[0080][0081][0082]
术前各组评分均为21分，损伤后均为0分。经过30d休养后，control组获得初步恢复，其余各组相对于control组得分均获得了显著性的提升。
[0083]
表5
[0084][0085]
注：*p＜0.05，vs control。
[0086]
从上述结果可知，本发明所制备得到的omgp抗体在10μg/g及以上的抗体浓度下，能够有效抑制omgp蛋白的活性，从而加快脊髓损伤的康复，具有很好的应用前景。
[0087]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0088]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。