一株具有促进石斛株高生长能力的胶膜菌菌株TP-3及其应用

一株具有促进石斛株高生长能力的胶膜菌菌株tp-3及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有促进石斛株高生长能力的胶膜菌(tulasnella sp.)菌株tp-3及其应用。


背景技术：

2.铁皮石斛(dendrobium officianle)被《道藏》誉为“中华九大仙草之首”，其化学成分多糖、生物碱、苷类、酚类和木质素等，已被确定具有调节免疫功能、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抗菌等多种药理作用。主要分布于我国湖南、云南、贵州、四川等喀斯特地形，喜温暖湿润气候，适宜在凉爽、湿润、空气畅通的半阴半阳的环境。自然条件下，其繁殖率低，生长周期长，由于过度采集，再加上生境破坏严重，导致野生资源极度匮乏。因此，如何以现有知识、资源、技术来保护恢复铁皮石斛种群，同时实现恢复友好栽培，满足消费需求成为难点。
3.目前，虽然已有大量关于促进种子萌发的共生真菌的报道，这些共生真菌能有效提高萌发率，但石斛的生长瓶颈在于萌发到幼苗阶段之间，种子萌发后无法实现幼苗建成。即使幼苗建成后，幼苗的质量影响后期生长，植株矮小瘦弱，易受外界阻力影响，不利于植株在自然环境中扎根生长。然而，从铁皮石斛幼苗分离获得的促进株高生长的真菌，能够解决这一问题。与促进株高生长的真菌形成共生的幼苗能够突破生长瓶颈，在自然环境中有较强的抵御能力，提高其存活率。有效真菌的获得目前多采用从兰科植物野生成年植株的根中分离，但由于成年植株中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得促株高生长有效真菌的筛选和分离工作变得复杂而繁琐。因此，获得促进幼苗株高生长的有效共生真菌是开展铁皮石斛保护、恢复种群资源以及实现恢复友好栽培的关键环节。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一株胶膜菌菌株tp-3，具有促进石斛株高生长能力，突破石斛幼苗生长瓶颈。
5.本发明提供了一种具有促进石斛株高生长能力的胶膜菌菌株 tp-3，保藏编号为cctcc no:m 20211282。
6.优选的，所述胶膜菌菌株tp-3的its序列如seq id no:1所示。
7.本发明提供了一种用于石斛栽培的产品，，包括所述胶膜菌菌株 tp-3和可接受的辅料。
8.优选的，所述产品包括微生物菌剂和/或菌肥。
9.本发明提供了所述胶膜菌菌株tp-3或所述产品在石斛生长中的应用。
10.优选的，所述石斛生长的指标包括以下一项或几项：石斛株高生长、幼苗叶片数增加、根系生长、茎粗的生长和幼苗的干重。
11.优选的，所述石斛包括铁皮石斛。
12.优选的，所述铁皮石斛包括铁皮石斛幼苗。
13.本发明提供了所述胶膜菌菌株tp-3在制备促进石斛生长的产品中的应用。
14.本发明提供了一种促进石斛幼苗株高的方法，包括以下步骤：
15.将所述胶膜菌菌株tp-3和石斛幼苗进行共生培养或将所述产品施用于石斛幼苗根部。
16.本发明提供的具有促进石斛株高生长能力的胶膜菌菌株tp-3，保藏编号为cctcc no:m 20211282。所述胶膜菌菌株tp-3是从铁皮石斛幼苗迁地诱导获得的形成共生关系的幼苗菌根中分离出来的，经形态鉴定、生理生化鉴定以及分子鉴定，得到tp-3菌株属于胶膜菌(tulasnella sp.)。与同批分离的同种或不同种菌株比，tp-3菌株与铁皮石斛共生培养能够显著促进株高生长。与此同时，所述菌株 tp-3还能促进石斛幼苗叶片、根系、生长，提高幼苗的干重。利用胶膜菌属真菌tp-3将铁皮石斛幼苗菌根化，可获得适应性强，节茎粗壮、成活率高的共生幼苗，有望实现重建铁皮石斛种群，实现药用铁皮石斛高效栽培。
17.本发明还提供一种促进石斛幼苗株高生长的方法，工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，在珍稀濒危兰科植物的回归保护、种群重建实践、药用兰科植物的生态栽培、解决铁皮石斛栽培产业的优质种苗来源瓶颈问题等方面都具有巨大的推广应用价值。
附图说明
18.图1为本发明提供的菌株tp-3与铁皮石斛共生培养促进株高生长的形态图。
19.生物材料保藏信息
20.胶膜菌属真菌(tulasnella sp.)tp-3，于2021年10月15日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学，保藏编号为：cctcc no:m 20211282。
具体实施方式
21.本发明提供了一种具有促进石斛株高生长能力的胶膜菌菌株 tp-3，保藏编号为cctcc no:m 20211282。
22.在本发明中，所述胶膜菌菌株tp-3是从铁皮石斛幼苗迁地诱导获得的形成共生关系的幼苗菌根中分离出来的。胶膜菌菌株tp-3的形态特征：在pda平板上培养10天，其菌落呈白色毯状，气生菌丝发达，规则圆形发散生长，菌落表面粗糙、干燥，有层次较明显的5 个同心圆。菌株tp-3的生理生化特性：使用盖玻片插片培养法观察菌株显微形态特征，在25
±
2℃条件下培养箱内黑暗培养10天，光学显微镜下观察，菌丝粗2.69～5.75μm，分枝近直角，新菌丝着生于老菌丝顶部，具更明显隔膜，且隔膜数量更多，老菌丝细胞壁具有加厚现象，隔室长。经过its基因片段分子鉴定，所述胶膜菌菌株tp-3 的its序列优选如seq id no:1所示，该菌株与真菌tulasnella sp. (km211335.1)最为相似，最大相似度达到99％。根据形态学、核苷酸序列结果表明，tp-3属于胶膜菌属的一株真菌(tulasnella sp.)。
23.在本发明中，所述胶膜菌菌株tp-3的扩大培养方法，优选包括以下步骤：将胶膜菌菌株tp-3接种在pda培养基上，黑暗培养至真菌菌丝长满培养皿。所述黑暗培养的温度优选为23～27℃，更优选为 25℃。本发明对所述pda培养基的种类不做特殊限制采用本领域所熟知的pda培养基即可。所述黑暗培养优选在人工气候箱中进行。本发明对所述接种的方法和接种量没有特殊限制，采用本领域所熟知的接种方法和接种量即可。
24.在本发明中，开展了胶膜菌属真菌tp-3菌株及同批分离筛选的菌株与铁皮石斛幼
苗共生实验，共生30d和90d后测定共生后的石斛幼苗的株高，结果表明，接种非菌根真菌tp-19和tp-25的处理组其株高生长反倒显著低于不接菌处理的pda对照组，而接种tp-6显著的处理组，其株高显著高于不接菌对照；而接种tp-3、tp-5、tp-12、 tp-14幼苗的株高与不接菌对照效果相当。共生培养90天时，绝大部分真菌处理幼苗株高与对照相当，甚至显著低于对照，只有接种 tp-3的幼苗株高显著高于对照组，高达4.621
±
0.263cm，较30天高出68.83％，其促进株高生长效果最佳，因此，tp-3菌株对铁皮石斛幼苗株高生长有最明显的促进效果。
25.本发明提供了一种用于石斛栽培的产品，包括所述胶膜菌菌株 tp-3和可接受的辅料。所述产品优选包括微生物菌剂和/或菌肥。本发明对所述植物菌肥和微生物菌剂的制备方法不做特殊限制，采用本领域所熟知的植物菌肥和微生物菌剂的制备方法即可。例如，微生物菌剂的制备方法，优选将上述扩大培养获得的菌株tp-3的菌丝接种至培养基上，待菌丝长满培养基后，混合，得到植物菌剂。所述植物菌肥优选是将上述扩大培养获得的菌株tp-3的菌丝接种至培养基上，待菌丝长满培养基后，与营养成分混合，得到菌肥。所述培养基包括麦麸、米糠、10％葡萄糖溶液等。所述麦麸、米糠、质量浓度10％葡萄糖溶液的体积比为2：3：3。每500ml培养基添加10片0.5cm3体积大小的菌块。所述培养的温度优选为23～27℃，更优选为25℃。所述培养优选为黑暗培养。所述培养的时间优选为14～16d，更优选为15天，直至辅料具有大量菌丝附着。所述营养成分还优选包括营养元素或有机肥等。
26.本发明提供了所述胶膜菌菌株tp-3在制备促进石斛生长的产品中的应用。所述产品与上述方案中所述产品相同，在此不做赘述。
27.基于胶膜菌菌株tp-3具有显著促进石斛幼苗株高的作用，因此本发明提供了所述胶膜菌菌株tp-3或所述产品在石斛生长中的应用。
28.在本发明中，所述石斛生长优选包括石斛株高生长、幼苗叶片数增加、根系生长、茎粗的生长和幼苗的干重，更优选为石斛株高生长。本发明所述方法适用于所有石斛植物，例如铁皮石斛、细茎石斛、梳唇石斛、美花石斛、钩状石斛、霍山石斛等。在本发明实施例中，以铁皮石斛幼苗为例说明tp-3的促进作用，但不能理解为对本发明保护范围的限制。
29.本发明提供了一种促进石斛幼苗株高的方法，包括以下步骤：
30.将所述胶膜菌菌株tp-3和石斛幼苗进行共生培养或将所述产品施用于石斛幼苗根部。
31.在本发明中，所述共生培养用培养基优选包括燕麦培养基。所述燕麦培养基优选包括以下含量的组分：4g
·
l-1
燕麦和10g
·
l-1
琼脂，培养基ph为5.6～5.8。所述石斛幼苗的移栽和所述胶膜菌菌株tp-3 接种的顺序没有特殊限制，采用本领域所熟知的共生关系的植株和菌的接种移栽顺序即可。在本发明实施例中，优先将石斛幼苗移栽至共生培养上，再接种菌株tp-3。菌株tp-3的接种量为每120ml燕麦培养基接种0.5cm3的菌株tp-3菌块。所述菌株tp-3菌块参见上述扩大培养方法获得即可。
32.在本发明中，所述共生培养的温度优选为23～27℃，更优选为 25℃。所述共生培养的光周期l/d＝12/12，光照强度优选为2000～ 3000lx，更优选为2500lx。所述共生培养优选在人工气候箱中进行，以便能够严格控制光照、温度等条件。所述共生培养的时间优选为 30～120d，更优选为90d。所述共生培养有利于胶膜菌菌株tp-3对石斛幼苗进行菌根化。菌株tp-3作为内生菌，通过分泌一定活性成分达到促进幼苗株高生长的技术效果。
33.下面结合实施例对本发明提供的一种具有促进石斛株高生长能力的胶膜菌菌株tp-3及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.实施例1
35.菌株tp-3的分离、纯化和鉴定方法
36.(一)菌株tp-3的分离、纯化
37.1.迁地诱导铁皮石斛幼苗菌根
38.(1)2018年7月底至9月，团队实地调研多个地方，采访当地采药人，最终确认云南广南(23
°
58
′
n,105
°
11
′
e；1428m alt.)、湖南崀山喀斯特地貌(26
°
30
′
n,111
°
10
′
e；340m alt.)与丹霞地貌(26
°
20
′ꢀ
n,110
°
46
′
e；455m alt.)、重庆罗田(30
°
31
′
n,108
°
33
′
e；1200m alt.)，四川泸定(29
°
23
′
n,102
°
21
′
e；1382m alt.)和石棉(29
°
22
′
n,105
°
11
′ꢀ
e；3596m alt.)六个地方是铁皮石斛原生境，因为历史上采药人于此采集到过野生铁皮石斛。期间采集六个原生境基质带回实验室，将野外带回来的基质分别与无菌混合基质(树皮、泥炭土、火山石以2:1:1 比例混合)等体积混合，然后用无菌水浇灌至饱和，后分装至塑料花盆(半径5cm，高10cm)备用。
39.(2)选取长势良好的无菌铁皮石斛幼苗，五株为一丛，将其移植到装有诱导基质的塑料花盆，于25
±
2℃室温条件下光照培养(光周期为12/12h l/d)，保持花盆内基质的湿度，并每隔15天采集幼苗根组织，在显微镜下检查根组织是否被真菌定殖。
40.(3)移栽60天后，幼苗根组织上发现菌丝团，采集幼苗根样，用于后续的真菌分离实验。
41.2.胶膜菌tp-3菌株的分离、纯化及保存
42.(1)根样的来源：铁皮石斛幼苗迁地诱导获得的形成共生关系的幼苗菌根
43.(2)根样内生真菌的诱导、分离、纯化及保存：在自来水下将用于真菌分离的根样冲洗干净。在超净工作台上，根样放入75％酒精 (c2h6o)消毒30s，再移入盛有2％次氯酸钠(naclo)溶液的灭菌平板中，轻轻搅拌消毒3min，后用无菌尖镊取出，无菌水冲洗3～4 次。用无菌手术刀将根样切成约0.1mm根片段，将其置于pda培养基中25℃培养箱黑暗培养。待根片段周围长出真菌菌丝，不断地切取菌丝尖端到新的pda培养基上作系列转移，转移3～5次后，可得纯菌落，一共获得27株共生真菌。
44.(3)真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存。将配制好的适量pda培养基倒入规格为18
×
20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的1/3。硅胶塞后，放入高压灭菌锅内灭菌(121℃，20min)。灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待用。在超净工作台上，将纯化后的菌株用无菌接种针挑取边缘菌丝接种于pda斜面上，并注明菌种、编号、日期。将接种后的试管置于人工气候箱内25
±
2℃培养。待菌丝要长满pda斜面时，将试管取出存入4℃冰箱内保存。
45.(三)胶膜菌属tp-3菌株的鉴定
46.(1)分子鉴定
47.采用ctab法提取真菌菌株tp-3的总dna，用真菌通用引物 its1(tccgtaggtgaacctgcgg，seq id no：2)和its4 (tcctccgcttattgatatgc，seq id no：3)；pcr反应体系(25μl) 包括：2.5μl 10
×
pcr缓冲液，0.4μl dntp，1.5μl mg
2
，1.5μl its1， 1.5μl its4，0.2μltaq酶，15.4μl ddh2o，2μl dna模板；扩增反应在pcr仪perkin elmer上
进行，如下pcr循环：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，30 次循环；最后72℃延伸10min；扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序。
48.将胶膜菌属菌株tp-3的nrdna its序列(seq id no:1)进行 blast比对，鉴定结果表明该菌株与真菌tulasnella sp.(km211335.1) 最为相似，最大相似度达到99％。
49.(2)对菌株tp-3进行形态观察，形态特征如下：
50.该胶膜菌属菌株在pda平板上培养10天，其菌落呈白色毯状，气生菌丝发达，规则圆形发散生长，菌落表面粗糙、干燥，有层次较明显的5个同心圆。
51.(3)菌株tp-3进行使用盖玻片插片培养法观察菌株显微形态特征，使用盖玻片插片培养法观察菌株显微形态特征，在25
±
2℃条件下培养箱内黑暗培养10天，光学显微镜下观察，菌丝粗2.69-5.75μm，分枝近直角，新菌丝着生于老菌丝顶部，具更明显隔膜，且隔膜数量更多，老菌丝细胞壁具有加厚现象，隔室长。
52.综合形态学、分子鉴定结果表明，菌株tp-3属于胶膜菌属 (tulasnella sp.)的一株真菌。
53.对比例1
54.实施例1中分离的27株内生真菌中，菌株编号tp-2、tp-5、tp-6、 tp-8、tp-10、tp-12、tp-14、tp-15、tp-19、tp-25的菌株按照实施例1的方法进行鉴定。菌株tp-2(seq id no:4)、tp-5(seq idno:5)、tp-6(seq id no:6)、tp-8(seq id no:7)均属于胶膜属真菌(tulasnella sp.)，菌株tp-12(seq id no:8)和tp-10(seqid no:9)均属于瘤菌根菌(epulorhiza sp)，菌株tp-14(seq idno:10)属于蜡壳菌属真菌(sebacina sp.)。菌株tp-15(seq id no:11) 属于sebacinales sp.，菌株tp-19(seq id no:12)属于clitopilus sp.，菌株tp-25(seq id no:13)属于muscodor sp.。
55.实施例2
56.胶膜菌属真菌tp-3菌株促进铁皮石斛幼苗株高生长有效性实验
57.利用无菌铁皮石斛幼苗与真菌在培养基内的共生实验来验证该真菌是否对幼苗株高生长有促进效果以及对比不同真菌对株高生长促进效果的差异：
58.(1)配制共生培养基：共生萌发培养基为燕麦琼脂培养基，包括4g
·
l-1燕麦和10g
·
l-1琼脂，培养基ph为5.6～5.8；
59.(2)将用于验证促生长功能的26株菌根真菌及本发明所述胶膜菌属真菌tulasnella sp.tp-3取出，接种在pda培养基上，置于人工气候箱内，在温度为25
±
2℃黑暗培养活化至真菌菌丝长满培养皿得到共生菌株材料；
60.(3)将长势大约一致(叶：4-5片，根：2条，株高：1.7-2.5cm，茎粗：1.2-1.5mm)的无菌幼苗移栽到装有燕麦琼脂培养基的组培瓶中，每组真菌处理230株苗，46个重复；
61.(4)将用于共生菌株接种至栽有无菌幼苗的组培瓶中，再置于组培室，在温度为25
±
2℃条件下恒温培养，光照周期l/d＝12/12，光照强度为2000～3000lx；
62.(5)真菌对铁皮石斛幼苗株高促进效果和数据统计分析：统计两个时期(共生30天和90天)，每次每组至少测量35株幼苗的株高，计算出每组株高平均值(h)，
63.h＝maen(ht)
±
se，其中ht为各时期幼苗的株高，se为标准误；
64.共生培养90天截止实验时，利用广义线性模型(glms)比较不同真菌接种处理对株高生长的影响，并用最小显著性差异(lsd)比较各处理平均值，不同共生真菌处理，对幼苗
株高影响程度不一，p《0.05 (表1)。
65.表1不同真菌对铁皮石斛幼苗株高生长的影响(30天、90天统计)
[0066][0067]
注意：小写字母表示不同真菌处理间的显著性。
[0068]
从表1可知，与铁皮石斛幼苗共生培养30天后，不同真菌处理组包括不接菌处理的pda对照组株高均有生长，但生长效果不尽相同。接种非菌根真菌tp-19和tp-25处理组其株高生长反倒显著低于不接菌处理的pda对照组，而接种tp-6显著的处理组，其株高显著高于不接菌对照。接种tp-3、tp-5、tp-12、tp-14幼苗的株高与不接菌对照效果相当。共生培养90天截止实验时，绝大部分真菌处理幼苗株高与对照相当，甚至显著低于对照，只有接种tp-3的幼苗株高显著高于对照组，高达4.621
±
0.263cm，较30天高出68.83％，其促进株高生长效果最佳，因此，tp-3菌株对铁皮石斛幼苗株高生长有最明显的促进效果(见图1)。
[0069]
真菌对幼苗生长促进效应不同，前期促进株高生长效果最好的 tp-6菌株，到后期，其效应并不明显，而接种tp-3菌株处理的幼苗其促进株高生长效果最佳，同时能够促进幼苗叶片。根系、茎的生长，且能增加有机物的含量(干重)。铁皮石斛幼苗与本发明菌株tp-3表现出有益的共生关系，可以利用tp-3菌株与铁皮石斛幼苗共生，实现铁皮石斛幼苗菌根化，同时可作为铁皮石斛栽培的生物菌剂原料。
[0070]
对比例2
[0071]
为了进一步明确筛选的tp-3菌株对铁皮石斛生长方面的影响，本发明分别测定真菌对铁皮石斛幼苗新叶、新根、茎粗及干重四个生长指标的影响，结果如表2所示。
[0072]
表2不同真菌对铁皮石斛幼苗生长的影响(90天统计)
[0073]
接种处理菌株新叶数(片)新根数(条)茎粗(mm)干重(g)tp-3tulasnellasp.2.894
±
0.492bc1.342
±
0.279c2.283
±
0.151abcd0.052
±
0.004abtp-5tulasnellasp.2.548
±
0.539c1.355
±
0.235c2.382
±
0.107ab0.041
±
0.003c
tp-6tulasnellasp.3.045
±
0.43b0.999
±
0.297d2.182
±
0.135bcd0.059
±
0.005atp-8tulasnellasp.3.06
±
0.515b1.712
±
0.36b2.493
±
0.248ab0.042
±
0.002ctp-10epulorhizasp.2.786
±
0.495bc1.715
±
0.302b2.235
±
0.142abcd0.048
±
0.003bctp-12epulorhizasp.3.92
±
0.512a1.677
±
0.333b1.936
±
0.089d0.039
±
0.003ctp-14sebacinasp.2.936
±
0.477bc1.715
±
0.223b1.973
±
0.115cd0.043
±
0.004bctp-15sebacinalessp.2.015
±
0.4de1.58
±
0.259bc2.295
±
0.088abc0.044
±
0.003bctp-19clitopilussp.2.399
±
0.502cd2.329
±
0.347a2.503
±
0.174ab0.038
±
0.004ctp-25muscodorsp.2.859
±
0.31bc2.606
±
0.312a2.587
±
0.098a0.039
±
0.003cpda(ck)不接菌1.531
±
0.347e0.59
±
0.171e1.948
±
0.164cd0.038
±
0.004c
[0074]
注意：小写字母表示不同真菌处理间的显著性。
[0075]
由上述可知，与空白对照相比，tp-3菌株对铁皮石斛幼苗的新叶数、新根数、茎粗和幼苗干重均具有显著促进作用。与其他菌株相比，tp-3菌株在促进幼苗新叶数、新根数、茎粗以及干重方面没有明显的优势。
[0076]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。