原核表达系统及其使用方法与流程

原核表达系统及其使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.根据35 usc
§
119(e)，本技术要求2019年7月4日提交的题为“原核表达系统及其使用方法”的美国临时专利申请号62/870,750的优先权权益，其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及合成牵引蛛丝聚合物。


背景技术：

4.牵引蛛丝在本领域中被认为是圆网蜘蛛用来构建它们的网的框架和半径以及当它们坠落或逃脱危险时的救生索的丝。为了能够完成这些任务，牵引纤维由于结合了高弹性和强度而表现出非常高的韧性，这使其无论是天然的还是人造的都成为最坚韧的纤维。例如，牵引丝的直径是高强度钢的六倍，并且比有史以来最强的合成纤维之一kevlar强三倍。
5.牵引丝由两种主要多肽组成，主要被称为大壶状腺丝蛋白(masp)1和2，并且也被称为十字园蛛(araneus diadematus)中的adf-3和adf-4。取决于样品年龄和分析条件，这些蛋白质的表观分子量在200-720kda范围内。已知的牵引丝腺丝蛋白由交替的富含丙氨酸的片段和富含甘氨酸的片段的高度迭代块组成，富含丙氨酸的片段在纤维中形成结晶β-折叠，富含甘氨酸的片段更灵活且主要缺乏有序结构。c-末端区域不重复，物种间高度保守，并且采用α-螺旋构象。还发现牵引丝蛋白的n-末端区域在不同腺丝蛋白之间以及不同蜘蛛物种之间高度保守。
6.已经进行了许多尝试以合成地制造蛛丝，比如通过在组织培养物和甚至转基因山羊中使用细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞的基因工程。
7.美国专利号8,461,301涉及包括半合成蛛丝蛋白结构域或其任何功能性同源物、变体、衍生物、片段或突变体的多个重复序列的分离的氨基酸序列，等等。涉及牵引蛛丝的其他出版物包括但不限于ittah，s.等人，biopolymers，93(5)，458-468，2010；ittah，s.等人biomacromolecules，8(9)，2768-2773，2007；ittah，s.等人，biomacromolecules，7(6)，1790-1795，2006；和huemmerich，d.，ittah，s.等人，current biology，14，2070-2074，2004。
8.对于用于生产具有与天然蛛丝的机械特性相似的合成蛛丝的改进的组合物和方法存在未满足的需求。


技术实现要素：

9.本发明涉及具有产生以β-折叠晶体结构组织的masp类蛋白质的能力的重组细菌、使用其产生masp类聚合物的方法以及包括其的组合物。
10.根据一个方面，本发明提供了一种组合物，其包括尺寸在0.5μm至1.5μm的范围内
的颗粒形式的合成的大壶状腺丝蛋白(major ampullate spidroin protein)(masp)类聚合物。
11.在一些实施方式中，masp类聚合物是不可溶于水的聚合物。
12.在一些实施方式中，组合物的dsc图展现在200℃至280℃的范围内的至少一个吸热峰。
13.在一些实施方式中，颗粒是多孔颗粒并且特征在于至少10m2/g的bet表面积。
14.在一些实施方式中，颗粒包括多个纳米原纤维。
15.在一些实施方式中，组合物进一步包括与masp类聚合物接触的另外的化合物。
16.在一些实施方式中，化合物选自生物活性剂和营养制剂。
17.在一些实施方式中，masp类聚合物与所述另外的化合物的重量比(w/w)在10:1和1:10之间。
18.在一些实施方式中，masp类聚合物包括如seq id no：2(sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgss)中所列的氨基酸序列。
19.在一些实施方式中，masp类聚合物包括如seq id no：3(aaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggygpggpgss)中所列的氨基酸序列。
20.在一些实施方式中，masp类聚合物包括10-20个seq id no：3的重复序列。
21.在一些实施方式中，masp类聚合物包括选自以下的单个n-末端区域：seq id no：4(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlv)。
22.在一些实施方式中，masp类聚合物包括选自以下的单个c-末端区域：seq id no：7(vaasrlsspaassrvssavsslvssgptngaavsgalnslvsqisasnpglsgcdalvqallelvsalvailssasigqvnvssvsqstqmisqals)。
23.在一些实施方式中，通过在细菌中表达masp来获得组合物。
24.在一些实施方式中，细菌是大肠杆菌。
25.在另一方面中，存在一种组合物，其包括与另外的聚合物结合的本发明的masp类聚合物，其中所述masp类聚合物与所述另外的聚合物的w/w比在1:1和1:100之间。
26.在一些实施方式中，所述另外的聚合物的w/w浓度为总组合物的50％至95％(w/w)。
27.在一些实施方式中，另外的聚合物选自合成聚合物、热塑性聚合物、热固性聚合物、成膜剂、环氧树脂、聚酯、聚酰胺、多元醇、聚氨酯、聚乙烯、硅、液晶聚合物、马来酸酐接枝聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚酰胺、尼龙4,6、尼龙6、尼龙6,6、尼龙11、尼龙12、聚(芳基酰胺)、聚乙烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯硫醚、聚邻苯二甲酰胺、聚丙烯、聚(偏二氟乙烯)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(phema)、聚氨酯、聚乙烯醇缩丁醛、乙烯乙烯醇共聚物、聚乳酸(pla)或其共聚物、聚己内酯(pcl)、黄原胶、纤维素、胶原、弹性蛋白、角蛋白、棉花、橡胶、纤维素、羊毛及其任意组合。
28.在一些实施方式中，成膜剂是固体成膜剂。
29.在一些实施方式中，所述成膜剂和所述masp类纤维之间的w/w比为5:1至50:1。
30.在一些实施方式中，与不含masp类聚合物的另外的聚合物的特性相比，组合物的特征在于至少一种改进的机械特性，其中所述特性选自：杨氏模量、抗拉强度、断裂应变、屈服点、韧性、破坏功、冲击强度、撕裂强度、弯曲模量、特定伸长率下的弯曲应变和应力，以及
磨损。
31.根据另一方面，本发明提供了包括本文描述的组合物的制品，其中制品的形式为膜、缝合线、外科网、医用胶带、静电纺丝网、皮肤移植物、脂肪移植物、化妆品、皮下填充剂、药物洗脱/输送装置、替换韧带、服装面料、防弹背心衬里、线缆、管子、膜、绳索、钓鱼线、轮胎、运动器材和增强塑料。
32.根据另一方面，本发明提供一种具有表达masp类聚合物的能力的重组细菌，该聚合物包括如seq id no：2(sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgss)中所列的氨基酸序列。
33.根据另一方面，本发明提供了一种方法，包括：(i)提供本文描述的重组细菌；(ii)为细菌表达masp提供条件；和(iii)分离表达的蛋白质，从而制造合成牵引蛛丝。
34.在一些实施方式中，步骤(ii)包括提供ph在5至6.5的范围内的溶液。
35.在一些实施方式中，步骤(ii)包括提供表达诱导剂。
36.在一些实施方式中，步骤(ii)包括等待一段时间以获得不可溶的聚合物。
37.在一些实施方式中，步骤(iii)进一步包括干燥所述合成牵引蛛丝。
38.在一些实施方式中，该方法进一步包括使用另外的聚合物的富集步骤。
39.在一些实施方式中，富集步骤包括将合成牵引蛛丝的溶液与第二聚合物的溶液混合。
40.从下文给出的详细描述中，本发明的其他实施方式和全部适用范围将变得显而易见。然而，应当理解，虽然表明了本发明的优选实施方式，但是详细描述和具体实例仅以说明的方式给出，因为从详细描述来看，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
附图说明
41.图1a-c是所得蛋白质的uv光谱(图1a)、显示所测量的与预期的氨基酸含量的图(图1b)和所得蛋白质(svx-e)的傅立叶变换红外光谱学(ftir)光谱(图1c)。
42.图2是展现使用描述的表达系统获得的蛋白质的粒径分布的图。
43.图3是获得的颗粒的ftir分析。
44.图4是细菌中表达的蛛丝蛋白(svx-e)与sf9细胞中表达的蛛丝svx的ftir光谱。
45.图5是与sf9细胞(svx)中表达的蛛丝和与丝纤维相比，细菌中表达的蛛丝蛋白(svx-e)的ftir光谱。
46.图6a-c是细菌svx-e中表达的蛛丝蛋白的差示扫描量热(dsc)曲线(图6a和图6b)和svx蛋白的dsc曲线(图6c)；
47.图7a-b是与来自sf9的svx(图7a)相比，svxe的透射电子显微镜图像(图7b)。
48.图8a-b是svxe对聚合物p490rsjt复合材料的机械特性的剂量依赖效应的图。图8a表示显示与对照(原始p490rsjt聚合物)相比，富含10％、20％和30％svxe的p490rsjt在500％模量时增加的应力(增加10％至20％)的条形图。图8b表示与对照(原始p490rsjt聚合物)相比，富含5％、10％、20％和30％svxe的p490rsjt的应力-应变曲线。
49.图9a-e是svxe对聚合物e394pota复合材料的机械特性的剂量依赖效应的图。图9a是显示与对照(原始e394pota聚合物)相比，富含10％、20％和30％svxe的e394pota的增加的杨氏模量(增加约50％至约400％)的条形图。图9b-d是与对照(原始e394pota聚合物)相
比，显示富含10％、20％和30％svxe的e394pota的uts(图9b)、％断裂伸长率(图9c)和韧性(图9d)的降低的条形图。图9e表示与对照(原始e394pota聚合物)相比，富含10％、20％和30％svxe的e394pota的应力-应变曲线。
50.图10a-e是富含20％svx、研磨的svx和svx-e的聚合物p490rsjt pu复合材料的机械特性的对比图。图10a是显示与对照(原始p490rsjt pu聚合物)相比，富集的p490rsjt pu的增加的杨氏模量(增加约150％至约300％之间)的条形图。图10b-d是显示与对照(原始p490rsjt pu聚合物)相比，富含10％、20％和30％svxe的p490rsjt pu的uts(图10b)、％断裂伸长率(图10c)和韧性(图10d)的降低的条形图。图10e表示与对照(原始e394pota聚合物)相比，富含20％svx、研磨的svx&svx-e的p490rsjt pu的应力-应变曲线。
51.图11a-e分别是表示聚合物e394pota pu和富含20％svx、研磨的svx和svx-e的复合材料的机械特性的对比的图。
52.图12是展现通过激光衍射测量的水性悬浮液中svx-e颗粒的尺寸的条形图。*指分离的svx-e颗粒的平均尺寸；**指干燥和重新悬浮后多孔或非聚集的svx-e颗粒的平均尺寸；***是指干燥和重新悬浮后“无孔”或聚集的svx-e颗粒的平均尺寸。
53.图13是显示富含15％w/w的svx-e的pu样品的对比应力-应变曲线的图。该图显示了与对照pu样品(实线)相比，富含无孔或聚集颗粒(svx聚集)以及多孔或非聚集颗粒(svx分散良好)的pu样品的应力-应变行为。
54.图14是汇总了富含10％w/w svx-e的成膜剂的机械特性的表格。
55.图15是在大肠杆菌中培养30小时时svx-e的量的图；svx-e是使用特定的β折叠晶体结合荧光染料测定的；
56.图16为在ph 5.8和ph 7.5下不同培养时间的svx-e染色图片；绿色斑点是由于特定的β晶体结合荧光染料进入细胞引起的；
57.图17是在一段时间内在ph 5.8下生长速率和β折叠晶体染色差异的图；
58.图18是在一段时间内在ph 5.8下的绝对生长曲线图；
59.图19是在一段时间内在ph 7.5下生长速率和β折叠晶体染色差异的图；
60.图20是表示与纤维素和丝相比，从svx-e纤维释放透明质酸(ha)的图。该图显示了ha特定峰和svx-e/丝/纤维素特定峰之间的计算比率(y轴)与洗涤次数(x轴)。
61.图21a-e是masp类(svx)纤维的扫描电子显微照片(sem)。图21a和图21b表示多孔纤维的图像。图21c和图21d表示无孔颗粒的图像。图21e表示由不同序列(seq id no：10)的表达产生的纤维。
具体实施方式
62.在一些实施方式中，本文提供了表达组合物的细菌，该组合物包括可用于制备合成牵引蛛丝的大壶状腺丝蛋白(masp)类蛋白质。本发明进一步提供了包括这些组合物的制品和复合材料。
63.本发明部分基于以下出人意料的发现，即微生物比如大肠杆菌出人意料地有效地作为生产masp蛋白的宿主。masp蛋白不仅在大肠杆菌中表达，而且在细菌内部自组装形成功能性蛛丝。令人惊讶的是，这种自组装仅在外部ph《7时发生，但是在中性ph值7-7.5时不发生。
64.本发明进一步部分基于以下出人意料的发现，即与天然牵引蛛丝相比或者与在其他表达系统中产生的牵引蛛丝蛋白相比，微生物产生的masp蛋白(本文中也用作svx-e)出人意料地具有出色的机械特性。
65.本发明进一步部分地基于以下出人意料的发现，即svx-e类纤维是尺寸在0.5μm至1.5μm的范围内的颗粒形式。如本文所举例说明的(例如图12)，与对照masp类聚合物相反，这些颗粒在水性分散体中保持稳定(例如，基本上不含聚集体)。此外，svx-e类纤维的特征在于孔隙率增加和bet表面积极大(例如，约180m2/g)。
66.组合物
67.根据一些实施方式，提供了一种组合物，其包括尺寸在0.5μm至1.5μm的范围内的颗粒形式的合成的大壶状腺丝蛋白(masp)类聚合物。在一些实施方式中，masp类聚合物是不可溶的聚合物。在一些实施方式中，该组合物的dsc图展现在200℃至280℃的范围内的至少一个吸热峰。在一些实施方式中，该组合物具有在1615cm-1
至1635cm-1
的范围内的酰胺峰，如通过ftir分析测量的。
68.根据一些实施方式，提供了一种包括合成的masp类聚合物的组合物，其中masp类聚合物具有选自以下的至少一种特征：
69.a)是不可溶的聚合物；
70.b)是尺寸在0.5μm至1.5μm的范围内的颗粒形式；
71.c)具有至少10m2/g的bet表面积；
72.d)具有展现在200℃至280℃的范围内的至少一个吸热峰的dsc图；和
73.e)具有在1615cm-1
和1638cm-1
的范围内的酰胺峰，如通过ftir分析测量的。
74.根据一些实施方式，提供了一种组合物，其包括颗粒形式的合成的masp类聚合物。在一些实施方式中，颗粒的尺寸在0.5μm至1.5μm、0.7μm至1.5μm、0.8μm至1.5μm、0.9μm至1.5μm、0.5μm至1μm、0.7μm至1μm、0.8μm至1μm、0.9μm至1μm、0.5μm至1.3μm、0.5μm至1.2μm、0.7μm至1.3μm、0.7μm至1.2μm或0.9μm至1.2μm的范围内，包括其间的任意范围。在一些实施方式中，粒径是指通过激光衍射测量的水性溶剂(例如水性分散体)内的平均粒径(参见实施例部分)。在一些实施方式中，粒径是指干燥粒径(例如基本上不含包括水分子的外壳的颗粒尺寸)。
75.在一些实施方式中，提供了一种组合物，其包括不可溶的masp类聚合物。在一些实施方式中，不可溶的masp类聚合物是颗粒形式。在一些实施方式中，不可溶的masp类聚合物在有机溶剂中是不可溶的。在一些实施方式中，不可溶的masp类聚合物在水溶液中是不可溶的。
76.如本文所使用的，术语“不可溶的”是指当暴露于过量溶剂时不溶解但可分散至不同程度的材料。在一些实施方式中，术语“不可溶的”是指以小于10％、小于5％、小于2％或小于1％溶解于溶剂中的材料。在一些实施方式中，“不可溶的”是指仅能以小于按重量计0.01％的浓度部分溶解于溶剂中的材料。根据本发明的溶剂包括有机溶剂和水溶液。在一些实施方式中，溶剂包括表面活性剂水溶液。表面活性剂(例如离子表面活性剂)是本领域众所周知的。在一些实施方式中，溶剂包括尿素水溶液。
77.在一些实施方式中，所公开的组合物的特征在于确定的差示扫描量热法(dsc)图。在一些实施方式中，“dsc图”是指峰的位置。在一些实施方式中，“峰”是指放热峰。在本文全
篇“峰的位置”或“峰位置”是指在热谱图中沿温度轴的峰，并且在一些实施方式中，可以指任何峰强度处的峰位置。本领域技术人员将理解，在dsc测量中获得的数据部分取决于所使用的仪器和进行测量时的环境条件(例如，湿度)。
78.在一些实施方式中，所公开的组合物的特征在于展现在200℃至280℃的范围内的至少一个吸热峰的dsc图。在一些实施方式中，所公开的组合物的特征在于展现在200℃至270℃、200℃至260℃、200℃至250℃、210℃至280℃、212℃至280℃、215℃至280℃、216℃至280℃、220℃至280℃、210℃至250℃、212℃至250℃、215℃至250℃、216℃至250℃、220℃至250℃、210℃至245℃、210℃至242℃或215℃至245℃的范围内，包括其间的任意范围的至少一个吸热峰的dsc图。
79.在一些实施方式中，所公开的组合物的特征在于与包括(masp)类纤维的相应组合物的dsc图相比展现低至少5℃至100℃、至少10℃至100℃、至少15℃至100℃、至少12℃至100℃、至少25℃至100℃、至少5℃至80℃、至少10℃至80℃、至少15℃至80℃、至少12℃至80℃、至少25℃至80℃、至少5℃至50℃、至少10℃至50℃、至少15℃至50℃、至少12℃至50℃或至少25℃至50℃的至少一个吸热峰的dsc图。
80.在一些实施方式中，所公开的组合物在约-100℃至约190℃的范围内没有dsc峰。在一些实施方式中，所公开的化合物在约-100℃至约25℃的范围内没有dsc峰。在一些实施方式中，所公开的组合物的特征至少在于展现在40℃至70℃的范围内没有放热峰的dsc图。
81.在一些实施方式中，所公开的组合物在约-100℃至约-50℃的范围内没有dsc峰。在一些实施方式中，所公开的化合物在约-50℃至约0℃的范围内没有dsc峰。在一些实施方式中，所公开的化合物在约-0℃至约-25℃的范围内没有dsc峰。
82.在一些实施方式中，所公开的组合物的特征在于具有在1615cm-1
至1635cm-1
的范围内的酰胺峰，如通过ftir分析测量的。在一些实施方式中，所公开的组合物的特征在于具有在1620cm-1
至1635cm-1
、1620cm-1
至1630cm-1
、1621cm-1
至1630cm-1
或1620cm-1
至1625cm-1
的范围内，包括其间的任意范围的酰胺峰，如通过ftir分析测量的。
83.在一些实施方式中，所公开的组合物没有在1700cm-1
至1800cm-1
的范围内的峰，如通过ftir分析测量的。
84.通过一个实施方式，本发明的masp类聚合物通过自组装进行组装。“自组装”是指单体，即本发明的合成蛛丝蛋白，在正常生理条件下或在室温下以能量有利的方式自发地相互结合，以产生具有本文描述的特性的大分子结构。此外，本发明的masp类聚合物非常有弹性，并且一旦组装，可以承受极端的化学攻击，比如在10％w/w表面活性剂溶液中的增溶和煮沸至少1小时。
[0085]“韧度(tenacity)”或“抗拉强度”是指在断裂前长丝可以承受的重量。产生的最大比应力通常是在长丝、纱线或织物中通过拉伸试验来破坏材料。根据具体实施方式，本发明的masp类聚合物的抗拉强度为约100-3000mpa(mpa＝n/mm2)、约300-3000mpa、约500-2700mpa、约700-2500mpa、约900-2300mpa、约1100-2000mpa、约1200-1800mpa、约1300-1700mpa或约1400-1600mpa，更具体地约1500mpa。
[0086]“韧性(toughness)”是指破坏masp类聚合物所需的能量。这是应力应变曲线下方的面积，有时称为“断裂能量”或断裂功。根据特定实施方式，本发明的masp类聚合物的韧性为约20-1000mj/m3、约50-950mj/m3、约100-900mj/m3、约120-850mj/m3、约150-800mj/m3、约
180-700mj/m3、约180-750mj/m3、约250-700mj/m3、约280-600mj/m3、约300-580mj/m3、约310-560mj/m3、约320-540mj/m3或约350-520mj/m3，最具体地为约350-520mj/m3。
[0087]“弹性(elasticity)”是指物体在变形后倾向于恢复其原始尺寸和形状的特性。塑性，即变形却没有恢复，与弹性相对。在masp类聚合物的分子构型上，通过原子间和分子间结构键的拉伸(重新定向)，可恢复或弹性变形是可能的。相反，分子间键断裂并重新形成新的稳定位置会导致不可恢复或塑性变形。
[0088]“伸长率”是指以初始长度的百分比或分数表示的长度增加。
[0089]“细度”是指masp类聚合物或长丝(例如，生物长丝)的平均直径，其通常以微米(μm)表示。
[0090]
根据一些方面，本文可互换使用的masp类蛋白质或masp类聚合物呈纤维形式。如本文所使用的，“纤维”是指由两根或更多根绞合在一起的长丝组成的纤维材料的细绳。“长丝”是指纤细的、细长的、线状物体或不确定长度的结构，范围从微观长度到一英里或更长的长度。具体而言，合成蛛丝长丝是微观的，并且是蛋白质的。“生物长丝”是指由蛋白质产生的长丝，包括重组产生的蛛丝蛋白。在一些实施方式中，术语“纤维”不包括非结构化聚集体或沉淀物。
[0091]
在一些实施方式中，masp类纤维包括多种masp类聚合物。在一些实施方式中，多种masp类聚合物包括具有不同化学组成和/或不同分子量(mw)的聚合物。在一些实施方式中，多种masp类聚合物包括具有不同数量的重复区域的聚合物。
[0092]
在一些实施方式中，masp类聚合物或masp类纤维基本上不含另外的非masp类蛋白质。在一个实施方式中，masp类聚合物或masp类纤维基本上不含另外的聚合物(例如合成聚合物，非masp类肽，非masp类蛋白质)。
[0093]
在一些实施方式中，蛋白质的纤维的特征在于其至少一个维度(例如，直径、长度)的尺寸。例如但不限于，纤维的直径在10nm-1μm之间、20-100nm之间或10-50nm之间。
[0094]
在一个实施方式中，masp类纤维由单体组成。在一个实施方式中，多种masp类聚合物布置在纳米原纤维中。在一个实施方式中，多个纳米原纤维布置在纤维中或构成纤维。在一个实施方式中，masp类纤维内的单体或纳米原纤维具有4至16nm的直径。在一个实施方式中，masp类纤维内的单体或纳米原纤维具有6至14nm的直径。在一个实施方式中，masp类纤维内的单体或纳米原纤维具有8至12nm的直径。在一些实施方式中，masp类纤维包括多个原纤维(例如纳米原纤维)，如下文所举例说明的(图21a-b)。在一些实施方式中，具有突变氨基酸序列(例如如seq id no：10(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamprkspfprpel)中所列的氨基酸序列)的纤维基本上不含纳米原纤维，如图21e中所示例的。在一些实施方式中，具有突变氨基酸序列(例如如seq id no：10(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamprkspfprpel中所列的氨基酸序列)的纤维呈无孔颗粒的形式，如图21e中所示例的。
[0095]
在一些实施方式中，纳米原纤维的直径为例如1nm、约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约6nm、约7nm、约8nm、约9nm、约10nm、约11nm、约12nm、约13nm、约14nm、约15nm、约16nm、约17nm、约18nm、约19nm、约20nm、约21nm、约22nm、约23nm、约24nm、约25nm、约26nm、约27nm、约28nm、约29nm、约30nm、约31nm、约32nm、约33nm、约34nm、约35nm、约36nm、约37nm、约38nm、约40nm、约42nm、约44nm、约46nm、约48nm或约50nm，包括其间的任何值或范围。在一个实施方式中，纳米原纤维的直径为3-7nm。在一个实施方式中，纳米原纤维的直径为4-6nm。
[0096]
在一个实施方式中，masp类纤维的直径为70至450nm。在一个实施方式中，masp类纤维的直径为80至350nm。在一个实施方式中，masp类纤维的直径为80至300nm。在一个实施方式中，masp类纤维的直径为150至250nm。在一个实施方式中，masp类纤维或masp类聚合物被布置为线圈。在一个实施方式中，单个纤维或一种masp类聚合物被布置为线圈。在一个实施方式中，线圈的直径为5至800微米。在一个实施方式中，线圈的直径为5至500微米。在一个实施方式中，线圈的直径为5至30微米。在一个实施方式中，线圈的直径为5至20微米。在一个实施方式中，masp类纤维或masp类聚合物的长度为5至800微米。在一个实施方式中，masp类纤维或masp类聚合物的长度为30至300微米。在一些实施方式中，masp类纤维的长度在之间1-200μm之间、10-100μm之间、100至500μm之间或200-500μm之间，包括其间的任意范围。
[0097]
在一些实施方式中，masp类纤维包括多个孔。在一些实施方式中，masp类纤维呈颗粒形式，如本文描述的。在一些实施方式中，该组合物包括多个masp类纤维。在一些实施方式中，多个masp类纤维包括具有不同的化学组成的纤维。在一些实施方式中，多个masp类纤维呈具有不同尺寸和/或不同结构的颗粒形式。在一些实施方式中，多个masp类纤维呈具有不同孔隙率(由bet表面积表示)的颗粒形式。
[0098]
在一些实施方式中，masp类纤维的特征在于多孔结构。在一些实施方式中，masp类纤维是多孔纤维。在一些实施方式中，多孔结构或多孔的masp类纤维的特征在于至少30％(例如，30至99％)的孔隙率。在一些实施方式中，多孔结构的特征在于至少50％(例如，50至99％)的孔隙率。在一些实施方式中，多孔结构的特征在于至少60％(例如，60至99％)的孔隙率。在一些实施方式中，多孔结构的特征在于至少70％(例如，70至99％)的孔隙率。在一些实施方式中，多孔结构的特征在于至少80％(例如，80至99％)的孔隙率。在一些实施方式中，多孔结构的特征在于至少90％(例如，90至99％)的孔隙率。在一些实施方式中，多孔结构的特征在于约90％的孔隙率。
[0099]
在本文中，术语“孔隙率”是指由孔隙组成的物质(例如“海绵状”材料)的体积百分比。在另一个实施方式中，孔隙率是根据表面积)内的孔隙除以整个表面积(多孔和无孔来测量的。
[0100]
在一些实施方式中，所公开的纤维的多孔结构允许在纤维表面上有效地吸收水。即，并且不受任何特定理论的束缚，可以鉴于所公开的纤维结构及其孔隙率与自然界中发现的天然蛛丝截然不同的孔隙率来解释这一惊人的发现。
[0101]
在一些实施方式中，多孔的masp类纤维呈颗粒形式，如本文描述的。在一些实施方式中，颗粒是多孔颗粒。在一些实施方式中，颗粒是基本上非聚集的颗粒。在一些实施方式中，颗粒包括由masp类聚合物的交织聚合链形成的多个孔(即空间或内腔)。在一些实施方式中，缠结的或交织的masp类聚合物形成基质。在一些实施方式中，化妆品活性成分填充基质内或颗粒内的孔的至少一部分。在一些实施方式中，化妆品活性成分被多个孔包封。
[0102]
在一些实施方式中，masp类纤维是多孔的masp类纤维，其特征在于bet表面积为至少10m2/g、至少20m2/g、至少30m2/g、至少40m2/g、至少50m2/g、至少60m2/g、至少70m2/g、至少80m2/g、至少100m2/g、至少130m2/g、至少150m2/g、至少160m2/g、至少170m2/g、至少180m2/g，包括其间的任意范围或值。
[0103]
在一些实施方式中，多孔的masp类纤维的特征在于bet表面积在10和200m2/g之
间、在10和50m2/g之间、在10和20m2/g之间、在20和50m2/g之间、在50和70m2/g之间、在70和100m2/g之间、在100和120m2/g之间、在120和150m2/g之间、在150和170m2/g之间、在170和190m2/g之间、在150和190m2/g之间、在160和190m2/g之间、在170和190m2/g之间、在100和190m2/g之间、在180和190m2/g之间、在170和180m2/g之间、在180和200m2/g之间、在190和200m2/g，包括其间的任意范围或值。在一些实施方式中，多孔的masp类纤维的特征在于bet表面积在100和200m2/g之间、在150和200m2/g之间，包括其间的任意范围或值。
[0104]
在一些实施方式中，masp类纤维呈无孔masp类纤维或无孔颗粒的形式。在一些实施方式中，masp类纤维呈聚集颗粒的形式。在一些实施方式中，无孔masp类纤维的特征在于bet表面积为至多10m2/g、至多8m2/g、至多6m2/g、至多5m2/g、至多3m2/g、至多2m2/g、至多1m2/g、至多0.5m2/g、至多0.3m2/g、至多0.1m2/g，包括其间的任意范围或值。在一些实施方式中，无孔masp类纤维或无孔颗粒的特征在于bet表面积在0.01和1m2/g之间。
[0105]
应当理解，与无孔颗粒(例如，bet表面积小于10m2/g的颗粒)相比，由大的表面积(例如多孔颗粒)表征的颗粒具有增加的包封能力。在图21a-d中表示了多孔或非聚集和无孔或聚集颗粒的比较sem图像。
[0106]
在一些实施方式中，术语“多孔颗粒”和术语“非聚集颗粒”在本文中可互换使用。在一些实施方式中，术语“无孔颗粒”和术语“聚集颗粒”在本文中可互换使用。
[0107]
在一些实施方式中，多孔颗粒在分散体中是稳定的。在一些实施方式中，与无孔颗粒相比，多孔颗粒在分散体中显著更稳定。在一些实施方式中，分散体是水性分散体。在一些实施方式中，干燥的多孔颗粒在再分散在水溶液中时基本上保持其尺寸。在一些实施方式中，多孔颗粒在水性分散体中没有聚集。在一些实施方式中，多孔颗粒在水性分散体中没有聚集体。
[0108]
在一些实施方式中，无孔颗粒的特征在于粒径大于10μm、大于20μm、大于30μm、大于40μm、大于50μm、大于60μm、大于70μm、大于80μm，包括其间的任意范围。在一些实施方式中，粒径为如本文描述的。在一些实施方式中，无孔颗粒在水溶液中呈聚集体或附聚物的形式。在一些实施方式中，无孔颗粒(例如，干燥的无孔颗粒)在再分散在水溶液中时形成聚集体。
[0109]
如下文所举例说明的(图12)，干燥的无孔(或聚集的)颗粒在水溶液中再分散时倾向于形成聚集体。这种聚集体的粒径可能为几十微米(高达100微米)。不受任何特定理论或机制的束缚，推测分散体中多孔颗粒的异常稳定性可能与由于多孔颗粒表面积增加而增加的与水性溶剂的相互作用有关。本领域技术人员将理解，分散体中多孔颗粒的稳定性在组合物的保质期、组合物(例如水性分散体)中颗粒的最大浓度和/或组合物(例如，包括结合在多个颗粒内或被多个颗粒包封的活性物质的组合物)的负载能力方面可能是有优势的。此外，假定多孔颗粒可以仅由本文描述的任一种细菌表达系统形成。
[0110]
在一些实施方式中，多孔颗粒的尺寸在0.5μm至1.5μm、0.7μm至1.5μm、0.8μm至1.5μm、0.9μm至1.5μm、0.5μm至1μm、0.7μm至1μm、0.8μm至1μm、0.9μm至1μm、0.5μm至1.3μm、0.5μm至1.2μm、0.7μm至1.3μm、0.7μm至1.2μm或0.9μm至1.2μm的范围内，包括其间的任意范围。在一些实施方式中，尺寸或粒径为如上文所描述的。
[0111]
在一些实施方式中，与富含无孔(或聚集)颗粒的材料相比，富含多孔颗粒的材料(例如聚合物材料)的特征在于至少一种改进的机械特性(参见图13)。在一些实施方式中，
机械特性如本文所描述。不受任何特定理论或机制的束缚，推测多孔颗粒相对于无孔颗粒在富集masp类纤维的材料(例如，如下文所描述的富含masp类纤维的聚合物)方面可能是有优势的。据推测，与无孔(或聚集)颗粒相比，富含多孔(或非聚集)颗粒的材料可能具有更高的富集百分比，从而提高masp类纤维的加固性能。
[0112]
包封
[0113]
在一些实施方式中，该组合物进一步包括与masp类聚合物或masp类纤维接触的另外的化合物。在一些实施方式中，另外的化合物与masp类聚合物或masp类纤维结合。在一些实施方式中，组合物包括经由非共价键、物理相互作用或两者基本上结合到多孔masp类纤维的另外的化合物。在一些实施方式中，化妆品活性成分填充基质内或颗粒内的至少一部分孔，其中基质由masp类聚合物的交织聚合链形成。在一些实施方式中，另外的化合物被多个孔包封。
[0114]
在一些实施方式中，与无孔颗粒相比，多孔颗粒的特征在于增加的包封能力。在一些实施方式中，包封能力是指颗粒并入另外的化合物的能力。在一些实施方式中，增加的包封能力与颗粒的大表面积有关，如上文所描述的。
[0115]
在一些实施方式中，另外的化合物被稳定地包封在颗粒的多个孔内。在一些实施方式中，包封的另外的化合物的特征在于逐渐释放曲线(例如在应用部位、在溶液中或在分散体中)。在一些实施方式中，包封另外的化合物的颗粒基本上防止另外的化合物从中快速释放。
[0116]
如本文所使用的，术语“稳定包封”是指组合物基本上防止活性成分(例如另外的化合物)从中释放的能力。如本文所使用的，术语“基本上防止”是指比如在随后洗涤时从组合物释放的活性成分的总量(如实施例部分所述)。
[0117]
在一些实施方式中，基本上包括按重量计至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的另外的化合物。在一些实施方式中，基本上包括经由非共价键、经由物理相互作用或二者将按重量计至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的另外的化合物结合到masp类纤维。非共价键在本领域是众所周知的，并且尤其包括氢键、p-p堆叠、范德华相互作用等。
[0118]
在一些实施方式中，物理相互作用是指将另外的化合物包封(即，截留)在由masp类聚合物形成的基质内。在一些实施方式中，基质与另外的化合物结合或接触。
[0119]
在一些实施方式中，另外的化合物选自生物试剂、药剂、营养素和膳食补充剂。
[0120]
如本文所使用的，术语“生物试剂(也称为生物材料)”涉及具有生物来源的任何物质或材料。例如，术语“生物试剂”涵盖细胞(包括干细胞)、蛋白质、肽或核酸(包括核酸类似物)。如本文所使用的，术语“药剂(也称为药物化合物)”是指可用于治疗、治愈、预防、防止或诊断病理状况，例如疾病或障碍，或可用于以其他方式增强身体、心理或精神健康的任何生物或化学物质。因此，在本发明的上下文中设想的术语“药剂”包括具有治疗、诊断或预防作用的任何药剂，即任何治疗剂、诊断剂或预防剂。
[0121]
药剂可以是影响或参与组织生长、细胞生长、细胞分化的试剂，能够引起生物学作用例如免疫反应的药剂，或可以在一个或多个生物过程中发挥任何其他作用的药剂。
[0122]
药剂的非限制性实例包括但不限于抗微生物剂(比如抗细菌剂(例如抗生素)、抗
病毒剂或抗真菌剂)、免疫抑制剂、抗炎剂、抗过敏剂、抗凝剂、抗风湿剂、抗银屑病剂、镇静剂、肌肉松弛剂、抗偏头痛剂、抗抑郁剂、驱虫剂、生长因子、激素、激素拮抗剂、抗体、佐剂(例如与免疫活性化合物比如抗体组合)、抗氧化剂、蛋白质(比如糖蛋白、脂蛋白或酶(例如透明质酸酶))、多糖、自由基清除剂、放疗剂、光动力治疗剂、染料(例如荧光染料)、造影剂、消毒剂、防腐剂或其任意组合。
[0123]
药剂也可以是小分子化合物。术语“小分子化合物”是指能够影响生物过程的分子。小分子可以包括目前已知和使用的任何数量的治疗剂，或者可以是在此类分子库中合成的小分子，用于筛选生物学功能的目的。小分子化合物的分子量通常小于约5,000道尔顿(da)，优选地小于约2,500da，更优选小于1,000da，最优选地小于约500da。
[0124]
如本文所使用的，“营养素”是生物体生存和生长所需的化学物质或生物体代谢中使用的必须从其环境中摄取的物质。有机营养素包括碳水化合物、脂肪、蛋白质(氨基酸)和维生素。无机营养素是膳食矿物质、水和氧气。优选的营养素是巨量营养素，比如碳水化合物、氨基酸或蛋白质和微量营养素如维生素。
[0125]
碳水化合物的非限制性实例包括但不限于单糖，例如甘油醛、赤藓糖、苏糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、二羟丙酮、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖或其立体异构体，氨基糖比如半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸、n-乙酰葡糖胺、磺基糖如磺基喹诺酮糖(sulfoquinovose)、二糖比如蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖(maltose)、海藻糖或麦芽糖(maltobiose)，和低聚糖比如低聚果糖(fos)、低聚半乳糖(gos)或低聚甘露聚糖(mos)。
[0126]
如本文所使用的，术语“膳食补充剂”(也称为食品补充剂或营养补充剂)是指旨在提供在个人饮食中缺少或没有摄入足够量的营养素比如维生素、矿物质、纤维、脂肪酸或氨基酸。
[0127]
膳食补充剂的非限制性实例包括但不限于类固醇，比如脱氢表雄酮(dhea)、孕烯醇酮或其衍生物、激素比如褪黑激素，和其他物质比如硫酸肼、咖啡因、儿茶素、大豆异黄酮、葡糖胺、辅酶q
10
或麻黄碱类生物碱，如麻黄碱、辛弗林、去甲麻黄碱或伪麻黄碱。
[0128]
活性剂可以带正电或带负电。活性剂也可以是电中性的。优选地，活性剂带正电或负电。术语“正电荷”和“阳离子”以及“负电荷”和“阴离子”可以互换使用。
[0129]
在一些实施方式中，masp类聚合物与另外的化合物的重量比(w/w)为10:1至1:10、10:1至8:1、8:1至6:1、6:1至4:1、4:1至3:1、3:1至2:1、2:1至1:1、1:1至1:2、1:2至1:3、1:3至1:5、1:5至1:10，包括其间的任意范围。
[0130]
聚合物富集
[0131]
在另一方面中，存在一种包括masp类聚合物和另外的聚合物的组合物。在一些实施方式中，另外的聚合物与masp类纤维或masp类聚合物接触。在一些实施方式中，另外的聚合物结合到masp类纤维或masp类聚合物。
[0132]
在一些实施方式中，该组合物包括与masp类纤维结合的另外的聚合物，以形成复合材料。在一些实施方式中，接触包括结合或粘附，其中结合为如本文描述的。
[0133]
在一些实施方式中，另外的聚合物填充孔体积的50％至100％。在一些实施方式中，另外的聚合物基本上填充孔体积的50％至100％，其中基本上为如上文所描述的。在一些实施方式中，另外的聚合物填充孔体积的55％至100％、60％至100％、55％至100％、70％
至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％、50％至99％、50％至98％、50％至97％、50％至95％、50％至90％、70％至90％或70％至95％，包括其间的任意范围。
[0134]
在一些实施方式中，该组合物包括与另外的聚合物结合的本发明的masp类聚合物，其中masp类聚合物与另外的聚合物的w/w比在1:1和1:100之间、在1:1和1:5之间、在1:1和1:3之间、在1:3和1:5之间、在1:5和1:10之间、在1:5和1:7之间、在1:7和1:10之间、在1:10和1:2之间、在1:12和1:15之间、在1:15和1:20之间、在1:20和1:30之间、在1:30和1:40之间、在1:40和1:50之间、在1:50和1:70之间、在1:70和1:100之间，包括其间的任意范围或值。
[0135]
在一些实施方式中，另外的聚合物为合成聚合物。在一些实施方式中，合成聚合物选自热塑性聚合物和热固性聚合物。合成聚合物的非限制性实例包括但不限于环氧树脂、聚酯、聚酰胺、多元醇、聚氨酯、聚乙烯、硅、液晶聚合物、马来酸酐接枝聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚酰胺、尼龙4,6、尼龙6、尼龙6,6、尼龙11、尼龙12、聚(芳基酰胺)、聚乙烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚苯硫醚、聚邻苯二甲酰胺、聚丙烯、聚(偏二氟乙烯)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(phema)、聚氨酯、聚乙烯醇缩丁醛、乙烯乙烯醇共聚物、聚乳酸(pla)或其共聚物、聚己内酯(pcl)、黄原胶、纤维素、胶原、弹性蛋白、角蛋白、棉花、橡胶、纤维素、羊毛和成膜剂或其任意组合。
[0136]
在一些实施方式中，另外的聚合物是合成聚合物。在一些实施方式中，另外的聚合物是成膜剂。在一些实施方式中，组合物中masp类纤维的w/w含量在0.1和20％之间、在0.1和1％之间、在1和2％之间、在2和5％之间、在5和7％之间、在4和6％之间、在6和8％之间、在8和10％之间、在10和12％之间、在12和15％之间、在15和20％之间，包括其间的任意范围或值。在一些实施方式中，包括大于20％w/w的masp类的组合物为非均质组合物。在一些实施方式中，包括大于20％w/w的masp类的组合物的特征在于形成聚集体。
[0137]
在一些实施方式中，成膜剂选自液体成膜剂和/或固体成膜剂。在一些实施方式中，成膜剂是固体成膜剂。
[0138]
在一些实施方式中，在包括成膜剂和masp类纤维的组合物中的成膜剂的w/w浓度在20和95％之间、在20和30％之间、在30和40％之间、在40和50％之间、在50和60％之间、在60和70％之间、在70和80％之间、在80和85％之间、在85和90％之间、在90和95％之间，包括其间的任意范围或值。
[0139]
成膜剂的非限制性实例包括但不限于多糖，比如普鲁兰多糖、基于龙舌兰的多糖(gosulin)；liftonintrik聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸烷基酯；糊精、纤维素衍生物比如烷基纤维素和硝化纤维素、硅化多糖比如普鲁兰多糖三(三甲基甲硅烷氧基)甲硅烷基丙基氨基甲酸酯等；多酚、树胶、丙烯酸-有机硅接枝共聚物如丙烯酸烷基酯-聚二甲基硅氧烷共聚物、有机硅树脂比如三甲基硅氧基硅酸或氟改性的有机硅树脂、有机硅改性的聚降冰片烯、氟碳树脂、芳烃树脂、聚合物乳液树脂，萜烯树脂、聚丁烯、聚异戊二烯、烷基化树脂、聚乙烯吡咯烷酮改性聚合物、松香改性的树脂和聚氨酯或其任意组合。
[0140]
成膜剂的其他非限制性实例包括但不限于普鲁兰多糖三(三甲基甲硅烷氧基)甲硅烷基丙基氨基甲酸酯(例如tspl-30-d5)、丙烯酸烷基酯-聚二甲基硅氧烷共聚物(例如
kp-543、545、549、550和545l)、三甲基甲硅烷氧基硅酸(例如kf-7312j和x-21-5250)和有机硅改性的聚降冰片烯或其任意组合。在一些实施方式中，成膜剂是普鲁兰多糖、基于龙舌兰的多糖(gosulin)和(基于木薯的多糖)中的至少一种。
[0141]
在一些实施方式中，成膜剂呈纯化的化合物、植物提取物、至少部分富集的植物提取物或其任意组合的形式。在一些实施方式中，组合物中合适浓度的成膜剂为其提供柔韧性(pliability)。在一些实施方式中，合适浓度的成膜剂能够将组合物施加(例如，涂抹)在受试者的皮肤上。在一些实施方式中，合适浓度的成膜剂促进组合物的成膜特性。在一些实施方式中，成膜剂的合适浓度如本文所描述。在实施例部分中提供了包括成膜剂的示例性组合物。
[0142]
在一些实施方式中，组合物包括与成膜剂结合的masp类聚合物。在一些实施方式中，组合物中成膜剂和所述masp类纤维之间的w/w比为5:1至50:1、5:1至7:1、7:1至8:1、8:1至9:1、9:1至10:1、10:1至11:1、11:1至12:1、12:1至15:1、15:1至20:1、20:1至30:1、30:1至40:1、40:1至50:1，包括其间的任意范围。在一些实施方式中，组合物为膜的形式。在一些实施方式中，组合物是柔韧的。在一些实施方式中，该组合物在施加到基板顶部时能够形成膜(例如层)。在一些实施方式中，组合物中合适浓度的masp类聚合物增强组合物的柔韧性。在一些实施方式中，masp类聚合物的合适浓度如本文所描述。在一些实施方式中，masp类聚合物改善了包含成膜剂的组合物的至少一种机械特性(如图14所示例)。在实施例部分中提供了包括成膜剂和masp类聚合物的示例性组合物。
[0143]
在一些实施方式中，另外的聚合物的含量为总组合物的10％至99％(w/w)、10％至90％(w/w)、10％至80％(w/w)、30％至99％(w/w)、30％至98％(w/w)、30％至95％(w/w)、30％至90％(w/w)、30％至85％(w/w)、30％至80％(w/w)、30％至75％(w/w)、30％至70％(w/w)、30％至65％(w/w)、30％至50％(w/w)、30％至45％(w/w)、30％至40％(w/w)、40％至70％(w/w)、40％至65％(w/w)、40％至50％(w/w)、40％至45％(w/w)、50％至70％(w/w)、50％至80％(w/w)、50％至90％(w/w)、50％至95％(w/w)、70％至80％(w/w)、70％至90％(w/w)或70％至95％(w/w)，包括其间的任意范围。
[0144]
在一些实施方式中，根据本发明的另外的聚合物富含本文描述的不可溶的masp类聚合物。在一些实施方式中，另外的聚合物富含超过1％(w/w)、超过2％(w/w)、超过4％(w/w)、超过5％(w/w)、超过10％(w/w)、超过12％(w/w)、超过15％(w/w)、超过20％(w/w)、超过25％(w/w)、超过30％(w/w)、超过40％(w/w)、超过45％(w/w)或超过50％(w/w)的不可溶的masp类聚合物。
[0145]
在一些实施方式中，另外的聚合物经由非共价键、经由物理相互作用或两者结合到masp类纤维。非共价键在本领域中是众所周知的，并且尤其包括氢键、p-p堆叠、范德华相互作用等。
[0146]
在一些实施方式中，物理相互作用是指另外的聚合物与masp类纤维缠结或交织，截留在由masp类纤维形成的网或基质中。在一些实施方式中，基质由填充masp类纤维内的至少一部分孔的化妆品活性成分形成。
[0147]
在一些实施方式中，组合物是复合材料，其中该复合材料包含与另外的聚合物结合的masp类纤维，其中经由非共价键、共价键、物理相互作用或其任意组合结合。
[0148]
在一些实施方式中，另外的聚合物与原纤维接触或结合。在一些实施方式中，masp
类纤维并入另外的聚合物内。在一些实施方式中，masp类纤维嵌入另外的聚合物中。在一些实施方式中，另外的聚合物由masp类纤维掺杂。在一些实施方式中，masp类纤维被另外的聚合物包封。
[0149]
在一些实施方式中，至少一部分另外的聚合物填充颗粒体积(例如内腔)的20％至100％。在一些实施方式中，至少一部分另外的聚合物填充颗粒体积的55％至100％、60％至100％、55％至100％、70％至100％、75％至100％、80％至100％、85％至100％、90％至100％、95％至100％、50％至99％、50％至98％、50％至97％、50％至95％、50％至90％、70％至90％或70％至95％，包括其间的任意范围。
[0150]
在一些实施方式中，另外的聚合物基本上不含任何另外的生物活性成分。在一些实施方式中，另外的聚合物基本上不含蛋白质，比如masp类蛋白质。在一些实施方式中，本发明的另外的聚合物基本上由上文所列的聚合物组成。
[0151]
在一些实施方式中，本发明的组合物基本上是均质的。
[0152]
在一些实施方式中，组合物或复合材料是固体。在一些实施方式中，组合物或复合材料为半固体。在一些实施方式中，组合物或复合材料是凝胶。在一些实施方式中，组合物(例如，固体组合物)基本上不含溶剂、表面活性剂、载体、颗粒中的任一种，其中基本上为按重量计组合物的至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％。
[0153]
在一些实施方式中，与不含masp类聚合物的另外的聚合物的特性相比，组合物的特征在于至少一种改进的机械特性。
[0154]
在一些实施方式中，特性选自：杨氏模量、抗拉强度、断裂应变、屈服点、韧性、破坏功、冲击强度、撕裂强度、弯曲模量、特定伸长率下的弯曲应变和应力，以及磨损。在一些实施方式中，机械特性选自储能模量和损耗模量或其任意组合。
[0155]
在一些实施方式中，本发明提供了耐磨组合物。在一些实施方式中，本发明提供了具有改进的耐磨性的组合物。如本文所使用的，术语“耐磨性”是指材料在暴露于硬颗粒或突起的相对运动时停止位移的能力。耐磨性可以通过本领域已知的多种测试来测量，诸如例如烧掉(taber)磨损测试、加德纳洗涤器(gardner scrubber)测试、砂落(落砂)测试。
[0156]
在一些实施方式中，选自杨氏模量、抗拉强度、屈服点、耐磨性和伸长应力的一种或多种特性提高了例如至少1％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％。
[0157]
在一些实施方式中，选自杨氏模量、抗拉强度、屈服点、耐磨性和伸长应力的一种或多种特性提高了例如至少100％、至少150％、至少250％、至少250％、至少260％、至少270％、至少280％、至少290％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％、至少550％、至少600％、至少650％、至少700％、至少750％、至少800％、至少850％、至少900％、至少1000％、至少1500％、至少2000％、至少2500％或至少3000％。
[0158]
在一些实施方式中，组合物的特征在于杨氏模量在50mpa至170mpa、52mpa至170mpa、60mpa至170mpa、68mpa至170mpa、90mpa至170mpa、100mpa至170mpa、101mpa至170mpa、105mpa至170mpa、101mpa至160mpa或105mpa至160mpa的范围内，包括其间的任意范
围。
[0159]
在一些实施方式中，选自杨氏模量、抗拉强度、屈服点、耐磨性和伸长应力的至少两种特性提高了例如至少1％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％。
[0160]
在一些实施方式中，选自杨氏模量、抗拉强度、屈服点、耐磨性和伸长应力的至少三种特性提高了例如至少1％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％。
[0161]
在一些实施方式中，杨氏模量提高了例如至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少50％、至少100％、至少200％或至少500％。
[0162]
在一些实施方式中，抗拉强度提高了例如至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％或至少50％。
[0163]
在一些实施方式中，屈服点提高了例如至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％或至少50％。
[0164]
在一些实施方式中，耐磨性提高了例如至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％或至少50％。
[0165]
在一些实施方式中，该组合物的特征在于结构强度，其中超过20％的结构强度由并入的masp类聚合物产生。在一些实施方式中，复合材料的特征在于结构强度，其中超过30％的结构强度由并入的masp类聚合物产生。
[0166]
在一些实施方式中，组合物的特征在于结构强度，其中超过1％的抗拉强度由并入的masp类聚合物产生。在一些实施方式中，复合材料的特征在于结构强度，其中超过5％的抗拉强度由并入的masp类聚合物产生。在一些实施方式中，复合材料的特征在于结构强度，其中超过10％的抗拉强度由并入的masp类聚合物产生。在一些实施方式中，复合材料的特征在于结构强度，其中超过20％的抗拉强度由并入的masp类聚合物产生。在一些实施方式中，复合材料的特征在于抗拉强度，其中超过30％的结构强度由并入的masp类聚合物产生。
[0167]
在一些实施方式中，如本文所使用的，短语“结构强度”是指机械特性，比如但不限
于弹性模量、拉伸应力、伸长率(应变)和韧性[例如拉伸应力和伸长率(应变)的组合]。
[0168]
在一些实施方式中，masp类聚合物改进包括成膜剂的组合物的至少一种机械特性，其中机械特性如本文所描述。在图14中汇总了包含masp类聚合物和成膜剂的示例性组合物的机械特性的实验结果。
[0169]
产生方法
[0170]
在一些实施方式中，提供了一种用于生产本发明的蛛丝(masp)类聚合物的方法。在一些实施方式中，根据本发明的组合物和/或方法使用的细菌是重组细菌。重组细菌蛋白质可以通过本领域已知的重组dna技术人工产生。
[0171]
如本文所使用的，“重组核酸”是这样的一种分子，其中编码感兴趣的多肽的核酸分子已经在体外被修饰，因此其序列不是天然存在的或者对应于未像它们定位在未被修饰的基因组中那样定位的天然存在的序列。
[0172]
在一个实施方式中，如本文所描述的细菌是基因修饰的细菌。在一个实施方式中，人工牵引蛛丝不是在诸如本文所描述的细菌中内源产生的。在如本文所描述的细菌中产生的本发明的人工牵引蛛丝具有出人意料的且独特的特性。
[0173]
在一些实施方式中，本发明的方法包括以下步骤：
[0174]
a.提供包括编码氨基酸序列的核酸序列的表达载体，其中核酸处于可操作连接的启动子和任选的调节序列的表达控制之下；
[0175]
b.用(a)的表达载体转化微生物(例如细菌)宿主；
[0176]
c.为(b)的微生物表达异源蛋白提供条件；和
[0177]
d.分离表达的蛋白质，
[0178]
从而获得本发明的合成氨基酸序列。
[0179]
根据一些实施方式，提供了一种(例如，制造合成牵引蛛丝的)方法，其包括：
[0180]
(i)提供如本文所描述的微生物(例如重组细菌)；
[0181]
(ii)为微生物表达masp提供条件；和
[0182]
(iii)分离表达的蛋白质，
[0183]
从而制造合成牵引蛛丝。
[0184]
在一些实施方式中，为细菌表达masp提供条件的步骤(ii)包括提供ph在5至6.5的范围内的溶液。在一些实施方式中，步骤(ii)包括提供ph低于6.5的溶液。
[0185]
在一些实施方式中，为细菌表达masp提供条件的步骤(ii)包括提供表达诱导剂。在一些实施方式中，表达诱导剂包括乳糖。在一些实施方式中，表达诱导剂包含异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(iptg)。如本文所使用的，术语“诱导剂”是指诱导和/或增加蛋白质表达的化合物。在一些实施方式中，表达是组成型表达。
[0186]
在一些实施方式中，为细菌表达masp提供条件的步骤(ii)包括等待一段时间以获得不可溶的masp类聚合物。在一些实施方式中，时间段在15小时至48小时、17小时至48小时、18小时至48小时、18小时至24小时、20小时至48小时、22小时至48小时、24小时至48小时、22小时至36小时、24小时至36小时或24小时至32小时的范围内，包括其间的任意范围。在一些实施方式中，等待一段时间允许在两个阶段中形成合成牵引蛛丝。在一些实施方式中，在第一阶段形成可溶性腺丝蛋白。一旦可溶性蛋白质的临界细胞内浓度积累，svx-e就会发生自组装，形成所需的不可溶的masp聚合物。
[0187]
在一些实施方式中，分离表达的蛋白质的步骤(iii)包括用表面活性剂在0.1％至10％之间的溶液溶解细菌和将混合物离心的步骤。在一些实施方式中，分离表达的蛋白质的步骤(iii)包括用表面活性剂在0.1和5％之间的溶液溶解细菌和将混合物离心的步骤。在一些实施方式中，将获得的沉淀悬浮在6m尿素溶液中。在一些实施方式中，在进一步离心之后，将沉淀悬浮在0.07％的表面活性剂溶液中。在一些实施方式中，在表面活性剂溶液和尿素中重新悬浮之后，根据众所周知的程序(例如通过使用10-90％w/w的单糖或二糖溶液)将蛋白质与细胞碎片分离。
[0188]
在一些实施方式中，该方法进一步包括用另外的聚合物和/或另外的化合物的富集步骤。在一些实施方式中，另外的聚合物和另外的化合物如本文所描述。在一些实施方式中，富集步骤包括将合成牵引蛛丝的溶液与另外的聚合物的溶液混合。
[0189]
在一些实施方式中，富集步骤包括对包括合成牵引蛛丝和另外的聚合物的溶液的混合物进行脱气。
[0190]
在一些实施方式中，通过让获得的悬浮液在20℃和50℃之间的温度下静置一段时间而不摇动来进行脱气。在一些实施方式中，该时间段在30分钟至24小时、1小时至24小时或1小时至12小时的范围内，包括其间的任意范围。
[0191]
在一些实施方式中，合成牵引蛛丝(例如masp类聚合物或masp类纤维)和另外的聚合物以1:4至4:1、1:3.9至4:1、1:3.8至4:1、1:3.5至4:1、1:3至4:1、1:2.8至4:1、1:2.5至4:1、1:2至4:1、1.5:4至4:1、1.5:3.9至4:1、1.5:3.8至4:1、1.5:3.5至4:1、1.5:3至4:1、1.5:2.8至4:1、1.5:2.5至4:1、1.5:2至4:1,2:4至4:1、2:3.9至4:1、2:3.8至4:1、2:3.5至4:1、2:3至4:1、2:2.8至4:1、2:2.5至4:1、2:2至4:1,1:4至3:1、1:3.9至3:1、1:3.8至3:1、1:3.5至3:1、1:3至3:1、1:2.8至3:1、1:2.5至3:1、1:2至3:1、1:4至4:3、1:3.9至4:3、1:3.8至4:3、1:3.5至4:3、1:3至4:3、1:2.8至4:3、1:2.5至4:3或1:2至4:3的比率使用，包括其间的任意范围。
[0192]
在一些实施方式中，合成牵引蛛丝(例如masp类聚合物或masp类纤维)和另外的聚合物以在1:1和1:100之间、在1:1和1:5之间、在1:1和1:3之间、在1:3和1:5之间、在1:5和1:10之间、在1:5和1:7之间、在1:7和1:10之间、在1:10和1:2之间、在1:12和1:15之间、在1:15和1:20之间、在1:20和1:30之间、在1:30和1:40之间、在1:40和1:50之间、在1:50和1:70之间、在1:70和1:100之间的比率使用，包括其间的任意范围。
[0193]
在一些实施方式中，合成牵引蛛丝(例如masp类聚合物或masp类纤维)和另外的化合物以10:1至1:10、10:1至8:1、8:1至6:1、6:1至4:1、4:1至3:1、3:1至2:1、2:1至1:1、1:1至1:2、1:2至1:3、1:3至1:5、1:5至1:10的比率使用，包括其间的任意范围。
[0194]
在一些实施方式中，聚合物选自合成聚合物、热塑性聚合物、热固性聚合物、成膜剂、环氧树脂、聚酯、聚酰胺、多元醇、聚氨酯、聚乙烯、尼龙、聚丙烯酸酯、聚碳酸酯、聚乳酸(pla)或其共聚物、硅、液晶聚合物、马来酸酐接枝聚丙烯、聚己内酯(pcl)、橡胶、纤维素或其任意组合。
[0195]
在一些实施方式中，步骤(iii)进一步包括干燥合成牵引蛛丝(例如svx-e类纤维)。在一些实施方式中，干燥包括纤维的部分干燥。在一些实施方式中，干燥通过蒸发按重量计至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％的溶剂(例如，水性溶剂)。在一些实施方式中，干燥是通过将纤维暴露于-180和200℃之间的
温度。在一些实施方式中，干燥是通过将纤维暴露于可见光和/或红外光谱中的电磁辐射。
[0196]
在一些实施方式中，干燥是通过将纤维暴露于在40和200℃之间、在40和50℃之间、在40和60℃之间、在60和80℃之间、在40和80℃之间、在60和100℃之间、在100和150℃之间、在150和200℃之间的温度，包括其间的任意范围或值。
[0197]
在一些实施方式中，干燥是通过将纤维暴露于微波辐射。在一些实施方式中，干燥通过对流干燥进行，比如通过向纤维施加热气流。在一些实施方式中，干燥通过冷干燥进行，比如通过向纤维施加除湿气流。在一些实施方式中，干燥通过冻干进行。通常，所选择的干燥方法和确切的干燥条件将取决于纤维的化学和/或物理稳定性(例如热稳定性)等。
[0198]
masp类纤维
[0199]
术语“大壶状腺丝蛋白”和“腺丝蛋白”在整篇描述中可互换使用并且包括所有已知的大壶状腺丝蛋白，在十字园蛛的情况下通常缩写为“masp”或“adf”。这些大壶状腺丝蛋白通常有两种类型，1型和2型。此外，这些术语包括如本文所公开的至少与已知大壶状腺丝蛋白的重复区域具有高度的同一性和/或相似性的非天然蛋白质。其他合适的蛛丝蛋白包括masp2、misp、misp2、acsp、flys、flas和鞭毛状蛋白(flagelliform)。
[0200]
如本文所使用的，术语“重复区域”、“重复序列”或“重复”是指源自重复单元的重组蛋白序列，所述重复单元在蛛丝氨基酸序列中(例如，在masp-1蛋白质中)天然发生多次。本领域技术人员将理解，蛛丝蛋白的一级结构被认为主要由单元重复的一系列小变化组成。天然存在的蛋白质中的单元重复通常彼此不同。即，沿着蛋白质长度的单位重复几乎没有或没有精确的复制。在一些实施方式中，制造本发明的合成蛛丝，其中蛋白质的一级结构包括单个单元重复的多个精确重复。在另外的实施方式中，本发明的合成蛛丝包括一个单元重复的多个重复以及第二个单元重复的多个重复。这种结构类似于典型的嵌段共聚物。也可以组合若干不同序列的单元重复以提供具有适合特定应用的特性的合成蛛丝蛋白。如本文所使用的，术语“同向重复(direct repeat)”是具有类似重复的串联重复(头对尾排列)。在另一个实施方式中，用于形成本发明的合成蛛丝的重复是同向重复。在一些实施方式中，重复在自然界中未发现(即，不是天然存在的氨基酸序列)。
[0201]
包括重复序列的示例性序列是df-4：aaaaaaasgsggygpenqgpsgpvaygpggp vssaaaaaaagsgpggygpenqgpsgpggygpggsgssaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggsggygpgsqgpsgpgassaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaasgpggygpgsqgpsgpggsggygpgsqgpsgpggpgasaaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaaaaaagsgpggygpgnqgpsgpggygpggpgssaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgvygpggpgssaaaaaaagsgpggygpgnqgpsgpggygpggsgssaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggsggygpgsqgpsgpgassaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaasgpggygpgsqgpsgpgaygpggpgssaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggsrgygpgsqgpggpgasaaaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpgyqgpsgpgaygpspsasas(seq id no：1)。在一些实施方式中，本发明的合成重复序列基于(例如，具有如下文定义的高百分比同一性)源自adf-4(seq id no：1)的一个或多个重复序列。如本文所使用的，术语“基于”是指与重复序列具有高同源性百分比的序列。
[0202]
在一些实施方式中，每个重复序列包括至多60个氨基酸、至多55个氨基酸、至多50个氨基酸、至多49个氨基酸、至多48个氨基酸、至多47个氨基酸、至多46个氨基酸、至多45个氨基酸、至多44个氨基酸、至多43个氨基酸、至多42个氨基酸、至多41个氨基酸、至多40个氨
基酸、至多39个氨基酸、至多38个氨基酸、至多37个氨基酸、至多36个氨基酸或至多35个氨基酸，其中可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，每个重复序列包括5至60个氨基酸、10至55个氨基酸、15至50个氨基酸、20至45个氨基酸、25至40个氨基酸、25至39个氨基酸或28至36个氨基酸，其中可能性代表本发明的单独实施方式。在一些实施方式中，每个重复序列包括30至40个氨基酸、31至39个氨基酸、32至38个氨基酸、33至37个氨基酸、34至36个氨基酸，其中每种可能性代表本发明的单独实施方式。在另外的实施方式中，每个重复序列包括35个氨基酸。
[0203]
在一些实施方式中，重复区域独立地包括如式1中所列的氨基酸序列：
[0204]
(x1)zx2gpggygpx3x4x5gpx6gx7ggx8gpggpgx9x
10
；其中在每种情况下x1独立地是a或g。
[0205]
在一些实施方式中，至少50％的(x1)z是a，z在5至30之间的整数；x2是s或g；x3是g或e；x4是g、s或n；x5是q或y；x6是g或s；x7是p或r；x8是y或q；x9是g或s；和x
10
是s或g。
[0206]
在另一个实施方式中，masp1蛋白的重复区域包括如seq id no：2(sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgss)中所列的氨基酸序列。在另一个实施方式中，masp1蛋白的重复区域包括如seq id no：3(aaaaaaaasgpggygpgsqgpsgpggygpggpgss)中所列的氨基酸序列。
[0207]
在另一个实施方式中，提供了与seq id no：1具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的masp1蛋白的重复区域的同源物。
[0208]
在另一个实施方式中，同源物与seq id no：2具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性。
[0209]
在另一个实施方式中，masp1蛋白的重复区域具有如seq id no：1中所列的氨基酸序列。
[0210]
在另一个实施方式中，masp1蛋白包括选自以下的单个n-末端区域：seq id no：4(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlv)；seq id no：5(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlvrplsnldnap)；seq id no：6(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamdpefkglrrraqlvdppgcrnsaragss)，或其任何功能性同源物、变体、衍生物或片段。在另一个实施方式中，c-末端区域的同源物与seq id no：4-6中的任一个具有至少70％的同源性。
[0211]
在另一个实施方式中，masp1蛋白进一步包括选自以下的单个c-末端区域：seq id no：7(vaasrlsspaassrvssavsslvssgptngaavsgalnslvsqisasnpglsgcdalvqallelvsalvailssasigqvnvssvsqstqmisqals)；和seq id no：8(gpsgpgaygpspsasasvaasrlsspaassrvssavsslvssgptngaavsgalnslvsqisasnpglsgcdalvqallelvsalvailssasigqvnvssvsqstqmisqals)，或其任何功能性同源物、变体、衍生物、片段或突变体。在另一个实施方式中，n-末端区域的同源物与seq id no：7-8具有至少70％的同源性。
[0212]
在一些实施方式中，masp类纤维包括根据wo2017025964公开的蛋白质混合物，其通过引用以其整体并入本文。
[0213]
在一些实施方式中，masp1蛋白进一步包含至少一个标签序列。可用于本发明的标
签的非限制性实例包括his标签、ha标签、t7标签等。技术人员非常了解替代的合适标签或其他融合伴侣。
[0214]
如本文所使用的，“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些由遗传密码编码的氨基酸，以及那些后来被修饰的氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同的基础化学结构，即与氢、羧基、氨基和r基团结合的α碳的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的r基团或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。氨基酸在本文中可以通过它们通常已知的三个字母符号或通过iupac-iub生物化学命名委员会推荐的一个字母符号来表示。
[0215]“氨基酸序列”或“肽序列”是位于肽和蛋白质链中的通过肽键连接的氨基酸残基的顺序。通常是从含有游离氨基的n-末端到含有游离羧基的c-末端来报道序列。如果代表蛋白质的一级结构，则氨基酸序列通常被称为肽、蛋白质序列，但是必须区分术语“氨基酸序列”或“肽序列”和“蛋白质”，因为蛋白质被定义为折叠成特定三维构型并且通常经过翻译后修饰(比如磷酸化、乙酰化、糖基化、巯基键形成、裂解等)的氨基酸序列。
[0216]
如本文所使用的，在合成蛛丝氨基酸序列或编码其的核酸分子的上下文中，如本发明所示例的，“分离的”或“基本上纯化的”是指氨基酸序列或多核苷酸已脱离其自然环境或已从其自然状态改变。因此，“分离的”不一定反映氨基酸序列或核酸分子已被纯化的程度。然而，应当理解，已被纯化到一定程度的这种分子是“分离的”。如果分子不存在于自然环境中，即它不存在于自然界中，则无论其存在于何处，该分子都是“分离的”。举例来说，天然不存在于人类中的氨基酸序列或多核苷酸是“分离的”，即使它们存在于人类中。
[0217]
当应用于氨基酸序列或核酸时，术语“分离的”或“基本上纯化的”表示该氨基酸序列或核酸基本上不含在自然状态下与其相关的其他细胞成分。它可以是均质状态，或者可以是干溶液或水溶液。纯度和均一性通常使用分析化学技术确定，比如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。作为制剂中存在的主要种类的氨基酸序列或核酸基本上是纯化的。
[0218]
在一些实施方式中，重复序列是masp1蛋白或其片段的重复区域的同源物、变体、衍生物。在一些实施方式中，重复序列是adf-4蛋白或其片段的重复区域的同源物、变体、衍生物。
[0219]
如本文所使用的，“功能性同源物、变体、衍生物或片段”中的术语“功能性”是指具有通过定义的功能测定鉴定的生物学功能或活性的氨基酸序列。更具体地，定义的功能测定是在表达功能性同源物、变体、衍生物或片段的细胞中形成自组装纤维。
[0220]
当同源性被确定为至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％或至少99％时，氨基酸序列或核酸序列是相应的氨基酸序列或核酸的同源物。
[0221]
在两个或更多个氨基酸或核酸序列的上下文中，术语“相同(identical)”、“基本同一性(substantial identity)”、“基本同源性(substantial homology)”或“同一性百分比”是指两个或更多个的序列或子序列相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当比较和比对在比较窗口或指定区域上的最大对应时，在指定区域(例如，氨基酸序列
seq id no：2或3)上约60％同一性，或至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％同一性)，如下所述使用默认参数的blast或blast 2.0序列比较算法测量的，或通过手动对齐和视觉检查。则这样的序列是“基本相同的”。该定义还涉及或可能适用于测试序列的补充。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。优选的算法可以考虑间隙等。
[0222]
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
[0223]
应当理解，本发明进一步包括包含seq id no：1、2或3中任一个的变体的n个重复的氨基酸序列。如本文所使用的，术语“变体”或“基本相似”包括与特定鉴定的序列不同的氨基酸或核苷酸序列，其中一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或25个)氨基酸残基或核苷酸被缺失、取代或添加。变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然来源的变体。变体或基本相似的序列是指氨基酸序列或核酸的片段，其特征在于它们的氨基酸或核苷酸序列与本文描述的氨基酸或核苷酸序列的同一性百分比，如通过现有技术中使用的常用算法确定的。优选的氨基酸或核酸片段是具有与参考序列相比时至少约40％或45％的序列同一性、优选地约50％或55％的序列同一性、更优选地约60％或65％的序列同一性、更优选地约70％或75％的序列同一性、更优选地约80％或85％的序列同一性、还更优选地约90％、91％、92％、93％、94％、95％，、96％、97％、98％或99％的序列同一性的那些氨基酸或核苷酸序列。
[0224]
如本文所使用的，术语衍生物和功能性衍生物是指具有任何插入、缺失、取代和修饰的本发明的氨基酸序列。
[0225]
应当理解，本文所使用的术语“插入”是指向本发明的序列添加以下任一种的氨基酸残基：1至50个氨基酸残基、具体地20至1个氨基酸残基，更具体地1至10个氨基酸残基之间。最具体地，1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个氨基酸残基。此外，本发明的氨基酸序列可以在其n-末端和/或c-末端用各种相同或不同的氨基酸残基进行延伸。
[0226]
氨基酸“取代”是用具有相似结构和/或化学特性的另一种氨基酸置换一个氨基酸的结果，即保守氨基酸置换。可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行氨基酸取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0227]
在另一个实施方式中，本发明的重复序列对seq id no：2或3中任一个的序列具有17个或更少、16个或更少、15个或更少、14个或更少、13个或更少、12个或更少、11个或更少、10个或更少、9个或更少、8个或更少、或7个或更少的氨基酸取代。在一个实施方式中，本发明的重复序列对seq id no：1、2或3中的任一个的序列具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少13个氨基酸取代。
spider)(celaenia excavata)、黑白棘蛛(black-and-white spiny spider)(库氏棘腹蛛(gasteracantha kuhlii))、黑黄园蛛(black-and-yellow garden spider)(argiope aurantia)、流星锤蛛(bolas spider)(ordgarius furcatus)、流星锤蛛巨蜘蛛(bolas spiders magnificent spider)(ordgarius magnificus)、棕色水手蛛(brown sailor spider)(嗜水新园蛛(neoscona nautical))、棕腿蛛(brown-legged spider)(neoscona rufofemorata)、加帽黑头蜘蛛(capped black-headed spider)(帆楚蛛(zygiella calyptrate))、普通园蛛(common garden spider)(parawixia dehaani)、普通园蛛(common orb weaver)(neoscona oxancensis)、蟹样棘园蛛(crab-like spiny orb weaver)(gasteracantha cancriformis(elipsoides))、curved spiny spider(gasteracantha arcuata)、桔云斑蛛(cyrtophora moluccensis)、cyrtophora parnasia、dolophones conifera、dolophones turrigera、doria带刺蜘蛛(gasteracantha doriae)、双点棘蛛(double-spotted spiny spider)(gasteracantha mammosa)、双尾帐篷蜘蛛(double-tailed tent spider)(方格云斑蛛(cyrtophora exanthematica))、塞若尖腹蛛(aculeperia ceropegia)、eriophora pustulosa、flat anepsion(anepsion depressium)、四刺宝石蜘蛛(four-spined jewel spider)(gasteracantha quadrispinosa)、园网蛛(garden orb web spider)(eriophora transmarina)、giant lichen orbweaver(araneus bicentenarius)、金色网蛛(golden web spider)(nephila maculata)、hasselt's棘蛛(gasteracantha hasseltii)、tegenaria atrica、heurodes turrita、岛屿艾蛛(island cyclosa spider)(岛艾蛛(cyclosa insulana))、jewel蜘蛛或带刺蜘蛛(astracantha minax)、肾形园蛛(kidney garden spider)(araneus mitificus)、laglaise's园蛛(eriovixia laglaisei)、长腹艾蛛(long-bellied cyclosa spider)(艾蛛(cyclosa bifida))、malabar蜘蛛(nephilengys malabarensis)、多色圣安德鲁十字蜘蛛(multi-coloured st andrew's cross spider)(多色金蛛(argiope versicolor))、观赏性树干蛛(ornamental tree-trunk spider)(裂腹虫(herennia ornatissima))、卵形圣安德鲁十字蜘蛛(oval st.andrew's cross spider)(好胜金蛛(argiope aemula))、红帐篷蜘蛛(red tent spider)(单色云斑蛛(cyrtophora unicolor))、俄罗斯帐篷蜘蛛(russian tent spider)(cyrtophora hirta)、圣安德鲁十字蜘蛛(saint andrew's cross spider)(凯氏金蛛(argiope keyserlingi))、猩红阿秋蛛(scarlet acusilas)(猩红阿秋蛛(acusilas coccineus))、银色金蛛(silver argiope)(argiope argentata)、多刺金丝魔蛛(spinybacked orbweaver)(gasteracantha cancriformis)、斑点园蛛(spotted orbweaver)(neoscona domiciliorum)、圣安德鲁十字蜘蛛(st.andrews cross)(argiope aetheria)、圣安德鲁十字蜘蛛(st.andrew's cross spider)(argiope keyserlingi)、树桩蜘蛛(tree-stump spider)(无鳞波蛛(poltys illepidus))、三角蜘蛛(triangular spider)(arkys clavatus)、三角蜘蛛(triangular spider)(arkys lancearius)、双刺蜘蛛(two-spined spider)(poecilopachys australasia)、nephila物种，例如nephila clavipes、nephila senegalensis、nephila madagascariensis和更多种。
[0236]
此外，合成蛛丝不仅可以通过选择不同的蜘蛛种类衍生来增强，而且可以通过使用除蛋白质之外的各种化合物来增强。吡咯烷具有吸湿性，并且有助于保持线的湿润。它以
特别高的浓度出现在胶线中。磷酸氢钾在水溶液中释放质子，导致ph约为4，使丝呈酸性，从而保护它免受真菌和细菌的侵害，否则真菌和细菌会消化蛋白质。硝酸钾被认为可以防止蛋白质在酸性环境中变性。
[0237]
在一些实施方式中，本发明的细菌系统可以利用多种表达载体，该表达载体根据表达的蛋白质的预期用途有利地选择。在一个实施方式中，需要大量的蛋白质。在一个实施方式中，引导高水平蛋白质产物的表达的载体是期望的，该蛋白质产物可能为与疏水性信号序列的融合物，该载体引导表达的产物进入细菌的周质或容易纯化蛋白质产物的培养基中。在一个实施方式中，某种融合蛋白工程化有特定的裂解位点以帮助恢复多肽。在一个实施方式中，适用于这种操作的载体包括但不限于pet系列表达载体。
[0238]“核酸”是指由含有糖、磷酸盐和嘌呤或嘧啶的单体(核苷酸)组成的可以是单链或双链的分子。在细菌中，“脱氧核糖核酸”(dna)是指遗传物质，而“核糖核酸”(rna)则参与将信息从dna翻译成蛋白质。
[0239]
由于遗传密码的简并性质，很明显可以使用多种不同的核酸序列来编码本发明的氨基酸序列。应当理解，包括在本发明的核酸序列中的密码子可以针对在细菌宿主细胞中的表达进行优化。
[0240]
术语“密码子优化的(codon-optimized)”指的是用于转化各种宿主的基因或核酸分子编码区，是指改变基因或核酸分子编码区的密码子以反映典型的密码子在不改变由dna编码的多肽的情况下使用宿主生物。在本发明的上下文中，基因和dna编码区被密码子优化以在宿主细菌细胞中最佳表达。
[0241]
如本文所使用的，术语“表达(expression)”旨在表示从编码基因产物序列的基因转录和翻译成基因产物。在表达中，首先将编码基因产物序列的dna链转录成互补rna(通常是信使rna)，然后如果基因产物是蛋白质，那么转录的信使rna被翻译成上述基因产物。
[0242]
在一些实施方式中，本发明涉及一种或多种包括编码本发明的蛋白质的核酸序列的表达载体。
[0243]
如本文所使用的，本文所指的“载体”、“表达载体”或“质粒”是通常携带外源基因(一个或多个)的染色体外元件，外源基因不是细菌细胞的中心代谢的一部分，并且通常为环状双链dna分子的形式。它可以是多种核酸中的任一种，通过限制和连接将所需序列插入核酸中以在不同遗传环境之间转运或在宿主细胞中表达。尽管也可以使用rna载体，但载体通常由dna组成。载体包括但不限于质粒和噬菌粒。克隆载体是一种能够在宿主细胞中复制的载体，其特征还在于一个或多个核酸内切酶限制性位点，在该位点上可以以确定的方式切割载体，并且可以将所需的dna序列连接(ligate)到其中，使得新的重组载体保留了在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况下，在宿主通过有丝分裂繁殖之前，随着质粒在宿主细菌内拷贝数的增加，或每个宿主只复制一次，所需序列的复制可能会发生多次。在噬菌体的情况下，复制可以在裂解阶段主动发生或在溶原阶段被动发生。表达载体是这样一种载体，在该载体中可以通过限制和连接将所需的dna序列插入其中，从而使其与调控序列可操作地连接并且可以表达为rna转录物。载体还可包含一个或多个适用于鉴定和选择已用载体转化或转染的细胞的标记序列。如本文所使用的，“转化”或“转染”是通过并入核酸在细胞中获得新基因。标记包括，例如，编码增加或降低对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性的蛋白质的基因，编码其活性可通过本领域已知的标准测定法检测的酶的基因(例如，β-半乳
糖苷酶或碱性磷酸酶)，和明显影响转化或转染细胞、宿主、集落或噬菌斑表型的基因。优选的载体是能够自主复制和表达存在于它们可操作地连接的dna片段中的结构基因产物，即表达合成蛛丝蛋白的那些。
[0244]
如上所述，本发明的表达载体与启动子可操作地连接。术语“启动子”和“启动子区域”是指通常位于结构基因的蛋白质编码序列(5'至)上游，通过提供对rna聚合酶的识别来控制编码区的表达和/或转录在正确位点开始所需的其他因素的dna序列。启动子序列是必要的，但并不总是足以驱动基因的表达。术语“合适的启动子”是指能够驱动合成蛛丝变异基因表达的任何原核启动子。
[0245]
可用于驱动细菌中异源dna片段表达的启动子为数众多并且是本领域技术人员所熟悉的。实际上，任何能够驱动编码丝变体蛋白的基因的细菌启动子都适用于本发明。
[0246]
当编码序列和调控序列以将编码序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制之下的方式共价连接时，它们是“可操作地链接(operably linked)”或“可操作地连接(operably joined)”。如果调节序列相对于基因定位，使得调节序列能够对产生的基因产物的量产生可测量的影响，则调节序列与该基因可操作地连接。如果需要将编码序列翻译成功能性蛋白质，如果5'调控序列中启动子的诱导导致编码序列的转录，并且如果两个dna序列之间的连接性质不会(1)导致移码突变的引入，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或者(3)干扰相应的rna转录物被翻译成蛋白质的能力，则两个dna序列被可操作地连接。因此，如果启动子区域能够影响该dna序列的转录，使得所得转录物可被翻译成所需的蛋白质或多肽，则该启动子区域将与编码序列可操作地连接。
[0247]
基因表达所需的调控序列的确切性质可能因物种或细胞类型而异，但必要时分别通常应包括涉及转录和翻译起始的5'非转录和5'非翻译序列，比如tata盒、封端序列、caat序列。特别地，这种5'非转录调控序列将包括启动子区域，该区域包括用于可操作地连接的基因的转录控制的启动子序列。根据需要，调节序列还可以包括增强子序列或上游激活序列。
[0248]“调节(regulation)”和“调节(regulate)”是指由主要但不排他地位于基因转录起点(5
′
)上游的dna序列元件控制的基因表达的调节。调节可能导致对刺激的全部反应或无反应，或者它可能导致基因表达水平的变化。
[0249]
在另一方面，本发明提供了用根据本发明的表达载体转化的宿主细胞。
[0250]“细胞(cell)”、“宿主细胞(host cell)”或“重组宿主细胞(recombinant host cell)”是本文可互换使用的术语。应当理解，此类术语不仅指特定的受试细胞，而且指此类细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境影响可能会在后代中发生某些修饰，因此此类后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范围内。
[0251]
如本文所使用的，“宿主细胞”是指可以用裸dna或使用重组dna技术构建的表达载体进行重组转化的细胞。抗药性或其他选择标记部分旨在促进转化体的选择。此外，选择标记如抗药性标记的存在可用于防止污染微生物在培养基中繁殖。通过在需要诱导表型才能存活的条件下培养细胞，可以获得转化宿主细胞的这种纯培养物。
[0252]
用本文描述的表达载体转化或转染本发明的宿主细胞以表达本发明的合成蛛丝蛋白。如本文所使用的，“转化(transformation)”是指细胞的基因型由于外源dna或rna的细胞摄取而改变的过程，并且例如转化的细胞表达所需合成蛛丝蛋白的重组形式。术语“转
染(transfection)”是指通过核酸介导的基因转移将核酸(例如裸dna或表达载体)引入受体细胞。
[0253]
在一些实施方式中，本发明的蛛丝蛋白没有翻译后修饰。
[0254]
根据一些方面，本发明提供了包括本发明的核酸序列的表达载体，其中该核酸序列处于可操作连接的启动子和任选的调节序列的表达控制之下。
[0255]
通用术语
[0256]
如本文所使用的，术语“约”是指
±
10％。
[0257]
词语“示例性(exemplary)”在本文中用于表示“用作示例、实例或说明”。被描述为“示例性”的任何实施方式不一定被解释为相对于其他实施方式是优选的或优于其他实施方式和/或排除其他实施方式的特征的并入。词语“任选地(optionally)”在本文中用于表示“在一些实施方式中提供而在其他实施方式中不提供”。本发明的任何特定实施方式可以包括多个“任选的”特征，除非这些特征冲突。
[0258]
如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示。因此，例如，提及“masp”包括多个这样的基因和变体并且提及“肽”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种肽，等等。
[0259]
此外，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。类似地，“包括(comprise)”、“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”是可互换的并且不旨在被限制。应进一步理解，在各种实施方式的描述使用术语“包括(comprising)”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些特定情况下，实施方式可以替代地使用语言“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”或“由
……
组成(consisting of)”来描述。
[0260]
贯穿本技术，可以以范围格式呈现本发明的各种实施方式。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当理解为对本发明范围的不灵活限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1到6的范围的描述应被认为已具体公开了子范围，比如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的广度如何，这都适用。
[0261]
在其中使用类似于“a、b和c等中的至少一个”的惯例(convention)的那些情况下，这样的结构通常意在本领域技术人员将理解惯例的意义(例如，“具有a、b和c中的至少一个的系统”将包括但不限于仅a、仅b、仅c、a和b一起、a和c一起、b和c一起和/或a、b和c一起等的系统)。在那些使用类似于“a、b或c等中的至少一个”的惯例的情况下，这样的结构通常旨在在本领域技术人员将理解惯例的意义上(例如，“具有a、b或c中的至少一个的系统”将包括但不限于仅a、仅b、仅c、a和b一起、a和c一起、b和c一起和/或a、b和c一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求或附图中，实际上任何呈现两个或更多个替代术语的转折词和/或短语都应被理解为考虑包括这些术语之一、任一个术语或两个术语的可能性。例如，短语“a或b”将被理解为包括“a”或“b”或“a和b”的可能性。
[0262]
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可用于所公开的方法和组合物的实践，但是本文描述了示例性方法、装置和材料。
[0263]
实施例
[0264]
实验步骤
[0265]
编码牵引蛛丝蛋白的单个重复单元的序列的合成：设计了代表构成(masp)类聚合物的重复区域的15个重复的平均共有序列的35个氨基酸长的序列(基因库条目u47856)被。平均共有序列肽序列是：由105dna碱基对序列编码的sgpggygpgsqgpsgpggygpggpgssaaaaaaaaaaaa(seq id no：11)：5
′‑
tctggtcctggaggttatggcccaggaagccaaggaccatctggtccaggaggatatggtccaggcggacctggctctagtgcagcagctgccgcagcagctgca-3
′
(seq id no：9)。上述合成dna是在ppcr-scriptampsk( )质粒中获得的。
[0266]
细菌生长
[0267]
将表达pet24r的细菌接种到3ml含有氯霉素和卡那霉素的lb培养基起始剂中，生长至od～0.6(在96孔板中以100μl测量)，并接种到生长培养基中。
[0268]
细菌在37℃下振荡生长，约20小时后进行od600和β折叠特异性染色。24小时后出现显著的β折叠染色。
[0269]
裂解和纯化
[0270]
将细菌离心并重新悬浮在去离子水中。然后，加入表面活性剂溶液并将所得悬浮液在37℃下震荡过夜。离心后，将沉淀重新悬浮在6m尿素中。离心后，将沉淀物重新悬浮并用表面活性剂溶液洗涤数次。
[0271]
为了定量，用去离子水洗涤1ml聚合物悬浮液，并在显微镜玻璃上干燥。在施加(masp)类聚合物之前和之后对玻璃称重，计算残留量。
[0272]
uv光谱法
[0273]
在细菌svxe中表达的蛛丝(masp)类聚合物通过在8m libr中加热溶解，用6m尿素按1:10稀释，并在一次性uv比色皿中用ultrospec 2100分光光度计在240-350nm处测量uv光谱。将与6m尿素按1:10稀释的8m libr用作对照。
[0274]
染色
[0275]
将β折叠特异性染色剂以0.8mg/ml溶解在二甲亚砜(dmso)中并在室温避光储存。向培养基中的大肠杆菌悬浮液中加入1-30％triton x-100，并离心细菌。将细菌沉淀重新悬浮在pbs中，并加入1-50μl/ml的β折叠特异性染色剂。将悬浮液在室温下温育30分钟，然后离心，并将细菌沉淀重新悬浮在相同体积的pbs中。如有必要，将染色的沉淀在4℃下储存。在cytation荧光计的96孔板中读取荧光。同时，测量od600，并将荧光归一化为od600值。为了将svx-e的最终制剂染色，将masp类聚合物重新悬浮在pbs中。其余步骤与染色细菌相同。
[0276]
差示扫描量热法(dsc)
[0277]
将svx-e或sf9衍生的svx的样品用水洗涤剩余的表面活性剂，干燥悬浮液。胶囊称重约5mg，在star量热仪(mettler toledo)上在25-300℃范围内以10
°
/min的速度进行扫描量热法。平行地，将svx-e样品溶解在6m硫氰酸胍中，透析到6m尿素中，然后透析到去离子水中(在水中，部分沉淀)。将变性蛋白干燥，并按相同条件进行扫描量热法。
[0278]
tem
[0279]
将在细菌svx-e悬浮液中表达的蛛丝纤维svx或蛛丝聚合物沉积在涂碳的铜网上，并静置5分钟。用蒸馏水洗涤网格并再用2％(w/v)乙酸双氧铀染色2分钟。在tem 120kev中
进行分析。
[0280]
sem
[0281]
根据标准方案进行各种样品的扫描电子显微术(sem)。
[0282]
动态光散射法(dls)
[0283]
将svx或svx-e悬浮液用0.07％表面活性剂溶液以1:100稀释，该溶液通过0.22μm过滤器过滤。使用malvern zetasizer nano设备进行dls分析。
[0284]
质谱分析
[0285]
通过离心沉淀svx或svx-e悬浮液，用6m硫氰酸胍溶解，并透析到两个变化的6m尿素中。为了进行分析，将样品按1:10稀释(尿素最终浓度为0.6m)，用dtt还原可能的二硫键并用碘乙酰胺封闭，并且然后用胰蛋白酶或化学胰蛋白酶裂解两个单独管中的蛋白质。
[0286]
通过q exactive质谱仪分析所得肽的序列，并相对于预期的svx序列和svx的杆状病毒蛋白和草地夜蛾(sf9来源)的数据库和svx-e的大肠杆菌蛋白质的数据库分析该序列。
[0287]
氨基酸分析
[0288]
对于氨基酸分析，将svx或svxe样品用6m hcl在110℃下水解18-24小时。
[0289]
ftir
[0290]
将svx或svx-e样品在显微镜载玻片上在100℃下干燥，并使用nicolet is5 ftir光谱仪(thermo fisher scientific)测量干燥材料的ir光谱。将酰胺i和酰胺ii峰用作蛋白质存在的标志，并将酰胺i峰的确切位置用于评估二级结构。将1610-1630cm-1
处的峰值位置是淀粉样蛋白样β-折叠的特征。
[0291]
用蛛丝聚合物富集聚氨酯的通用方案
[0292]
1.有机溶剂中的分散体：将水性悬浮液中不同量(表1)的蛛丝聚合物离心并重新悬浮在ddw(双蒸水)中。使悬浮液稳定3分钟。然后将其离心并重新悬浮在乙醇中。然后将其离心并重新悬浮在足量的干燥的醚类溶剂中两次(使悬浮液稳定)。然后将悬浮液通过40μm过滤器过滤。然后将其离心并重新悬浮在干燥的醚类溶剂中。将悬浮液置于旋转振荡器上10-200分钟(室温)。
[0293]
在纤维素的情况下，粉末纤维素直接分散在足量的醚类溶剂中，无需预先离心和重新悬浮在水和乙醇中的步骤。
[0294]
2.聚合物的溶解：将不同量(表1)的聚氨酯溶解在带有软木塞螺丝的透明玻璃小瓶中的足量醚类溶剂中(振荡器：37℃，200rpm，1-24小时)。
[0295]
3.将蛛丝悬浮液与聚合物溶液混合：将蛛丝聚合物悬浮液离心并重新悬浮在足量的醚类溶剂中。然后在超声仪中进行超声处理。使用光学显微镜测试蛛丝聚合物悬浮液的尺寸、断裂和聚集状态。将悬浮液倒入聚合物溶液中。将聚合物和蛛丝聚合物悬浮液彻底混合直至达到均匀，然后将其置于旋转振荡器(室温，50rpm)中，持续60分钟。
[0296]
4.脱气：将悬浮液在20-60℃下静置0.5-5小时，不振荡(脱气)。如果任何气泡可见，则在密闭容器中持续脱气时间更长。
[0297]
5.流延：使用光学显微镜测试蛛丝聚合物悬浮液的尺寸、断裂和聚集状态。将烧瓶的内容物(18.2g)完全流延在直径为9cm的玻璃培养皿中，持续14小时。将培养皿用纸板盖住，并放在带罩的塑料盒下。然后将富集的聚氨酯片从培养皿中取出并在80℃下真空放置90分钟。将富集的聚氨酯片在室温下保持2天，然后切成60
×
7mm的条带。
[0298]
6.机械特性测量：在lloyd ls5万能试验机中分析复合材料。以50mm/min的张力速率(mm/min)拉动条带。将50n称重传感器(load cell)用于准确的杨氏模量评估，并将5kn称重传感器用于伸长率和(极限抗拉强度)uts。
[0299]
表1.
[0300][0301]
svx-蛛丝纤维；在细菌中表达的svx-e-蛛丝聚合物。
[0302]
svx和svx-e在各种变性剂中的溶出曲线方案
[0303]
在ddw中制备8m硫氰酸胍、7.5m盐酸胍和6m尿素的储备溶液，并将不同浓度的适当化合物分散在96孔板中的80μl体积中。加入20μl svx(6.3mg/ml)或svxe(10mg/ml)，充分混合，并测量每孔的od600。如果在2小时或过夜后重复测量相同的孔，结果没有差异。
[0304]
实施例1
[0305]
细菌中的蛋白质表达
[0306]
细菌表达破坏细胞壁的溶菌酶。将仅表达溶菌酶的细菌用作对照。培养基ph是5.8。
[0307]
β-折叠的染色用于追踪不可溶的聚合物的形成。在纯化后，所得产物为蛋白质。平均产量(优化前)为105mg/l培养基。
[0308]
在6m guascn中溶解并透析成尿素后，uv光谱是含酪氨酸蛋白的特征，在276nm处达到最大值(图1a)。
[0309]
氨基酸含量对应于预期的序列(图1b)。
[0310]
ftir光谱显示酰胺键的特征峰：酰胺i和酰胺ii(图1c)。
[0311]
所得产物是含有β-折叠的颗粒。使用动态光散射(dls)，并且确定的粒径为1.04
±
0.2μm(图2)，并且颗粒的ftir分析证实了β-折叠结构(图3)。
[0312]
在大肠杆菌中表达的蛛丝蛋白(svxe)的酰胺i峰在1622cm-1
处具有最大值，类似于来自sf9的蛛丝蛋白(svx)。这是β-折叠的波长特征。用hfip(导致α-螺旋构象)或天然α-螺旋蛋白(bsa)溶解的svx显示移位的酰胺i峰。
[0313]
在sf9细胞(svx)中表达的蛛丝蛋白的ftir光谱类似于在大肠杆菌中表达的蛛丝蛋白(svxe)(图4)。
[0314]
当与蠕虫丝相比时，蠕虫丝的光谱显示出在svx和svx-e的光谱中不存在的独特峰(图5)。
[0315]
颗粒的差示扫描量热法(dsc)证实了晶体结构。
[0316]
颗粒在tm＝216℃时具有相变(图6a)。相变峰在用6m胍scn变性的蛋白质中消失(图6b)。
[0317]
来自sf9的纤维在tm＝242℃时具有相变(图6c)。
[0318]
svxe颗粒的tem揭示了其精细结构，这在常见的包涵体中没有出现(图7a-b)。此外，多孔svxe颗粒的sem图像(图21a-b)代表由纳米原纤维组成的纤维(由图21b中的箭头表示)，导致非常多孔的颗粒。当发生聚集时，颗粒的孔隙率明显降低(图21c-d)。
[0319]
图21e表示由具有如seq id no:10(msyyhhhhhhdydipttenlyfqgamprkspfprpel)中所列氨基酸序列的不同构建体的表达产生的纯化发酵产物的sem图像。虽然，从不同构建体的表达中获得的纤维是颗粒形式，但是这些纤维基本上不含纳米原纤维并且没有任何多孔结构。
[0320]
svxe纤维(例如图21a-b表示的)和从具有如seq id no：10中所列的序列的不同构建体的表达获得的纤维(例如由图21e表示)的ftir光谱(数据未显示)表明svxe纤维的特征在于与具有如seq id no：10中列出的序列的纤维相比，显著增加的β折叠量。
[0321]
实施例2
[0322]
细菌中表达的蛛丝蛋白的聚合物富集
[0323]
在示例性实验中，聚氨酯p490rsjt富含增加量的svx-e(表2)。
[0324]
表2.
[0325]
[0326]
结果表明存在剂量依赖性响应，其中杨氏模量随着svx-e％的增加而增加，而uts、％断裂伸长率和韧性降低(图8a-b)。
[0327]
用富含各种浓度的svx-e的聚合物e394pota进行了类似的实验。结果显示了剂量依赖性响应，其中杨氏模量随着％svx-e的增加而增加，而uts、％断裂伸长率和韧性降低(图9a-e)。
[0328]
图10a-e呈现了由包含20％svx或svx-e的聚氨酯p490rsjt制成的复合材料的对比的图。svx和svx-e都使聚合物更硬，如通过与对照相比增加的杨氏模量证明的。在这方面，svx和svx-e之间没有区别。与对照相比，svx和svx-e二者都降低了抗拉强度、％伸长率和韧性。svx-e显示出比svx更大的效果。
[0329]
图11a-e呈现了由含有20％svx或svx-e的聚氨酯e394pota制成的复合材料的对比的图。svx和svx-e二者都使聚合物更硬，如通过与对照相比增加的杨氏模量证明的。在这方面，svx和svx-e之间没有区别。与对照相比，svx和svx-e都降低了抗拉强度、％伸长率和韧性。如图8b、9e和10e，应变-应力曲线(未显示)显示出类似的行为。svx-e显示出比svx更大的效果。
[0330]
表3描述了由包含20％svx或svx-e的聚氨酯p490rsjt制成的复合材料的比较，以及由包含5％&10％svx或svx-e的聚氨酯pu399制成的复合材料的比较。
[0331]
表3.
[0332][0333][0334]
另外的聚合物已经富含svx-e纤维，并且已经研究了所得材料的机械特性。结果汇总如下(表3a)，表明富含svx-e的聚合物组合物的杨氏模量显著增加(在130％和1160％之间，包括其间的任意范围)。
[0335]
表3a.
[0336][0337]
此外，成膜剂已富集有10％w/w svx-e纤维并且研究了所得材料的机械特性。结果汇总在图14中，显示富含svx-e的成膜剂(普鲁兰多糖和liftonin)的杨氏模量和uts显著增加(73％至145％)。另外，如图14中所示，获得了测试的富含svx-e的成膜剂(普鲁兰多糖、liftoninskitrikliftlissgosulin)的储能模量的显著增加(在10和500％之间，包括其间的任意范围)和损耗模量的显著增加(在10和60％之间，包括其间的任意范围)。
[0338]
实施例3
[0339]
透明质酸的加载和释放
[0340]
将蛛丝纤维(svx)或在细菌中表达的蛛丝纤维(svx-e)用乙醇洗涤两次，然后用水洗涤(如上所述)。将10mg透明质酸(ha)加入到分散在1-20ml水中的10mg svx。用hcl或磷酸盐缓冲液调节ph，并加入水以达到所需体积。振荡混合物并离心。弃去上清液，在载玻片上干燥少量沉淀样品，产生ha svx-e或ha svx沉淀。随后通过ftir(nicolet is5 ftir光谱仪，thermo fisher scientific)对沉淀进行测试。将剩余的沉淀重新悬浮在水中，并将悬浮液在25℃下以200rpm振荡1-30分钟。这个过程重复几次。对于通过ftir分析的每个沉淀样品，ha在总干重中的比例是通过将ha特有的峰强度除以聚合物特有的峰强度来计算的(表4)。这些结果证实了masp类纤维(例如svx或svx-e)稳定包封另外的化合物(例如ha)的能力，其中包封的化合物与纤维(例如svx或svx-e)的w/w比大约是1:1。
[0341]
表4.
[0342]
混合物ha峰聚合物峰ha svx或ha svx-e1040cm-1
1640cm-1
ha 丝1040cm-1
1550cm-1
[0343]
实施例4
[0344]
ph值对大肠杆菌中svx-e形成的影响
[0345]
以下实施例表明，大肠杆菌中svx-e的形成取决于培养基ph(图15)。svx-e的检测是使用β-折叠特异性荧光染料完成的，该染料结合自组装蛛丝，但不结合可溶性蛛丝。
[0346]
数据还显示svx-e仅在存在乳糖(其是svx-e表达的诱导剂)和svx-e表达质粒的情况下表达。
[0347]
图16显示了在ph 7.5或ph 5.8下生长的培养物中，在不同时间点用共焦显微镜拍
摄的染色图像。
[0348]
实施例5
[0349]
svx-e的表达具有双相动力学模式
[0350]
以下实施例显示在诱导重组蛛丝蛋白之后的延迟，svx-e以其最终的不可溶的形式产生。由于蛋白质合成不是通过加入诱导剂(例如乳糖或iptg)在特定时间诱导的，而是诱导剂从一开始就存在于生长培养基中(在少量葡萄糖作为首选碳源的情况下，一旦它消耗就利用乳糖并开始重组蛋白合成)。按照重组蛋白合成动力学的方法是比较两种培养物的生长速率，一种含有乳糖(表达培养物)，和另一种不含乳糖(对照培养物)。两种培养物的生长速率(在600nm处测得的吸光度)之间的差异表明，含乳糖的培养物的生长速率比不含乳糖的对照培养物慢。不受任何特定理论的束缚，这被解释为在较慢的培养物中诱导蛛丝的表达，因为众所周知，当细菌表达重组蛋白时它们的生长速率减慢，这是由于利用代谢机制进行蛋白质合成而不是生长。
[0351]
图17表明，蛋白质表达时间窗口是表达培养物落后于对照培养物的时间。发明人将特定探针用于β折叠晶体，其为形成为β折叠相互堆叠的结构(褶皱β折叠)——这是天然和人造蛛丝(比如svx-e)，而不是可溶性蛛丝蛋白(spidroin)的众所周知的特性。
[0352]
不可溶的svx-e的增加发生在两种培养物在大约20小时达到相等的生长速率之后，此时细菌不再表达svx-e。此外，通过查看绝对生长曲线(图18)，可以看出不可溶的svx-e的形成仅在细菌达到稳定期后才开始，此时重组蛋白通常不再表达。
[0353]
综上所述，结果表明在ph 5.8时，重组蛛丝的生产具有双相动力学，其中在第一阶段形成可溶性蛛丝蛋白，而在第二阶段，一旦积累到可溶性蛋白质的临界细胞内浓度，就会发生svx-e的自组装，其由分子内和分子间β折叠和β折叠晶体稳定。
[0354]
在ph 7.5(图19)下，上述情况均未发生。未检测到不可溶的svx(第2阶段)，并且未表明第1阶段存在差异生长和可溶性蛋白质表达。
[0355]
本发明人已经在表达svx的sf9细胞中观察到类似的现象。在培养物被杆状病毒感染70小时后，通过相同的β折叠晶体特异性染色检测到svx的出现，在这个阶段，细胞已经达到稳定期并且它们没有分裂。这些结果也再次表明昆虫细胞中svx产生的双相动力学。
[0356]
实施例6
[0357]
svx和svx-e在各种变性剂中的溶出曲线
[0358]
表5汇总了实验数据，表明svx和svx-e在众所周知的变性剂(da)尿素(未显示)、氯化胍和硫氰酸胍中具有相似的溶出曲线。表5表示溶出任一种纤维(svx和svx-e)总量的50％w/w溶出所需的特定变性剂(c
1/2
(da))的摩尔浓度。如表5所示，溶出两种纤维(svx和svx-e)需要类似浓度的各种da。
[0359]
表5.
[0360][0361]
数据表明两者具有相似的化学组成，并且分散性的差异是由于svx-e的尺寸较小，
这导致较高的表面积。
[0362]
尽管已经结合其具体实施方式描述了本发明，但是显然，许多替代、修改和变型对于本领域技术人员来说将是显而易见的。因此，其意图包括落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变型。
[0363]
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