一种用于荧光素酶长期储存的保存液的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于荧光素酶长期储存的保存液。


背景技术：

2.荧光素酶在一定条件下可以催化荧光素发出荧光，其发光强度在一定范围内和atp的浓度正相关，因此荧光素酶可以指示atp的浓度，用于食品生产过程及食品成品微生物指标的快速检测。荧光素酶也可应用于细胞的代谢研究、生物传感器、药物筛选等领域。
3.荧光素酶作为一个具有生物活性的蛋白，热稳定性很差，在水溶液中的稳定性也欠佳，在室温下容易失活，其活性的保持对检测极其重要。荧光素酶在干粉状态下在-20℃的环境下能保存数年，但是频繁的开启和使用仍会对其造成影响。荧光素酶干粉使用不便，配置时容易出现偏差。
4.荧光素酶配成溶液时，荧光素酶的稳定和活性非常的不稳定。要想保持较高的活性，必须要摸索出使荧光素酶在一定时间内保持稳定的条件。目前常用的保存方式是添加一定的保护剂后储存于低于-20℃的条件下，但该保存方式对于检测来讲比较繁琐，且受反复冻融次数的影响。所以根据酶本身的化学性质，找到更加合适的缓冲液以及保护剂，从而降低保存温度的要求，对于实际应用有重要的意义。另外，低浓度的荧光素酶液对保存条件更为敏感，难以保持其酶活性。因此现有技术中多针对高浓度的荧光素酶进行保存，但是在进行微量取样时，容易导致取样误差影响实验结果。
5.cn101463347a公开了一种虫荧光素酶稳定剂，包括下述组分：甘油80g/l－120g/l，海藻糖0.08－0.12mol/l，余量为双蒸水。本发明的虫荧光素酶稳定剂对虫荧光素酶的活性有保护作用，使虫荧光素酶对温度及冻融等因素不敏感，使用时分装保存在4℃冰箱中。虫荧光素酶稳定性加强，保存时间长，使用更为方便快捷。
6.cn101993858a公开了一种虫荧光素酶的保存缓冲液，所述保存缓冲液含有ph7.0～8.0的10～50mm tris-acetate，25～35％乙二醇，1～5mm edta，0.5～2mm dtt，0.5～2％bsa，和5～15％甘油。该保存缓冲液实质为裂解缓冲液，主要用于荧光素酶的分离纯化。该文件中，纯化得到的荧光素酶依然需要冻干以便长期保存。
7.cn105018457a公开了一种虫荧光素酶稳定剂，它包括以下组分：甘油100-250g/l，甘氨酸0.08-0.12mol/l，溶剂为双蒸水；本发明的虫荧光素酶稳定剂对虫荧光素酶的活性有保护作用，降低虫荧光素酶对温度及冻融等因素的敏感度，使虫荧光素酶在使用时只需分装保存在4℃的冰箱中即可，有效提高了虫荧光素酶的稳定性，延长了保存时间，使用更为方便快捷。其实验数据显示45h内，发光强度可以稳定。这种稳定剂显然难以满足更长时间，如1周以上时间的保存。
8.cn105121653a公开了用于荧光素酶和核苷磷酸的发光检测的稳定制剂，主要通过将d-荧光素、l-荧光素、荧光素酶复配，以提高荧光素酶的稳定性。使用阿伦尼乌斯方程来计算较低温度下的衰变率。在22℃，计算10％性能损失在8.6天时发生。在4℃，计算10％和50％损失分别在4.2个月和2年时发生。在-20℃，计算10％的损失在20年时发生。
9.现有技术中，基本没有可长期保持荧光素酶活性的液体制剂。开发出一种不需要冷冻保存且可以长期保持荧光素酶活性的液体制剂具有非常重要的意义。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于荧光素酶长期储存的保存液。
11.本发明所采取的技术方案是：
12.本发明的第一个方面，提供：
13.一种用于荧光素酶长期储存的保存液，其组成为：nacl 100～150mm、二价离子5～10mm、edta 1～2mm、二硫苏糖醇0.5～5mm、还原型谷胱甘肽0.5～5mm、热稳定保护剂0.5～5wt％，余量为ph缓冲液，ph 6.5～7.4；
14.所述二价离子选自mg
2
、ca
2
和mn
2
中的至少一种；
15.所述热稳定保护剂选自海藻糖和甜菜碱中的至少一种。
16.在一些实例中，还包括酪蛋白0.01～0.03wt％和/或防腐剂适量。。
17.在一些实例中，所述防腐剂为硫柳汞钠，其使用浓度为0.01～0.02wt％。
18.在一些实例中，所述ph缓冲液为hepes缓冲液，其在保存液中的浓度为20～50mm。
19.在一些实例中，所述二硫苏糖醇的终浓度为3～5mm。
20.在一些实例中，所述还原型谷胱甘肽的终浓度为0.5～2mm。
21.在一些实例中，所述热稳定保护剂为海藻糖，其终浓度为1～3wt％。
22.在一些实例中，所述保存液的组成为：nacl 150mm、mg
2
5mm、edta 1.5mm、二硫苏糖醇5mm、还原型谷胱甘肽0.5mm、海藻糖2wt％、酪蛋白0.02wt％，硫柳汞钠0.01～0.02wt％，余量为25mm的hepes缓冲液，ph 6.5～7.4。
23.本发明的第二个方面，提供：
24.一种荧光素酶液，通过将将荧光素酶分散于本发明第一个方面所述的保存液得到。
25.在一些实例中，荧光素酶的浓度为0.08～0.65mg/ml。
26.本发明的第三个方面，提供：
27.一种atp检测试剂盒，其包括本发明第二个方面所述的荧光素酶液。
28.本发明的有益效果是：
29.本发明一些实例的保存液，可使荧光素酶在2～8℃稳定保存约1年，极大地方便了荧光素酶的使用。
附图说明
30.图1是保存液4在不同条件下保存14天后的检测结果；
31.图2是保存液6在不同条件下保存14天后的检测结果；
32.图3是不同荧光素酶保存液的线性比较结果。
具体实施方式
33.本发明的第一个方面，提供：
34.一种用于荧光素酶长期储存的保存液，其组成为：nacl 100～150mm、二价离子5～10mm、edta 1～2mm、二硫苏糖醇0.5～5mm、还原型谷胱甘肽0.5～5mm、热稳定保护剂0.5～5wt％，余量为ph缓冲液，ph 6.5～7.4；
35.所述二价离子选自mg
2
、ca
2
和mn
2
中的至少一种；
36.所述热稳定保护剂选自海藻糖和甜菜碱中的至少一种。
37.配置时，先将edta与ph缓冲液混合，之后加入其他组分。
38.edta与mg
2
、ca
2
或mn
2
络合后，依然是一种水溶性的组分，络合反应的结合力较弱，有一定浓度的二价离子可以游离参与反应。当反应体系中存在其他与edta结合力更强的二价离子时，可以将mg
2
、ca
2
或mn
2
置换出来。二价离子的作用在于提高atp与酶分子结合的能力并促进光子产生。根据已有的研究结果，mg
2
、ca
2
和mn
2
均能较好地促进atp与酶分子结合及光子产生。mg
2
的效果更佳，是更佳的选择。
39.edta用于维持合适的金属离子浓度，达到提高酶活性，增加发光强度的目的。其浓度可以根据需要进行一定的调整。edta的终浓度在1.5
±
0.5mm内，可以更好地维持所需要的金属离子浓度。
40.二硫苏糖醇(dtt)、还原型谷胱甘肽(gsh)的作用在于进一步提高酶活性，保护荧光素酶上的还原性氨基酸不被氧化。本发明的实验数据显示dtt和gsh具有协同作用，二者联用具有更好的效果。
41.热稳定保护剂的作用主要在于维持酶的热稳定性。
42.在一些实例中，所述保存液还添加有蛋白类保护剂0.01～0.04wt％和/或防腐剂适量；所述蛋白类保护剂选自酪蛋白、bsa和白蛋白中的至少一种。蛋白类保护剂可以进一步提高荧光素酶的稳定性。
43.防腐剂只要不影响后续的检测反应即可，在一些实例中，所述防腐剂为硫柳汞钠，其使用浓度为0.01～0.02wt％。实验数据表明，硫柳汞钠不会影响荧光的产生，可以更好地保证检测效果。
44.在一些实例中，所述ph缓冲液为hepes缓冲液，其在保存液中的浓度为20～50mm。
45.在一些实例中，所述二硫苏糖醇的终浓度为3～5mm。
46.在一些实例中，所述还原型谷胱甘肽的终浓度为0.5～2mm。
47.在一些实例中，所述热稳定保护剂为海藻糖，其终浓度为1～3wt％。
48.在一些实例中，所述蛋白类保护剂为酪蛋白，其终浓度为0.01～0.03wt％。
49.在一些实例中，所述保存液的组成为：nacl 150mm、mg
2
5mm、edta 1.5mm、二硫苏糖醇5mm、还原型谷胱甘肽0.5mm、海藻糖2wt％、酪蛋白0.02wt％，硫柳汞钠0.01～0.02wt％，余量为25mm的hepes缓冲液，ph 6.5～7.4。
50.本发明的第二个方面，提供：
51.一种荧光素酶液，通过将将荧光素酶分散于本发明第一个方面所述的保存液得到。
52.在一些实例中，荧光素酶的浓度为0.08～0.65mg/ml。这种低浓度的荧光素酶液可以减少取样误差，同时使用时也不用进一步稀释，使用更加方便。
53.本发明的第三个方面，提供：
54.一种atp检测试剂盒，其包括本发明第二个方面所述的荧光素酶液。
55.下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
56.实施例1：
57.保存液的热稳定性验证方法具体如下：
58.采用25mm hepes的缓冲液，分别配制以下保存液1-7，保存液1-7的组成如下：
59.保存液1：nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm；
60.保存液2：nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm、海藻糖1％；
61.保存液3：nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm、海藻糖1％、gsh 0.1mm；
62.保存液4：nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm、海藻糖2％、gsh 0.5mm；
63.保存液5：nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm、甜菜碱2％、gsh 0.5mm；
64.保存液6：nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm、海藻糖2％、gsh 0.5mm、酪蛋白0.02％；
65.保存液7：nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm、海藻糖2％、gsh 0.5mm、bsa 0.25％。
66.配制方法如下：
67.1)搅拌使其充分溶解后，调ph至7.4；
68.2)将配制好的保存液采用0.22μm滤膜过滤除杂灭菌；
69.3)采用配制好的保存液作为荧光素酶保存液及稀释液，对高浓度的荧光素酶进行稀释，至荧光素酶的终浓度为0.65mg/ml，对不同配方的14天的热稳定性进行研究；
70.4)检测：
71.a)先进行atp校准品的准备和配制，配制好的800ng/ml atp校准品每孔加入70ul至反应板中；
72.b)不同配方保存的荧光素酶分别进行反应工作液的配制，将反应液、荧光素酶、荧光素底物按照1000:3:24配制成反应液工作液，每孔加入70ul的反应工作液，室温静置1min；
73.c)采用多功能酶标仪进行读板，计算其下降比例。
74.结果如表1所示。
75.表1
76.77.由表1的数据可知：
78.1)保存液1和保存液2的效果对比可知，海藻糖的加入可以显著提升保存液的热稳定性；
79.2)保存液3通过在保存液2的基础上进一步增加gsh，进一步显著提升了保存液的稳定性；
80.3)保存液4的海藻糖和gsh用量相较保存液3增加，使得保存液保存效果进一步显著提升；
81.4)保存液5中使用甜菜碱替代海藻糖，保存液的保存效果未有显著变化，说明甜菜碱在本发明中也是优异的热稳定保护剂；
82.5)保存液6在保存液4的基础上进一步增加了适量蛋白保护剂酪蛋白，保存液的效果进一步提高了；
83.6)保存液7使用bsa替换了酪蛋白，其效果略差于保存液6，但无显著差异；
84.7)保存液4和保存液6的37℃下14天(相当于4℃保存1年)的加速稳定性试验显示不超过10％的衰减，具有良好的稳定性。
85.缓冲液种类对荧光素酶保存稳定性的影响
86.分别使用25mm的hepes和tris缓冲液配制荧光素酶液(ph＝7.4)，其余组分的浓度为：nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm、海藻糖2wt％、gsh 0.5mm、酪蛋白0.02wt％。对得到荧光素酶液进行14天的热稳定性测试，结果如表2所示。
87.表2
[0088][0089]
由表2的数据可知，hepes和tris缓冲液的效果差别不大，说明hepes和tris缓冲液均可用于配制本发明的荧光素酶液。
[0090]
实施例2：不同ph环境下的稳定性研究
[0091]
对相对较稳定的保存液4和保存液6，不同ph环境下的稳定性进行研究，调整前ph为7.4，分别调整保存液的ph至6.5(偏酸性环境)及8.5(碱性环境)，实验组共4组，分别对荧光素酶进行保存，荧光素酶浓度为0.65mg/ml，对热稳定性进行研究，检测方法同实施例1。实验结果如表3所示。
[0092]
表3
[0093][0094]
由表3的数据可知，保存液4和保存液6可稳定保存于偏酸性环境中，不能稳定保存于偏碱性环境中，因中性生理环境的ph为7.4，因此，缓冲液的ph优选为6.5～7.4，更佳的选择为7.4。
[0095]
实施例3：保存体系针对不同浓度的荧光素酶的保存
[0096]
荧光素酶在较低浓度时，更不易保存，稳定性更差，且易发生降解，虽然高浓度的荧光素酶较低浓度易保存，但由于在配置反应工作液时，反应液、荧光素酶、荧光素底物按照1000：3：24的比例进行配置，高浓度荧光素酶在微量取样时，取样误差较大，而当取样低浓度保存的荧光素酶，可极大降低其取样误差，提高实验的精准度。为此对不同浓度的荧光素酶稳定性进行检测。
[0097]
采用ph＝7.4的上述保存液4和保存液6作为荧光素酶保存液，并分别用对应保存液对荧光素酶进行一定比例稀释，使其终浓度分别为0.65mg/ml，0.1625mg/ml，0.0813mg/ml，即在0.65mg/ml基础上稀释4倍和8倍。稀释过的荧光素酶分别在不同条件下保存14天后进行检测，检测方法同实施例1。实验结果如表4、图1和图2所示。
[0098]
表4
[0099] 保存液4保存液6-20℃原倍6415.95194.6-20℃稀释4倍4158.14737.04℃稀释4倍3575.64568.237℃稀释4倍3447.04540.5-20℃稀释8倍3069.44434.84℃稀释8倍2490.84121.037℃稀释8倍2442.64084.0
[0100]
由表4的实验数据可知，在﹣20℃条件下，保存液4通过4倍和8倍稀释后检测，经37℃加速14天后发光值下降在20％左右，保存液6通过4倍和8倍稀释后检测，经37℃加速14天后发光值下降不到10％，发光值随着荧光素酶的稀释倍数变化较小，可以满足较低浓度的荧光素酶保存。
[0101]
实施例4：不同荧光素酶液的稳定性比较
[0102]
本发明荧光素酶液的组成为：hepes缓冲液(25mm，ph7.4)、nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm、海藻糖2wt％、gsh 0.5mm、酪蛋白0.02wt％。
[0103]
cn102559847a荧光素酶液由稳定剂与生物发光试剂按体积比为1：2的比例混合，其中：稳定剂的组成为：tris缓冲液(25mmol/l，ph7.8)、海藻糖0.3mol/l，gsh 2mmol/l，edta 0.1mmol/l；生物发光试剂的组成为：荧光素0.8mg/ml、荧光素酶0.036mg/ml、氯化镁10mm、牛血清白蛋白0.11mm、乙二胺四乙酸2mm、二硫苏糖醇1mm、tris-hcl(100mm)ph7.8。
[0104]
两种荧光素酶液进行加速7天热稳定性实验，实验结果如表5所示。
[0105]
表5
[0106][0107]
由表5的实验数据可知，cn102559847 a的荧光素酶液衰减70％左右，与cn102559847a中的记载不一致，根据arrhenius公示推算cn102559847 a的荧光素酶液在4℃的保存稳定期为3个月左右。
[0108]
实施例5：防腐剂的选择
[0109]
选择上述s1配方的荧光素酶，在该配方基础上分别添加不同的防腐剂，其中对照为不添加防腐剂，叠氮钠添加浓度为0.01-0.02％，硫柳汞钠添加浓度为0.01～0.02％，双抗添加浓度为青霉素0.05-0.5ku/ml；链霉素0.05-0.5mg/ml。检测方法同实施例1。实验结果如表6所示。
[0110]
表6
[0111]
防腐剂-20℃37℃对照9898.99167.9叠氮钠5292.1917.6硫柳汞钠7207.27208.5双抗6830.33997.6
[0112]
从表6可知，添加叠氮钠对荧光素酶的活性有明显的抑制作用，双抗次之，而添加一定浓度的硫柳汞钠在能够保证其稳定性。
[0113]
实施例6：与现有荧光素酶保存液的性能对比
[0114]
专利荧光素酶保存液的组成为：甘油100g/l，海藻糖0.1mol/l，gsh 0.5mmol/l，dtt 0.5mmol/l，余量为水(cn101463347a的最佳组合)。
[0115]
本发明荧光素酶保存液的组成为：nacl 150mm、mgso
4 5mm、edta 1.5mm、dtt 5mm、海藻糖2wt％、gsh 0.5mm、酪蛋白0.02wt％。
[0116]
检测4℃和37℃加速7天后的本发明荧光素酶保存液和专利荧光素酶保存液的校曲线性及发光值差异，判断加速稳定性是否良好。检测方法同实施例1。
[0117]
实验结果如表7和图3所示。
[0118]
表7
[0119][0120]
表注：rlu偏差以800ng/ml计，37℃/4℃。
[0121]
从表7和图3可知：
[0122]
1)4℃和37℃的本发明荧光素酶加速7天的发光值差异小于10％，稳定性好，两者线性良好；
[0123]
2)4℃和37℃专利荧光素酶加速7天的发光值差异为83.52％，说明37℃专利荧光素酶的发光值较4℃衰减了80％以上，稳定性差。本发明配方在稳定性上比专利配方更好。
[0124]
实施例7：atp检测试剂盒的应用
[0125]
该试剂盒用于检测细胞裂解后产生的atp。
[0126]
1)样本准备：取细胞裂解完成后的裂解物70ul至反应微板条；
[0127]
2)反应：将反应液、本发明荧光素酶、荧光素底物按照1000:3:24配制成反应液工作液，每孔加入70ul的反应工作液，室温静置1min；
[0128]
3)读数：使用多功能酶标仪读取全波长下发光值。
[0129]
样本来源：人外周血中分离的pbmc细胞。
[0130]
取2份pbmc细胞裂解完成后的样本，其中1份细胞浓度为另1份的一半，采用复孔检测，检测结果如下所示表8。
[0131]
表8
[0132][0133]
由表8的数据可知，2份样本atp检测值有很好的倍数关系，检测值也较稳定。
[0134]
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。