杯冠化合物及其用途的制作方法

杯冠化合物及其用途
1.发明背景
发明领域
2.在各实施方案中，本发明广泛涉及新的杯冠化合物及其在生物分析中的用途。


背景技术：

3.将酶、抗原、抗体等固定在固体载体上已成为生物技术和蛋白研究例如免疫化学和酶化学中最基本的技术之一。例如，酶联免疫吸附试验(elisa)是一种在生物技术中广泛应用的技术，用于在实验或临床实验室中分析引起某种疾病的特定蛋白质或特异性蛋白质。所述elisa检测试剂盒是市售的。蛋白质芯片的开发需要改进在固体基质上固定蛋白质的方法，对于后基因组时代蛋白质组学研究的进一步发展，最近蛋白质芯片的开发在生物技术领域受到重大关注。
4.以前，蛋白质(例如抗原、抗体或酶)的固定通常是通过蛋白质在高分子量生物聚合物(例如各种胶原蛋白、葡聚糖或纤维素衍生物)上的物理吸附来实现的。也已将经化学反应形成蛋白质与载体表面之间的共价键广泛用作蛋白质固定的方法。通过“三明治”技术(三分子层)的蛋白质固定方法已在文献zhang,x等人，science 262：1706
‑
1708(1993)中公开，其描述通过蛋白质和载体表面之间的生物素
‑
亲和素(或链酶亲和素)相互作用进行化学键合的方法。也就是说，生物素附着到载体表面，随后亲和素或链酶亲和素连接到生物素上。最后，与生物素连接的蛋白质可以固定在化学修饰的载体表面。
5.然而，在固定蛋白质的各种方法中存在如下许多问题。
6.1.密度
7.过去所用的蛋白质固定方法的最关键问题一直是基质(substrate)表面固定的蛋白质的量非常小。当待被固定在载体表面的蛋白质的密度低时，其他蛋白质可形成非特异性结合。因此，有必要对载体表面进行化学处理，以消除结合到载体表面的不需要的蛋白质。然而，所述化学处理可能使固定的蛋白质分子失活或变性。此外，即使将特异性目标蛋白质成功固定在载体表面，也只能捕获极少量的蛋白质，因此，可能需要通过其他分析方法进一步确认测试结果。当更多的蛋白质固定在载体表面的单位面积上时，测试方法是更简单的。在这方面，已经进行了许多研究，以开发在载体表面固定最大量的单分子层蛋白质的方法。然而，尚未取得令人满意的结果。
8.2.活性
9.在通过化学键合或载体表面物理吸附固定蛋白质的现有方法中，与溶液中的游离蛋白质相比，会降低固定的蛋白质的活性。众所周知，因为蛋白质通过物理吸附或化学结合紧密地结合在载体表面上，固定在固体载体上的蛋白质可能由于蛋白质的构象变化或变性尤其是在其活性部位周围而失去其活性。
10.3.方向
11.在用于在载体表面固定蛋白质的现有方法中，蛋白质的活性位点可能变得基本上
朝向载体表面，从而掩蔽活性位点，由此蛋白质的活性丧失。所述现象发生在几乎一半的固定的蛋白质中。
12.先前已表明杯冠化合物可用于在固体基质上形成单层杯冠化合物，这有助于固定关注的蛋白质，例如通过识别蛋白质表面上氨基酸的阳离子官能团，诸如铵基。参见例如美国专利申请号6,485,984b1和lee等人，proteomics 3:2289
‑
2304(2003)。wo2009069980a2还描述杯冠化合物在用于测定激酶或磷酸酶活性的蛋白质芯片中的各种用途。
13.这些先前几代杯冠化合物可以在一定程度上解决上述问题。仍然存在对新的蛋白质芯片的需求，例如具有高灵敏度的那些。
14.发明简述
15.在各实施方案中，本公开书至少部分基于下述发现，即某些新杯冠化合物可用于包被固体基质，且包被的固体基质可用于固定蛋白质，并高灵敏度地检测样品中蛋白质(或蛋白质
‑
蛋白质相互作用)的存在。
16.在一些实施方案中，本公开书涉及具有本文所定义的式i、ii或iii的新杯冠化合物。在一些特定实施方案中，本发明涉及本文所定义的化合物6(ips
‑
linker a)或ips
‑
linker b。
17.在一些实施方案中，提供了用本公开书的杯冠化合物包被的固体基质。在一些实施方案中，固体基质可以是无机或有机固体基质，例如选自金、银、玻璃、硅、聚苯乙烯和聚碳酸酯的基质。在一些实施方案中，固体基质是蛋白质芯片、诊断试剂盒或蛋白质分离包。
18.在一些实施方案中，提供了具有固定的蛋白质的固体基质，其中将固体基质用本公开书的杯冠化合物包被。在一些实施方案中，固体基质可以是无机或有机固体基质，例如选自金、银、玻璃、硅、聚苯乙烯和聚碳酸酯的基质。在一些实施方案中，固定的蛋白质可以是抗体、酶、膜结合受体和非膜结合受体、蛋白质结构域和基序，以及细胞内信号蛋白包括修饰的蛋白质，例如溴结构域蛋白4(bromodomain
‑
containing protein 4)、肝素结合域、polo
‑
box域等。
19.在一些实施方案中，本公开书提供将蛋白质固定在固体基质上的方法。通常，该方法可包括将本公开书的杯冠化合物应用到无机或有机固体基质上，以形成杯冠化合物包被的固体基质；并随后将所述杯冠化合物包被的固体基质浸入包含所述蛋白质的溶液中。
20.在一些实施方案中，还提供检测蛋白质
‑
蛋白质相互作用的方法。例如，在一些实施方案中，该方法可包括将第一种蛋白质固定在被本公开书的杯冠化合物包被的固体基质上，以形成具有固定的第一种蛋白质的固体基质；用含第二种蛋白质的溶液孵育具有固定的第一种蛋白质的固体基质；以及检测所述固定的第一种蛋白质和第二种蛋白质之间的相互作用。在一些实施方案中，第二种蛋白质是疾病的生物标记物。
21.附图简述
22.图1a.显示从用aβ1‑
42
固定并用不同浓度vegf
165
孵育的prolinker包被的载玻片检测到的荧光信号的图。
23.图1b.显示从用aβ1‑
42
固定并用不同浓度vegf
165
孵育的ips
‑
linker包被的载玻片检测到的荧光信号的图。
24.图2.利用ips
‑
linker包被的芯片检测人il
‑
17。
25.图3.图中显示利用ips
‑
linker
‑
包被的芯片测试il
‑
23及其受体之间的蛋白质
‑
蛋
白质相互作用的结果。
26.图4.图中显示利用ips
‑
linker
‑
包被的芯片测试pd
‑
1和pd
‑
l1之间的蛋白质
‑
蛋白质相互作用的结果。
27.图5.图中显示利用ips
‑
linker
‑
包被的芯片测试sting和c
‑
di
‑
gmp之间的蛋白质
‑
核苷酸相互作用的结果。
28.发明详述
29.在各种实施方案中，本公开书提供新杯冠化合物及其在生物分析中的应用。
30.杯冠化合物
31.发现杯冠化合物对碱金属和碱土金属阳离子以及叔胺具有离子载体特性。它们的结合选择性很大程度上取决于聚乙二醇桥中氧原子的数量、冠桥上取代基的性质，以及结合位点杯芳烃骨架的立体化学。通常参见salorinne等人，j.incl.phenom.macrocycl.chem.61:11
–
27(2008)，以其全部引入文中作为参考。
32.本公开书的杯冠化合物通常是杯[4]冠。杯[4]冠可以是1,3
‑
桥接或1,2
‑
桥接的。本公开书的杯[4]冠通常为1,3
‑
桥接的。通常，本公开书的杯冠化合物可以采用1,3
‑
交替构象，尽管在某些情况下，部分锥型或锥型构象也是可能的。
[0033]
本公开书的杯冠化合物通常可具有根据式i、ii或iii的结构。在一些实施方案中，文中的杯冠化合物可具有氨基和/或羧酸基团，并且所述杯冠化合物可以以盐的形式存在。对于文中具有羧酸官能团的杯冠化合物，其酯例如c1‑4烷基酯也是本公开书的新化合物。例如，所述酯可例如用作制备具有相应羧酸官能团的化合物的中间体。
[0034]
在一些实施方案中，本公开书的杯冠化合物可由式i表征：
[0035][0036]
其中：
[0037]
r1和r3独立地表示氢、—ch2sh、—ch2cl、—ch2cn、—ch2cho、—ch2nh2或—ch2cooh；
[0038]
r2和r4独立地表示—ch2sh、—ch2cl、—ch2cn、—ch2cho、—ch2nh2、—ch2cooh、—cn、—cho或—cooh；且
[0039]
x和y独立地表示氢、c1‑4烷基、oh或c1‑4烷氧基。
[0040]
通常，在式i中，r1和r3是氢。然而，在一些实施方案中，r1和r3还可以独立地是与固体基质(例如金)表面具有亲和力的基团。在一些实施方案中，r1和r3还可以独立地是基团例如—ch2sh、—ch2cho、—ch2nh2或—ch2cooh。
[0041]
通常，在式i中，x和y是氢。然而，在一些实施方案中，x和y还可以独立地是基团例如c1‑4基团、oh或c1‑4烷氧基。
[0042]
通常，在式i中，r2和r4是—cooh。在一些实施方案中，r2和r4还可以独立地是与固体基质(例如金)表面具有亲和力的基团。在一些实施方案中，r2和r4还可以独立地是基团例如—ch2sh、—ch2cho、—ch2nh2、—cho或—ch2cooh。
[0043]
在一些实施方案中，式i的杯冠化合物是化合物6(ips
‑
linker a)或ips
‑
linker b：
[0044][0045]
在一些实施方案中，本公开书的杯冠化合物可由式ii表征：
[0046][0047]
其中：
[0048]
r1和r3独立地表示氢、—ch2sh、—ch2cl、—ch2cn、—ch2cho、—ch2nh2或—ch2cooh；
[0049]
r2和r4独立地表示—ch2sh、—ch2cl、—ch2cn、—ch2cho、—ch2nh2、—ch2cooh、—cn、—cho或—cooh；且
[0050]
x和y独立地表示氢、c1‑4烷基、oh或c1‑4烷氧基。
[0051]
通常，在式ii中，r1和r3是氢。然而，在一些实施方案中，r1和r3还可以独立地是与固体基质(例如金)表面具有亲和力的基团。在一些实施方案中，r1和r3还可以独立地是基团例如—ch2sh、—ch2cho、—ch2nh2或—ch2cooh。
[0052]
通常，在式ii中，x和y是氢。然而，在一些实施方案中，x和y还可以独立地是基团例如c1‑4基团、oh或c1‑4烷氧基。
[0053]
通常，在式ii中，r2和r4是—cooh。在一些实施方案中，r2和r4还可以独立地是与固体基质(例如金)表面具有亲和力的基团。在一些实施方案中，r2和r4还可以独立地是基团例如—ch2sh、—ch2cho、—ch2nh2、—cho或—ch2cooh。
[0054]
在一些实施方案中，本公开书的杯冠化合物可由式iii表征：
[0055][0056]
其中：
[0057]
r1和r3独立地表示氢、—ch2sh、—ch2cl、—ch2cn、—ch2cho、—ch2nh2或—ch2cooh；
[0058]
r2和r4独立地表示—ch2sh、—ch2cl、—ch2cn、—ch2cho、—ch2nh2、—ch2cooh、—cn、—cho或—cooh；且
[0059]
x和y独立地表示氢、c1‑4烷基、oh或c1‑4烷氧基。
[0060]
通常，在式iii中，r1和r3是氢。然而，在一些实施方案中，r1和r3还可以独立地是与固体基质(例如金)表面具有亲和力的基团。在一些实施方案中，r1和r3还可以独立地是基团例如—ch2sh、—ch2cho、—ch2nh2或—ch2cooh。
[0061]
通常，在式iii中，x和y是氢。然而，在一些实施方案中，x和y还可以独立地是基团例如c1‑4基团、oh或c1‑4烷氧基。
[0062]
通常，在式iii中，r2和r4是—cooh。在一些实施方案中，r2和r4还可以独立地是与固体基质(例如金)表面具有亲和力的基团。在一些实施方案中，r2和r4还可以独立地是基团例如—ch2sh、—ch2cho、—ch2nh2、—cho或—ch2cooh。
[0063]
根据本公开书，本领域技术人员可以容易地制备文中公开的杯冠化合物。例如在各种碱存在下，通过杯[4]芳烃与适当的聚乙二醇二甲苯磺酸酯反应，可容易地制备杯冠化合物。在实施例部分，还详细说明文中杯冠化合物(化合物6)的制备示例。
[0064]
生物芯片
[0065]
本公开书的杯冠化合物通常是双功能化合物，这可使它们结合至表面并识别阳离子官能团。本公开书的杯冠化合物通常也可自组装在固体基质上形成单层，其可通过冠醚基团捕获具有阳离子官能团的物质例如蛋白质。
[0066]
因此，在各种实施方案中，本公开书还提供本公开书杯冠化合物包被的固体基质、其制备方法和各种相关用途。在一些实施方案中，固体基质可以是蛋白质芯片、诊断试剂盒或蛋白质分离包。在一些实施方案中，固体基质也可以是完整芯片(well
‑
on
‑
a
‑
chip)、阵列等，其可用于例如高通量分析/筛选。
[0067]
在一些实施方案中，本公开书提供了本公开书的杯冠化合物(例如化合物6)包被的固体基质。在一些实施方案中，固体基质是无机或有机固体基质。在一些实施方案中，固体基质是无机固体基质。通常，无机固体基质可以是金属或玻璃基质。例如，在一些实施方案中，固体基质可以是金属基质例如金、银、铂等。在一些实施方案中，固体基质还可以是玻璃基质。在一些实施方案中，固体基质可以是基于聚合物的基质。非限制性示例包括聚苯乙
烯和聚碳酸酯基质。在一些实施方案中，固体基质可选自金、银、玻璃、硅、聚苯乙烯和聚碳酸酯。在文中所述的实施方案中的任何一个实施方案中，本公开书的杯冠化合物可在固体基质上形成单层。
[0068]
文中描述了用本公开书的杯冠化合物包被固体基质的方法。通常，所述方法包含将本公开书的杯冠化合物应用至固体基质。
[0069]
在一些实施方案中，本公开书还提供具有固定的蛋白质的固体基质，其中固体基质被本公开书的杯冠化合物(例如上文所述的，诸如化合物6)包被。在一些实施方案中，固体基质可以是无机或有机固体基质，例如选自金、银、玻璃、硅、聚苯乙烯和聚碳酸酯的基质。在一些实施方案中，固定的蛋白质可以是抗体、酶、膜结合受体和非膜结合受体、蛋白质结构域和基序，以及细胞内信号蛋白包括修饰的蛋白质，例如溴结构域蛋白4、肝素结合域、polo
‑
box域等。
[0070]
本文描述了将蛋白质固定在固体基质上的方法。例如，在一些实施方案中，所述方法可包括将本公开书的杯冠化合物(例如化合物6)应用至无机或有机固体基质上，以形成杯冠化合物包被的固体基质；随后将所述杯冠化合物包被的固体基质浸入包含所述蛋白质的溶液中。通常，本公开书的杯冠化合物在固体基质上形成单层。所述溶液可以是缓冲液。将杯冠化合物包被的固体基质浸入蛋白质溶液后，可将混合物孵育一段时间，以使蛋白质与杯冠化合物相互作用。通常，所述溶液以大约1nm至大约500um、优选大约1um至大约500um(例如大约50um至大约250um)的浓度或者高达蛋白质的溶解度极限的任何浓度含有所述蛋白质。本文描述了适当的固体基质。与蛋白质溶液孵育后，通常清洗、封闭固体基质，以除去非特异性结合，并干燥。实施例部分详述示例性操作。
[0071]
文中的具有固定的蛋白质的固体基质可进一步用于检测蛋白质
‑
蛋白质相互作用或用于检测生物标记物。例如，在一些实施方案中，本公开书提供检测蛋白质
‑
蛋白质相互作用的方法，该方法可包括将第一种蛋白质固定在用本公开书的杯冠化合物包被的固体基质上，以形成具有固定的第一种蛋白质的固体基质；用含有第二种蛋白质的溶液孵育具有固定的第一种蛋白质的固体基质；以及检测固定的第一种蛋白质和第二种蛋白质之间的相互作用。在一些实施方案中，第二种蛋白质可以是生物标记物，例如，抗体、酶、膜结合受体和非膜结合受体、蛋白质结构域和基序，以及细胞内信号蛋白包括修饰的蛋白质，例如溴结构域蛋白4、肝素结合域、polo
‑
box域等。在一些实施方案中，包含第二种蛋白质的溶液来自患者(例如人类患者)的生物液体样品。在一些实施方案中，患者可患有癌症，并且第二种蛋白质是癌症的生物标记物。在一些实施方案中，生物流体样品可以是原始样品、稀释样品或其他处理过的样品。在一些实施方案中，该溶液可含有一定浓度的第二种蛋白质，所述浓度范围为大约1am(阿(atto)m)至大约100μm，例如大约1fm(femto m)至大约10μm，大约10fm至大约10μm，大约50fm至大约2μm，大约100fm至大约1μm，大约250fm至大约1μm等。例如，可通过elisa系统中所用的比色酶测定法检测该蛋白质。
[0072]
典型的elisa系统方法包括：
[0073]
·
板制备
[0074]
在不含载体蛋白的pbs(1x)中，将捕获抗体稀释至工作浓度。立即用100μl/孔的稀释的捕获抗体包被96
‑
孔微孔板。密封板并在室温下孵育过夜。抽吸每个孔，并用洗涤缓冲液(含有0.05％吐温20的pbs 1x)洗涤，重复该操作两次，共洗涤三次。利用喷射瓶、歧管分
配器或自动清洗机向每个孔填充清洗缓冲液(400μl)，进行清洗。每一步完全清除液体对于良好的性能至关重要。最后一次清洗后，通过抽吸或倒置板并用干净的纸巾吸取，除去剩余的清洗缓冲液。通过向每个孔中加入300μl试剂稀释剂(含有1％bsa的pbs 1x)封闭板。在室温下孵育至少1小时。重复第2步中的抽吸/清洗。现在，板已经准备好，用于添加样品。
[0075]
·
测试方法
[0076]
向每孔加入100μl在试剂稀释剂或适当的稀释剂中的样品或标准品。用胶带覆盖并在室温下孵育2小时。重复板制备步骤2中的抽吸/清洗。向每个孔中添加100μl检测抗体，在试剂稀释剂中稀释。用新的胶带覆盖，并在室温下孵育2小时。重复板制备步骤2中的抽吸/清洗。向每个孔中添加100μl链霉亲和素
‑
hrp的工作稀释液。盖上板，并在室温下孵育20分钟。避免将板放在直射光下。重复步骤2中的抽吸/清洗。向每个孔中添加100μl底物溶液(显色剂a(h2o2)和显色剂b(四甲基联苯胺)的1:1混合物)(r&d systems，minneapolis，mn)。在室温下孵育20分钟。避免将板放在直射光下。向每个孔中加入50μl停止溶液(2n h2so4(r&d systems,minneapolis,mn))。轻轻敲打板，确保充分混合。利用设置为450nm的酶标仪，立即测定每个孔的光密度。如果波长校正可用，则设置为540nm或570nm。如果波长校正不可用，则从450nm处的读数中减去540nm或570nm处的读数。此减法将纠正板中的光学缺陷。在450nm处直接读取而不进行校正的读数可能更高，且更不准确。
[0077]
如实施例部分所述，当与前代杯冠化合物prolinker包被的对照固体基质相比时，本公开书的杯冠化合物(例如化合物6)包被，随后被固定的蛋白质(aβ1‑
42
)包被的固体基质能够以明显更低的浓度检测vegf
165
。参见美国专利号6,485,984b1和lee等人，proteomics 3:2289
‑
2304(2003)，将其各自以其全部引入文中作为参考。wo2009069980a2还描述杯冠化合物在用于测定激酶或磷酸酶活性的蛋白质芯片中的各种用途，以其全部引入文中作为参考。因此，利用本公开书的杯冠化合物可提高检测限和灵敏度，这比现有技术更为有利。
[0078]
可以用各种方法检测在固体基质上捕获的第二种蛋白质。例如，在一些实施方案中，所述检测包括使第二种蛋白质的抗体与固体基质接触。在一些实施方案中，检测还包括使染料标记的二级抗体与固体基质接触，其中二级抗体与第二种蛋白质的抗体结合。在一些实施方案中，检测还包括测量与固体基质相关的染料标记的二级抗体水平。可以使用任何适当的染料。通常，染料是荧光染料，并且测量包含测量荧光信号。例如，在一些实施方案中，染料可以是cy5。
[0079]
定义
[0080]
应该理解，对于文中的结构式，所有基团及其组合保持适当的价态。
[0081]
应该理解，文中变量基团的特定实施方案可以与具有相同标识符的另一特定实施方案是相同的或不同的。
[0082]
适用时，独立选择式i、ii或iii化合物中变量的适当基团。可以组合本发明的所述实施方案。所述组合是被考虑的，并在本发明的范围内。例如，一个变量的定义可以与式i、ii或iii中任何其他变量的任何定义组合。
[0083]
如本文所用，术语“本公开书的杯冠化合物”等指文中根据式i、ii或iii所述的任何化合物，或化合物6、其同位素标记化合物、其互变异构体、其构象异构体、其盐(例如碱加成盐诸如na盐)和/或其酯(例如c1‑4烷基酯)。
[0084]
如本文所用，术语“烷基”(其本身或作为另一基团的一部分使用时)指直链或支链
脂肪烃，通常含有1
‑
20个碳。在一些实施方案中，烷基为直链c1‑6烷基基团。在其他实施方案中，烷基为支链c3‑6烷基基团。在其他实施方案中，烷基为直链c1‑4烷基基团。如本领域技术人员所理解的，烷基是饱和的。本文所用的c1‑4烷基指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、叔丁基或异丁基。还如本领域技术人员所理解的，“亚烷基”指衍生自相应烷基的二价基团。例如，本文所用的c1‑4亚烷基基团指亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚仲丁基、亚叔丁基或亚异丁基。
[0085]
如本文所用，术语“烷氧基”(当其本身或作为另一基团的一部分使用时)，指式or
a1
基团，其中r
a1
是烷基。
[0086]
本文使用的术语“患者”指作为治疗、观察或实验对象的动物，例如哺乳动物、非人类或人类。
实施例
[0087]
实施例1.杯冠化合物6的制备
[0088][0089]
1)化合物1(四乙二醇二甲苯磺酸酯)的合成
[0090]
将四乙二醇(4ml，23mmol)溶解在无水氯仿(30ml)中。将溶液在氯化钠冰浴中冷却至
‑
20℃。依次加入对甲苯磺酰氯(13g，69mmol)和无水吡啶(24ml)，同时保持溶液温度低于0℃。在
‑
20℃反应5h后，减压除去氯仿和吡啶，加入冰水(250ml)，并将溶液用ch2cl2(200ml，每次)提取三次。将合并的有机相依次用hcl(2n，250ml)和水(200ml)洗涤两次。用硫酸钠干燥有机层后，减压除去溶剂。将残余物进行硅胶色谱，利用乙酸乙酯/己烷(乙酸乙酯与己烷
的比例为2:8至5:5)，以得到无色油状的产品(9.45g)，产率：725。r
f
＝0.31(硅胶，1:1，乙酸乙酯/己烷)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δppm 2.45(s,6h),3.68(t,j＝4.7hz,4h),4.16(t,j＝4.7hz,4h),7.35(d,j＝8.2hz,4h),7.80(d,j＝8.2hz,4h)；
13
c nmr(400mhz,cdcl3)δppm 21.6,68.7,69.3,70.5,70.7,128.0,129.8,133.0,144.8.
[0091]
2)化合物2的合成
[0092]2‑
1)将对叔丁基苯酚(化合物1)(150g,1mol)和naoh(1.8g,45mmol)溶解在37％甲醛(100.7g,1.24mol)中。反应混合物在120℃下回流12小时。溶液冷却至室温后，真空除去h2o，然后加入苯醚(450ml)和甲苯(150ml)。反应混合物再次在250℃下回流。反应混合物的颜色变为深棕色。然后，将粗产物在乙酸乙酯(300ml)中重结晶，并用乙酸(100ml)洗涤。白色晶状固体2，产率56.79％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δppm 10.36(s,4h),7.04(s,8h),4.25(d,4h),3.49(d,4h),1.21(s,36h).
[0093]
3)化合物3的合成
[0094]2‑
2)将对叔丁基杯[4]芳烃(化合物2)(10.00g，13.5mmol)、甲苯(100ml)和苯酚(1.75g，18.60mmol)加入烧瓶中，并将溶液在氩气气氛下搅拌10分钟。在剧烈机械搅拌下，加入三氯化铝(10.00g，75.0mmol)。将混合物在室温搅拌5小时。将混合物倒入含有碎冰(200g)的500ml烧杯中，并用ch2cl2(400ml)萃取。用1n hcl(3
×
100ml)和水(2
×
100ml)洗涤有机层，并用naso4干燥。将溶剂真空蒸发。向橙色油状残留物中加入乙醚(50ml)，并将非均相混合物在
‑
15℃下保持1h。过滤沉淀的固体并用乙醚(100ml)研磨。将混合物在
‑
15℃下保持1小时，并过滤以提供5.54g淡黄色粉末(90％)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ10.20(s,4h),7.04(d,8h,j＝7.6hz),6.73(t,4h,j＝7.6hz),4.24(br s,4h),3.54(br s,4h).
[0095]
3)化合物4的合成
[0096]
在氮气下，向含nah(5.00eq,2.16g,90.0mmol)和dmf(1300ml)混合物的2000ml三颈烧瓶中，历经1小时，加入25,26,27,28
‑
四羟基杯[4]芳烃(化合物3)(1.00eq,7.64g,18.0mmol)的dmf(100ml)溶液。将混合物再搅拌1小时。历经1小时，加入四乙二醇二甲苯磺酸酯(2.20eq,13.88g,39.6mmol)的dmf(100ml)溶液。将混合物在50℃下搅拌72小时。加入h2o(50ml)淬灭反应，并将溶液用ch2cl2(50ml)萃取三次。将合并的有机相依次用hcl(3n,50ml)和水(200ml)洗涤两次。有机层用硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。将残留物进行硅胶色谱，利用乙酸乙酯/己烷(乙酸乙酯与己烷的比例为1:4～1:2)，以得到浅黄色粉末产品(2.34g)，产率45％。r
f
＝0.55(硅胶，1:1，乙酸乙酯/己烷)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ8.34(s,2h),7.13
‑
6.87(m,8h),6.80(t,j＝7.5hz,2h),6.60(t,j＝7.5hz,2h),4.62
‑
4.41(m,12h),4.41
‑
4.28(m,2h),4.11(t,j＝9.0hz,2h),4.06
‑
3.88(m,6h),3.87
‑
3.65(m,4h),3.39(d,j＝12.3hz,1h),3.36(d,j＝13.5hz,2h),3.32(d,j＝3.8hz,1h).
[0097]
4)化合物5的合成
[0098]
在圆底烧瓶中，将化合物4(1g，1.77mmol)溶于干燥乙腈中。加入碳酸钾(1.17g，8.41mmol)和溴乙酸叔丁酯(0.90g，4.61mmol)，并将混合物回流24小时。完成后，蒸发溶剂，加入水(100ml)，用二氯甲烷(2x 100ml)萃取。分离有机层，硫酸钠干燥，过滤并浓缩。加入水(250ml)，并将溶液用ch2cl2(200ml，每次)萃取三次。将残留物进行硅胶色谱，利用乙酸乙酯/己烷(乙酸乙酯与己烷的比例为1:3)，以得到浅黄色粉末产品(1.1g)，产率90％。r
f
＝0.6(硅胶，1:2，乙酸乙酯/己烷)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ6.59(m,12h),4.64(d,4h),4.21
(m,2h),3.98(m,6h),3.18(m,4h),1.45(s,18h).
[0099]
5)化合物6(ips linker a)的合成
[0100]
将naoh(15％)的水溶液(252ml)加入化合物5(1.16g,1.68mmol)的乙醇溶液(70ml)中。将反应混合物加热回流24小时。将反应物冷却至室温，并经旋转蒸发除去溶剂。然后，向固体物质中加入50ml冷水，在激烈搅拌下，滴加hcl(5n)，直到溶液的ph达到7。将溶液用ch2cl2(50ml)萃取三次。将合并的有机相用水(50ml)洗涤两次。有机层用硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。将残留物进行硅胶色谱，利用甲醇/二氯甲烷(甲醇与二氯甲烷的比例为1:9
‑
1:1)，以得到浅黄色粉末产品(0.7g)，产率60％。r
f
＝0.3(硅胶，3:1，甲醇:二氯甲烷)。1h nmr(300mhz,cdcl3):7.08(m,8h),6.80(s,4h),4.43(m,4h),4.22
‑
3.66(m,16h),3.35(m,4h).
[0101]
实施例2.用杯冠化合物6包被的蛋白芯片的制备
[0102][0103]
将载玻片置于60ml清洗溶液(甲醇：35％氯化氢＝1:1)中，并清洗30分钟。将载玻片浸于piranha溶液(硫酸：过氧化氢＝3:1)中，并用蒸馏水洗涤30分钟。在黑暗条件下，将用氮气干燥的载玻片在60ml胺化溶液(3％(3
‑
氨基丙基)三乙氧基硅烷的乙醇溶液)中浸泡2小时。将其用乙醇冲洗三次，然后用蒸馏水反复冲洗，最后用乙醇冲洗。用氮气干燥载玻片，并在100℃下反应2小时。将其用60ml a溶液(10mg ips
‑
linker(杯冠化合物6)的dmf溶液，5mg n
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑
n'
‑
乙基碳二亚胺盐酸盐(edc
‑
hcl)，3mg 1
‑
羟基苯并三唑水合物(hobt)，1mg 4
‑
n,n
‑
二甲氨基吡啶(dmap))浸泡，在室温下孵育12小时。用70毫升dmf洗涤载玻片3次，持续10分钟，然后再重复2次。载玻片用氮气干燥，并在室温下真空保存备用。
[0104]
ips
‑
linker(化合物6)的结构如下：
[0105][0106]
用prolinker包被的proteochip的制备
[0107]
将载玻片浸入清洗液(甲醇:hcl＝1:1)中，保持30分钟，并浸入piranha溶液中，保持10分钟(室温)。将载玻片用无菌d.w.彻底清洗并干燥。将载玻片在室温下浸于胺化溶液中6小时。用甲苯洗涤后，用无水乙醇洗涤。在100℃下孵育1小时。在室温下，将胺化载玻片浸入10mm的prolinker氯仿溶液中，保持3小时。用氯仿洗涤后，用无水乙醇洗涤。用无菌d.w.洗涤后，充分干燥。
[0108]
将稀释缓冲液(30％甘油的pbs溶液，ph 7.4)中的aβ1‑
42
点样在proteochip(protogen，韩国，prolinker包被的芯片)或ips芯片(innopharmascreen，韩国，ips
‑
linker包被的芯片)上，并将芯片在4℃的湿度箱中孵育过夜。proteochip的prolinker结构如下：
[0109][0110]
将芯片在pbst(吐温
‑
20的0.5％pbs溶液)中漂洗两次，保持10分钟，并在室温下，用含有0.05％吐温
‑
20溶液的3％bsa孵育，以阻断非特异性结合。经过大量冲洗后，aβ1‑
42
微阵列可用于检测与aβ1‑
42
的蛋白质相互作用。
[0111]
实施例3.利用蛋白质芯片进行vegf
‑
aβ结合的蛋白质相互作用测定。
[0112]
将实施例2中制备的aβ1‑
42
微阵列用vegf
165
的混合物(vexxon，韩国)点样。用pbst和dw冲洗后，将兔
‑
抗
‑
vegf(a20)(santacruz，德国)用含3％bsa和30％甘油的pbs稀释至1:10，点样，以识别与aβ1‑
42
结合的vegf
165
。用pbst和dw冲洗后，在30℃下，将用cy5(invitrogen，usa)标记的抗兔二级抗体(用含有3％bsa和30％甘油的pbs稀释至1:100)应用在芯片上1小时。用pbst和dw冲洗后，在n2气流中干燥芯片。通过测量混合物斑点与对照斑点(仅vegf)的相对荧光强度来确定蛋白质
‑
蛋白质相互作用。
[0113]
检测和数据分析：利用genetix aquiretm扫描仪(genetix,uk)扫描芯片，并将其保存为tiff文件。利用genepix pro 6.0(axon instruments,ca,usa)分析扫描的图像，并利用excel(microsoft,redmond,wa)和origin 6.1(originlab,ma,usa)分析数据。
[0114]
结果：构建aβ微阵列，用于分析aβ1
‑
42
‑
vegf165相互作用。为了构建aβ微阵列，将可溶性aβ1
‑
42(50mg/ml)固定在每个蛋白质芯片基板上作为捕获分子。芯片上的aβ1
‑
42微阵列与0.25μg/ml～250.0μg/ml的不同浓度的vegf165相互作用(图1a和1b)。结果表明，在两种芯片系统中，aβ1
‑
42与vegf165以剂量依赖方式良好相互作用。如图所示，与prolinker(大约3.9mg/ml)包被的proteochip相比，用ips
‑
linker包被的ips
‑
chip能够检测到低水平(0.25mg/ml)的vegf蛋白。综上所述，这一发现表明ips
‑
linker
‑
包被的芯片在检测蛋白质方面比prolinker包被的芯片更敏感。
[0115]
实施例4.用ips
‑
linker
‑
包被的芯片检测人il
‑
17
[0116]
将il
‑
17捕获抗体(r&d systems，usa)固定在ips
‑
linker
‑
包被的芯片上，在4℃下过夜。将芯片在洗涤溶液中冲洗两次，每次10分钟，然后用封闭液封闭1小时。将封闭的il
‑
17抗体芯片在洗涤溶液和dw(蒸馏水)中冲洗，然后在n2气流下干燥。经过大量冲洗后，在37℃的湿度箱中，将反应溶液中的重组il
‑
17蛋白(r&d systems，usa)点样在il
‑
17抗体芯片上，保持2小时。将芯片在洗涤溶液和dw中冲洗，然后在n2气流下干燥。经过大量冲洗后，将反应溶液中的il
‑
17检测抗体(r&d systems，usa)点样在芯片上，并在37℃的湿度箱中培养
1小时。然后，在洗涤溶液和dw中冲洗芯片，随后在n2气流下干燥。经过大量冲洗后，将反应溶液中cy5标记的链霉亲和素(ge healthcare，usa)点样在芯片上，并在37℃的湿度箱中培养1小时。用pbst(pbs
‑
吐温20)和dw冲洗后，将芯片在n2气流下干燥，并利用荧光扫描仪测量荧光强度。
[0117]
检测和数据分析：利用genepix 4000b扫描仪(molecular devices,usa)扫描芯片，并将其保存为tiff文件。利用genepix pro 6.0(molecular devices,usa)分析扫描的图像，并利用excel(microsoft,wa)和origin 6.1(originlab,usa)分析数据。
[0118]
结果：构建aβ微阵列，用于人il
‑
17的定量分析。为了构建il
‑
17检测芯片，将捕获il
‑
17抗体(0.1mg/ml)固定在每个ips
‑
chip板上。il
‑
17检测芯片与0.06pg/ml
‑
60000pg/ml的不同浓度的il
‑
17蛋白相互作用，然后通过检测il
‑
17抗体和cy5标记的链霉亲和素进行检测(图2)。与基于96孔板的elisa(15.6pg/ml)相比，用ips
‑
linker包被的ips
‑
chip能够检测到低水平(0.06pg/ml)的人il
‑
17蛋白。综上所述，这一发现表明ips
‑
linker
‑
包被的芯片在检测蛋白质方面比基于96孔板的elisa更敏感。
[0119]
实施例5.用ips
‑
linker
‑
包被的芯片检测il
‑
23与其受体的蛋白质
‑
蛋白质相互作用
[0120]
将100μg/ml重组人il
‑
23受体fc嵌合蛋白(r&d systems,usa)用固定缓冲液固定在ips
‑
chip上。用pbst和dw冲洗后，用3％bsa的pbs溶液封闭每个孔。用pbst和dw冲洗封闭的ips
‑
chip，然后在n2气流中干燥。芯片完全干燥后，将在含有1％bsa和30％甘油的pbs中稀释为各种浓度的用cy5标记的il
‑
23配体点样在芯片上，并在37℃的湿度箱中培养1小时。在用pbst和dw冲洗并在n2流下干燥后，测量荧光强度，以确认蛋白质
‑
蛋白质相互作用。
[0121]
检测和数据分析：利用genepix 4000b扫描仪(molecular devices,usa)扫描芯片，并将其保存为tiff文件。利用genepix pro 6.0(molecular devices,usa)分析扫描的图像，并利用excel(microsoft,wa)和origin 6.1(originlab,usa)分析数据。
[0122]
结果：如前所述，将1μl的蛋白质点样在孔中。在每个孔上，固定100ng重组人il
‑
23受体fc嵌合体，并分别与不同浓度(12.8pg
‑
20ng)的il
‑
23配体孵育(图3)。如图所示，il
‑
23受体以剂量依赖方式与il
‑
23配体结合，且仅1.6ng il
‑
23配体就足以检测。综上所述，ips
‑
linker包被的ips
‑
chipips是检测蛋白质相互作用的敏感且经济有效的方法。
[0123]
实施例6.用ips
‑
linker
‑
包被的芯片检测pd
‑
1和pd
‑
l1的蛋白质相互作用
[0124]
将重组人pd
‑
1fc嵌合蛋白(acro biosystems，usa)用含30％甘油的pbs溶液稀释至1.6μg/ml
‑
400μg/ml的工作浓度。将pd
‑
1蛋白固定在ips
‑
linker
‑
包被的芯片上，在4℃下持续24小时。然后，用50ml pbst溶液(含0.1％吐温20的10mm pbs，ph 7.8)洗涤两次，并在气流表面下干燥。在室温下，用含0.005％吐温20和3％bsa的pbs溶液封闭芯片1小时。按照与前面操作相同的方式洗涤。在含30％甘油的pbs溶液中，将生物素化重组人pd
‑
l1蛋白(r&d systems,usa)稀释至0.4μg/ml
‑
100μg/ml的工作浓度，并将其添加至ips
‑
chip上的每个pd
‑
1蛋白斑点，并在37℃下孵育1小时。然后，按照与前面操作相同的方式洗涤。将10μg/ml的cy5
‑
缀合的链霉亲和素(ge healthcare,usa)添加到每个斑点上，并在37℃下孵育1小时。按照与前面操作相同的方式洗涤。
[0125]
检测和数据分析：利用genepix 4000b扫描仪(molecular devices,usa)扫描芯片，并将其保存为tiff文件。利用genepix pro 6.0(molecular devices,usa)分析扫描的
图像，并利用excel(microsoft,wa)和origin 6.1(originlab,usa)分析数据。
[0126]
结果：1.6μg/ml
‑
400μg/ml的不同浓度的pd
‑
1蛋白与0.4μg/ml
‑
100μg/ml的不同浓度的pd
‑
l1蛋白相互作用(图4)。结果表明，pd
‑
1和pd
‑
l1蛋白以剂量依赖的方式相互作用。如图所示，利用ips
‑
linker
‑
包被的芯片，pd
‑
1和pd
‑
l1的检测限灵敏度分别为1.6μg/ml和10μg/ml。
[0127]
实施例7.利用ips
‑
linker
‑
包被的芯片检测sting和c
‑
di
‑
gmp结合的蛋白质
‑
核苷酸相互作用
[0128]
对于sting蛋白与其已知配体c
‑
di
‑
gmp之间的浓度依赖性结合分析，4℃下，将用30％甘油稀释的his x 6抗体(thermo fisher scientific，usa)以100μg/ml浓度固定在ips
‑
chip上，持续3h。用pbst(含0.1％吐温20的10mm pbs，ph 7.8)洗涤芯片，并用氮气干燥。然后，将30％甘油中his
‑
标记的sting(active motif，usa)的重组蛋白以一系列浓度0μm、5μm、10μm分配至芯片的各孔中，并在4℃下继续反应过夜。然后，用pbst洗涤芯片，并用氮气干燥。室温下，用5％bsa封闭1h后，用pbst洗涤芯片并用氮气干燥。为了测试sting蛋白与其配体(称为cdn配体的2'[dy
‑
547]
‑
ahc
‑
c
‑
di gmp(biolog，德国))的结合能力，将30％甘油中的2'[dy
‑
547]
‑
ahc
‑
c
‑
di gmp以一系列浓度0μm、3.9μm、15.62μm、62.25μm、250μm分配至芯片上的各孔中，并在37℃下孵育1小时。芯片用pbst洗涤，并用氮气干燥。
[0129]
检测和数据分析：利用genepix 4000b扫描仪(molecular devices,usa)扫描芯片，并将其保存为tiff文件。利用genepix pro 6.0(molecular devices,usa)分析扫描的图像，并利用excel(microsoft,wa)和origin 6.1(originlab,usa)分析数据。
[0130]
结果：芯片上显示5μm
‑
10μm的sting蛋白与3.9μm
‑
250μm的c
‑
di
‑
gmp相互作用(图5)。并且，sting与c
‑
di
‑
gmp之间的相互作用是剂量依赖方式的。综上所述，如图所示，ips
‑
linker包被的芯片适用于检测蛋白质(sting)和核苷酸(c
‑
di
‑
gmp)之间的相互作用，低至5μm sting蛋白质和3.9μmc
‑
di
‑
gmp的相互作用。
[0131]
应该理解，详述部分而不是简述和摘要部分旨在用于解释权利要求书。简述和摘要部分可以阐述发明人设想的本发明的一个或多个但不是所有示例性实施方案，因此，并不意欲以任何方式限制本发明和所附权利要求书。
[0132]
已借助于说明指定功能及其关系实现的功能构建块，将本发明在上文中进行了描述。为了便于描述，本文任意定义了所述功能构建块的边界。只要适当地执行指定的功能及其关系，就可以定义替代边界。
[0133]
上述对特定实施方案的描述将充分揭示本发明的通用性质，使得其他人可以通过应用本领域技术范围内的知识，在不进行过度实验的情况下，容易地修改和/或调整所述特定实施方案的各种应用，而不脱离本发明的一般概念。因此，基于本文给出的教导和指导，所述调整和修改意图在所公开实施方案的等价物的含义和范围内。应该理解，本文中的措辞或术语用于描述而非限制，如此本说明书的术语或措辞应由本领域技术人员根据教导和指导进行解释。
[0134]
关于描述为属的本发明的方面，将所有个体种类单独地视为本发明的单独方面。如果将本发明的方面描述为“包含”特征，则也将实施方案视为“由
…
组成”或“基本上由
…
组成”特征。
[0135]
本发明的广度和范围不应受到上述任何示例性实施方案的限制，而应仅根据下述
权利要求及其等价物进行定义。
[0136]
本文描述的所有各个方面、实施方案和选项可以在任何和所有变体中组合。
[0137]
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以如下程度引入文中作为参考，即与将每个单独的出版物、专利或专利申请具体和单独地说明引入作为参考的程度相同。如果本文件中某一术语的任何含义或定义与引入作为参考的文件中同一术语的任何含义或定义相冲突，应以本文件中该术语的含义或定义为准。