一株解淀粉芽孢杆菌W0101及其应用

一株解淀粉芽孢杆菌w0101及其应用
技术领域
1.本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌w0101及其应用。


背景技术：

2.随着世界人口的迅速倍增，农业生产的绿色健康发展已经成为维持整个社会安定，促进国家发展和人民幸福的头等大事，然而全世界每年农林业因病虫害造成的损失占总产值的37%，每年的经济损失高达1260亿美元。尽管化学农药的使用在一定程度上缓解了农作物病害频发的问题，但近年来化学农药的滥用也带来病原微生物抗药性增加，环境污染以及农产品中药物残留超标等问题，直接危害人类健康和生态环境等。因此，研发对人类和环境友好、防治效果优良的植物病害防治新策略尤为重要。生物防治是利用微生物或其活性产物来防治农作物病虫害，具有安全高和防治效果好的优点，已经成为当前控制农作物病虫害的重要途径，其中活性微生物筛选是不可或缺的关键环节。
3.北极拥有非常丰富的生物资源。干燥、酷寒、强辐射等极端环境使得极地生物在在繁殖、发育、生长及代谢等方面都具有不同于陆地生物的显著特征，其代谢产物与陆地生物的代谢产物相比，在组成、结构及生物学活性等方面可能表现出不同的特性。因此，极地生物已成为前研开安全、高效新型生物农药的新来源。
4.芽孢杆菌（bacillus sp.）是一类兼性厌氧或者好氧，可产生芽孢的革兰式阳性杆菌的总称，其种类繁多，在自然界中广泛存在。芽孢杆菌能通过同化作用产生抗菌物质，抑制有害病原微生物的生长或者直接杀死病原微生物。由于芽孢杆菌具有抗逆性强、繁殖速度快、营养要求简单等特点，使其在植物病害生物防治中被广泛的研究和利用。目前已有部分生防芽孢杆菌成功地应用于植物病害生物防治，如由澳大利亚开发的bacillus subtilis a-13对麦类和胡萝卜立枯病以及其他病害具有很好的防治和增产作用，而我国南京农业大学王金生等也同样利用枯草芽孢杆菌bacillus subtilis b1防治大白菜软腐病，取得较好的防治效果。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明首先提供了一株解淀粉芽孢杆菌w0101，所述菌株分类命名为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101，其分离自中国第六次北极科学考察所采集的泥土样品（168
º
09
′
41
′′
w，69
º
13
′
37
′′
n）；该菌已于2021年9月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏中心保藏编号为cctcc no：m 20211201。
7.通过聚合酶链式反应（pcr）扩增上述解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101的16s rdna序列，并与美国国家生物技术信息中心（ncbi）
genbank数据库中相应的序列进行比对分析，发现其与芽孢杆菌属（bacillus amyloliquefaciens）具有99.93%的序列相似性。
8.体外抑菌实验表明，上述解淀粉芽孢杆菌w0101对核盘菌、镰刀菌、长柄链格孢、绿色木霉、胶孢炭疽菌、立枯丝核菌、梨黑斑菌、梨炭疽菌、宛氏拟青霉具有抑制作用。
9.本发明还提供了上述解淀粉芽孢杆菌w0101在防治植物病害中的应用；其中，所述应用的具体方法为：将解淀粉芽孢杆菌w0101发酵上清液喷洒于植物表面；其中，所述植物病害包括油菜菌核病和小麦赤霉病；其中，所述解淀粉芽孢杆菌w0101的发酵上清液的制备步骤如下：1）活化：将解淀粉芽孢杆菌w0101单菌落接种于5 ml的lb液体培养基中进行活化培养，得到种子液；2）扩培：按照1vol%的接种量将种子液转接于lb液体培养基中进行发酵培养，得纯培养物；3）离心：将纯培养物离心，收集上清液，即得解淀粉芽孢杆菌w0101发酵上清液；其中，所述lb液体培养基的配方为：氯化钠10 g/l，胰蛋白胨10 g/l，酵母提取物5 g/l；121℃高灭压菌20 min；其中，所述活化培养的条件为：温度28℃，摇床转速200 rpm，时间12 h；其中，所述发酵培养的条件为：温度28℃，摇床转速200 rpm，时间60 h；其中，所述离心条件为：转速10000 rpm，时间15 min。
10.与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明解淀粉芽孢杆菌w0101抑制真菌谱广，生防效果好，其发酵上清液的制备工艺简单，在油菜菌核病和小麦赤霉病的田间防治试验中显示出较好的生物防治效果，防效均可达74%以上，高于市售化学农药的防治效果。
附图说明
11.图1为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101的菌落形态图。
12.图2为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101的发酵上清液对不同植物致病真菌的抑菌效果图。其中：a：立枯丝核菌；b：胶孢炭疽菌；c：镰刀菌；d：绿色木霉；e：宛氏拟青霉；f：梨黑斑；g：长柄链格孢；h：核盘菌；i：梨炭疽。
具体实施方式
13.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
14.实施例1 解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101的分离筛选解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101分离自申请人从中国第六次北极科学考察所采集的泥土样品。首先将沉积物样品用无菌海水梯度稀释至10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
、10-8
、10-9
、10-10
，分别取100 μl不同梯度的稀释液均匀的涂布在2216e固体培养基平板上，每个梯度做三个平行重复，并放置在28℃培养箱中培养48 h。根据菌落的形态、颜色等特征，挑取单菌落划线于2216e培养基中，直至一个培养基中菌落的
形态和颜色等特征基本一致，则完成菌株的分离纯化，将该菌株命名为w0101。
15.将w0101菌株接种到2216e琼脂培养基（蛋白胨5g，酵母提取物1g，磷酸高铁0.1g，琼脂粉10g，ph 7.6~7.8，陈海水定容到1l）上，28℃培养24 h后，其菌落呈乳白色不透明圆形，表面光滑，无褶皱突起，菌落四周有波状晕圈（图1）。
16.实施例2 解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101的菌种鉴定利用16s rdna通用引物27f和1492r（27f：agagtttgatcctggctcat；1492r：acggctaccttgttacgactt）对北极来源菌株w0101的16s rdna 序列进行扩增。以w0101菌株基因组dna为pcr扩增模板，在pcr扩增仪上进行pcr反应。反应条件为：94℃变性1 min；55℃退火1 min ；72℃延伸1.5 min，30个循环。扩增序列经测序公司测序后，获得该菌株16s rdna序列（seq id no.1）。将该序列通过与美国国家生物技术信息中心genbank中核酸数据进行比对分析（http://ncbi.nlm.nih.gov/blast）。结果显示，菌株w0101的16s rdna序列与bacillus amyloliquefaciens（ky685066.1）、bacillus amyloliquefaciens（mt233097.1）及bacillus amyloliquefaciens（jf496500.1）等菌株的序列相似性为99.93%，即菌株w0101与芽孢杆菌同源，因此，确定菌株w0101为解淀粉芽孢杆菌bacillus amyloliquefaciens。
17.实施例3 植物致病真菌抗菌谱的测定制备解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101的发酵上清液。首先将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101单菌落接种到5 ml的lb液体培养基中，在28℃、摇床转速200 rpm的条件下活化培养12 h，得到种子液；然后将种子液按1vol%的接种量转接至新的lb液体培养基，在28℃、摇床转速200 rpm的条件下发酵培养60 h，得到纯培养物；发酵培养结束后，将纯培养物在10000 rpm的条件下离心15 min以除去菌体，收集上清液，即为解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101的发酵上清液。其中，所述lb液体培养基的配方为：氯化钠10 g/l，胰蛋白胨10 g/l，酵母提取物5 g/l；121℃高灭压菌20 min。
18.采用纸片法测定解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101发酵上清液对9种植物致病真菌的抑制活性。用无菌打孔器将受试致病真菌制成菌饼（直径6 mm），用牙签挑取一菌块接种于马铃薯固体培养基平板中央，28℃的条件下培养，待受试致病真菌菌丝体扩散生长后，将灭菌的双层滤纸片(直径6 mm) 放置于菌块四周，滤纸片距离菌丝边缘约1 cm。在每个滤纸片上加60 μl解淀粉芽孢杆菌w0101发酵上清液，以无菌水为对照，继续培养24 h，通过与对照组比较，观测菌丝体的生长是否会受到抑制，若受试致病真菌的菌丝体受到抑制，菌丝体会形成月牙型或者线型边缘。结果如表1和图2所示，解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101发酵上清液对核盘菌、镰刀菌、长柄链格孢、绿色木霉、胶孢炭疽菌、立枯丝核菌、梨黑斑菌、梨炭疽菌和宛氏拟青霉9种受试植物致病真菌均具有抑制活性。
19.表1 w0101抑制相关致病真菌的抑菌直径表
（注：有抑菌圈且抑菌圈直径《10mm为有抑菌作用，抑菌圈直径10-14mm为中强抑菌，抑菌圈直径15-20mm为高强抑菌，抑菌圈直径20mm以上为极强抑菌作用）实施例4 油菜菌核病（核盘菌）的生物防治田间试验供试油菜品种为丰油737。田间试验设置9个小区，每小区面积30 m2，采用解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101菌株10倍稀释发酵上清液进行防治油菜菌核病（sclerotinia sclerotiorum）的田间试验，并用40%菌核净可湿性粉剂和清水作为对照，每组处理重复3次，具体试验设计如下表所示：表2 油菜菌核病生物防治田间试验具体试验设计于油菜盛花后期，将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101发酵上清液的10倍稀释液、40wt%菌核净可湿性粉剂300倍稀释液、清水分别用小型喷雾器（容量500 ml）进行均匀喷雾，用药液量为450 l/hm2，药剂不留残液。37天后调查油菜菌核病的病株数和病情等级，具体标准如下：0级：无病；1级：一个大分枝发病或主茎3cm左右发病；2级：两个大分枝发病或主茎3～7cm发病；3级：三个大分枝发病或主茎7～10cm发病；4级：四个以上大分枝发病或主茎10cm以上发病。
20.按下式计算油菜菌核病的病情指数：病情指数=∑（各级病株数
×
该病级值）/（调查总株数
×
最高级值）
×
100
每小区调查油菜50株，分成5点，每点10株，平行线取样。油菜菌核病防治效果按下式计算：计算结果表明（表3），解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101对油菜菌核病的防效高达74.09%，高于化学药剂40wt%菌核净的防治效果。
21.表3 解淀粉芽孢杆菌w0101防治油菜菌核病试验结果实施例5 小麦赤霉病（镰刀菌）的生物防治田间试验供试小麦品种为宁麦13。田间试验设置12个小区，每小区面积40 m2，采用解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101菌株发酵上清液进行防治小麦赤霉病（fusarium graminearum）的田间试验，并用50wt%多菌灵可湿性粉剂、43wt%戊唑醇悬浮剂和清水作为对照，每组处理重复3次，具体试验设计如下表所示：表4 小麦赤霉病生物防治田间试验具体试验设计于小麦处于扬花期，将解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101发酵上清液的10倍稀释液、50%多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液、43%戊唑醇悬浮剂2000倍稀释液和清水分别用小型喷雾器（容量500 ml）进行均匀喷雾，用药液量450 l/hm2，药剂不留残液。40天后调查小麦赤霉病的病株数和病情等级，具体标准如下：0级：全穗无病；1级：感病穗长度占全穗长度的四分之一以下；3级：感病穗长度占全穗长度的四分之一至二分之一；5级：感病穗长度占全穗长度的二分之一至四分之三以下；7级：感病穗长度占全穗长度的四分之三以上。
22.按下式计算小麦赤霉病的病情指数：病情指数=∑（各级病株数
×
该病级值）/（调查总株数
×
最高级值）
×
100每小区调查小麦250株，分成5点，每点50株，平行线取样。小麦赤霉病防治效果按下式计算：
计算结果表明（表5），解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）w0101对小麦赤霉病的防效高达74.8%，高于化学农药多菌灵和戊唑醇。
23.表5 解淀粉芽孢杆菌w0101防治小麦赤霉病试验结果以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。