EHBP1L1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用的制作方法

ehbp1l1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用
技术领域
1.本发明涉及人乳腺癌细胞治疗领域，特别涉及ehbp1l1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用。


背景技术：

2.乳腺癌是我国乃至全球最常见的恶性肿瘤之一。随着医学技术的不断进步，近年来乳腺癌患者整体生存和预后有所改善，但肿瘤转移和浸润性生长仍是乳腺癌死亡主要的原因，因此及时阻断肿瘤细胞的浸润和转移是治疗乳腺癌和降低乳腺癌死亡率的重要路径。乳腺癌是一种异质性肿瘤，其发生发展是一个多步骤、多阶段、多因素共同参与的过程。
3.ehbp1l1基因是一个位于11号染色体上的(11q13.1)的蛋白质产物基因。目前关于ehbp1l1基因仅有少量的文献报道，其功能研究值得进一步探索。一项关于血压调节中的基因-年龄交互作用的研究发现，血压与ehbp1l1基因座之间存在明显关联，该基因位点仅在欧洲血统的个体中通过基因-年龄交互作用研究中被发现，表明该基因村早潜在的种族间异质性。另外，ehbp1l1在肿瘤中研究也有报道，wei等利用5-cpg分类器筛选出5个与cpgs相对应的基因，其中ehbp1l1的甲基化程度与基因表达呈显著负相关，这些已有的研究提示ehbp1l1基因可能在调控肿瘤进展中发挥不同的作用，包括肿瘤免疫反应、癌细胞增殖和上皮向间充质转化。
4.在抗癌药体外干预乳腺癌细胞时，发现抗癌药物作用于乳腺癌细胞时，细胞中ehbp1l1基因的表达水平明显下调，ehbp1l1基因可作为治疗乳腺癌分子靶点之一。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供ehbp1l1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用。涉及eh结构域结合蛋白1样1(eh domain-binding protein 1-like 1,ehbp1l1)基因在乳腺癌细胞中生物学功能的研究领域，是ehbp1l1基因作为用于开发抑制乳腺癌细胞增殖、转移和侵袭等方面的治疗靶点研究的理论依据。
7.为达到上述目的，本发明的技术方案为：
8.ehbp1l1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用。
9.进一步的，干扰目的基因ehbp1l1对人乳腺癌细胞mda-mb-231和t-47d有抑制其细胞增殖的作用。
10.一种针对ehbp1l1基因的rnai慢病毒载体，其能感染乳腺癌mda-mb-231细胞，使细胞内ehbp1l1基因表达沉默。
11.进一步的，所述慢病毒载体构建过程为：
12.步骤1、rna干扰靶点设计
13.根据rna干扰序列设计原则，以ehbp1l1基因为模板，设计多个19-21nt rna干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点。
[0014][0015]
步骤2、dna oligo序列合成
[0016]
根据已选靶点序列设计shrna干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加ttttt终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链dna oligo。
[0017][0018]
＊ccgg：agei酶切位点；aattc：ecori酶切位点；g：ecori酶切位点互补序列。
[0019]
步骤3、双链dna oligo制备
[0020]
将合成的单链dna oligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μm)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。
[0021]
步骤4、双链dna oligo与线性化的载体连接、转化、阳性克隆pcr鉴定。
[0022]
进一步的，所述慢病毒载体序列如seq id no.1所示。
[0023]
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
[0024]
本发明提供了ehbp1l1基因的新应用，干扰目的基因ehbp1l1对人乳腺癌细胞mda-mb-231和t-47d有抑制其增殖的作用；同时还提供了一种针对ehbp1l1基因的rnai慢病毒载体，其能感染乳腺癌mda-mb-231细胞，使细胞内ehbp1l1基因表达沉默，从而可以作为人乳腺癌细胞治疗药物。
附图说明
[0025]
图1为本发明的试验流程图；
[0026]
图2为qpcr检测mrna水平ehbp1l1基因消减效率图，其中a为mda-mb-231细胞，b为t-47d细胞；
[0027]
图3为检测ehbp1l1基因消减对细胞克隆形成能力的影响图，其中，a为mda-mb-231细胞，b为t-47d细胞；
[0028]
图4为facs检测ehbp1l1基因消减对凋亡的影响图，其中a为mda-mb-231细胞，b为t-47d细胞；
[0029]
图5为mtt检测ehbp1l1基因敲减对mda-mb-231细胞增殖影响图；
[0030]
图6为mtt检测ehbp1l1基因消减对t-47d细胞增殖影响图；
[0031]
图7为facs检测ehbp1l1基因消减对mda-mb-231细胞周期影响图；
[0032]
图8为facs检测ehbp1l1基因消减对t-47d细胞周期影响图；
[0033]
图9为western blot检测靶点降低mda-mb-231细胞ehbp1l1基因蛋白水平表达图；
[0034]
图10为western blot检测靶点降低t-47d细胞ehbp1l1基因蛋白水平表达图；
[0035]
图11为载体构建流程图。
具体实施方式
[0036]
下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：
[0037]
实验例：
[0038]
实验流程如图1所示：
[0039]
一、实验信息
[0040][0041]
二、功能检测实验数据
[0042]
前期已针对ehbp1l1基因，构建了目的基因rna干扰慢病毒载体。实验过程如下。
[0043]
1、载体构建流程如图11所示：
[0044]
2、rna干扰靶点设计
[0045]
根据rna干扰序列设计原则，以ehbp1l1基因为模板，设计多个19-21nt rna干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点。
[0046][0047]
3、dna oligo序列合成
[0048]
根据已选靶点序列设计shrna干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加ttttt终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链dna oligo。
[0049]
[0050]
＊ccgg：agei酶切位点；aattc：ecori酶切位点；g：ecori酶切位点互补序列。
[0051]
4、双链dna oligo制备
[0052]
将合成的单链dna oligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μm)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。
[0053]
5、双链dna oligo与线性化的载体连接、转化、阳性克隆pcr鉴定
[0054]
阳性克隆测序结果分析
[0055]
以鉴定引物-f进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。
[0056]
psc70355测序结果所述慢病毒载体序列如seq id no.1所示
[0057]
gcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggggccaaagagtggacatttatctcgagataaatgtccactctttggcctttttgaattctcgacctcgagacaaatggcagtattcatccacggatcctaacccgtgtcggctccaacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagta
[0058]
＊shrna干扰序列插入片段用黑体字体标注，其中agei酶切位点被破坏。
[0059]
如图2所示为qpcr检测mrna水平ehbp1l1基因消减效率经shrna慢病毒感染3天后，实验组mda-mb-231和t-47d细胞中ehbp1l1基因在mrna水平的表达量受到抑制。
[0060]
实验过程：
[0061]
1、细胞总rna抽提：收集细胞(6孔板80％细胞密度)，2000rpm离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1ml trizol，充分混匀后室温静置5min，然后转秱至新的1.5ml ep管中；
[0062]
2、反转录获得cdna；使用promega m-mlv试剂盒；
[0063]
3、real-time pcr检测：按下列比例配置反应体系(12μl体系)：
[0064][0065]
4、数据分析
[0066]
相对定量分析f＝2-δδct
，δct＝目的基因ct值-内参基因ct值；-δδct＝nc组δct平均值-各样品δct值；2-δδct
反映各样品相对nc组样品目的基因的相对表达水平。
[0067]
如图3所示为检测ehbp1l1基因消减对细胞克隆形成能力的影响
[0068]
shrna慢病毒感染3天后，细胞铺于6孔板，mda-mb-231铺板量为600，8天后，观察克隆数，发现实验组mda-mb-231细胞集落数目减少。t-47d铺板量为1000，13天后，观察克隆数，发现实验组t-47d细胞集落数目减少。提示ehbp1l1基因与mda-mb-231和t-47d细胞的克
隆形成能力显著相关。
[0069]
实验过程：
[0070]
1、准备感染后细胞：将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化，完全培养基重悬，制成细胞悬液，计数。
[0071]
2、细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1000个细胞/孔，每个实验组设3个复孔。
[0072]
3、将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态。
[0073]
4、实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照，pbs洗涤细胞1次。
[0074]
5、每孔加入1ml4％多聚甲醛，固定细胞30-60min，pbs洗涤细胞1次。
[0075]
6、每孔加入洁净、无杂质结晶紫染液1000μl，染细胞10-20min。
[0076]
7、ddh2o洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照，克隆计数。
[0077]
如图4所示：facs检测ehbp1l1基因消减对凋亡的影响
[0078]
shrna慢病毒感染5天后，实验组发生凋亡的mda-mb-231和t-47d细胞显著增加，提示ehbp1l1基因与mda-mb-231和t-47d细胞的凋亡显著相关。
[0079]
实验过程：
[0080]
1、待各实验组6孔板细胞生长至覆盖率约为70％时药物诱导凋亡。
[0081]
2、细胞胰酶消化，完全培养基重悬，将贴壁细胞和上清细胞收集于同一5ml离心管中，每组设3个复孔。
[0082]
3、1300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的pbs洗涤细胞沉淀。
[0083]
4、1
×
bingding buffer洗涤细胞沉淀一次，1300rmp，3min离心，收集细胞。
[0084]
5、200μl 1
×
bingding buffer重悬细胞沉淀。
[0085]
6、加入10μl annexin v-apc染色，室温避光10-15min。
[0086]
7、根据细胞量，补加400
‑‑
800μl 1
×
bingding buffer，上机检测。
[0087]
8、结果分析。
[0088]
如图5.6所示：mtt检测ehbp1l1基因消减对细胞增殖的影响
[0089]
经shrna慢病毒感染3天后，细胞铺于96孔板，铺板数为2000。连续检测5天，发现实验组mda-mb-231细胞的增殖速率受到显著抑制，t-47d细胞的增殖速率有微弱的减缓，提示ehbp1l1基因与mda-mb-231细胞的增殖能力显著相关与t-47d细胞的增殖能力无关。
[0090]
实验过程：
[0091]
1、胰酶消化好细胞，制作成重悬液，计数；
[0092]
2、用2000cell/well的密度铺板，每一个分组重复3次，铺板数为5张96孔板；
[0093]
3、细胞完全沉淀后，用显微镜观察各组的细胞密度，轻轻调整各组密度均匀后培养，5天后结束培养；
[0094]
4、培养终止前4h，每孔加入20μl、5mg/ml的mtt；
[0095]
5、4h后去除培养液，加100μl二甲基亚砜；
[0096]
6、振荡器振荡3min后，在490nm波长处检测od值；
[0097]
7、数据统计分析。
[0098]
如图7.8所示：facs检测ehbp1l1基因消减对周期的影响shrna慢病毒感染5天后，
mda-mb-231细胞，相比shctrl组，shehbp1l1组处于s期的细胞数目增多(p《0.05)，处于g1期的细胞数目无明显变化(p》0.05)，处于g2/m期的细胞数目减少(p《0.05)。t-47d细胞，相比shctrl组，shehbp1l1组处于s期、g1期的细胞数目无显著性差异(p》0.05)，处于g2/m期的细胞数目减少(p《0.05)，提示ehbp1l1基因与mda-mb-231和t-47d细胞的周期分布相关。
[0099]
实验过程：
[0100]
1、细胞感染后第4天传代，第6天检测。待各实验组6cm dish细胞生长至覆盖率约为80％时，这时细胞还未进入生长平台期，胰酶消化后制成细胞悬液，收集细胞于5ml离心管中，每组重复三次(细胞数目≥106/处理)；
[0101]
2、1300rpm，离心5min，弃上清，用4℃预冷的杜氏磷酸缓冲液(ph:7.2-7.4)来洗涤细胞，沉淀细胞1次；
[0102]
3、1300rpm,离心5min；
[0103]
4、细胞染色液配制：40
×
pi母液(2mg/ml)：100
×
rnase母液(10mg/ml)：1
×
杜氏磷酸缓冲液：25
×
tritonx-100＝25：10：1000：40；
[0104]
5、细胞染色：根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液(0.6-1ml)重悬，使上机时细胞通过率为300-800cell/s；
[0105]
6、将细胞上机检测dna含量；
[0106]
7、数据分析得出结果。
[0107]
如图9.10所示：western blot检测靶点降低ehbp1l1基因蛋白水平表达从western blot结果可以看出，在mda-mb-231和t-47d细胞中，靶点对ehbp1l1基因的内源表达在蛋白质水平有显著的敲减作用。
[0108]
统计分析：
[0109]
柱形图代表三次实验的平均值，误差线表示标准偏差(sd)。
[0110]
**,shctrl与目的基因shrna慢病毒处理组相比，p《0.01。
[0111]
*,shctrl与目的基因shrna慢病毒处理组相比，0.01《p《0.05。
[0112]
western blot检测步骤：
[0113]
(1)细胞总蛋白提取
[0114]
1)将实验所需的细胞用磷酸缓冲液洗涤两次。吸取适量的ripa裂解液，使用前几分钟内加入pmsf，调整pmsf的最终浓度为1mm；
[0115]
2)在细胞中加入适量的ripa裂解液后，将细胞放在冰上，裂解10min。将细胞刮下后，转移入新的ep管中，然后超声破碎细胞(40w共20次，每次1s，间隔2s)；
[0116]
3)设置离心机温度4℃、12000g，离心15min，吸取上清，用bca法测定蛋白浓度；
[0117]
4)加入新的裂解液，将每个样品的蛋白质浓度调为一致，一般为浓度调整为2μg/μl。接着加入1/5原体积的6xlodding buffer，混匀后用100度金属浴煮10min，短暂离心后，-80℃保存备用。
[0118]
(2)sds-page
[0119]
1)制胶：分离胶浓度为gapdh：10％，ehbp1l1：8％；
[0120]
2)电泳：电泳设置条件分别为浓缩胶80ma,20min；分离胶120ma,1h；
[0121]
(3)免疫印迹(此处用湿转法)
[0122]
待上一步的电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300ma恒流条件下电泳转移
150min，目的是将分离胶中的蛋白转移到pvdf膜上。
[0123]
(4)抗体杂交：
[0124]
1)用封闭液(此处用含有5％脱脂牛奶的tbst缓冲液)室温条件下封闭聚偏二氟乙烯膜(pvdf膜)，时间为1h或4℃过夜；
[0125]
2)一抗孵育：用封闭液稀释抗体，此处稀释倍数为anti-ehbp1l1：1:500,anti-gapdh：1:10000，然后将封闭好的pvdf膜室温孵育，时间为2h或者4℃过夜，并用tbst缓冲液清洗pvdf膜4次，每次时间为8min；
[0126]
3)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗，稀释倍数为anti hrp-goat anti rabbit：1:10000，接着在室温条件下孵育pvdf膜，时间为1.5个小时，并用tbst缓冲液清洗pvdf膜4次，时间为每次8min。
[0127]
(5)显影：
[0128]
1)将试剂盒中的a液和b液拿出，按照1:1的比例混合，颠倒混匀，放置3分钟后可使用；
[0129]
2)将pvdf膜取出，擦干上面残留的缓冲液，滴加上一步骤配置的适量混匀的ecl发光液，铺上一层保鲜膜(这一步是为了尽可能避免产生气泡)，在化学显色仪中曝光1min；
[0130]
3)将显好影的pvdf膜拍照，分析得到的结果。
[0131]
三、实验结论
[0132]
综合上述实验结果，证实干扰目的基因ehbp1l1对人乳腺癌细胞mda-mb-231和t-47d有抑制其增殖的作用。
[0133]
实验结果介绍
[0134]
抗癌中药体外干预乳腺癌细胞后，ehbp1l1基因表达下调，推测该基因是乳腺癌致癌性基因。
[0135]
构建针对ehbp1l1基因的rnai慢病毒载体，感染乳腺癌mda-mb-231细胞，使细胞内ehbp1l1基因表达沉默。随后研究ehbp1l1基因消减后对细胞生物学功能的影响，具体如下：
[0136]
1、细胞克隆能力：shrna慢病毒感染3天后，细胞铺于6孔板，8天后，观察克隆数，发现shehbp1l1组mda-mb-231细胞集落数目减少。提示ehbp1l1基因与mda-mb-231和t-47d细胞的克隆形成能力显著相关。
[0137]
2、细胞凋亡：shrna慢病毒感染5天后，shehbp1l1组发生凋亡的mda-mb-231和t-47d细胞显著增加，提示ehbp1l1基因与mda-mb-231和t-47d细胞的凋亡显著相关。
[0138]
3、细胞增殖：shrna慢病毒感染5天后，shehbp1l1组mda-mb-231细胞的增殖速率受到显著抑制
[0139]
4、细胞周期：shrna慢病毒感染5天后，shehbp1l1组处于s期、g1期的细胞数目无显著性差异(p》0.05)，处于g2/m期的细胞数目减少(p《0.05)。提示ehbp1l1基因与mda-mb-231和t-47d细胞的周期分布相关。
[0140]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。