一种细胞修复液、制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种细胞修复液、制备方法及其应用，属于农业技术领域。


背景技术：

2.随着工业化进程的不断加快，矿产资源的不合理开采及其冶炼排放、长期对土壤进行污水灌溉和污泥施用、人为活动引起的大气沉降、化肥和农药的施用等原因，造成了土壤污染严重。
3.全国土壤总的超标率为16.1%，其中轻微、轻度、中度和重度污染点位比例分别为11.2%、2.3%、1.5%和1.1%。污染类型以无机型为主，有机型次之，复合型污染比重较小，无机污染物超标点位数占全部超标点位的82.8%。
4.作物种植于污染的土壤会造成重金属超标，产量低下，作物在地里长势羸弱，发生烂根等病害，影响食品安全和农民收入，现有技术有在植物生长周期中通过施用植物细胞修复液，通过修复植物细胞来防止植物烂根等病害，但是在正常土壤中对植物细胞的修复作用比较好，在轻度污染土壤中修复效果差，植物烂根等病害发病率仍然较高，作物产量低，同时也无法阻止重金属在作物体内的富集，影响产量和质量。
5.综上所述，现有技术存在以下问题：（1）现有细胞修复液，在轻度污染土壤中修复效果差，植物烂根等病害发病率高；（2）现有细胞修复液，在轻度污染土壤中使用，作物产量低；（2）现有细胞修复液，在轻度污染土壤中无法阻止作物中重金属的富集。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，通过多步酶解制备特定分子量多肽，添加改性原料制成细胞修复液，实现以下发明目的：（1）细胞修复液在轻度污染土壤中修复效果好，植物烂根等病害发病率低；（2）细胞修复液在轻度污染土壤中使用，作物产量高；（2）细胞修复液在轻度污染土壤中可以阻止作物中重金属的富集。
7.为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种细胞修复液，其特征在于，所述细胞修复液按质量份计，包括以下组分：鲟鱼小分子多肽营养液14-16份、腐殖酸1.5-2.5份、改性高岭石超细粉4-6份、氨基三乙酸1.5-2.5份、木瓜多酚1.5-2.5份、环糊精包埋角鲨烯复合物4-6份、豆甾醇2.5-3.5份、丙烯酰二甲基牛磺酸钠0.8-1.2份、透明质酸钠2.5-3.5份、白芨提取物2.5-3.5份、杏仁提取物2.5-3.5份、牛蒡粉1.5-2.5份、螺旋藻多糖2.5-3.5份、吐温-80 10-20份、水250-350份。
8.以下是对上述技术方案的进一步改进：所述制备方法包括连续酶解制备鲟鱼小分子多肽营养液、制备改性高岭石超细粉、制备环糊精包埋角鲨烯复合物、制备细胞修复液。
9.所述连续酶解制备鲟鱼小分子多肽营养液包括前处理、一步酶解、二步酶解、三步
酶解；所述前处理，鲟鱼除去头部和内脏，剩余部分破碎后冻干，再粉碎至80-120目得到鲟鱼肉骨粉备用；头部和内脏粉碎至大小为2-3cm，在100℃下蒸煮20-40min，得到鲟鱼熟内脏备用。
10.所述一步酶解，将鲟鱼熟内脏与去离子水混合并调节ph为8.0-9.0，加入枯草杆菌蛋白酶和抗坏血酸，辅以80-120w功率的微波辐照下于50-60℃下酶解25-35min，过滤得到一步酶解液；所述鲟鱼熟内脏与去离子水的质量比为2:4-6；所述枯草杆菌蛋白酶的酶活力为9.0-9.5*105u/g；所述枯草杆菌蛋白酶与鲟鱼熟内脏的质量比为1:250-350；所述抗坏血酸与鲟鱼熟内脏的质量比1:800-1200。
11.所述二步酶解，一步酶解液加入鲟鱼肉骨粉，再加入一定量的去离子水，调节ph为6.0-7.0，加入木瓜蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的组合酶a，于50-60℃下酶解30-50min，得到二步酶解液；所述鲟鱼肉骨粉与一步酶解液的质量比为1:1.5-2.5；所述去离子水与一步酶解液的质量比为1: 1.5-2.5；所述组合酶a中木瓜蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的质量比为2:2-4；所述木瓜蛋白酶的酶活力为7.0-8.0*105u/g；所述丝氨酸蛋白酶的酶活力为8.0-9.0*105u/g；所述组合酶a与一步酶解液的质量比为1:80-120。
12.所述三步酶解，二步酶解液加入鲟鱼肉骨粉，再加入一定量的去离子水，调节ph为1.8-2.2，加入胃蛋白酶于30-40℃下酶解15-25min，然后调节ph为7.0-8.0，再加入胰蛋白酶于30-40℃下酶解30-50min得到三步酶解液，同时三步酶解全程辅以间隔的超声，超声功率200-300w、频率30-50khz，每间隔3-7min辅助超声3-7min，三步酶解液灭活并调节ph为中性，过滤离心取上清液得到鲟鱼小分子多肽营养液；所述鲟鱼小分子多肽营养液中多肽分子量为1.2-1.4kda，硒含量为130-140mg/l，锰含量为50-60 mg/l，锶含量为30-40 mg/l，锌含量为180-190 mg/l；所述鲟鱼肉骨粉与二步酶解液的质量比为1:0.8-1.2；所述去离子水与二步酶解液的质量比为1:1.5-2.5；所述胃蛋白酶与二步酶解液的质量比为1:200-300；所述丝氨酸蛋白酶的酶活力为3.0-4.0*105u/g；所述胰蛋白酶与二步酶解液的质量比为1:100-200；所述丝氨酸蛋白酶的酶活力为2.0-3.0*105u/g。
13.所述制备改性高岭石超细粉，将高岭石粉碎至40-60μm，分散于无水乙醇形成均匀的分散液，并调节ph至3.0-4.0，缓慢滴加3-氨基丙烷三乙氧基硅烷，2-4min内滴加完成，搅拌50-70min，过滤后将滤渣清洗至中性，在105-130℃下干燥200-300min得到初步改性高岭石粉，将初步改性高岭石粉与石榴籽油混合，在73-80℃下搅拌25-35min，再加入氨基环丙烷羧酸、马来酸酐、浓硫酸的混合物，在105-120℃下搅拌300-400min，然后水洗至中性并干燥，最后粉碎至粒径为5-10μm得到改性高岭石超细粉；
所述高岭石与无水乙醇的质量比为1:50-70；所述3-氨基丙烷三乙氧基硅烷与高岭石的质量比为1:100-200；所述石榴籽油与初步改性高岭石粉的质量比为2:4-6；所述混合物中氨基环丙烷羧酸、马来酸酐、浓硫酸的质量比为2:14-16:0.8-1.2；所述混合物与初步改性高岭石粉的质量比为1:8-12。
14.所述制备环糊精包埋角鲨烯复合物，将三聚磷酸钠溶解于去离子水，然后加入磷酸溶液调节ph至6.0-7.0，然后加入环糊精搅拌40-50min后抽滤，再用无水乙醇淋洗后继续抽滤，干燥至滤饼含水量至5-10%得到改性环糊精备用，将改性环糊精分散于角鲨烯的丙酮溶液中搅拌200-300min，然后蒸发溶剂干燥并粉碎至80-120目得到环糊精包埋角鲨烯复合物，包埋量为70-80mg/g；所述三聚磷酸钠与去离子水的质量比为1:8-10；所述环糊精与三聚磷酸钠的质量比为3-5:1；所述角鲨烯的丙酮溶液中角鲨烷与丙酮的质量比为1:250-350；所述改性环糊精与角鲨烯的丙酮溶液的质量比为40-60:1。
15.所述制备细胞修复液，将鲟鱼小分子多肽营养液、腐殖酸、改性高岭石超细粉、氨基三乙酸、木瓜多酚、环糊精包埋角鲨烯复合物、豆甾醇、丙烯酰二甲基牛磺酸钠、透明质酸钠、白芨提取物、杏仁提取物、牛蒡粉、螺旋藻多糖、吐温-80、水混合均匀得到细胞修复液。
16.一种细胞修复液在物细胞修复中的应用。
17.与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：本发明的细胞修复液可以降低作物烂根以及其他病害发病率, 轻度污染土壤中西红柿烂根率为10.58%，叶霉病发病率为12.37%，早疫病发病率为9.62%；本发明的细胞修复液可以提高作物产量, 轻度污染土壤中西红柿产量为1800斤/亩；本发明的细胞修复液可以降低重金属在植物体内的富集，作物茎叶中重金属含量低，轻度污染土壤中西红柿果实中镉含量＜0.05mg/kg，铅含量＜0.1mg/kg，低于国家蔬菜重金属限量值。
具体实施方式
18.实施例1（1）连续酶解制备鲟鱼小分子多肽营养液a、前处理成年鲟鱼宰杀后除去头部和内脏，剩余部分破碎后进行冻干除去水分，再粉碎至100目得到干燥的鲟鱼肉骨粉备用；头部和内脏清洗后，粗略粉碎至大小为2-3cm的块状，并在100℃下蒸煮30min，得到鲟鱼熟内脏备用；b、一步酶解将鲟鱼熟内脏与去离子水混合并调节ph为8.5，加入枯草杆菌蛋白酶和抗坏血酸，辅以100w功率的微波辐照下于55℃下酶解30min，过滤得到一步酶解液；所述鲟鱼熟内脏与去离子水的质量比为2:5；
所述枯草杆菌蛋白酶的酶活力为9.2*105u/g；所述枯草杆菌蛋白酶与鲟鱼熟内脏的质量比为1:300；所述抗坏血酸与鲟鱼熟内脏的质量比1:1000。
19.c、二步酶解一步酶解液加入鲟鱼肉骨粉，再加入一定量的去离子水，调节ph为6.5，加入木瓜蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的组合酶a，于55℃下酶解40min，得到二步酶解液；所述鲟鱼肉骨粉与一步酶解液的质量比为1:2；所述去离子水与一步酶解液的质量比为1:2；所述组合酶a中木瓜蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的质量比为2:3；所述木瓜蛋白酶的酶活力为7.5*105u/g；所述丝氨酸蛋白酶的酶活力为8.7*105u/g；所述组合酶a与一步酶解液的质量比为1:100。
20.d、三步酶解二步酶解液加入鲟鱼肉骨粉，再加入一定量的去离子水，调节ph为2.0，加入胃蛋白酶于35℃下酶解20min，然后调节ph为7.5，再加入胰蛋白酶于35℃下酶解40min得到三步酶解液，同时三步酶解全程辅以间隔的超声，超声功率250w、频率40khz，每间隔5min辅助超声5min，三步酶解液在95℃下灭活20min，并调节ph为中性，最后过滤离心取上清液得到鲟鱼小分子多肽营养液；所述鲟鱼小分子多肽营养液中多肽分子量为1.2-1.4kda，硒含量为137mg/l，锰含量为53 mg/l，锶含量为38 mg/l，锌含量为185 mg/l；所述鲟鱼肉骨粉与二步酶解液的质量比为1:1；所述去离子水与二步酶解液的质量比为1:2；所述胃蛋白酶与二步酶解液的质量比为1:250；所述丝氨酸蛋白酶的酶活力为3.5*105u/g；所述胰蛋白酶与二步酶解液的质量比为1:150；所述丝氨酸蛋白酶的酶活力为2.8*105u/g。
21.（2）制备改性高岭石超细粉将高岭石粉碎至50μm，分散于无水乙醇形成均匀的分散液，并调节ph至3.5，缓慢滴加3-氨基丙烷三乙氧基硅烷，3min内滴加完成，搅拌60min，过滤后将滤渣清洗至中性，在120℃下干燥240min得到初步改性高岭石粉，将初步改性高岭石粉与石榴籽油混合，在75℃下搅拌30min，再加入氨基环丙烷羧酸、马来酸酐、浓硫酸的混合物，在110℃下搅拌350min，然后水洗至中性并干燥，最后气流粉碎至粒径为8μm得到改性高岭石超细粉；所述高岭石与无水乙醇的质量比为1:60；所述3-氨基丙烷三乙氧基硅烷与高岭石的质量比为1:150；所述石榴籽油与初步改性高岭石粉的质量比为2:5；所述混合物中氨基环丙烷羧酸、马来酸酐、浓硫酸的质量比为2:15:1；所述混合物与初步改性高岭石粉的质量比为1:10。
22.（3）制备环糊精包埋角鲨烯复合物将三聚磷酸钠溶解于去离子水，然后加入磷酸溶液调节ph至6.5，然后加入环糊精
搅拌45min后抽滤，再用无水乙醇淋洗后继续抽滤，干燥至滤饼含水量至8%得到改性环糊精备用，将改性环糊精分散于角鲨烯的丙酮溶液中搅拌240min，然后蒸发溶剂干燥并粉碎至100目得到环糊精包埋角鲨烯复合物，包埋量为75.3mg/g；所述三聚磷酸钠与去离子水的质量比为1:9；所述环糊精与三聚磷酸钠的质量比为4:1；所述角鲨烯的丙酮溶液中角鲨烷与丙酮的质量比为1:300；所述改性环糊精与角鲨烯的丙酮溶液的质量比为50:1。
23.（4）制备细胞修复液所述细胞修复液按质量份计，包括以下组分：鲟鱼小分子多肽营养液15份、腐殖酸2份、改性高岭石超细粉5份、氨基三乙酸2份、木瓜多酚2份、环糊精包埋角鲨烯复合物5份、豆甾醇3份、丙烯酰二甲基牛磺酸钠1份、透明质酸钠3份、白芨提取物3份、杏仁提取物3份、牛蒡粉2份、螺旋藻多糖3份、吐温-80 15份、水300份；所述细胞修复液的制备方法，将鲟鱼小分子多肽营养液、腐殖酸、改性高岭石超细粉、氨基三乙酸、木瓜多酚、环糊精包埋角鲨烯复合物、豆甾醇、丙烯酰二甲基牛磺酸钠、透明质酸钠、白芨提取物、杏仁提取物、牛蒡粉、螺旋藻多糖、吐温-80、水混合均匀得到细胞修复液。
24.实施例2于土壤镉含量0.87mg/kg，铅含量为66mg/kg，ph为6.7的轻度污染土壤中，种植西红柿，分为正常水肥处理和正常水肥加使用细胞修复液处理，观察统计其生长情况；所述正常水肥加使用细胞修复液处理，西红柿植株幼苗期开始，将细胞修复液的250倍液喷施于根部土壤，每亩使用修复液的250倍液8.5kg，间隔10天喷施一次，共喷施三次，开花坐果期开始，将细胞修复液的250倍液喷施于根部土壤，每亩使用修复液的250倍液5kg，喷施一次。
25.正常水肥处理西红柿烂根率为13.25%，叶霉病发病率为15.83%，早疫病发病率为11.75%，正常水肥加使用细胞修复液处理西红柿烂根率为4.35%，叶霉病发病率为5.47%，早疫病发病率为4.88%；正常水肥处理西红柿产量为1700斤/亩，正常水肥加使用细胞修复液处理西红柿产量为2100斤/亩；正常水肥处理西红柿茎叶中镉含量为1.25mg/kg，铅含量为13.53mg/kg，果实中镉含量＞0.05mg/kg，铅含量＞0.1mg/kg，高于国家蔬菜重金属限量值，正常水肥加使用细胞修复液处理西红柿茎叶中镉含量为0.58 mg/kg，铅含量为4.33 mg/kg，果实中镉含量＜0.05mg/kg，铅含量＜0.1mg/kg，低于国家蔬菜重金属限量值。
26.对比例1在实施例1的基础上，省去制备改性高岭石超细粉步骤，仅使用未改性的高岭石粉与石榴籽油混合后直接粉碎至粒径为8μm制得超细粉，其余步骤相同，制得细胞修复液，用实施例2中正常水肥加使用细胞修复液处理相同的方法，进行种植，观察统计西红柿生长情况；西红柿烂根率为6.25%，叶霉病发病率为8.33%，早疫病发病率为5.13%；西红柿产量为1950斤/亩；
西红柿茎叶中镉含量为0.93mg/kg，铅含量为10.35mg/kg，果实中镉含量＞0.05mg/kg，铅含量＞0.1mg/kg，高于国家蔬菜重金属限量值。
27.对比例2在实施例1的基础上，省去连续酶解制备鲟鱼小分子多肽营养液步骤中三步酶解步骤，得到多肽分子量为13.5kda，其余步骤相同，制得细胞修复液，用实施例2中正常水肥加使用细胞修复液处理相同的方法，进行种植，观察统计西红柿生长情况；西红柿烂根率为10.58%，叶霉病发病率为12.37%，早疫病发病率为9.62%；西红柿产量为1800斤/亩；西红柿茎叶中镉含量为0.85mg/kg，铅含量为9.37mg/kg，果实中镉含量＜0.05mg/kg，铅含量＜0.1mg/kg，低于国家蔬菜重金属限量值。
28.对比例3在实施例1的基础上，省去制备环糊精包埋角鲨烯复合物步骤，直接添加角鲨烷制得细胞修复液，其余步骤相同，用实施例2中正常水肥加使用细胞修复液处理相同的方法，进行种植，观察统计西红柿生长情况；西红柿烂根率为9.38%，叶霉病发病率为10.53%，早疫病发病率为8.71%；西红柿产量为1800斤/亩；西红柿茎叶中镉含量为0.72mg/kg，铅含量为5.35mg/kg，果实中镉含量＞0.05mg/kg，铅含量＞0.1mg/kg，高于国家蔬菜重金属限量值。
29.对比例4在实施例1的基础上，制备细胞修复液中，省去添加豆甾醇、丙烯酰二甲基牛磺酸钠、透明质酸钠，其余步骤相同，制得细胞修复液，用实施例2中正常水肥加使用细胞修复液处理相同的方法，进行种植，观察统计西红柿生长情况；西红柿烂根率为10.58%，叶霉病发病率为11.87%，早疫病发病率为9.24%；西红柿产量为1700斤/亩；西红柿茎叶中镉含量为0.73mg/kg，铅含量为6.71mg/kg，果实中镉含量＜0.05mg/kg，铅含量＜0.1mg/kg，低于国家蔬菜重金属限量值。