一种处理样本的方法及其核酸提取方法与文库与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种处理样本的方法及其核酸提取方法与文库。


背景技术：

2.尿液样本成分复杂，其中细胞含量较少，且不便于储存，难以获得合格的rna用于下游的分子生物学检测。而越来越多的研究表明，对尿液上皮细胞中rna进行有效分析能有助于遗传性疾病的诊断。临床常规的尿液样本采集方式不利于后续核酸提取，且rna极易降解，样本运输要求较高；而要获得满足分析条件的rna，尿液样本的采集、保存方式则是首先需要解决的问题。
3.现有技术主要是从尿液等体液样本中富集外泌体、分离尿蛋白等物质，不涉及对细胞的处理，也不涉及样本保存。


技术实现要素：

4.根据第一方面，在一实施例中，提供一种处理样本的方法，包括：
5.离心步骤，包括对待测样本进行离心，然后移去上清液，得到离心后的沉淀；
6.漂洗步骤，包括使用缓冲液重悬所述沉淀，然后移去上清液，得到漂洗后的沉淀；
7.过滤步骤，包括使用缓冲液稀释沉淀，过滤，取经过滤膜的液体，即为过滤后的样本。
8.根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面所述方法处理得到的样本。
9.根据第三方面，在一实施例中，提供一种核酸提取方法，包括：
10.从第二方面所述样本中提取得到核酸。
11.根据第四方面，在一实施例中，提供第三方面所述核酸提取方法提取得到的核酸。
12.根据第五方面，在一实施例中，提供一种测序文库，所述测序文库由第四方面所述核酸构建得到。
13.依据上述实施例的一种处理样本的方法及其核酸提取方法与文库，该处理方法显著提高样本的杂质去除效率，显著降低杂质对后续测序的影响，同时有效提升了核酸质量。
14.在一实施例中，还可加入核酸保护剂，得到可在2～8℃冷藏条件运输、保存的样本。
具体实施方式
15.下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本技术相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述
所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
16.另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
17.本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
18.尿液样本成分复杂，其中细胞含量较少，且不便于储存，难以获得合格的rna用于下游的分子生物学检测。而越来越多的研究表明，对尿液细胞中rna进行有效分析能有助于遗传性疾病的诊断。临床常规的尿液样本采集方式不利于后续核酸提取，且rna极易降解，样本运输要求较高；而要获得满足分析条件的rna，尿液样本的采集、保存方式则是首先需要解决的问题。
19.目前暂无较好办法对尿液样本中的核酸进行高质量提取，临床实验室通常对尿液简单离心后，使用常规的trizol法提取rna，获得的rna浓度通常可以满足要求，但无法获得稳定的rt-qpcr结果，rna碎片化程度过高，更无法进行rnaseq测序。
20.根据第一方面，在一实施例中，提供一种处理样本的方法，包括：
21.离心步骤，包括对待测样本进行离心，然后移去上清液，得到离心后的沉淀；
22.漂洗步骤，包括使用缓冲液重悬所述沉淀，然后移去上清液，得到漂洗后的沉淀；
23.过滤步骤，包括使用缓冲液稀释沉淀，过滤，取经过滤膜的液体，即为过滤后的样本。
24.在一实施例中，本发明的处理对象主要是尿液(也包括羊水等其他体液样本)中的脱落上皮细胞，具有完整的细胞结构，不同于现有技术中所提取的外泌体、尿蛋白等物质。因此，本发明的富集目标不同，离心分离等具体的处理方法也不同。
25.在一实施例中，所述待测样本包括体液样本。
26.在一实施例中，所述体液样本包括但不限于尿液、羊水中的至少一种。
27.在一实施例中，离心时，温度为2～8℃，低温离心减少因离心机运行时间过长导致的腔体内温度升高，对细胞有保护作用。温度包括但不限于2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃。
28.在一实施例中，离心时，转速为1600rpm(转/分)，时间为10min。
29.在一实施例中，所述缓冲液包括但不限于杜氏磷酸盐缓冲液(亦称dpbs溶液)。
30.在一实施例中，过滤时，滤膜孔径可以为40μm。使用40μm滤膜的目的是让细胞通过滤膜，同时去掉大分子物质或杂质。
31.在一实施例中，还包括对过滤后的样本再次离心，得到的沉淀即为离心后的样本。
32.在一实施例中，再次离心的转速为1600rpm(转/分)，时间为10min。
33.在一实施例中，再次离心后，将所得沉淀与核酸保护剂混合，得到样本。该样本即为可进行核酸提取的样本。
34.在一实施例中，所述核酸保护剂包括但不限于rnalater等核酸保护剂。
35.在一实施例中，所述待测样本包含dna、rna中的至少一种。本发明富集的细胞，既
可用于dna提取，也可用于rna提取。
36.根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面所述方法处理得到的样本。
37.根据第三方面，在一实施例中，提供一种核酸提取方法，包括：
38.从第二方面所述样本中提取得到核酸。
39.在一实施例中，核酸提取所用的试剂盒可以从市场上购买得到，提取方法参照试剂盒说明书进行。
40.在一实施例中，所述核酸包括dna、rna中的至少一种。
41.在一实施例中，所述核酸为rna。
42.根据第四方面，在一实施例中，提供第三方面所述核酸提取方法提取得到的核酸。
43.根据第五方面，在一实施例中，提供一种测序文库，所述测序文库由第四方面所述核酸构建得到。
44.在一实施例中，文库构建所需试剂盒可从市场上购买得到，构建方法参照试剂盒说明书进行。
45.在一实施例中，本发明提供的方法如下：
46.使用无菌耗材采集约100ml尿液，避免大量饮水后采集。分装至2个50ml无菌离心管中。采集后立即4℃低温离心，转速1600rpm离心10分钟。以下操作全程在冰上操作，用移液管移去上清，管底留下约1ml左右体积，加入10ml 1
×
dpbs重悬沉淀，重复一次；加入1ml dpbs，用移液管轻轻吹打沉淀并将悬液经40μm的细胞过滤器转移到新的离心管中；1600rpm离心10分钟，去掉上清，加入1ml rnalater核酸保护剂，将新的悬液转移到无菌酶免冻存管中。
47.样本可在4℃保存2天，-20℃长期保存。采用trizol法提取rna，所提取核酸质量无明显变化。
48.尿液成分复杂，杂质多时对核酸提取效率有较大影响，在一实施例中，本发明经离心、漂洗、过滤等步骤处理后，可获得少量杂质较少的尿液中的上皮细胞。
49.在一实施例中，本发明向细胞沉淀中加入了rnalater保护剂，该试剂可有效保护尿液上皮细胞在4℃维持完整形态，减少rnase的释放造成的rna降解，且无需超低温运输及储存，更便于临床采纳该方法。
50.实施例1：
51.试剂：dpbs溶液(即杜氏磷酸盐缓冲液，且不含钙镁)，rnalater保护剂。
52.耗材：无菌采尿杯，无菌酶免50ml尖底离心管，40μm细胞过滤器。
53.仪器：离心机，移液器。
54.实验步骤如下：
55.1、使用无菌耗材采集约100ml新鲜尿液，避免大量饮水后采集。
56.2、将尿液等分至2个50ml无菌离心管中。
57.3、采集后立即4℃低温离心，转速1600rpm离心10分钟。低温是为了保护细胞，离心是为了富集细胞。
58.4、在冰上完成以下操作：用移液管移去上清，管底留下约1ml左右体积，加入10ml1
×
dpbs重悬沉淀，弃去上清，重复一次。该步骤旨在洗涤细胞。
59.5、加入1ml预冷的dpbs，用移液管轻轻吹打沉淀并将2管离心管中的悬液经40μm的
细胞过滤器转移到1个新的离心管中，取过滤后的液体。加入预冷的dpbs的作用是洗涤、稀释、便于下一步过滤。过滤的作用是去除大分子和杂质。
60.6、1600rpm离心10分钟(离心的作用为富集细胞)，去掉上清，加入1ml rnalater核酸保护剂，将新的悬液转移到无菌酶免冻存管中。
61.7、采用trizol法提取经处理后的样本的rna并使用zymo的rna纯化试剂盒对rna进行纯化，使用nanodrop测得rna纯度为a260/280＝1.969，a260/230＝2.064，rna浓度为20.64ng/μl，rna完整性指标rin＝5.8。根据rna的完整性程度可使用去核糖体rna的rna建库试剂盒进行rna文库构建并可用于下游rnaseq。
62.实施例2
63.试剂、耗材、仪器与实施例1相同。采集约300ml新鲜尿液，等分成6份。实验步骤如下：
64.1、使用无菌耗材采集约300ml新鲜尿液，避免大量饮水后采集。
65.2、将尿液等分至6个50ml无菌离心管中。
66.3、采集后立即4℃低温离心，转速1600rpm离心10分钟。
67.4、在冰上完成以下操作：用移液管移去上清，管底留下约1ml左右体积，加入10ml 1
×
dpbs重悬沉淀，弃去上清，重复一次。
68.5、加入1ml预冷的dpbs，用移液管轻轻吹打沉淀并将离心管中的悬液经40μm的细胞过滤器转移到1个新的离心管中。
69.6、1600rpm离心10分钟，去掉上清，加入1ml rnalater核酸保护剂，将新的悬液转移到无菌酶免冻存管中，编号1～6。
70.7、样本1～6的存储条件如下：
71.表1
72.样本编号存储温度(℃)存储时间14采集当天立即提取241天342天4-201个月5-203个月6-206个月
73.8、采用trizol法提取经处理后的样本的rna并使用zymo的rna纯化试剂盒对rna进行纯化，rna质检结果如下：
74.表2
[0075][0076]
[0077]
a260/280在1.7～2.0之间较好，a260/230在2.0左右较好，a260/280、a260/230用于表征所提取rna的纯度；从表2可以看出，从本实施例富集的尿液细胞中提取的rna满足前述要求。并且，rin值较高，说明提取的rna完整性较好。如果不用本实施例的方法采集尿液，rna的rin值多在1～3左右。
[0078]
从表2可见，新鲜采集的尿液样本，采用本实施例的方法富集细胞，样本4℃存放2天，提取的rna质量没有明显下降，即rna纯度、浓度较当天提取样本基本无变化，rin值有轻微降低，但仍然满足下游建库要求；样本-20℃存放6个月，提取的rna质量没有明显下降，即rna纯度、浓度较当天提取样本变化不大，rin值有所降低，但仍然满足下游建库要求。
[0079]
对比例1
[0080]
本对比例的方法如下：采用与实施例2相同来源的尿液样本，尿液采集后1600rpm离心10分钟，去上清，向沉淀中直接加入1ml trizol轻吹沉淀，-80℃存储2天，用于模拟干冰条件运输2天，经与实施例1相同的核酸提取方法获得rna。使用nanodrop测得rna浓度为7.96ng/μl，rin＝1.3。rin值过低，说明rna降解非常严重，无法进行下游建库。
[0081]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。