rna构建体
技术领域：
：1.本发明涉及rna构建体，尤其，尽管不是唯一地，涉及rna复制子和sarna分子，以及涉及编码此类rna复制子的遗传构建体或载体。本发明延伸到此类rna构建体和复制子在治疗中，例如在治疗疾病和/或在疫苗递送中的用途。本发明延伸至包含此类rna构建体的药物组合物以及其方法及其用途。
背景技术：
：：2.信使rna(mrna)是用于生物疗法的有希望的工具。然而，虽然已证明在小动物中mrna疗法是高效的，但是当这些制剂在人类的剂量递增研究中被翻译时，结果不是线性缩放的。此外，与诱导干扰素反应相关的不良事件已经限制了人类中可能有效的rna的剂量的增加。这种不一致性的原因尚不清楚，但本发明人假设人体先天感知的差异对rna疗法从实验室转化到临床构成障碍。此外，rna的先天感知已经与蛋白质表达抑制相关的。迄今为止，克服外源性rna先天识别的主要方法一直是使用通过先天感知机制不易检测到的经修饰核糖核苷酸。然而，经修饰的mrna不是完全不可检测的，仍然导致一定程度的干扰素激活、蛋白质沉默以及对于人类使用的可耐受性降低。3.另一种方法是使用通常基于甲病毒骨架的自扩增或sarna载体，所述甲病毒骨架具有通过在其非结构蛋白内编码聚合酶活性而自扩增其自身rna的能力。现有技术方法涉及用目的基因(goi)取代这些载体的结构蛋白，所述目的基因是疫苗构建体或编码治疗性蛋白。其他版本的sarna已基于小核糖核酸病毒、黄病毒和冠状病毒。当sarna被摄取到靶细胞的细胞质中时，这导致了通过编码的聚合酶体系的rna扩增以及非常高的goi表达水平。因此，已证明sarna可以用比mrna更低的剂量(低10-100倍)诱导免疫反应，并导致小鼠中的蛋白质表达时间延长多达60天。4.然而，sarna的缺点是其通过先天识别仍可以被感知，从而触发限制这些现有技术sarna的蛋白质表达和自扩增的抗病毒反应。由于其具有大尺寸(通常》5000个碱基)和包含双链区(dsrna)的深度(profound)二级结构，因此sarna的先天感知与mrna的先天感知不同。长双链rna通过mda5(黑色素瘤分化相关蛋白5)途径触发先天反应。这一点通过促进mda5寡聚化的pact(pkr激活蛋白)与长dsrnarna的结合，和随后抑制sarna的复制和表达的下游信号级联的触发而被促进。5.因此，本领域需要产生新方法，通过所述方法可以在患者体内递送和表达rna疗法，使得患者能够克服rna的先天免疫系统感知。技术实现要素：6.本发明人开发了新型自扩增rna(sarna)，所述sarna通过表达阻断或减少先天免疫系统机制的先天抑制剂蛋白，导致蛋白质表达和自扩增提高，从而有利地克服rna的先天免疫系统感知。7.因此，在本发明的第一方面，提供了一种rna构建体，其编码(i)至少一种治疗性生物分子；(ii)至少一种先天抑制剂蛋白(iip)。8.rna复制子或构建体被认为是用于疫苗和疗法中目的基因的递送和表达的潜在工具。然而，双链rna(dsrna)在细胞内由触发反应的先天感知机制检测，这抑制了蛋白质翻译。因此，在复制子中编码的目的基因的表达显著受损，因此rna复制子的治疗潜力受到限制。有利地，本发明的rna构建体克服了这个问题，因为它们编码一种或多种先天抑制剂蛋白，即iip，其消除了转基因表达的下游抑制。干扰素的诱导是先天识别的下游结果，但应当理解，其他分子和途径可以被诱导，这些中的任一都被包含在rna构建体中的一个或多个iip抑制。唯一先前发表的用sarna消除干扰素反应的方法使用来自自痘苗病毒e3、k3和b18的干扰素抑制蛋白。然而，在这项研究中，这些干扰素抑制蛋白以与sarna组合的单独mrna分子形式递送和配制。这需要制造sarna和mrna两者，并且必须使用根据本发明的复制子rna构建体的3-6倍的疫苗mrna，以确保共同递送到同一细胞中且提供任何可观察到的蛋白质表达增强。此外，mrna和sarna的表达动力学不同，使得与本发明的rna构建体(长达60天)相比，由mrna表达的iip的任何有益效果将仅具有非常短的持续时间(长达72小时)。9.有利的是，在第一方面的rna构建体中，一个或多个iip的存在能够与目的多肽或蛋白质进行双重蛋白质表达。相对于现有技术中描述的递送一条编码目的肽/蛋白、一条编码iip的两条不同的rna链，使用本发明的构建体，将仅单个链递送到靶细胞，从而确保rna和先天抑制剂蛋白的共定位。iip抑制rna的先天感知，从而使蛋白质表达更高，iip自身表达由于与目的基因(即治疗性生物分子)在亚基因组链上共同表达而被自扩增。如实施例所述，已令人惊讶地表明，本发明的编码荧光素酶的rna构建体(也称为“stealthicons”)，在体外在人类细胞系中，提高荧光素酶蛋白质表达水平高达两个数量级，并且在bl/6小鼠体内与传统veevrna复制子相比，还提高了荧光素酶的蛋白质表达量和持续时间两者。本领域技术人员很容易理解，荧光素酶报告子是治疗性生物分子的真实代表，因为它证明了rna构建体能够在体内表达本发明的rna分子上包含的基因。因此，荧光素酶提供了概念验证的有力证据，即本发明的sarna构建体可用于表达任何具有治疗活性的生物分子。10.本领域技术人员将理解，rna构建体也可以被称为自复制rna病毒载体或rna复制子。rna构建体可以是双链的或单链的。优选地，所述rna构建体包含自扩增rna(sarna)，并且优选地为sarna构建体。11.优选地，所述rna构建体包含或衍生自正链rna病毒，所述正链rna病毒选自由以下组成的属的组：甲病毒属；小核糖核酸病毒属；黄病毒属；风疹病毒属；瘟病毒属；肝炎病毒属；杯状病毒属或冠状病毒属。12.合适的野生型甲病毒属序列是众所周知的。合适的甲病毒属的代表实例包括奥拉病毒、比巴鲁病毒、卡巴斯欧病毒、基孔肯雅病毒、东部马脑炎病毒、摩根堡病毒(fortmorgan)、盖他病毒、孜拉加奇病毒、马雅罗、马雅罗病毒、米德尔堡(middleburg)、穆坎布病毒、恩杜茂病毒、皮克斯纳病(pixunavirus)、罗斯河病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、图那特病毒、特里尼蒂病毒(triniti)、una、委内瑞拉马脑炎、西部马脑炎、瓦塔罗阿病毒和y-62-33。13.优选地，rna构建体包含或衍生自病毒，所述病毒选自由以下组成的物种的组的：委内瑞拉马脑炎病毒(veev)；肠道病毒71；脑心肌炎病毒；库京病毒以及中东呼吸道综合征病毒。优选地，所述载体衍生自veev。14.所述rna构建体包含编码至少一种治疗性生物分子的序列。所述至少一种治疗性生物分子可包含或是疫苗构建体或治疗性蛋白质。本领域技术人员可以理解，治疗性蛋白质涉及优选在人类中具有治疗应用的任何蛋白质。可由rna分子编码的示例性治疗性生物分子包括衍生自诸如细菌、病毒、真菌、原生动物/或寄生生物的病原体的蛋白质和肽。优选地，所述蛋白质和肽是抗原。15.衍生自病毒的蛋白质和肽可以是病毒抗原。所述病毒抗原可衍生自选自由以下组成的组的病毒：正黏液病毒；副黏液病毒科病毒；偏肺病毒和麻疹病毒；肺炎病毒；副粘病毒；痘病毒科；偏肺病毒；麻疹病毒；小核糖核酸病毒；肠道病毒；布尼亚病毒；白蛉病毒；内罗病毒；嗜肝rna病毒；披膜病毒；甲病毒；动脉炎病毒；黄病毒；瘟病毒；嗜肝dna病毒；弹状病毒；杯状病毒科；冠状病毒；逆转录酶病毒；呼吸道肠道病毒；细小病毒；丁型肝炎病毒(hdv)；戊型肝炎病毒(hev)；人类疱疹病毒和乳多泡病毒。16.正黏液病毒可以是甲型流感、乙型流感和丙型流感。副粘病毒科病毒可以是肺炎病毒(rsv)、副粘病毒(piv)。偏肺病毒可以是麻疹病毒(如麻疹)。肺炎病毒可以是呼吸道合胞病毒(rsv)、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒或火鸡鼻气管炎病毒。副粘病毒可以是1-4型副流感病毒(piv)、流行性腮腺炎、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒、尼帕病毒、亨尼病毒或新城疫病毒。痘病毒科可以是天花病毒，例如大天花和小天花。偏肺病毒可以是人偏肺病毒(hmpv)或禽类偏肺病毒(ampv)。麻疹病毒可以是麻疹。小核糖核酸病毒可以是肠道病毒、鼻病毒、嗜肝rna病毒、副肠孤病毒、心病毒和口蹄疫病毒。肠道病毒可以是1、2或3型脊髓灰质炎病毒；1至22和24型柯萨奇a病毒；1至6型柯萨奇b病毒；1至9、11至27和29至34型艾柯病毒(echo)病毒或肠道病毒68至71。布尼亚病毒可以是加利福尼亚脑炎病毒。白蛉病毒可以是裂谷热病毒。内罗病毒可以是克里米亚-刚果出血热病毒。嗜肝rna病毒可以是甲肝病毒(hav)。披膜病毒可以是风疹病毒。黄病毒可以是蜱传脑炎(tbe)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、俄罗斯春夏脑炎病毒或波瓦桑脑炎病毒。瘟病毒可以是牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、古典猪瘟病毒(csfv)或边界病病毒(bdv)。嗜肝dna病毒可以是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。弹状病毒可以是狂犬病病毒(狂犬病病毒)或水疱性病毒(vsv)。杯状病毒科可以是诺沃克病毒，或诺沃克样病毒，如夏威夷病毒和雪山病毒。冠状病毒可以是sarscov-1、sars-cov-2、mers、人类呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎病毒(ibv)、小鼠肝炎病毒(mhv)或猪传染性胃肠炎病毒(tgev)。逆转录酶病毒可以是肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。呼吸道肠道病毒可以是正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗病毒。细小病毒可以是细小病毒b19。人类疱疹病毒可以是单纯疱疹病毒(hsv)、水痘-带状疱疹病毒(vzv)、艾巴氏病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)、人类疱疹病毒6(hhv6)、人类疱疹病毒7(hhv7)或人类疱疹病毒8(hhv8)。乳多泡病毒也可以是乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或沙粒病毒。17.如实施例和图13中所示，在优选的实施方案中，病毒抗原可以是狂犬病病毒抗原，优选狂犬病病毒糖蛋白。在另一优选的实施方案中，如实施例和图29所示，病毒抗原可以是冠状病毒抗原。优选地，冠状病毒抗原是表面糖蛋白，更优选sars-cov-2表面糖蛋白。18.衍生自细菌的蛋白质和肽可以是细菌抗原。19.所述细菌抗原可以衍生自细菌，所述细菌选自由以下组成的组：脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎双球菌、酿脓链球菌、卡他莫拉菌、百日咳博代氏杆菌、伯克霍尔德氏菌属(例如，鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌和洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacepacia))、金黄色酿脓葡萄球菌、流感嗜血杆菌(haemophilusinkuenzae)、破伤风梭菌(破伤风)、产气荚膜梭菌、肉毒杆菌、白喉棒状杆菌(白喉)、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、伯氏考克斯氏体、布鲁氏菌(例如，流产布鲁氏菌(b.abortus)、犬属布鲁氏菌(b.canis)、马耳他布鲁氏菌(b.melitensis)、沙漠森林野鼠种布氏菌(b.neotomae)、羊属布鲁氏菌(b.ovis)、猪布鲁氏菌(b.suis)和鳍型布鲁氏菌(b.pinnipediae))、弗朗西斯氏菌属(jfrancisellasp.)(例如，新凶手弗朗西斯菌(f.novicida)、蜃楼弗朗西斯菌(f.philomiragia)、土拉弗朗西斯菌(f.tularensis))、无乳链球菌、淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体(梅毒)、杜克雷嗜血杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、幽门螺杆菌、腐生葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌、炭疽杆菌(炭疽)、鼠疫耶尔森菌(瘟疫)、结核分支杆菌、立克次氏体、李斯特菌、肺炎衣原体、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌(伤寒症)、氏疏螺旋体、卟啉单胞菌和克雷伯氏菌。20.衍生自真菌的蛋白质和肽可以是真菌抗原。21.所述真菌抗原可以衍生自真菌的真菌抗原，所述真菌选自由以下组成的组：皮霉(dermatophytres)，包括：表皮癣菌、奥杜安氏小孢子菌、犬小孢子菌、扭曲小孢子菌(microsporumdistortum)、马类小孢子菌、石膏小孢子菌(microsporumgypsum)、猪小孢子菌、同心毛癣菌、马毛癣菌、鸡毛癣菌、石膏样毛癣菌(trichophytongypseum)、麦格毛菌、须毛癣菌、昆克努发癣菌(trichophytonquinckeanum)、红色毛癣菌、许兰黄癣菌、断发毛癣菌、疣状癣菌、疣状发癣菌白色变种、盘状变种、赭黄变种，紫色毛癣菌和/或蜜块状毛癣菌(trichophytonfaviforme)；或衍生自烟曲霉菌、黄柄曲霉(aspergilluskavus)、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、萨氏曲霉(aspergillussydowi)、kavatus曲霉、灰绿曲霉、芽生裂殖菌、白色念珠菌、烯醇酶假丝酵母(candidaenolase)、热带念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯假丝酵母、近平滑念珠菌、类星形念珠菌、克鲁斯假丝酵母、帕拉克斯假丝酵母(candidaparakwsei)、葡萄牙假丝酵母、伪热带念珠菌、季也蒙假丝酵母、卡氏枝孢霉(cladosporiumcarrionii)、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、新型隐球菌、棒地霉、荚膜组织胞浆菌、肺炎克雷伯氏菌、微孢子虫目(microsporidia)、脑胞内原虫属(encephalitozoonspp.)、肠隔膜虫和双肠肠虫(septataintestinalisandenterocytozoonbieneusi)、虫属实菌(brachiolaspp)、微孢子虫属、小孢子虫属(nosemaspp.)、匹里虫属(pleistophoraspp.)、人气管普孢虫属(trachipleistophoraspp.)、条抱虫属(vittaformaspp)、巴西副球孢子菌、卡氏肺孢子虫、隐袭腐霉、卵状糠秕孢子菌、酿酒酵母、布拉迪酵母(saccharomycesboulardii)、粟酒裂殖酵母、尖端赛多孢子菌、申克孢子丝菌、白吉利毛孢子菌、弓形虫(toxoplasmagondii)、马尔尼菲青霉、马拉色菌属、着色真菌属、万吉拉菌(wangiellaspp.)、孢子丝菌属、蛙粪霉属、耳霉属、根霉属、毛霉菌属、犁头霉属、被孢霉属、小坎宁安霉属(cunninghamellaspp)、瓶霉属、链格孢菌属、知菌弯孢霉属(curvulariaspp)、长蠕孢霉属、镰胞菌属、曲霉菌属、青霉菌属、链核盘菌属、丝核菌属、拟青霉属、皮司霉属和枝孢霉属。22.衍生自原生动物的蛋白质和肽可以是原生动物抗原。23.所述原生动物抗原可以衍生自原生动物，所述原生动物选自由以下组成的组：痢疾变形虫、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、卡耶塔环孢子球虫和弓形体。24.所述治疗性生物分子可以是衍生自植物的蛋白质和肽。优选地，所述蛋白质和肽是植物抗原。所述植物抗原可以衍生自蓖麻。25.在另一实施方案中，所述治疗性生物分子可以是免疫原或抗原。优选地，所述免疫原或抗原是肿瘤免疫原或抗原或癌症免疫原或抗原。所述肿瘤免疫原和抗原可以是含肽的肿瘤抗原，如多肽肿瘤抗原或糖蛋白肿瘤抗原。26.所述肿瘤抗原可是(a)与癌细胞相关的全长分子、(b)其同系物和修饰的形式，包括具有缺失、添加和/或取代部分的分子、和(c)其片段。27.合适的肿瘤免疫原包括：由cd8 淋巴细胞识别的i类限制性抗原或由cd4 淋巴细胞识别的ii类限制性抗原。28.所述肿瘤抗原可是与癌症相关的抗原，所述癌症选自由以下组成的组：睾丸癌、黑色素瘤、肺癌、头颈癌、nsclc、乳腺癌、胃肠癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、肾癌、肝癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌。29.所述肿瘤抗原可选自：30.(a)癌症-睾丸抗原如ny-eso-i、ssx2、scpl以及rage、bage、gage和mage家族多肽，例如，gage-1、gage-2、mage-1、mage-2、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6和mage-12(例如，其可以用于解决黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、nsclc，乳腺肿瘤、胃肠肿瘤和膀胱肿瘤)；31.(b)突变的抗原，例如，p53(与多种实体瘤，例如结直肠癌、肺癌、头颈部癌相关)、p21/ras(与例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌相关)、cdk4(与例如黑色素瘤相关)、mum1(与例如黑色素瘤相关)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(与例如头颈癌相关)、cia0205(与例如膀胱癌相关)、hla-a2-r1701、β连环蛋白(与例如黑色素瘤相关)、tcr(与例如t-细胞非霍奇金斯淋巴瘤相关)、bcr-abl(与例如慢性髓性白血病相关)、磷酸丙糖异构酶、kia0205、cdc-27和ldlr-fut；32.(c)过表达的抗原，例如半乳糖凝集素4(与例如结直肠癌相关)、半乳糖凝集素9(与例如霍奇金病相关)、蛋白酶3(与例如慢性粒细胞白血病相关)、wt1(与例如多种白血病相关)、碳酸酐酶(与例如肾癌相关的)、醛缩酶a(与例如肺癌相关)、prame(与例如黑色素瘤相关的)、her-2/neu(与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌相关)、甲胎蛋白(与例如肝癌相关)、ksa(与例如结直肠癌相关)、胃泌素(与例如胰腺癌和胃癌相关)、端粒酶催化蛋白、muc-i(与例如乳腺癌和卵巢癌相关)、g-250(与例如肾细胞癌相关)、p53(与例如乳腺癌、结肠癌相关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌和诸如如结直肠癌的胃肠癌症相关)33.(d)共有抗原(sharedantigen)，例如，黑色素瘤-黑色素细胞分化抗原，如mart-1/melana、gploo、mc1r、促黑色素细胞激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/trpl和酪氨酸酶相关蛋白-2/trp2(与例如黑色素瘤相关)；34.(e)前列腺相关的抗原，如pap、psa、psma、psh-pl、psm-pl、psm-p2，与例如前列腺癌相关；和/或35.(f)免疫球蛋白个体基因型(例如，与骨髓瘤和b细胞淋巴瘤相关)。36.所述治疗性生物分子可以是真核生物多肽。在一个实施方案中，所述真核生物多肽是哺乳动物多肽。所述哺乳动物多肽可以选自由以下组成的组：酶；酶抑制剂；激素；免疫系统蛋白质；受体；结合蛋白；转录或翻译因子；肿瘤生长抑制蛋白；结构蛋白；和血蛋白。37.所述酶可以选自由以下组成的组：凝乳酶；胃脂肪酶；组织纤溶酶原激活物；链激酶；胆固醇生物合成或降解甾体生成酶；激酶；磷酸二酯酶；甲基酶；去甲基酶；脱氢酶；纤维素酶；蛋白酶；脂肪酶；磷脂酶；芳香酶；细胞色素；腺苷酸或鸟苷酸环化酶和神经酰胺酶。38.所述酶抑制剂可以是金属蛋白酶的组织抑制剂(timp)。所述激素可以是生长激素。39.所述免疫系统蛋白可以选自由以下组成的组：细胞因子；趋化因子；淋巴因子；促红细胞生成素；整合素；地址素；选择素；归巢受体；t细胞受体和免疫球蛋白。40.所述细胞因子可以是白细胞介素，例如il-2、il-4和/或il-6；集落刺激因子(csf)；粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)或肿瘤坏死因子(tnf)。41.所述趋化因子可以是巨噬细胞炎症蛋白-2和/或纤溶酶原激活物。42.所述淋巴因子可以是干扰素。43.所述免疫球蛋白可以是天然的、经修饰的或嵌合的免疫球蛋白或其片段。优选地，免疫球蛋白是具有双重活性的嵌合免疫球蛋白，如抗体酶或抗体-毒素嵌合体。44.所述激素可以选自由以下组成的组：胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、促激素、泌乳素、催产素、多巴胺、牛生长激素、瘦素、生长激素(例如，人生长激素)、生长因子(例如表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子等)。45.所述受体可以是类固醇激素受体或肽受体。优选地，所述受体是生长因子受体。46.所述结合蛋白可以是生长因子结合蛋白。47.所述肿瘤生长抑制蛋白质可以是抑制血管生成的蛋白质。48.所述结构蛋白可以选自由以下组成的组：胶原蛋白；丝心蛋白；纤维蛋白原；弹性蛋白；微管蛋白；肌动蛋白和肌球蛋白。49.所述血蛋白可以选自由以下组成的组：凝血酶；血清白蛋白；因子vii；因子viii；胰岛素；因子ix；因子x；组织纤溶酶原激活物；蛋白c；血管性假血友病因子；抗凝血酶iii；葡糖脑苷脂酶；促红细胞生成素粒细胞菌落刺激因子(gcsf)或经修饰的因子viii；和抗凝血剂。50.在一个优选的实施方案中，所述治疗性生物分子是能够调节淋巴内稳态的细胞因子，优选地为参与并优选诱导或增强t细胞的发育、启动、扩增、分化和/或存活的细胞因子。因此，优选地，所述细胞因子是白细胞介素。最优选il-2、il-7、il-12、il-15或il-21。51.所述治疗性生物分子可以是能够增强将体细胞重编程为具有干细胞特性的细胞的蛋白质。52.能够增强将体细胞重新编程为具有干细胞特性的细胞的蛋白质可以选自由以下组成的组：oct4、sox2、nanog、lin28、p53、art-4、bage、ss-连环蛋白/m、bcr-ablcamel、cap-1、casp-8、cdc27/m、cd4/m、cea、claudin-12、c-myc、ct、cyp-b、dam、elf2m、etv6-aml1、g250、gage、gnt-v、gaploo、hage、her-2/neu、hpv-e7、hpv-e6、hast-2、htert(或htrt)、lage、ldlr/fut、mage-a、mage-b、mage-c、mart-l/melan-a、mc1r、肌球蛋白/m、muc1、mum-1,-2,-3、na88-a、nf1、ny-eso-1、ny-br-1、pl90minorbcr-abl、plac-1、pml/rara、prame、蛋白酶3、psa、psm、rage、ru1或ru2、sage、sart-1或sart-3、scgb3a2、scp1、scp2、scp3、ssx、survivin、tel/aml1、tpi/m、trp-1、trp-2、trp-2/int2、tpte和wt，优选wt-1。53.优选地，mage-a选自由以下组成的组：mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11或mage-a12。54.优选地，能够增强将体细胞重编程为具有干细胞特性的蛋白质是oct4、sox2、lf4、c-myc、nanog、lin28。55.所述治疗性生物分子可以是用于离体修饰细胞以用于细胞疗法适应症的生物分子。因此，优选的治疗性生物分子可以选自由免疫球蛋白、t细胞受体和nk受体组成的组。56.所述治疗性生物分子可以是能够调节内源宿主基因表达的rna分子，例如干扰rna，如小rna、sirna或microrna。57.优选地，所述rna构建体包含编码至少一种先天抑制剂蛋白(iip)的基因，所述先天抑制剂蛋白能够减少或阻断对rna的先天免疫反应。优选通过iip通过减少或阻断由含有本发明的rna构建体的宿主细胞产生的rna(优选长rna(本领域技术人员将理解为意指长度为至少1kb的rna)或dsrna)的识别实现减少或阻断对rna的先天免疫反应。更优选地，先天抑制剂蛋白是一种先天抑制蛋白，使得能够减少或阻断对rna优选第一方面的rna构建体的rna的先天反应。先天抑制剂蛋白能够减少或防止细胞溶质sarna被模式识别受体的识别，这种识别导致干扰素调节因子3和7(irf3和irf7)以及nf-κb转录因子的激活，直接触发一系列抗病毒基因(例如，已知抑制sarna表达的ifit1-3、mx1、mx2)、其产物协调先天免疫反应的促炎基因以及任何干扰素依赖性级联上游的经典ifn刺激基因(isg)的直接激活。通过诱导i型和iii型干扰素可增强这些途径，所述i型和iii型干扰素提供进一步放大许多抗病毒反应的正反馈回路。58.所述rna可以是单链rna或双链rna。优选地，所述rna是sarna。59.所述至少一种先天抑制剂蛋白能够：(i)减少或阻断黑色素瘤分化相关蛋白5(mda5)的作用，例如通过阻止mda5的寡聚化以及mda5与rna的结合，和/或(ii)阻断或减少pact与rna的结合，也可以称为pkr激活蛋白与rna的结合。本领域技术人员将理解，这些传感蛋白(sensor)传输信号以将信号转导至下游线粒体接合体、线粒体抗病毒信号传导(mavs)激活下游级联，包括转录因子(nf-κb、irf-3、irf-7)的激活。这反过来导致适当的抗病毒信号反应和编码具有抗病毒活性的分子的i型干扰素刺激基因(包括已知抑制sarna表达的ifit1)的激活。60.阻断mda5作用的至少一种先天抑制剂蛋白可以选自由以下组成的组：副粘病毒v蛋白、柯萨奇病毒a16、柯萨奇病毒a6和肠道病毒d68病毒的3c蛋白、双rna病毒的vp3蛋白、猪δ冠状病毒的辅助蛋白ns6；和脑心肌炎病毒的2c蛋白；及其直系同系物。61.优选地，阻断mda5作用的所述至少一种先天抑制剂蛋白是副粘病毒v蛋白。最优选地，阻断mda5作用的所述至少一种先天抑制剂蛋白是副流感病毒5型v蛋白(piv5v)。62.阻断或减少pact与rna的结合的所述至少一种先天抑制剂蛋白可以选自由以下组成的组：任何冠状病毒的orf4a(ns4a)、任何冠状病毒的orf3b或小鼠肝炎病毒和sars(冠状病毒)的核衣壳蛋白；及其直系同系物。63.优选地，orf4a(ns4a)是中东呼吸综合征冠状病毒mers冠状病毒(orf4a)。64.优选地，冠状病毒orf3b是sars-c0v2orf3b。65.以下提供piv5v、orf4a和orf3b的每个的蛋白质、dna和rna序列。66.在一个实施方案中，本文提供为seqidno：11的piv5v多肽，如下：[0067][0068]相应地，优选地，piv5v多肽包含基本上如seqidno：11所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：11或其生物活性变体或片段的rna核苷酸序列。[0069]在一个实施方案中，piv5v多肽由seqidno：12的核苷酸序列编码，如下：[0070][0071]相应地，优选地，piv5v多肽由基本上如seqidno：12所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0072]因此，所述rna构建体可包含seqidno：47的rna核苷酸序列，如下：[0073][0074]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：47所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0075]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：15的mers-covorf4a多肽，如下：[0076][0077]相应地，优选地，mers-covorf4a多肽包含基本上如seqidno：15所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：15或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0078]在一个实施方案中，mers-covorf4a多肽由seqidno：16的核苷酸序列编码，如下：[0079][0080]相应地，优选地，mers-covorf4a多肽由基本上如seqidno：16所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0081]因此，所述rna构建体可包含seqidno：48的rna核苷酸序列，如下：[0082]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：48所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0083]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：20的sars-cov-2orf3b多肽，如下：[0084][0085]相应地，优选地，sars-cov-2orf3b多肽包含基本上如seqidno：20所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：20或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0086]在一个实施方案中，sars-cov-2orf3b多肽由seqidno：55的核苷酸序列(登陆号.nc_045512.2；核苷酸25814-26050)编码，如下：[0087][0088]相应地，优选地，sars-cov-2orf3b多肽由基本上如seqidno：55所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0089]因此，所述rna构建体可包含seqidno：56的rna核苷酸序列，如下：[0090][0091]相应地，因此，优选地，rna构建体包含基本上如seqidno：56所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0092]在另一实施方案中，所述至少一种先天抑制剂蛋白质可以能够抑制mda5激活的下游通路或阻断dsrna的mda/pact识别的下游通路。[0093]能够抑制mda5激活的下游通路或阻断dsrna的mda/pact识别的下游通路的所述至少一种先天抑制剂蛋白可以选自由以下组成的组：hsv-2us1；hsv-1us1；hsv-1us11；ov20.0l；bvdvnpro；兰加特病毒ns5；和流感ns1。[0094]本领域技术人员将理解，能够抑制mda5激活的下游通路或阻断dsrna的mda/pact识别的下游通路的所述至少一种先天抑制剂蛋白可以与阻断mda5的作用的所述至少一种先天抑制剂蛋白和/或阻断或减少pact与rna的结合的所述至少一种先天抑制剂蛋白组合使用。[0095]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：1所示的hsv-2us1多肽，如下：[0096][0097]相应地，优选地，hsv-2us1多肽包含基本上如seqidno：1所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：1或其生物活性变体或片段的rna核苷酸序列。[0098]在一个实施方案中，hsv-2us1多肽由seqidno：2的核苷酸序列编码，如下：[0099][0100]相应地，优选地，hsv-2us1多肽由基本上如seqidno：2所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0101]因此，所述rna构建体可包含seqidno：42的rna核苷酸序列，如下：[0102][0103]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：42所示的rna核苷酸序列或其生物活性变体或片段。[0104]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：3所示的hsv-1us1多肽，如下：[0105][0106]相应地，优选地，hsv-1us1多肽包含基本上如seqidno：3所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：3或其生物活性变体或片段的rna核苷酸序列。[0107]在一个实施方案中，hsv-1us1多肽由seqidno：4的核苷酸序列编码，如下：[0108][0109]相应地，优选地，hsv-1us1多肽由基本上如seqidno：4所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0110]因此，所述rna构建体可包含seqidno：43的rna核苷酸序列，如下：[0111][0112]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：43所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0113]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：5所示的hsv-1us11多肽，如下：[0114][0115]相应地，优选地，hsv-1us11多肽包含基本上如seqidno：5所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：5或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0116]在一个实施方案中，hsv-1us11多肽由seqidno：6的核苷酸序列编码，如下：[0117][0118]相应地，优选地，hsv-1us11多肽由基本上如seqidno：6所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0119]因此，所述rna构建体可包含seqidno：44的rna核苷酸序列，如下：[0120][0121]相应地，因此，优选地，rna构建体包含基本上如seqidno：44所示的rna核苷酸序列或其变体或片段编码。[0122]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：7的ov20.0l多肽，如下：[0123][0124]相应地，优选地，ov20.0l多肽包含基本上如seqidno：7所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：7或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0125]在一个实施方案中，ov20.0l多肽由seqidno：8的核苷酸序列编码，如下：[0126][0127]相应地，优选地，ov20.0l多肽由基本上如seqidno：8所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0128]因此，rna构建体可包含seqidno：45的rna核苷酸序列，如下：[0129][0130]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：45所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0131]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：9所示的bvdvnpro多肽，如下：[0132][0133]相应地，优选地，bvdvnpro多肽包含基本上如seqidno：9所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：9或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0134]在一个实施方案中，bvdvnpro多肽由seqidno：10的核苷酸序列编码，如下：[0135][0136]相应地，优选地，bvdvnpro多肽由基本上如seqidno：10所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0137]因此，所述rna构建体可包含seqidno：46的rna核苷酸序列，如下：[0138]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：46所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0139]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：17的兰加特ns5多肽，如下：[0140]相应地，优选地，兰加特ns5多肽包含基本上如seqidno：17所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：17或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0141]在一个实施方案中，兰加特ns5多肽由seqidno：18的核苷酸序列编码，如下：[0142][0143]相应地，优选地，兰加特病毒ns5多肽由基本上如seqidno：18所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0144]因此，所述rna构建体可包含seqidno：49的rna核苷酸序列，如下：[0145]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：49所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0146]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：13的流感ns1多肽(登录号dq508893)如下：[0147][0148]因此，优选地，所述流感ns1多肽包含基本上如seqidno：13所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：13或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0149]在一个实施方案中，所述流感ns1多肽由seqidno：14的核苷酸序列编码，如下：[0150][0151]相应地，优选地，所述流感ns1多肽由基本上如seqidno：14所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0152]因此，所述rna构建体可包含seqidno：19的rna核苷酸序列，如下：[0153][0154]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：19所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0155]优选地，所述先天抑制剂蛋白选自由以下组成的组：hsv-2us1；hsv-1us11；ov20.0l；bvdvnpro；piv5v；mers-covorf4a；sars-cov-2orf3b；兰加特病毒ns5和流感ns1。[0156]优选地，所述先天抑制剂蛋白选自由以下组成的组：hsv-2us1；hsv-1us11；ov20.0l；bvdvnpro；piv5v；mers-covorf4a；和兰加特病毒ns5。[0157]优选地，所述先天抑制剂蛋白选自由以下组成的组：hsv-2us1；hsv-1us11；ov20.0l；bvdvnpro；piv5v；和mers-covorf4a。[0158]如实施例所述，通过筛选多种多样的iip的过程，本发明人鉴定了两种高度有效的iip，令人惊讶地它们能够在体外和体内显著增强sarna的表达：副流感病毒5型v蛋白(piv-5)-mda5激活的抑制剂和中东呼吸综合征(mers)冠状病毒orf4a-pact/mda激活的抑制剂。本发明人使用了这两种新型iip，即piv-5和mers-covorf4a，先前它们没有被用来减弱复制子rna的先天感知。本发明人已经表明，这些构建体可以成为使人类中的rna疫苗和疗法具有更高的效力的下一代rna复制子。本发明人认为，无论是在甲病毒、小核糖核酸病毒、黄病毒还是冠状病毒的复制子中表达，它们都将具有重要的实用性。[0159]因此，最优选地，所述先天抑制剂蛋白是piv-5和/或mers-covorf4a，本领域技术人员将理解它也可以被称为ns4a。[0160]这样的构建体与现有技术中描述的构建体相比显示出许多优势，包括：[0161]i)将piv-5和orf4a蛋白直接插入veev复制子，从而实现vpii蛋白和目的基因的双蛋白表达。[0162]ii)相对于提供一条编码目的基因(goi)(即治疗性生物分子)、另一条编码iip的两条不同rna链，递送一条链，从而确保rna和先天抑制剂蛋白共同定位；[0163]iii)iip抑制rna的先天感知，从而实现更高的蛋白质表达；[0164]iv)iip表达本身由于与goi在亚基因组链上共同表达而被自扩增；和/或[0165]v)与传统的veevrna复制子构建体相比，提高了蛋白质表达量和持续时间两者。[0166]编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列可以设置在rna构建体或复制子序列内的任何地方，例如可以将编码所述至少一种目的肽或蛋白的序列设置在编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'或3'处。[0167]然而，优选地，编码所述至少一种目的肽或蛋白的序列设置在编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'处。[0168]优选地，根据第一方面的rna构建体包含基因组的或亚基因组的至少一个启动子。优选地，所述启动子是亚基因组启动子。[0169]本领域技术人员可以理解，亚基因组启动子是指与编码所述至少一种治疗性生物分子和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列可操作地连接的启动子，从而实现编码治疗性生物分子和至少一种先天抑制剂蛋白的核苷酸序列的转录。[0170]优选地，所述亚基因组启动子是26s，本文提供为seqidno：57的26s，如下：[0171][0172]因此，优选的启动子(优选地亚基因组启动子)是基本上如seqidno：57所示或其变体或片段。[0173]在一个实施方案中，同一启动子与编码所述至少一种目的肽或蛋白质的序列和编码所述至少一种先天抑制剂的序列可操作的连接。[0174]本发明人的设计(其中在一条链上编码goi(即治疗性生物分子)和iip两者)有利地实现了使用更小剂量的rna，因为它确保了在感知rna的同一细胞中表达而且还可以复制蛋白质，因此具有放大先天抑制成分的另外方面。[0175]因此，在一个实施方案中，将启动子设置在编码所述目的肽或蛋白质(即治疗性生物分子)的序列和编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'处，使得所述启动子与这两条序列可操作的连接。[0176]在另一实施方案中，第一启动子与编码所述至少一种目的肽或蛋白质(即治疗性生物分子)的序列可操作的连接，第二启动子与编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列可操作的连接。[0177]所述rna构建体可编码至少两个、三个、四个或五个iip。在其中有一个以上编码先天抑制物蛋白的序列的实施方案中，单个启动子可与编码先天抑制物蛋白的所有序列可操作的连接。或者，启动子可以与编码先天抑制物蛋白的至少一个其他序列中的每个连接，使得每个先天抑制物蛋白可操作的与独立的启动子连接。在这个实施方案中，独立的启动子可以包含相同的启动子序列或不同的启动子序列。在另一实施方案中，将不同的启动子与编码先天抑制剂蛋白的每个序列可操作的连接。[0178]所述rna构建体可进一步包括设置在编码所述至少一种目的肽或蛋白质(即治疗性生物分子)的序列和编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列之间的接头。[0179]在一个实施方案中，所述连接序列包含编码肽间隔的序列，该肽间隔被配置为被消化以由此将目的基因编码的所述至少一种治疗性生物分子和所述至少一种先天抑制剂蛋白分离。因此，优选地，将间隔序列设置在编码所述至少一种目的肽或蛋白的序列和编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列之间。[0180]因此，所述间隔物序列优选为可切割肽，例如2a肽。合适的2a肽包括猪捷申病毒-12a(p2a)-atnfsllkqagdveenpgp(seqidno：21)、东亚细亚(thoseaasigna)病毒2a(t2a)-qctnyallklagdvesnpgp(seqidno：22)、马鼻炎a病毒2a(e2a)以及口蹄疫病毒2a(f2a)vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno：23)。优选地，所述2a肽是东亚细亚病毒2a(t2a)。[0181]在另一实施方案中，可切割肽是自切割肽。优选地，所述自切割肽是弗林蛋白酶/2a肽。可以将弗林蛋白酶序列设置在2a序列的3'或5'处。然而，优选地，将弗林蛋白酶序列设置在2a序列的5'处，且优选具有设置在弗林蛋白酶和2a序列之间的gsg间隔。[0182]本领域技术人员将理解，弗林蛋白酶是位于分泌通路中(主要在高尔基体和跨高尔基体网络中)的普遍存在的钙依赖性原蛋白转化酶，在特定识别序列-标准r-x-r/k/x-r(seqidno：24)处切割前体蛋白，在最后的r后切割原蛋白。因此，在一个实施方案中，弗林蛋白酶序列是r-x-r/k/x-r。然而，优选地，弗林蛋白酶序列是优化的序列rrrrrr(seqidno：25)-gsg序列。优选地，gsg间隔设置在弗林蛋白酶序列的3'和2a序列的5'处。[0183]因此，优选地，所述间隔序列是弗林蛋白酶/t2a，如ncbi参考序列genbank：aac97195.1所提供的，本文提供为seqidno：26的间隔物序列，如下：[0184][0185]因此，优选地，所述间隔序列包含基本上如seqidno：26所示的氨基酸序列，或其变体或片段。[0186]在其中rna构建体或复制子包含一个以上编码先天抑制剂蛋白的序列的实施方案中，所述复制子可以具有设置在每个编码先天抑制剂蛋白的序列之间或设置在仅一些iip之间的连接序列。[0187]在一个实施方案中，所述至少一个编码治疗性生物分子的序列和所述至少一个先天抑制剂蛋白可以被后其后是够启动下游序列翻译的内部核糖体进入位点(ires)序列的终止密码子隔开。典型的ires序列包括诸如脑心肌炎病毒或血管内皮生长因子和l型胶原诱导蛋白(vcip)的ires序列的那些序列，并且是本领域技术人员已知的。因此，优选地，ires序列设置在编码所述至少一种目的肽或蛋白的序列和编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列之间。在使用多个编码所述至少一个先天抑制剂蛋白的序列时，间隔序列可以包括已知切割序列和/或ires序列的组合。[0188]在另一实施方案中，编码所述至少一种治疗性生物分子和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列可以被其后是能够启动下游序列转录的第二亚基因组启动子序列的终止密码子隔开。[0189]所述rna构建体可以编码至少一种非结构蛋白(nsp)，所述至少一种nsp设置在编码所述至少一种目的肽或蛋白和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'或3'处。优选地，编码所述至少一种nsp的序列设置在编码所述目的肽或蛋白质和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'处。因此，优选地，编码所述至少一种nsp的序列设置在rna构建体的5'端。[0190]由所述rna构建体编码的至少一种非结构蛋白可以是rna聚合酶nsp4。优选地，所述构建体编码nsp1、nsp2、nsp3和nsp4。本领域技术人员将理解，nsp1是病毒加帽酶且是复制子复合物(rc)的膜锚定点，nsp2是一种rna解旋酶并为负责ns多聚蛋白加工的蛋白酶。nsp3与几种宿主蛋白相互作用并可以调节蛋白的多聚-和单聚-adp-核糖基化，nsp4是核心病毒rna依赖的rna聚合酶。[0191]在一个实施方案中，本文提供了为seqidno：27的nsp1，如下：[0192][0193]相应地，nsp1优选包含基本上如seqidno：27所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。[0194]在一个实施方案中，nsp1由seqidno：28中定义的核苷酸序列编码，如下：[0195][0196]相应地，nsp1优选地由基本上如seqidno：28中所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0197]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：50所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0198][0199]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：29的nsp2，如下：[0200][0201]相应地，nsp2优选包含基本上如seqidno：29所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。[0202]在一个实施方案中，nsp2由seqidno：30中定义的核苷酸序列编码，如下：[0203][0204]相应地，优选地，nsp2由基本上如seqidno：30中所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0205]因此，所述rna构建体可以包含seqidno：51，如下：[0206][0207]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：51所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0208]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：31的nsp3，如下：[0209][0210]相应地，nsp3优选包含基本上如seqidno：31所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。[0211]在一个实施方案中，nsp3由seqidno：32中定义的核苷酸序列编码，如下：[0212]相应地，优选地，nsp3由基本上如seqidno：32中所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0213]因此，所述rna构建体可以包含seqidno：52，如下：[0214][0215]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：52所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。在一个实施方案中，本文提供为seqidno：33的nsp4，如下：[0216][0217]相应地，nsp4优选包含基本上如seqidno：33所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。[0218]在一个实施方案中，nsp4由seqidno：34中定义的核苷酸序列编码，如下：[0219][0220]相应地，优选地，nsp4由基本上如seqidno：34所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0221]因此，所述rna构建体可以包含seqidno：53，如下：[0222][0223]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：53所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0224]优选地，与存在于宿主细胞中的蛋白质一起，由本发明的rna构建体编码的非结构蛋白形成酶复合物，所述酶复合物是编码所述至少一种目的肽或蛋白质和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的基因组复制和转录所必需的。例如，所述一个或多个非结构蛋白可以编码聚合酶，以使构建体能够扩增编码所述至少一种目的肽或蛋白和所述至少一种先天抑制剂蛋白的核苷酸序列。[0225]所述宿主细胞可以是真核生物或原核生物宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是真核生物宿主细胞。更优选地，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。[0226]所述rna构建体可进一步包括设置在至少一种非结构蛋白5'处的启动子，使得启动子与编码所述至少一种非结构蛋白的序列可操作的连接，并使所述至少一种非结构蛋白能够在宿主细胞中表达。[0227]优选地，所述启动子包含5'utr保守序列元件，在本文中可以被称为seqidno：54，如下：[0228][0229]相应地，优选地，utr设置在所述至少一种非结构蛋白的5'处，并包含基本上如seqidno：54所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0230]优选地，复制子包含polya尾。优选地，polya尾设置在复制子的3'端。复制子可进一步包括5'帽。在本发明的上下文中，术语“5'-帽”包括5'-帽类似物，其类似于rna帽结构并被修饰为，优选地在体内和/或在细胞中，如果连接在rna上具有稳定rna和/或增强rna翻译的能力。[0231]可以在所述5'-帽存在的情况下通过体外转录dna模板得到带有5'-帽的rna，其中所述5'-帽被共同转录地掺入到生成的rna链中，或者可以例如，通过体外转录等方式生成所述rna，5'-帽可以通过使用加帽酶(例如牛痘病毒的加帽酶)连接到转录后的rna上。在加帽的rna中，(加帽的)rna分子的第一个碱基的3'位置通过磷酸二酯键与rna分子的后续碱基(“第二碱基”)的5'位置连接。[0232]在一个实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列和至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列。[0233]在另一实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、和至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列。[0234]在又一实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列和polya尾。[0235]在再一实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列，任选地在每个至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列之间的间隔序列和polya尾。[0236]在另又一个实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，5'帽，启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列，任选地在每个至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列之间的间隔序列以及polya尾。[0237]在再又一个实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，5'帽、启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列和polya尾。[0238]在又另一个实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，5'帽、启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、编码至少一种先天抑制剂蛋白的序列，任选地在每个编码至少一种先天抑制剂蛋白的序列之间的间隔序列和polya尾。[0239]据认为piv5的v蛋白直接与mda5结合防止寡聚，而据认为orf4a阻断pact与dsrna的结合。本发明人将这些蛋白编码基因掺入sarna中，在目的基因(goi)(即治疗性生物分子)之后，由t2a切割位点分隔，以产生能够有利地绕过先天感知机制的构建体。将goi和iip配对成在表达时被内源性蛋白酶(t2a)切割的单个开放阅读框，使两者以设定比例和相同动力学在同一细胞内的表达最大化。[0240]因此，优选地，所述rna构建体，从5'至3'包含，5'帽、包含51个核苷酸保守序列元件的启动子、nsp1、nsp2、nsp3v、nsp4、亚基因组启动子26s、编码治疗性生物分子的序列、t2a间隔序列、编码piv5v和/或mers-covorf4a的序列和polya尾。[0241]因此，在一个实施方案中，所述rna构建体可以包含seqidno：38或由seqidno：38组成，如下：[0242][0243][0244][0245][0246]相应地，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：38所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0247]因此，在另一实施方案中，所述rna构建体可以包含seqidno：39或由seqidno：39组成，如下：[0248][0249][0250][0251][0252]因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：39中所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0253]在本发明的第二方面，提供了编码第一方面的rna构建体的核酸序列。[0254]在一个实施方案中，所述核酸序列可以包含seqidno：40或由seqidno：40组成，如下：[0255][0256][0257][0258][0259]相应地，优选地，所述核酸序列包含基本上如seqidno：40所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0260]在一个实施方案中，所述核酸序列可以包含seqidno：41或由seqidno：41组成，如下：[0261][0262][0263][0264][0265]相应地，优选地，所述核酸序列包含基本上如seqidno：41所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0266]在第三方面，提供了包含根据第二方面的核酸序列的表达盒。[0267]本发明的核酸序列优选被包含在重组载体中，例如用于递送到目的宿主细胞中以能够生产rna构建体的重组载体中。[0268]因此，在第四方面，提供了包含根据第三方面的表达盒的重组载体。[0269]在一个实施方案中，所述载体可包括seqidno：35的核酸序列，如下，其中“goi”代表治疗性生物分子编码序列的位置：[0270][0271][0272][0273]相应地，优选地，所述载体包含基本上如seqidno：35所示的核苷酸序列或其变体或片段。[0274]在一个实施方案中，所述载体包含编码包含mers-covorf4a的rna构建体的核酸序列，所述载体可以包含seqidno：36的核酸序列，如下，其中“goi”代表治疗性生物分子编码序列的位置：[0275][0276][0277][0278]相应地，优选地，所述载体包含基本上如seqidno：36所述的核苷酸序列或其变体或片段。[0279]在一个实施方案中，所述载体包含编码包含piv5的rna构建体的核酸序列，所述载体可以包括seqidno：37的核酸序列，如下，其中“goi”代表编码治疗性生物分子的序列的位置：[0280][0281][0282][0283][0284]相应地，优选地，所述载体包含基本上如seqidno：37所示的核苷酸序列或其变体或片段。[0285]可使用图7或8中所示的dna质粒作为模板制作本发明的sarna构建体。然后可通过使用聚合酶(如t7聚合酶)进行体外转录制作rna拷贝，t7启动子显示在图7或8的质粒图中的sarna的上游。因此，可以使用如图7或8所示的具有seqidno：35-37中任一所示的核酸序列或其变体或片段的dna质粒作为模板来制作第一方面的sarna构建体。当然，可以理解的是，可以用其他rna聚合酶，例如sp6或t3聚合酶来代替t7聚合酶，在这种情况下，sarna构建体可以代替的包含sp6或t3启动子。[0286]编码第一方面的rna构建体的第四方面的载体例如可以是质粒、粘粒或噬菌体和/或病毒载体。这样的重组载体在本发明的递送系统中是非常有用的，用于用核苷酸序列转化细胞。核苷酸序列优选是dna序列，正是该dna序列编码形成第一方面的rna构建体的rna序列。[0287]编码第一方面的rna构建体的重组载体也可以包含其他功能元件。例如，它们可以进一步包含各种其他功能元件，包括用于在宿主细胞中引入载体后启动转基因表达的合适启动子。例如，载体优选能够在宿主细胞(如细菌细胞)的细胞核中自主复制。在这种情况下，重组载体中可能需要诱导或调节dna复制的元件。或者，重组载体可被设计成使得其整合到宿主细胞的基因组中。在这种情况下，设想有利于定向整合(如通过同源重组)的dna序列。合适的启动子可包括sv40启动子、cmv、ef1a、pgk、病毒长末端重复以及可诱导启动子，如四环素可诱导系统等。表达盒或载体还可包括终止子，如β球蛋白、sv40聚腺苷酸序列或合成聚腺苷酸序列。重组载体还可包括启动子或调节子或增强子，以根据需要控制核酸的表达。[0288]载体还可以包含编码在克隆过程中可用作可选择标记的基因的dna，即，以实现已经转染或转化的细胞的选择，并实现含有整合了异源dna的载体的细胞的选择。例如，设想氨苄青霉素、新霉素、嘌呤霉素或氯霉素抗性。图7和图8所示的载体包含对在细菌中选择质粒很有用的氨苄青霉素抗性标记。另外，可选择的标记基因可以在与含有转基因的载体同时使用的不同的载体中。表达盒或载体还可以包含参与调节核苷酸序列表达或用于将表达的多肽靶向到宿主细胞的某个部分的dna。[0289]可以通过适当的方式，例如直接内吞摄取将纯化的载体直接插入宿主细胞。可以通过转染、感染、电穿孔、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击(ballisticbombardment)将载体直接引入宿主细胞(如真核生物细胞或原核生物细胞)。另外，可以用粒子枪将本发明的载体直接引入宿主细胞。[0290]核酸分子可以(但不一定)是被整合到宿主细胞的dna中的一种核酸分子。可以稳定地转化未分化的细胞，从而导致产生基因修饰的子细胞(在这种情况下，可能需要如用特定的转录因子或基因激活剂来调节受试者中的表达)。另外，可以将递送系统设计成有利于分化细胞的不稳定或瞬时转化。在这种情况下，调节表达可能不那么重要，因为当转化的细胞死亡或停止表达蛋白质时，dna分子的表达将停止。[0291]另外，在不将核酸分子整合到载体中的情况下，递送系统可以向宿主细胞提供核酸分子。例如，核酸分子可以被整合到脂质体或病毒颗粒中。另外，“裸”核酸分子可以通过适当的方式(例如直接内吞摄取)插入宿主细胞。[0292]在第五方面，提供了一种药物组合物，其包括第一方面的rna构建体、第二方面的核酸序列、第三方面的表达盒或第四方面的载体以及药学上可接受的赋形剂。[0293]在第六方面，提供了一种用于制造根据第五方面的药物组合物的方法，该方法包括使第一方面的rna构建体、第二方面的核酸序列、第三方面的表达盒或第四方面的载体与药学上可接受的赋形剂接触。[0294]在第七方面，提供了一种制备第一方面的rna构建体的方法，该方法包括：[0295]a)i)将第四方面的载体引入宿主细胞中；以及[0296]ii)在导致产生第一方面的rna构建体的条件下培养宿主细胞；或者[0297]b)转录来自根据第四方面的载体的rna构建体。[0298]步骤a)的宿主细胞可以是真核生物或原核生物宿主细胞。优选地，宿主细胞是真核生物宿主细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，如人胚肾293细胞或中国仓鼠卵巢(cho)细胞。步骤(b)可以在体外或体内进行，优选在体外进行。[0299]在本领域中合适的体外转录方法是众所周知的，本领域的技术人员也是知道的。例如，如《分子克隆，实验室手册》第二版(1989)cnolan编辑，冷泉港实验室出版社中所述的。[0300]第一方面的rna复制子特别适合用于治疗。[0301]虽然本发明人设想将通过体外转录产生在体内用于治疗的第一方面的rna构建体，但本领域技术人员将认识到，通过在体内将根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体递送到受试者体内，也可以在受试者中体内地产生用于治疗的rna构建体。[0302]因此，根据第八方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用作药物或用于治疗中。[0303]在本发明的第九方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用于预防、改善或治疗原生生物、真菌、细菌或病毒感染中。[0304]原生动物、真菌、细菌或病毒感染可能是如第一方面定义的原生动物、真菌、细菌或病毒的感染。[0305]在本发明的第十方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用于预防、改善或治疗癌症。[0306]癌症可以如第一方面所定义。[0307]在本发明的第十一方面，提供了一种治疗原生动物、真菌、细菌或病毒感染的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物。[0308]待治疗的原生动物、真菌、细菌或病毒感染可以是如第一方面定义的原生动物、真菌、细菌或病毒的感染。[0309]在本发明的第十二方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物。[0310]待治疗的癌症可以如第一方面所定义。[0311]本文所述的rna构建体提供了使受试者接种疫苗以抗病毒感染和癌症的有效方法。[0312]因此，在本发明的第十三方面，提供了一种疫苗，其包含根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物。[0313]优选地，疫苗包含合适的佐剂。[0314]佐剂可以是在第一方面的rna构建体序列、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物中被编码的编码分子佐剂，或者作为佐剂掺入递送制剂中的佐剂。[0315]编码分子佐剂可以编码细胞因子(例如il-12、gm-csf、il-2、ifn-g)或效应蛋白(例如cd40l、flt-3)或微生物蛋白(例如鞭毛蛋白或霍乱毒素b)。[0316]掺入递送制剂的佐剂可选自由以下组成的组：细菌脂肽、脂蛋白和脂磷壁酸；分枝杆菌脂聚糖、酵母聚糖、孔蛋白、脂多糖、脂质a、单磷酰脂质a(mpl)、鞭毛蛋白、cpgdna、疟原虫色素、皂素(quil-a、qs-21、番茄素、iscom、iscomatrixtm)、角鲨烯基乳液、诸如pei的聚合物、卡波姆、脂质纳米颗粒和细菌毒素(ct、lt)。[0317]在本发明的第十四方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用于在受试者中刺激免疫反应。[0318]根据第一方面定义的抗原，可以刺激针对原生动物、细菌、病毒、真菌或癌症的免疫反应。[0319]根据第十五方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用于干细胞疗法中。[0320]干细胞疗法可涉及将体细胞重新编程为具有干细胞特性的细胞。[0321]通过递送能够增强体细胞向具有如第一方面定义的干细胞特性的重编程的一种或多种蛋白来重编程体细胞。[0322]根据第十六方面，提供了一种在离体或体外修饰细胞的方法，所述方法包括将根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物递送至细胞。[0323]优选地，该方法离体进行。[0324]细胞可以是真核生物细胞或原核生物细胞。优选地，细胞是真核生物细胞。更优选地，细胞是哺乳动物宿主细胞。最优选地，细胞是人细胞。[0325]优选地，经修饰的细胞适用于细胞疗法适应症。[0326]在第十七方面，提供了从第十六方面的方法获得的或可通过该方法获得的经修饰的细胞。[0327]在第十八方面，提供了第十七方面的经修饰的细胞，其用于治疗，任选地细胞疗法中。[0328]可以理解的是，根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物(本文称为活性剂)可用于药物中，该药物可作为单一疗法(即使用活性剂)用于治疗、改善或预防疾病或接种疫苗。另外，根据本发明的活性剂可以作为治疗、改善或预防疾病的已知疗法的辅助手段，或与之组合使用。[0329]取决于特别是组合物的使用方式，可以将本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物组合在具有许多不同形式的组合物。因此，例如，所述组合物可以是粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液、复合物(polyplex)、乳剂、脂质纳米颗粒(表面上具有rna或具有封装的rna)的形式或可以向需要治疗或接种疫苗的人或动物施用的任何其它合适的形式。将理解的是，根据本发明的药物的赋形剂应该是被给予该药物赋形剂的受试者能够很好地耐受的赋形剂。[0330]本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物也可被掺入到缓释或延迟释放装置中。这种装置，例如可以插在皮肤上或皮肤下，可以在几周甚至几个月内释放药物。该装置可至少位于治疗部位的附近。当需要用基因构建体或重组载体进行长期治疗并且通常需要频繁施用(例如至少每天注射)时，这种装置可能是特别有利的。[0331]然而，在优选的实施方案中，可以通过注射到血液、肌肉、皮肤或直接注射到需要治疗的部位来将根据本发明的药物施用至受试者。最优选地，药物，包括rna构建体，被注射到肌肉中。注射可以是静脉注射(团注或输注)或皮下注射(团注或输注)或皮内注射(团注或输注)或肌肉注射(团注或输注)。[0332]可以理解的是，所需的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物的量由其生物活性和生物利用度确定的，而生物利用度又取决于施用方式，rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物的理化性质以及是否作为单一疗法或在联合疗法中使用。施用的频率也将受活性剂在被治疗受试者体内的半衰期的影响。可施用的最佳剂量由本领域技术人员确定，并将随使用的具体rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物；药物组合物的强度；施用方式；以及病毒感染的类型和进展情况而变化。取决于被治疗的特定受试者的其他因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。[0333]一般来说，根据所用的活性剂，可以将日剂量为0.001μg/kg体重至10mg/kg体重或0.01μg/kg体重至1mg/kg体重的本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物用于治疗、改善或预防疾病。[0334]可以以单次施用的方式(例如，每天单次注射或吸入鼻腔喷雾)给予日剂量。另外，rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物可能需要在一天内施用两次或更多次。作为实例，可以以两个(或更多，取决于被治疗疾病的严重程度)0.07μg至700mg的日剂量(即假设体重为70kg)施用rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。接受治疗的患者可以在醒来时服用第一剂量，然后在晚上或其后间隔3或4个小时服用第二剂量(如果采用两剂量方案)。另外，可以使用缓释装置以向患者提供最佳剂量的根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物，而不需要施用重复剂量。[0335]然而，优选地，可以以每周一次的剂量，更优选的两周一次的剂量给予根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。[0336]可以将已知规程，如制药业常规采用的那些规程(如体内实验、临床试验等)，用于形成根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒或载体的特定制剂和精确治疗方案(如药剂的日剂量和施用频率)。[0337]“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的组合物和药物可用于治疗任何哺乳动物，例如牲畜(如马)、宠物，或可以用于其他兽医应用。然而，最优选地，受试者是人。[0338]rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物的“治疗有效量”是指，当对受试者施用时，改善、预防或治疗任何给定疾病所需的前述量的任何量。[0339]例如，可以使用的本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物可以为约0.0001mg至约800mg，优选地为约0.001mg至约500mg。优选地，复制子、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物的量为约0.01mg至约250mg的量，最优选地为约0.01mg至约1mg的量。优选地，以1-200μg的剂量施用根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。[0340]本文所指的“药学上可接受的赋形剂”是本领域技术人员已知的在配制药物组合物中有用的任何已知化合物或已知化合物的组合。[0341]在一个实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是固体，组合物可以是粉末或片剂的形式。固体药学上可接受的赋形剂可包括也可作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填料、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣或片剂分解剂的一种或多种物质。赋形剂也可以是封装材料。在粉末中，赋形剂是细碎的固体，其与根据本发明的细碎的活性剂混合在一起。在片剂中，活性剂(例如根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物)可与具有必要的压缩性能的赋形剂按适当比例混合并被压制成所需的形状和大小。粉末和片剂优选含有高达99％的活性剂。合适的固体赋形剂包括，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一实施方案中，药物赋形剂可以是凝胶，组合物可以是乳膏等的形式。[0342]然而，药物赋形剂可以是液体，药物组合物则是溶液的形式。液体赋形剂用于制备溶液、悬浮液、乳剂、糖浆、酏剂和压缩组合物。根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物可以溶解或悬浮于药学上可接受的液体赋形剂中，所述液体赋形剂比如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。液体赋形剂可以包含其他合适的药物添加剂，比如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服和胃肠外施用的液体赋形剂的合适实例包括水(部分含有上述添加剂，如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，如乙二醇)及其衍生物以及油(如分馏椰子油和花生油)。对于胃肠外施用，赋形剂也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。在胃肠外施用的无菌液体形式组合物中无菌液体赋形剂是有用的。压缩组合物的液体赋形剂可以是卤代烃或其他药学上可接受的喷射剂(propellant)。[0343]液体药物组合物(为无菌溶液或悬浮液)可以通过例如皮下注射、皮内注射、鞘内注射、硬膜外注射、腹膜内注射、静脉注射，特别是肌肉注射而被利用。本发明的核酸序列或表达盒可以制备成无菌固体组合物，该无菌固体组合物在施用时可以使用无菌水、生理盐水或其他适当的无菌注射介质溶解或悬浮。[0344]可以以含有其他溶质或悬浮剂(例如，足够的盐水或葡萄糖以使溶液等渗)、胆汁盐、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨醇及其酸酐与环氧乙烷共聚的油酸酯)等的无菌溶液或悬浮液的形式口服地施用本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。也可以以液体或固体组合物形式口服地施用根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。适合口服施用的组合物包括固体形式和液体形式，所述固体形式比如丸剂、胶囊、颗粒、片剂和粉剂，以及所述液体形式比如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液。用于胃肠外施用的形式包括无菌溶液、乳剂和悬浮液。[0345]可以理解的是，本发明延伸到任何核酸或多肽或其变体、其衍生物或其类似物，它们基本上包含本文提及的任何序列的氨基酸或核酸序列，包括其变体或片段。术语“基本上氨基酸/核苷酸/肽序列”、“变体”和“片段”可以是与本文提到的任一序列的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％的序列同一性，例如与seqidno：1-55等所定义的序列具有至少40％的序列同一性的序列。[0346]还设想了与本文提及的任何序列具有序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列，所述序列同一性大于65％，更优选大于70％，甚至更优选大于75％，再更优选大于80％序列同一性。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与本文提及的任何序列具有至少85％同一性，更优选至少90％同一性，甚至更优选至少92％同一性，甚至更优选至少95％同一性，甚至更优选至少97％同一性，甚至更优选至少98％同一性，和最优选与本文提及的任何序列具有至少99％同一性。[0347]本领域技术人员将理解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性，必须首先准备两个序列的比对，然后计算序列同一性值。两个序列的百分比同一性可以有不同的值，这取决于：(i)用于比对序列的方法，例如clustalw、blast、fasta、smith-waterman(在不同的程序中实现)，或来自3d比较的结构比对；(ii)比对方法使用的参数，例如局部与全局比对，使用的配对-得分矩阵(例如blosum62、pam250、gonnet等)和空位罚分，例如函数形式和常数。[0348]在进行比对之后，有许多不同的方法计算两个序列之间的百分比同一性。例如，我们可以将一致性的数量除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数量；或(v)不包括突出粘性末端(overhang)的等价位置的数量。此外，可以理解的是，百分比同一性也是高度依赖于长度的。因此，一对序列越短，可以预期偶然出现的序列同一性就越高。[0349]因此，可以理解的是，蛋白质或dna序列的精确比对是复杂的过程。普遍的多重比对程序clustalw(thompson等，1994,nucleicacidsresearch,22,4673-4680；thompson等，1997,nucleicacidsresearch,24,4876-4882)是生成本发明的蛋白质或dna多重比对的优选方法。clustalw的合适参数可以如下：对于dna比对，空位开放罚分＝15.0,空位延伸罚分＝6.66和矩阵＝identity。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝10.0,空位延伸罚分＝0.2和矩阵＝gonnet。对于dna和蛋白质比对：endgap＝-l和gapdist＝4。本领域的技术人员将意识到，可能有必要改变这些和其他参数以达到最佳序列比对。[0350]优选地，两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比一致性的计算可以根据(n/t)*100这样的比对进行计算，其中n是序列共享相同残基的位置数量，t是包括空位以及包括或不包括突出粘性末端的比较位置的总数。优选地，计算中包括突出粘性末端。因此，计算两个序列之间的百分比同一性的最优选方法包括：(i)使用clustalw程序使用合适的参数设置(例如如上所述的)准备序列比对；以及(ii)将n和t的值代入以下公式：序列同一性＝(n/t)*100。[0351]对于本领域的技术人员来说识别相似序列的其他方法是已知的。例如，基本相似的核苷酸序列将由在严格条件下与dna序列或其互补物杂交的序列编码。本发明人所说的严格条件是指在约45℃在3×氯化钠/柠檬酸钠(ssc)中核苷酸与滤膜结合的dna或rna杂交，然后在约20-65℃下在0.2×ssc/0.1％sds中洗涤至少一次。另外，基本相似的多肽可以与例如seqidno：1至57中所示的序列有至少1个，但少于5、10、20、50或100个氨基酸不同。[0352]由于遗传密码的简并性，很明显，在不对由此编码的蛋白质的序列产生实质性影响的情况下，可以改变或变化本文所述的任何核酸序列，以提供其功能性变体。合适的核苷酸变体是具有通过替换对序列内相同氨基酸进行编码的不同密码子而改变，从而产生沉默(同义)变化的那些序列。其他合适的变体是具有同源核苷酸序列但包含通过替换对与其所替换的氨基酸相似的生物物理性质的侧链的氨基酸进行编码的不同密码子以产生保守性变化而改变的序列的全部或部分序列的那些。例如，小的非极性、疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，可以理解可以用具有类似生物物理性质的氨基酸替换哪些氨基酸，本领域技术人员知道编码这些氨基酸的核苷酸序列。[0353]本文(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)描述的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可与上述任何方面进行任何组合，但其中至少一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合除外。附图说明[0354]为了更好地理解本发明，并显示如何实施本发明的实施方案，现借助实施例提及所附的附图，其中：[0355]图1显示了基于委内瑞拉马脑炎病毒(veev)骨架的自扩增rna复制子或构建体的一个实施方案的示意图。所谓的“stealthicon”载体是编码位于goi(目的基因)的上游或下游的非结构蛋白(nsp1-4)和先天抑制蛋白(iip)的sarna复制子/构建体。[0356]图2显示了基因组复制子产生由传感蛋白分子(sensormolecule)mda5和pact所识别dsrna。这些传感蛋白传递信号以激活下游级联，包括转录因子(nf-κb、irf-3、irf-7)、直接抑制rna扩增和蛋白质表达的限制因子(虚线)的激活。piv-v或orf4a的表达阻断了mda5和pact对dsrna的先天识别，从而防止了限制复制子rna的扩增和合成rna的蛋白表达的下游级联的激活。[0357]图3显示了a)在体外筛选编码iip的veev复制子。用两批含有作为报告蛋白的荧光素酶的rna转染细胞，并评估24小时后的蛋白质表达。与hek相比，已知hela和mrc5具有更完整的ifn表达通路，和b)显示为相对于野生型的表达的倍数变化的图3a的数据。[0358]图4显示了在balb/c和bl/6小鼠中使用萤火虫荧光素酶作为报告蛋白筛选编码iip的复制子(#6和#8)。已知bl/6小鼠比balb/c表达更多的ifn，因此iip在3天实现了更高的荧光素酶表达以及更长的表达，持续时间》14天。[0359]图5显示了在balb/c和bl/6小鼠中使用高斯荧光素酶蛋白作为报告蛋白筛选编码iip的复制子(#6和#8)。已知bl/6小鼠比balb/c表达更多的ifn，因此iip实现了可溶性报告蛋白更长的表达，持续时间》14天。[0360]图6显示了编码包含goi的rna构建体的表达载体的一个实施方案的构建图。[0361]图7显示了编码包含goi-mers-covorf4a的rna构建体的表达载体的一个实施方案的构建图。[0362]图8显示了编码包含goi-piv5的rna构建体的表达载体的一个实施方案的构建图。[0363]图9显示了本发明的构建体以及来自野生型和iipveev复制子的体外蛋白质表达的示意图。a)野生型和顺式编码iip的veev复制子的示意图。b)自扩增rna的先天感知的示意图。c)以相对光单位(rlu)测量的hek293t.17、hela和mrc5细胞中的萤火虫荧光素酶sarna的体外转染。棒代表归一化至野生型veev对照的平均倍数变化±标准偏差，n＝3。[0364]图10显示了在c57bl6/j小鼠中wt和merscov-2复制子的剂量调整。在肌肉注射0.2、2或20μg的rna后的第7天和第10天，对蛋白质表达进行定量。每个点代表一只小鼠，棒代表平均值±sem，n＝10。*表示使用带有多重比较的kruskal-wallis检验评估的p《0.05的显著性。[0365]图11显示了在c57bl6/j小鼠中wt和merscov_2复制子与jak抑制剂鲁索替尼的共制剂。在肌肉注射5μgrna与100μg鲁索替尼后的第4、7、10和14天(分别为a、b、c和d)对蛋白质表达进行定量。每个点代表一只小鼠腿，棒代表平均值±sem，n＝10。[0366]图12显示了在人皮肤外植体中egfp±merscov_2rna(对应于mers-covorf4a)(0.2、2或20μg)(a,b)或±鲁索替尼(0.1、1、10或100μg)(c,d)的蛋白质表达。在注射后72小时对egfp表达细胞的数量(％gfp 细胞)(a,c)和每个细胞的总蛋白质表达(gfp中位荧光强度(mfi))(b,d)进行定量。每个点代表平均值±sem，n＝3。*表示使用带有多重比较的kruskal-wallis检验评估的p《0.05的显著性。[0367]图13显示了兔中rabv±mers-cov_2(对应于mers-covorf4a)的免疫原性。a)在第0和4周以20μg初免和加强免疫进行肌肉内免疫后的rabv抗原特异性igg抗体滴度，n＝5。b)针对假型rabv病毒的中和ic50，n＝5，灰色虚线代表检测限。*表示使用带有多重比较的kruskal-wallis检验评估的p《0.05的显著性。[0368]图14显示了以相对光单位(rlu)测量的hek293t.17、hela和mrc5细胞中萤火虫荧光素酶sarna的体外转染。棒代表平均值±标准偏差对照，n＝3。'a'和'b'表示rna的两个单独制备的批次。[0369]图15显示了以相对光单位(rlu)测量的a)小鼠(mef)、b)兔子(rk13)、c)非人灵长类(llc)和d)人类(mrc5)细胞中的wtfluc、mers-cov_2orf4a和piv-5rna的体外转染。棒代表平均值±标准差对照，n＝3。[0370]图16显示了balb/c和c57bl6/j小鼠中的细胞内蛋白(萤火虫荧光素酶)和分泌蛋白(高斯荧光素酶)的体内荧光素酶表达。在第3天(a,b)、第7天(c,d)和第14天(e,f)使用体内成像系统(ivis)对肌肉(a,c,e)中的或血清(b,d,f)中的蛋白质表达进行定量。每个点代表一只小鼠，棒代表平均数±sem，且对于萤火虫荧光素酶(fluc)，n＝10，对于高斯荧光素酶(gluc)，n＝5。[0371]图17显示了用0.2μgegfprna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0372]图18显示了用2μgegfprna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0373]图19显示了用20μgegfprna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0374]图20显示了用0.2μgegfp-piv-5rna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0375]图21显示了用2μgegfp-piv-5rna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞(绿色)的门控的、按表型(蓝色)分开的无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0376]图22显示了用20μgegfp-piv-5rna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0377]图23显示了用0.2μgegfp-mers-cov_2rna(对应于mers-covorf4a)处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0378]图24显示了用2μgegfp-mers-cov_2rna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0379]图25显示了用20μgegfp-mers-cov_2rna(对应于mers-covorf4a)处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0380]图26显示了在皮内(id)注射egfp±ruxo制剂后如通过流式细胞术测定的人皮肤外植体中存在的细胞和gfp 细胞的表型鉴定，a)从人皮肤外植体提取的总细胞群中的和用2μgegfp编码sarna±0.1、1、10或100μgruxo处理的外植体的gfp-表达皮肤细胞群中的细胞鉴定，n＝3。b)表达gfp的每种表型的细胞百分比。使用以下抗体鉴定的细胞：上皮细胞(cd45-)、纤维母细胞(cd90 )、nk细胞(cd56 )、白细胞(cd45 )、朗格汉斯细胞(cd1a )、单核细胞(cd14 )、树突细胞(cd11c )、t细胞(cd3 )和b细胞(cd19 )。[0381]图27显示了在小鼠和大鼠中rabv±mers-cov_2(对应于mers-covorf4a)的免疫原性。a)在第0周和第4周以1μg的初免和加强免疫对小鼠进行肌肉内免疫后的rabv抗原特异性igg抗体滴度，n＝5。b)针对假型rabv病毒的小鼠的中和ic50，n＝5，灰色虚线代表检测限。a)在第0周和第4周以20μg的初免和加强免疫对大鼠进行肌肉内免疫后的rabv抗原特异性igg抗体滴度，n＝5。b)针对假型rabv病毒的大鼠的中和ic50，n＝5，灰色虚线代表检测限。[0382]图28显示了piv-5v和mers-covorf4a对sarna感知的拟定机制的示意图。[0383]图29显示了中位荧光强度(mfi)数据，该数据表明在hela细胞中，当与仅编码sars-cov-2糖蛋白(即没有iip)的sarna相比，来自根据本发明的一个实施方案的sarna的sars-cov-2糖蛋白当与先天抑制蛋白mers-orf4a共同表达时表达增加。实施例[0384]本发明人假设，已知抑制sarna的先天识别的来自病毒的顺式编码蛋白抑制先天感知并提高sarna疫苗的蛋白质表达和免疫原性。因此，本发明人设计并测试了一系列含有先天抑制蛋白(iip)和目的基因的rna复制子，然后表征了这些复制子是否增强细胞内蛋白表达和(由目的基因编码的)分泌蛋白的表达。[0385]材料和方法[0386]先天抑制蛋白(iip)复制子的克隆[0387]如先前所述(53)，将编码萤火虫荧光素酶、高斯荧光素酶、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、狂犬病病毒糖蛋白(rabv)和来自委内瑞拉马脑炎的复制酶的自扩增rna克隆到质粒载体上。干扰素抑制蛋白文库被克隆到这些载体骨架上作为具有t2a切割位点的目的基因(fluc、gluc、egfp或rabv)的一部分(genbank登录号#aac97195.1)。以如下genbank登录号可以找到干扰素抑制蛋白：hsv-2us1(z86099.2)、hsv-1us1(awo69381.1)、hsv-1us11(yp_009137147.1)、ov20.0l(af053969.1)、bvdvnpro(aie38066.1)、piv-5v(yp_138513.1)、mers-covm(ahc74104.1)、mers-covorf4a(ahc74090.1)、兰加特病毒ns5(af253420)和流感病毒ns1(dq508893.1)。在小鼠的研究中，使用了具有n100d突变的piv-5v蛋白(45)。[0388]sarna的体外转录[0389]使用体外转录生产自扩增rna。将质粒dna(pdna)转化到大肠杆菌(e.coli)(newenglandbiolabs,uk)中，并在100ml具有100μg/ml的羧苄青霉素(sigmaaldrich,uk)的luriabroth(lb)中培养。随后使用plasmidplusmaxiprep试剂盒(qiagen，uk)分离pdna，并在nanodropone(thermofisher,uk)上测量pdna的终浓度。在37℃下使用mlul使pdna线性化达3小时。在mmachinetmt7转录仪(invitrogen,uk)中使用1μg线性化的pdna模板制备用于体外转染的rna，并使用megacleartm转录清理试剂盒(invitrogen,uk)按照制造商的说明进行纯化。如先前所述(2)制备用于离体和体内实验的rna。使用1μg线性化pdna模板，使用megascripttmt7转录仪(invitrogen,uk)按照制造商的说明在37℃下来生产未加帽的rna转录物达2小时。然后通过在-20℃下通过过夜licl沉淀法来纯化转录物，在4℃下以14,000rpm离心20分钟以沉淀rna，用70％etoh冲洗一次，在4℃再次以14,000rpm离心5分钟，然后将其重悬于ultrapureh2o(ambion,uk)中。使用scriptcaptmcap1加帽系统试剂盒(cellscript,wi,usa)按照制造商的说明在37℃将纯化的转录物加帽2小时。然后如上所述用licl沉淀法最后一次纯化加帽转录物，并将其重新悬浮在rna储存缓冲液(10mmhepes、0.1mmedta和100mg/ml海藻糖)中，并储存在-80℃下直至进一步使用。[0390]sarna配制[0391]使用如先前所述的滴定法(titrationmethod)(2)，将用于蛋白质表达实验的fluc、gluc和egfpsarna与100kdapabol复配。将用于体内免疫原性实验的rabvsarna与8kdapabol复配。简言之，将rna和pabol稀释在hepes缓冲液(20mmhepes，5wt.％葡萄糖水溶液，ph7.4)中，并在nanoassemblr台式配制装置(precisionnanosystems,inc.,vancouver,canada)上以4:1(rna比聚合物)的体积比和10ml/min的流速结合。聚合物与sarna的最终比例为45:1(w/w)。多聚物(polyplexes)是新鲜制备的，在制备后1小时内使用。对于共制剂(co-formulation)，将鲁索替尼(ruxo，selleckchemicals，uk)以指定剂量直接添加到多聚物(polyplexes)中。[0392]体外转染[0393]在hek293t.17细胞(atcc,usa)、hel细胞(atcc,usa)、mrc5细胞(atcc,usa)、小鼠胚胎纤维母细胞(mef)细胞(sigmaaldrich,uk)、rk13兔肾细胞(publichealthengland，uk)和llc-mk2恒河猴肾细胞(atcc,usa)中进行转染。在含有10％(v/v)胎牛血清(fbs)、5mg/mll-谷氨酰胺和5mg/ml青霉素/链霉素(thermofisher,uk)的完全dulbecco改良eagle培养基(cdmem)(gibco,thermofisher,uk)(hek,hela,mef细胞)；含有10％(v/v)胎牛血清(fbs)、5mg/mll-谷氨酰胺和5mg/ml青霉素/链霉素(thermofisher，uk)的完全改良eagle培养基(cmem)(mrc5、rk13细胞)；或含有1％马血清(gibco，thermofisher，uk)的完全培养基199(cm199，sigmaaldrich,uk)(llc细胞)中培养细胞。在转染前24小时，将细胞以每孔50,000个细胞的密度铺在透明的96孔板中。然后完全去除培养基，并替换成50μl预热的转染培养基(dmem 5mg/mll-谷氨酰胺，mem 5mg/mll-谷氨酰胺或m199)。然后将100μl多聚物(polyplexes)溶液(含100ngsarna)添加到每个孔中并温育4小时。然后完全去除转染培养基，替换成cdmem、cmem或cm199。24小时后，从每个孔中取出50μl培养基，并添加50μlone-glod-荧光素底物(promega,uk)，并通过移液混合均匀。然后将每个孔的总体积转移到白色96孔板(costar)上进行分析，并在fluostaromega酶标仪(bmglabtech,uk)上进行定量。从每个孔中减去对照孔的背景荧光。[0394]小鼠体内荧光素酶表达[0395]所有动物的处理都符合1986年uk内政部动物科学程序法，并有当地伦理委员会和uk政府批准的项目许可证(p63fe629c)和个人许可证(ic37cbb8f)。食物和水是自由供应的。雌性babl/c小鼠(charlesriver,uk)或c57bl/6小鼠(charlesriver,uk)，6-8周龄，分组饲养(每笼5只)，并饲养在一个完全适应的房间里。向小鼠肌肉内注射(im)50μl总体积的与pabol复合的5μgflucsarna(双后腿)或5μggluc(单后腿)。在3、4、7、10或14天后，按照先前描述的(54，55)针对fluc对小鼠进行成像，或采集血液用于gluc分析，该分析使用gaussialuciferaseglow分析试剂盒(pierce,thermoscientific,uk)根据制造商的说明进行。在fluostaromega酶标仪(bmglabtech,uk)上对血清中的蛋白质表达进行定量。从每个孔中减去对照孔的背景荧光。对于fluc分析，向小鼠腹腔内注射(ip)150μlxenolightredijectd-荧光素底物(perkinelmer,uk)并允许小鼠休息10分钟。然后用异氟醚对小鼠进行麻醉，在装有分子成像软件5.0版(carestreamhealth，usa)的体内成像系统(ivis)fxpro(kodakco.,rochester,ny,usa)上成像2分钟。使用分子成像软件对每个注射点的信号进行定量，并以总通量(flux)(p/s)表示。[0396]小鼠体内高斯荧光素酶的表达[0397]将6-8周龄的雌性balb/c小鼠或c57bl/6小鼠(charlesriver,uk)分为几组(n＝5)，并饲养在完全适应的房间里。小鼠肌肉内注射(im)50μl总体积的5μg的gluc(单后腿)。在3、7和14天后，通过尾静脉给小鼠放血。允许血液凝固并在10,000rpm下离心5分钟，然后取出血清。然后使用piercetmgaussialuciferaseglow分析试剂盒使用20μl血清和根据制造商的说明准备的100μl工作溶液在单个96孔白板(costar)上检测所有时间点的血清。用fluostaromega酶标仪(bmglabtech,uk)分析荧光素，并从每个样品中减去原始(naive)动物的背景。[0398]小鼠、大鼠和兔子的疫苗接种[0399]在一条后腿上以50μl(小鼠)或100μl(大鼠、兔子)的总体积用与pabol一起配制的1μg(小鼠)或20μg(大鼠、兔子)编码rabv的sarna肌肉内注射(im)免疫balb/c小鼠、spraguedawley大鼠和新西兰白兔。初免4周后，再给予一次加强注射。在研究开始后的0、4和6周后收集血液并在10,000rpm下离心5分钟。然后将血清倒出并保存在-80℃下直到进一步分析。[0400]rabv特异性elisa[0401]按照先前的描述(56)进行半定量的免疫球蛋白elisa方案。简而言之，用1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)和0.05％(v/v)tween-20的pbs溶液封闭0.5μg/mlrabv包被的elisa板。洗涤后，向板中添加稀释的血清样品，温育2小时。然后洗涤板，对于小鼠elisa，向板中添加1:4000稀释的抗小鼠igg-hrp(southernbiotech,uk)，对于大鼠elisa，向板中添加1:4000稀释的山羊抗大鼠igg-hrp(southernbiotech,uk)，对于兔elisa，向板中添加1:10000稀释的鼠抗兔igg-hrp(sigma,uk)。小鼠标准品通过以下制备：用抗小鼠κ(1:1,000)和λ(1:1,000)轻链(serotec,uk)包被elisa板孔，用1％(w/v)bsa/0.05％(v/v)tween-20的pbs溶液封闭，洗涤，并添加纯化的igg(southernbiotech,uk)，从1000ng/ml开始，用5倍的稀释系列向下滴定。大鼠标准品通过以下制备：用纯化的大鼠igg(r&dsytems,uk)包被elisa板孔，从1000ng/ml开始，用5倍的稀释系列向下滴定。兔标准品通过以下制备：用1:1250的抗兔iggfc(milipore)包被elisa板孔，用1％(w/v)bsa/0.05％(v/v)tween-20的pbs溶液封闭，洗涤，并添加纯化的rabiitigg(abdserotech,uk)，从1000ng/ml开始，用5倍的稀释系列向下滴定。使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)对样品和标准品进行显影。5分钟后用终止液(insightbiotechnologies,uk)停止反应。用采用softmaxprogxpv5软件的分光光度计(versamax,moleculardevices,uk)读取吸光度。[0402]rabv微中和分析[0403]对第0、4和6周的样本进行假型狂犬病病毒微中和。在96孔板中的cdmem中以10,000个细胞/孔接种bhk-21细胞。将血清在56℃下热灭活，然后在cdmem中以1:5连续稀释。然后将样品用等体积的浓度为50μl中100tcid50的伪病毒稀释，在37℃温育1小时，然后添加到bhk-21细胞中，在37℃下培养48小时。然后裂解细胞，用bright-glo荧光素酶检测法(promega,uk)对荧光素酶活性进行定量。然后将每个孔的总体积转移到白色96孔板(costar)上进行分析，并在fluostaromega酶标仪(bmglabtech,uk)上进行定量，并计算每个样品的ic50。[0404]人皮肤外植体培养和注射[0405]在离体研究中，在英国伦敦的charingcrosshospital，imperialnhstrust收集手术切除的人皮肤组织标本。所有组织都是在收到接受选择性腹部整形手术或乳房切除手术的患者签署知情同意书后在伦敦帝国学院的localresearchethicscommittee(med_rs_ii_014)批准的方案下收集的。皮肤组织在使用前被冷藏，并被切成1cm2的部分，并在12孔板中在37℃和5％co2下用2mlcdmem培养。使用micro-finedemi0.3ml注射器(bectondickinson,uk)以50μl总体积中的2μgsarna的剂量皮内注射(id)外植体。在培养过程中，每天更换培养基。[0406]流式细胞术[0407]注射72小时后，修剪皮肤外植体以去除皮下脂肪层，用剪刀将表皮和真皮层剪碎，并在2ml补充有1mg/ml胶原酶p(sigmaaldrich,uk)和5mg/ml分散酶ii(sigmaaldrich,uk)的dmem中在旋转摇床上于37℃下培养4小时。然后将消化物通过70μm细胞过滤器进行过滤，并在1,750rpm下离心5分钟。然后将细胞重新悬浮在100μlfacs缓冲液(pbs 2.5％fbs)中，在冰上用facs缓冲液中的1:400稀释的可固定aqua活/死细胞染色剂(thermofisher,uk)染色20分钟。然后将样品用1ml的facs缓冲液洗涤，在1,750rpm下离心5分钟，并用下列抗体的混合物进行染色：cd3-v450(biolegend,uk)、cd14-qdot605(biolegend,uk)、cd19-bv650(biolegend,uk)、cd56-bv711(biolegend,uk)、cd1a-percp-efluor710(biolegend,uk)、cd11c-pe(biolegend,uk)、cd90-pe-cy7(biolegend,uk)和cd45-af700(biolegend,uk)。然后将样品用1mlfacs缓冲液进行洗涤，以1,750rpm离心5分钟，重新悬浮在250μlpbs中，然后用250μl3％多聚甲醛进行固定，多聚甲醛的终浓度为1.5％，并进行冷藏直到进行流式细胞仪分析。在带有facsdiva软件(bdbiosciences,uk)以及10万个获得细胞事件的lsrfortessa(bdbiosciences,uk)流式细胞仪上分析样品。如先前所述(58)进行门控策略，并使用flowjo版本10(flowjollc,oregon,usa)对gfp 细胞的表型鉴定进行量化。在flowjo中使用1000次迭代、30的困惑度(perplexity)、15196的学习率、exact(优势树)knn算法和barnes-hut梯度算法进行无监督的活细胞簇的t-分布式随机邻域嵌入(tsne)分析。[0408]sars-cov-2糖蛋白的体外工作[0409]基于特立尼达(trinidad)驴委内瑞拉马脑炎病毒株(veev)α病毒基因组，本发明人使用质粒载体合成了自扩增rna(sarna)复制子。将亚基因组启动子驱动的病毒结构蛋白由新型严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的表面'刺突'糖蛋白(genbank登录号qhd43416.1)取代。发明人用寡核苷酸串(strings)(geneart,德国)合成了编码sars-cov-2基因的寡核苷酸片段，并用gibson组装法(nebltd,uk)将这些片段组装到质粒载体上。在sars-cov-2复制子载体的进一步修饰中，合成了编码mers-covorf4a(ahc74090.1)的寡核苷酸串(geneart,德国)，并将其3'插入sars-cov-2编码区，该区使用弗林蛋白酶/t2a的变体序列(seqidno：26)连接在连续开放阅读框中，产生新的sars-cov-2orf4a载体。用sars-cov-2和sars-cov-2orf4asarna分别转染细胞，然后用多克隆抗体进行染色以检查表达。简而言之，转染后24小时，收获细胞并以1×107个细胞/ml的浓度将其重悬于1mlfacs缓冲液(pbs 2.5％fbs)中。将100μl重悬的细胞加入到facs管中，在冰上用50μl活/死固定aqua死细胞染色剂(thermofisherscientific,uk)以1:400的稀释度染色20分钟。然后将细胞用2.5ml的facs缓冲液洗涤，并在1750rpm下离心7分钟。离心后，将细胞在冰上用2.5μg的sars-cov刺突蛋白多克隆抗体(pa1-41165,thermofisherscientific,uk)染色30分钟，然后用2.5mlfacs缓冲液洗涤，并在1750rpm下离心7分钟。然后将细胞在冰上用0.4μgfitc山羊抗兔igg(bdpharmigen,uk)染色30分钟。孵育后，将细胞用2.5mlfacs缓冲液洗涤，在1750rpm下离心7分钟，并用250μlpbs重新悬浮。用250μl3％的多聚甲醛固定细胞，多聚甲醛的终浓度为1.5％。在带有facsdiva软件(bdbiosciences,uk)的lsrforterssa(bdbiosciences,uk)上分析样品。使用flowjo版本10(flowjollc,usa)分析数据，并测量阳性细胞群的中位荧光强度(mfi)，其中阴性/阳性截止值设置在门控为活的且单个的以及使用与上述相同的方法进行模拟转染但不含有sars-cov-2或sars-cov-2orf4a复制子sarna的细胞上。[0410]统计学分析[0411]在graphpadprism,版本8中制作图表和统计。使用双因素anova或调整用于多重比较的kruskal-wallis检验来分析统计学差异，并用p《0.05表示显著性。[0412]结果和讨论[0413]据认为rna复制子是用于疫苗和疗法中递送和表达目的基因的潜在工具。然而，双链rna(dsrna)在细胞内由触发抑制蛋白质翻译的信号级联的先天感知机制检测。结果，在复制子中编码的目的基因的表达显著受损，并因此限制了rna复制子的治疗潜力。[0414]本发明人通过开发编码先天抑制剂蛋白的rna复制子以减弱sarna的先天识别来着手克服这一问题。先前发表的唯一用sarna减弱干扰素反应的方法是使用来自疫苗病毒的干扰素抑制蛋白，e3、k3和b18。然而，在这项研究中，干扰素抑制蛋白作为与sarna组合的单独mrna分子被递送和配制。这需要制造sarna和mrna两者，并需要使用复制子rna的3-6倍的疫苗mrna，以确保共递送到同一细胞中，并提供任何可观察到的蛋白质表达增强。此外，mrna和sarna的表达动力学不同，因此从mrna表达的iip的任何有益效果与伴随的复制子相比都是短暂的。[0415]鉴于目前在治疗中使用sarna的困难，本发明人设计了将比现有技术方法更有效地限制对其的免疫反应的新型sarna，从而提高其在接种疫苗和治疗中的效用。[0416]使用piv-5和orf4a作为新型iip[0417]已知piv-5和orf4a阻断mda-5，mda-5是一种细胞质rna螺旋酶，通过称为mav的接合体(apator)分子发出信号，导致干扰素调节因子3和7(irf3和irf7)的诱导，这分别导致产生降低引入的合成sarna的翻译的限制因子(图l)。这2个iip是在对来自一系列不同病毒的10个iip进行初步体外筛选中鉴定的。[0418]l.hsv-2us1-通过抑制irf-3与ifn-β启动子的结合来抑制ifn-b的产生[1]。[0419]2.hsv-1us1(来自hsv-1的调节因子)[0420]3.hsv-1us11-阻止rig-i信号传导[2,3]。[0421]4.ov20.0l-与dsrna结合，并抑制pkr和pact两者，阻断rig-i信号传导[4,5]。[0422]5.bvdvnpro：阻断irf3磷酸化和s100a9信号传导[6,7]。[0423]6.piv5v：通过与mda-5结合阻断mda-5和irf3[8,9][0424]7.mers-covm：与traf3相互作用，破坏traf3-tbk1结合，导致irf3激活减少[10-12]。[0425]8.mers-covorf4a：与dsrna结合(对长rna有偏好)，抑制mda5和rig-i、pkr的pact触发和应激反应[13,14]。[0426]9.兰加特病毒ns5：下调ifna1r，损害jak-stat信号传导[15-16]。[0427]10.流感ns1：与dsrna结合，阻断rig-i信号传导[17]。[0428]这些iip连同作为goi并用作表达标记物的荧光素酶被整合在本发明人的标准veevsarna复制子中(图1)。在三种人类细胞系：具有受损的先天感知通路的hek293t细胞、hela细胞和原代mrc5胚胎上皮细胞中评估这些构建体(图3a和b)。在没有先天识别的情况下，在hek293t细胞中所有iip候选sarna都以与野生型sarna类似的方式复制。一系列的iip(除mers-covm和流感ns1外)能够增强hela细胞中的表达，但是观察到piv-v和orf4a的增强最显著(3logs)。在原代mrc5细胞中最重要的评估表明，仅piv-v和orf4a能够将荧光素酶的表达提高2logs。这些数据表明，在增强人类原代细胞中goi表达的能力方面piv-v和orf4a是独一无二的。鉴定包含在rna载体中的piv-5和orf4a是基于这些实验数据，考虑到据认为被评估的其他iip通过类似的机制工作，它们的活性是不可预测的。为了进一步支持它们在基因递送中的应用，本发明人在小鼠中进行了体内实验。本文中，本发明人利用了black6(bl6)小鼠，已知此类小鼠具有比balbc小鼠更强健的先天感知机制和下游干扰素反应，因此在这两种模型中的比较是有启发性的。本发明人使用萤火虫荧光素酶(fluc)作为报告蛋白，评估了在bl/6小鼠中wt、piv-5和orf4a复制子的相对表达(图4)。[0429]由于fluc在细胞内表达，因此可以在用底物d-荧光素腹膜内(ip)注射后将目的基因的表达可视化为基于荧光素酶的表达，并表示为总通量(p/s)(参见方法)。这些体内实验证明piv5和orf4a将bl/6细胞中荧光素酶表达的持续时间延长至14天，而wt构建体在这个时间点是阴性的。在进一步的研究中，本发明人评估了这两种rna复制子构建体对gluc(作为goi)的高斯荧光素酶(图5)的表达的影响。gluc作为可溶性蛋白质被分泌，在血液中测量其活性(参见方法)。这些体内实验证明piv5和orf4a将bl/6细胞中荧光素酶表达的持续时间延长至14天。在第14天，piv5和orf4arna复制子两者的gluc表达显著更高(分别p＝0.0244和0.00422)。超过14天的“曲线下面积”的计算表明以下auc值，如下：flucbalbc＝1950；piv5balbc＝2742；orf4abalbc＝1596；flucbl6＝2012；piv5bl6＝4513；orf4abl6＝6972(总通量(p/s))。虽然这些体内实验是支持性的，但重要的是要注意人类和小鼠之间在先天限制因子和干扰素刺激基因(其中有》100)的特异性方面存在显著差异，因此，基于对人类细胞系的体外观察，这些数据很可能低估了对人类可能产生的影响。[0430]干扰素抑制蛋白在体外增强sarna的蛋白质表达[0431]本发明人试图确定干扰素抑制蛋白文库是否能增强萤火虫荧光素酶(fluc)的体外蛋白质表达。他们制备了具有各种各样的细胞质干扰素靶标(表1)，包括irf-3、mda5、rig-i和jak/stat(图9b)的sarnaveev复制子库，其中用t2a切割位点将iip与fluc分开(图9a)。[0432][0433]表l.干扰素抑制veev复制子和相关的ifn靶标。[0434]然后，本发明人使用pabol(图9c，补充图1)将sarna转染到hek293t.17、hela和mrc5细胞中，pabol是一种聚合物递送系统，其先前已经被表征为产生相对较高的蛋白质表达，但由于其生物可还原性质，是相对免疫沉默的(2)。本发明人选择这三种细胞系是因为它们在ifn通路的完整性方面存在差异；hek293t.17细胞没有完整的通路，因为它们缺乏内源性rig-i和mda5的表达(37)，因此对影响该通路的蛋白质应该不太敏感，而hela和mrc5则更具有鉴别性(38，39)。本发明人观察到，在hek293t.17细胞中，没有iip复制子增强了蛋白质表达(图lc)，但有趣的是兰加特和流感iip都明显降低了蛋白质表达0.06倍，其中分别为p＝0.0097和0.0061。在hela细胞中，许多iip都增强了蛋白质表达；在fluc表达上，hsv-2、hsv-1_1、hsv-1_2、orf和bvdv增加范围为20-150倍。然而，piv-5v和mers-covorf4a蛋白增强的蛋白质表达最大，分别为796倍和893倍，尽管只有piv-5组具有统计学意义(p＝0.0272)，而orf4a组没有(p＝0.0689)。在mrc5细胞中，本发明人同样观察从piv-5v和mers-covorf4a蛋白中观察到了最大增强，分别具有72倍和109倍更高的fluc表达，其中p＝0.0485和0.025。在所有细胞类型和每个构建体中，来自两批单独制备批次的rna(图14)的表达水平之间存在良好的一致性。[0435]本发明人进一步研究了在小鼠(mef)、兔子(rk13)、非人灵长类(llc)和人类细胞(mrc5)中piv-5v和mers-covorf4a蛋白的两个突变如何影响蛋白质表达(图15a-d)。piv-5v中的r172a突变消除了阻断mda5而不是stat的能力(40)，而mers-covorf4a中的k63a/k67a突变阻断了与dsrna的结合(41)。本发明人观察到，在mef或rk13细胞中piv-5v和mers-covorf4a蛋白没有增强蛋白质表达。在llc和mrc5细胞中mers-covorf4a蛋白确实增强了蛋白质表达(图15c,d)，k63a/k67a突变极大降低了蛋白质表达。在mrc5细胞中piv-5v蛋白增强了蛋白质表达，但在llc细胞中没有增强，而在mrc5细胞中r172a突变降低了蛋白质表达。总的来说，这些数据表明，在干扰素感受态人类细胞中piv-5v和mers-covorf4a蛋白增强了蛋白质表达，而以k63a/k67a和r172a替换来突变蛋白则使sarna表达变弱。[0436]mers-covorf4a蛋白部分地减弱了体内剂量非线性的增加。[0437]鉴于piv-5v和mers-covorf4a蛋白对体外蛋白质表达的增强，随后本发明人试图确定这些构建体是否能增强体内蛋白质表达并减弱增加sarna剂量的非线性。本发明人测试了编码萤火虫荧光素酶(一种细胞内蛋白)和高斯荧光素酶(一种体内分泌蛋白)两者的sarna(表2)。[0438][0439]表2.在14天的过程中balb/c和c57bl6/j中总荧光素酶表达的曲线下面积(auc)，n＝5。[0440]由于干扰素生成能力的差异，本发明人选择在balb/c和c57bl/6小鼠中测试这些构建体：balb/c是ifn的不良生产者，而先前已发现c57bl/6小鼠是ifn-α/β和ifn-γ的高生产者(42)，类似于体外hek293t.17和hela/mrc-5细胞的差异性。本发明人观察到，在balb/c小鼠中整合piv-5v和mers-covorf4a蛋白并没有增强fluc或gluc的蛋白质表达(表2，图16)。本发明人观察到，在具有mers-covorf4a蛋白的c57bl/6小鼠中fluc蛋白质表达的总曲线下面积(auc)略有增强，而具有piv-5v和mers-covorf4a蛋白的c57bl/6小鼠中gluc蛋白质表达的总曲线下面积(auc)略有增加，尽管这种差异不是统计显著性的。[0441]本发明人先前已经观察到，增加sarna的剂量最终导致较低的蛋白质表达水平，因此试图表征mers-covorf4a蛋白是否能减弱sarna的体内非线性剂量依赖性。本发明人测试了剂量为0.2、2和20μg的野生型fluc和fluc mers-covorf4a复制子，并在肌肉内注射(im)后的第7天和第10天对蛋白质表达进行定量(图10)。本发明人观察到，7天后，两种构建体在0.2μg剂量下具有相似的蛋白质表达(～5000p/s)，当剂量增加到2μg时，两种构建体的蛋白质表达都提高(wt为～5,0000p/s，mers-covorf4a构建体为～200,000p/s)，但mers-covorf4a蛋白的整合使蛋白质表达增强了4倍，p＝0.0029。有趣的是，7天后，两种构建体在剂量为20μg时都表现出较低的蛋白质表达，但wt比mers-cov构建体低18倍，p《0.0001。10天后，2μg剂量的蛋白质表达水平已经相等，在0.2和20μg剂量下没有观察到表达。在不希望被任何特定理论束缚的情况下，这些数据表明mers-covorf4a蛋白能够部分拯救sarna的体内非线性剂量依赖性。[0442]鲁索替尼增强了体内sarna的蛋白质表达。[0443]鉴于jak/stat通路在下游干扰素反应中的作用，本发明人随后试图表征将sarna、mers-covorf4a干扰素抑制蛋白和鲁索替尼(一种jak1和jak2蛋白激酶的强效、选择性抑制剂(36))组合如何影响体内的蛋白质表达(图3)。发明人向小鼠im注射与100μg鲁索替尼或不与100μg鲁索替尼共同配制的5μg编码fluc±mers-covorf4a的sarna，并在注射后4、7、10和14天对蛋白质表达进行定量。4天后(图11a)，与wt或mers-covorf4a构建体(～5x105p/s)相比，含有鲁索替尼的两种制剂具有略高的蛋白质表达(～106p/s)，尽管不是统计学上显著的。然而，7天后，与仅sarna的平行组相比，含有鲁索替尼的两种制剂都具有更高的蛋白质表达量，其中分别为p＝0.0347和0.0447。到第10天，这些组仍有轻微的升高，但差异不再是统计学上显著的。14天后，在不含鲁索替尼的sarna组中没有观察到蛋白质表达，而鲁索替尼组只有少数阳性样本。在不希望被任何特定理论所束缚的情况下，这些数据表明，鲁索替尼能使sarna蛋白质表达深度提高，但当mers-covorf4a蛋白与鲁索替尼组合时，mers-covorf4a蛋白与鲁索替尼之间并没有协同效应。[0444]在人皮肤外植体中piv-5v和mers-covorf4a蛋白减弱了离体剂量非线性增加。[0445]由于本发明人观察到在体外iip根据细胞类型的种类表现出蛋白质表达差异，他们试图在更具临床意义的人皮肤外植体模型中测试sarnaiip构建体。本发明人表征了在整合了piv-5v和mers-covorf4a蛋白(图中称为mers-cov_2)以及与鲁索替尼共配制的驻留人皮肤细胞中的蛋白质表达的数量(egfp 细胞的百分比)和质量(每个细胞的中值egfp荧光强度)(图12)。本发明人测试了剂量为0.2、2和20μg具有piv-5v和mers-covorf4a蛋白的egfpsarna(图12a，b)，并观察到将wt构建体的剂量从0.2μg增加到2μg导致egfp 细胞的百分比从10％增加到18％，但当剂量增加到20μg时，egfp 细胞的百分比骤降到～5％。然而，对于piv-5和mers-covorf4a构建体，随着sarna剂量增加，剂量线性增加。对于这两种国构建体，0.2μg的剂量同样导致egfp 为～12％，2μg时进一步提高到15％，20μg时提高到25％，此时piv-5和mers-covorf4a构建体均具有统计学上显著更高的egfp 细胞百分比，其中对于两者，p《0.0001。有趣的是，无论是剂量还是piv-5或mers-covorf4a蛋白的整合与否都不影响egfpmfi，对于所有样品，都为～350(图12b)。[0446]本发明人使用t-分布随机邻域嵌入进一步表征了哪些细胞正在表达sarna，t-分布随机邻域嵌入是一种用于流式细胞术数据的原理成分分析类型，其允许通过采用叠加的限定的蛋白质和表型门控的无监督的细胞聚类的可视化(图17-25)(43)。本发明人观察到，在sarna的最高剂量下(20μg)，piv-5v和mers-covorf4a蛋白实现了在包括t细胞、树突细胞、单核细胞、b细胞、朗格汉斯细胞、白细胞和nk细胞的免疫细胞中而不是驻留上皮细胞和纤维母细胞中的蛋白质表达。[0447]接下来，本发明人测试了鲁索替尼的整合剂量(0-100μg)如何影响人皮肤驻留细胞中的sarna表达。他们观察到鲁索替尼与sarna的共制剂对egfp 细胞的百分比没有任何影响(图4c)，尽管有增加鲁索替尼的剂量实际上使egfp 细胞的百分比从～8％下降到～5％的轻微趋势。然而，本发明人确实观察到对每种细胞egfp表达的质量的深度影响(图12d)；增加鲁索替尼的剂量，在10μg剂量的鲁索替尼下，egfpmfi从～100增加到～2000，尽管在100μg剂量的鲁索替尼下，mfi下降到～1000。与表达sarnapiv-5和mers-covorf4a蛋白的细胞类似，发明人发现鲁索替尼增强了免疫细胞而不是上皮细胞和纤维母细胞中的蛋白质表达，尤其增加了t细胞、朗格汉斯细胞、白细胞和nk细胞中的摄取(图26a,b)。[0448]综上所述，在不希望被任何特定理论束缚的情况下，这些数据显示iip复制子通过增加表达sarna的细胞比例来增强免疫细胞中的表达，而鲁索替尼则在每个细胞的基础上增强蛋白质表达。[0449]在兔体内mers-covorf4a蛋白增强rabv糖蛋白的免疫原性[0450]由于核酸制剂的蛋白质表达并不总是免疫原性的直接预测(2)，随后本发明人试图表征作为治疗性生物分子的模型蛋白质(即由genebankid号np_056796.i代表的狂犬病病毒糖蛋白(rabv))在本发明的sarna构建中与mers-covorf4a蛋白(作为先天抑制蛋白或iip)组合时的免疫原性。此外，使用具有氨基酸替换的，即阻止与细胞p75ntr表面受体结合的f318v修饰的rabv蛋白。本发明人给兔子注射了20μgsarna的初级剂量并在4周后注射了加强剂量，然后在0、4和6周后对其血液中的rabv特异性igg抗体进行采样(图13a)。本发明人观察到，对于野生型和mers-covorf4a构建体两者的所有兔子在一次注射后都发生了血清转化。4周后，mers-cov组的igg滴度(～104ng/ml)比野生型(～5×103ng/ml)略高，但不是统计学上显著的。然而，6周后，mers-covorf4a组的动物的抗体滴度(～105ng/ml)与wt组(～104ng/ml)相比显著更高，其中p＝0.0061。rabv假型中和反映了抗体的趋势(图13b)。4周后，wt组的平均ic50为～103，而mers-cov组的ic50为～104。6周后，mers-cov组的ic50高得多，为～105，而wt组已稳定在～103。发明人还比较了在小鼠和大鼠中wtrabv和rabv-mers-covorf4asarna的免疫原性(图27)，但在这些物种中没有观察到抗体滴度之间和中和ic50之间的任何差异。在不希望被任何特定的理论所束缚的情况下，这些数据表明在兔子中mers-covorf4a蛋白增强了由sarna编码的rabv糖蛋白的免疫原性。[0451]mers-covorf4a蛋白增强sars-cov-2糖蛋白的体外表达[0452]本发明人还表征了另一种模型蛋白(即治疗性生物分子，即由genbankidno:qhd43416.1代表的sars-cov-2糖蛋白)在本发明的sarna构建中与mers-covorf4a蛋白(即先天抑制剂蛋白或iip)组合时的免疫原性。[0453]在转染到hela细胞系24小时后，比较了sars-cov-2(无iip)和与mers-covorf4a(iip)组合的sars-cov-2的表面表达水平。参照图29，测量了阳性细胞群的中位荧光强度，其中阴性/阳性截止值设置在门控为活的单个的且被模拟转染的细胞上。令人惊讶的是，与只编码sars-cov-2糖蛋白(即无iip)的sarna相比，mers-covorf4a蛋白几乎使每细胞sars-cov-2糖蛋白的表达水平翻了一倍。[0454]讨论[0455]本发明人筛选了带有顺式编码的干扰素抑制蛋白的自扩增rna文库，用于在小鼠、兔子、非人灵长类动物和人类细胞中体外、在人皮肤外植体中离体以及在小鼠体内的蛋白质表达，以及在小鼠、大鼠和兔子体内的免疫原性。本发明人观察到，在ifn感受态hela和mrc5细胞中piv-5v和mers-covorf4a蛋白在体外增强蛋白质表达100-500倍。他们发现mers-covorf4a蛋白在体内部分减弱了剂量非线性，鲁索替尼而非iip在体内增强了sarna的蛋白质表达。在表达sarna的人皮肤外植体中发现piv-5v和mers-covorf4a蛋白都提高驻留细胞的百分比，并完全拯救了sarna的剂量非线性，而鲁索替尼在每个细胞基础上提高了蛋白质表达。最后，本发明人观察到在兔子中mers-covorf4a使rabv特异性igg滴度和中和ic50提高了10倍，但在小鼠或大鼠中未观察到这种结果。[0456]在这些实验中表征的蛋白质设计、细胞和突变提供了对piv-5v和mers-covorf4a蛋白提高蛋白质表达机制的见解。piv-5v蛋白通过与mda-5结合阻断mda-5和irf3(26，27)，而mers-covorf4a蛋白与dsrna结合并抑制mda-5和rig-i的pact触发(29-31)。在我们的体外筛选后，本发明人选择继续使用mers-covorf4a复制子，因为在体内筛选所有10个候选者是不可行的，而且piv-5v蛋白在物种间并不保守(例如适应小鼠所需的n100d突变(44))，而orf4a蛋白在物种间更高度保守(29-31)。本发明人观察到，piv-5v蛋白的r172a突变(其消除了阻断与mda-5而不是与stat结合的能力(45))轻微抑制了mrc5细胞中的蛋白质表达(图15d)，从而表明与mda5的结合是增强蛋白质表达的部分原因。同样，mers-covorf4a蛋白的k63a/k67a突变限制了结合dsrna的能力(46，47)，并观察到该种突变在非人灵长类和人类细胞中降低蛋白质表达(图15c，d)。虽然各种iip通过与piv-5v和mers-covorf4a类似的机制抑制干扰素，但观察到的作用机制不一定能预测可以增强蛋白质表达。[0457]本发明人先前已经观察到sarna制剂的蛋白质表达不一定能预测免疫原性(2)，因此还表征了在小鼠、大鼠和兔子中mers-covorf4a蛋白如何影响狂犬病病毒糖蛋白的免疫原性。本发明人在兔子中观察到采用编码rabv和mers-covorf4a的sarna，抗体滴度和中和ic50都增加(图13a，b)，但在小鼠或大鼠中没有观察到免疫原性的提高。虽然没有任何临床前动物模型能完美预测人类的反应，但认为兔子比小鼠或大鼠在免疫学上与人类更相似(48-50)。此外，本发明人没有观察到在鼠细胞中由piv-5v或mers-covorf4a蛋白带来的任何蛋白质表达增强(图15a)，因此免疫原性没有增强并不意外。本发明人将临床前动物模型中的特征与人类移植模型配对，其中细胞处于原生组织结构中，拥有人类固有的ifn反应。据他们所知，本发明人是第一个观察到iip提高了表达sarna的细胞的百分比，而鲁索替尼则增强了每个细胞的表达。鉴于这些有希望的结果，本发明人认为在人类中mers-covorf4a蛋白可增强sarna疫苗的免疫原性，对sarna应用于蛋白质替代疗法中也是有用的(51，52)。[0458]这些实验提供了，iip可以被直接编码到sarna载体中并有效地减弱非线性剂量依赖性并增强免疫原性的概念验证。正如机理研究所表明的，干扰素通路的不同方面可以成为靶标，并提高sarna的表达，从而促使探究iip与其他ifn抑制策略(如鲁索替尼)的组合。[0459]财政支持声明[0460]交托本技术的项目得到了mariesklodowska-curie授权协议no.794059下的欧盟horizon2020研究和创新计划的资金资助。[0461]参考文献[0462]1.s.perrietal.,analphavirusrepliconparticlechimeraderivedfromvenezuelanequineencephalitisandsindbisvirusesisapotentgene-basedvaccinedeliveryvector.jvirol77,10394-10403(2003).[0463]2.a.k.blakneyetal.,bigisbeautiful：enhancedsarnadeliveryandimmunogenicitybyahighermolecularweight,bioreducible,cationicpolymer.acsnano10.1021/acsnano.0c00326(2020).[0464]3.l.a.britoetal.,acationicnanoemulsionforthedeliveryofnext-generationrnavaccines.moleculartherapy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy22,2118-2129(2014).[0465]4.a.k.blakney,p.f.mckay,b.i.yus,y.aldon,r.j.shattock,insideout：optimizationoflipidnanoparticleformulationsforexteriorcomplexationandinvivodeliveryofsarna.genetherapy10.1038/s41434-019-0095-2(2019).[0466]5.a.j.gealletal,nonviraldeliveryofself-amplifyingrnavaccines.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica109,14604-14609(2012).[0467]6.j.s.chahaletal,dendrimer-rnananoparticlesgenerateprotectiveimmunityagainstlethalebola,h1n1influenza,andtoxoplasmagondiichallengeswithasingledose.procnatlacadsciusa113,e4133-4142(2016).[0468]7.a.b.vogeletal.,self-amplifyingrnavaccinesgiveequivalentprotectionagainstinfluenzatomrnavaccinesbutatmuchlowerdoses.mol.ther.26,446-455(2018).[0469]8.k.j.kallenetal,anovel,disruptivevaccinationtechnology：self-adjuvantedrnactivevaccines.humvaccinimmunother9,2263-2276(2013).[0470]9.n.pardi,m.j.hogan,f.w.porter,d.weissman,mrnavaccines—anewerainvaccinology.naturereviewsdrugdiscovery10.1038/nrd.2017.243(2018).[0471]10.c.deharo,r.méndez,j.santoyo,theeif-2alphakinasesandthecontrolofproteinsynthesis.fasebj10,1378-1387(1996).[0472]11.s.l.liang,d.quirk,a.zhou,rnasel：itsbiologicalrolesandregulation.iubmblife58,508-514(2006).[0473]12.m.albereretal.,safetyandimmunogenicityofamrnarabiesvaccineinhealthyadults：anopen-label,non-randomised,prospective,first-in-humanphaselclinic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技术领域：
：1.本发明涉及rna构建体，尤其，尽管不是唯一地，涉及rna复制子和sarna分子，以及涉及编码此类rna复制子的遗传构建体或载体。本发明延伸到此类rna构建体和复制子在治疗中，例如在治疗疾病和/或在疫苗递送中的用途。本发明延伸至包含此类rna构建体的药物组合物以及其方法及其用途。
背景技术：
：：2.信使rna(mrna)是用于生物疗法的有希望的工具。然而，虽然已证明在小动物中mrna疗法是高效的，但是当这些制剂在人类的剂量递增研究中被翻译时，结果不是线性缩放的。此外，与诱导干扰素反应相关的不良事件已经限制了人类中可能有效的rna的剂量的增加。这种不一致性的原因尚不清楚，但本发明人假设人体先天感知的差异对rna疗法从实验室转化到临床构成障碍。此外，rna的先天感知已经与蛋白质表达抑制相关的。迄今为止，克服外源性rna先天识别的主要方法一直是使用通过先天感知机制不易检测到的经修饰核糖核苷酸。然而，经修饰的mrna不是完全不可检测的，仍然导致一定程度的干扰素激活、蛋白质沉默以及对于人类使用的可耐受性降低。3.另一种方法是使用通常基于甲病毒骨架的自扩增或sarna载体，所述甲病毒骨架具有通过在其非结构蛋白内编码聚合酶活性而自扩增其自身rna的能力。现有技术方法涉及用目的基因(goi)取代这些载体的结构蛋白，所述目的基因是疫苗构建体或编码治疗性蛋白。其他版本的sarna已基于小核糖核酸病毒、黄病毒和冠状病毒。当sarna被摄取到靶细胞的细胞质中时，这导致了通过编码的聚合酶体系的rna扩增以及非常高的goi表达水平。因此，已证明sarna可以用比mrna更低的剂量(低10-100倍)诱导免疫反应，并导致小鼠中的蛋白质表达时间延长多达60天。4.然而，sarna的缺点是其通过先天识别仍可以被感知，从而触发限制这些现有技术sarna的蛋白质表达和自扩增的抗病毒反应。由于其具有大尺寸(通常》5000个碱基)和包含双链区(dsrna)的深度(profound)二级结构，因此sarna的先天感知与mrna的先天感知不同。长双链rna通过mda5(黑色素瘤分化相关蛋白5)途径触发先天反应。这一点通过促进mda5寡聚化的pact(pkr激活蛋白)与长dsrnarna的结合，和随后抑制sarna的复制和表达的下游信号级联的触发而被促进。5.因此，本领域需要产生新方法，通过所述方法可以在患者体内递送和表达rna疗法，使得患者能够克服rna的先天免疫系统感知。技术实现要素：6.本发明人开发了新型自扩增rna(sarna)，所述sarna通过表达阻断或减少先天免疫系统机制的先天抑制剂蛋白，导致蛋白质表达和自扩增提高，从而有利地克服rna的先天免疫系统感知。7.因此，在本发明的第一方面，提供了一种rna构建体，其编码(i)至少一种治疗性生物分子；(ii)至少一种先天抑制剂蛋白(iip)。8.rna复制子或构建体被认为是用于疫苗和疗法中目的基因的递送和表达的潜在工具。然而，双链rna(dsrna)在细胞内由触发反应的先天感知机制检测，这抑制了蛋白质翻译。因此，在复制子中编码的目的基因的表达显著受损，因此rna复制子的治疗潜力受到限制。有利地，本发明的rna构建体克服了这个问题，因为它们编码一种或多种先天抑制剂蛋白，即iip，其消除了转基因表达的下游抑制。干扰素的诱导是先天识别的下游结果，但应当理解，其他分子和途径可以被诱导，这些中的任一都被包含在rna构建体中的一个或多个iip抑制。唯一先前发表的用sarna消除干扰素反应的方法使用来自自痘苗病毒e3、k3和b18的干扰素抑制蛋白。然而，在这项研究中，这些干扰素抑制蛋白以与sarna组合的单独mrna分子形式递送和配制。这需要制造sarna和mrna两者，并且必须使用根据本发明的复制子rna构建体的3-6倍的疫苗mrna，以确保共同递送到同一细胞中且提供任何可观察到的蛋白质表达增强。此外，mrna和sarna的表达动力学不同，使得与本发明的rna构建体(长达60天)相比，由mrna表达的iip的任何有益效果将仅具有非常短的持续时间(长达72小时)。9.有利的是，在第一方面的rna构建体中，一个或多个iip的存在能够与目的多肽或蛋白质进行双重蛋白质表达。相对于现有技术中描述的递送一条编码目的肽/蛋白、一条编码iip的两条不同的rna链，使用本发明的构建体，将仅单个链递送到靶细胞，从而确保rna和先天抑制剂蛋白的共定位。iip抑制rna的先天感知，从而使蛋白质表达更高，iip自身表达由于与目的基因(即治疗性生物分子)在亚基因组链上共同表达而被自扩增。如实施例所述，已令人惊讶地表明，本发明的编码荧光素酶的rna构建体(也称为“stealthicons”)，在体外在人类细胞系中，提高荧光素酶蛋白质表达水平高达两个数量级，并且在bl/6小鼠体内与传统veevrna复制子相比，还提高了荧光素酶的蛋白质表达量和持续时间两者。本领域技术人员很容易理解，荧光素酶报告子是治疗性生物分子的真实代表，因为它证明了rna构建体能够在体内表达本发明的rna分子上包含的基因。因此，荧光素酶提供了概念验证的有力证据，即本发明的sarna构建体可用于表达任何具有治疗活性的生物分子。10.本领域技术人员将理解，rna构建体也可以被称为自复制rna病毒载体或rna复制子。rna构建体可以是双链的或单链的。优选地，所述rna构建体包含自扩增rna(sarna)，并且优选地为sarna构建体。11.优选地，所述rna构建体包含或衍生自正链rna病毒，所述正链rna病毒选自由以下组成的属的组：甲病毒属；小核糖核酸病毒属；黄病毒属；风疹病毒属；瘟病毒属；肝炎病毒属；杯状病毒属或冠状病毒属。12.合适的野生型甲病毒属序列是众所周知的。合适的甲病毒属的代表实例包括奥拉病毒、比巴鲁病毒、卡巴斯欧病毒、基孔肯雅病毒、东部马脑炎病毒、摩根堡病毒(fortmorgan)、盖他病毒、孜拉加奇病毒、马雅罗、马雅罗病毒、米德尔堡(middleburg)、穆坎布病毒、恩杜茂病毒、皮克斯纳病(pixunavirus)、罗斯河病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒、图那特病毒、特里尼蒂病毒(triniti)、una、委内瑞拉马脑炎、西部马脑炎、瓦塔罗阿病毒和y-62-33。13.优选地，rna构建体包含或衍生自病毒，所述病毒选自由以下组成的物种的组的：委内瑞拉马脑炎病毒(veev)；肠道病毒71；脑心肌炎病毒；库京病毒以及中东呼吸道综合征病毒。优选地，所述载体衍生自veev。14.所述rna构建体包含编码至少一种治疗性生物分子的序列。所述至少一种治疗性生物分子可包含或是疫苗构建体或治疗性蛋白质。本领域技术人员可以理解，治疗性蛋白质涉及优选在人类中具有治疗应用的任何蛋白质。可由rna分子编码的示例性治疗性生物分子包括衍生自诸如细菌、病毒、真菌、原生动物/或寄生生物的病原体的蛋白质和肽。优选地，所述蛋白质和肽是抗原。15.衍生自病毒的蛋白质和肽可以是病毒抗原。所述病毒抗原可衍生自选自由以下组成的组的病毒：正黏液病毒；副黏液病毒科病毒；偏肺病毒和麻疹病毒；肺炎病毒；副粘病毒；痘病毒科；偏肺病毒；麻疹病毒；小核糖核酸病毒；肠道病毒；布尼亚病毒；白蛉病毒；内罗病毒；嗜肝rna病毒；披膜病毒；甲病毒；动脉炎病毒；黄病毒；瘟病毒；嗜肝dna病毒；弹状病毒；杯状病毒科；冠状病毒；逆转录酶病毒；呼吸道肠道病毒；细小病毒；丁型肝炎病毒(hdv)；戊型肝炎病毒(hev)；人类疱疹病毒和乳多泡病毒。16.正黏液病毒可以是甲型流感、乙型流感和丙型流感。副粘病毒科病毒可以是肺炎病毒(rsv)、副粘病毒(piv)。偏肺病毒可以是麻疹病毒(如麻疹)。肺炎病毒可以是呼吸道合胞病毒(rsv)、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒或火鸡鼻气管炎病毒。副粘病毒可以是1-4型副流感病毒(piv)、流行性腮腺炎、仙台病毒、猿猴病毒5、牛副流感病毒、尼帕病毒、亨尼病毒或新城疫病毒。痘病毒科可以是天花病毒，例如大天花和小天花。偏肺病毒可以是人偏肺病毒(hmpv)或禽类偏肺病毒(ampv)。麻疹病毒可以是麻疹。小核糖核酸病毒可以是肠道病毒、鼻病毒、嗜肝rna病毒、副肠孤病毒、心病毒和口蹄疫病毒。肠道病毒可以是1、2或3型脊髓灰质炎病毒；1至22和24型柯萨奇a病毒；1至6型柯萨奇b病毒；1至9、11至27和29至34型艾柯病毒(echo)病毒或肠道病毒68至71。布尼亚病毒可以是加利福尼亚脑炎病毒。白蛉病毒可以是裂谷热病毒。内罗病毒可以是克里米亚-刚果出血热病毒。嗜肝rna病毒可以是甲肝病毒(hav)。披膜病毒可以是风疹病毒。黄病毒可以是蜱传脑炎(tbe)病毒、登革热(1、2、3或4型)病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、西尼罗河脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、俄罗斯春夏脑炎病毒或波瓦桑脑炎病毒。瘟病毒可以是牛病毒性腹泻病毒(bvdv)、古典猪瘟病毒(csfv)或边界病病毒(bdv)。嗜肝dna病毒可以是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。弹状病毒可以是狂犬病病毒(狂犬病病毒)或水疱性病毒(vsv)。杯状病毒科可以是诺沃克病毒，或诺沃克样病毒，如夏威夷病毒和雪山病毒。冠状病毒可以是sarscov-1、sars-cov-2、mers、人类呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎病毒(ibv)、小鼠肝炎病毒(mhv)或猪传染性胃肠炎病毒(tgev)。逆转录酶病毒可以是肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。呼吸道肠道病毒可以是正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗病毒。细小病毒可以是细小病毒b19。人类疱疹病毒可以是单纯疱疹病毒(hsv)、水痘-带状疱疹病毒(vzv)、艾巴氏病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)、人类疱疹病毒6(hhv6)、人类疱疹病毒7(hhv7)或人类疱疹病毒8(hhv8)。乳多泡病毒也可以是乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或沙粒病毒。17.如实施例和图13中所示，在优选的实施方案中，病毒抗原可以是狂犬病病毒抗原，优选狂犬病病毒糖蛋白。在另一优选的实施方案中，如实施例和图29所示，病毒抗原可以是冠状病毒抗原。优选地，冠状病毒抗原是表面糖蛋白，更优选sars-cov-2表面糖蛋白。18.衍生自细菌的蛋白质和肽可以是细菌抗原。19.所述细菌抗原可以衍生自细菌，所述细菌选自由以下组成的组：脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎双球菌、酿脓链球菌、卡他莫拉菌、百日咳博代氏杆菌、伯克霍尔德氏菌属(例如，鼻疽伯克霍尔德氏菌、类鼻疽伯克霍尔德氏菌和洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacepacia))、金黄色酿脓葡萄球菌、流感嗜血杆菌(haemophilusinkuenzae)、破伤风梭菌(破伤风)、产气荚膜梭菌、肉毒杆菌、白喉棒状杆菌(白喉)、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、伯氏考克斯氏体、布鲁氏菌(例如，流产布鲁氏菌(b.abortus)、犬属布鲁氏菌(b.canis)、马耳他布鲁氏菌(b.melitensis)、沙漠森林野鼠种布氏菌(b.neotomae)、羊属布鲁氏菌(b.ovis)、猪布鲁氏菌(b.suis)和鳍型布鲁氏菌(b.pinnipediae))、弗朗西斯氏菌属(jfrancisellasp.)(例如，新凶手弗朗西斯菌(f.novicida)、蜃楼弗朗西斯菌(f.philomiragia)、土拉弗朗西斯菌(f.tularensis))、无乳链球菌、淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、梅毒螺旋体(梅毒)、杜克雷嗜血杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、幽门螺杆菌、腐生葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠杆菌、炭疽杆菌(炭疽)、鼠疫耶尔森菌(瘟疫)、结核分支杆菌、立克次氏体、李斯特菌、肺炎衣原体、霍乱弧菌、伤寒沙门氏菌(伤寒症)、氏疏螺旋体、卟啉单胞菌和克雷伯氏菌。20.衍生自真菌的蛋白质和肽可以是真菌抗原。21.所述真菌抗原可以衍生自真菌的真菌抗原，所述真菌选自由以下组成的组：皮霉(dermatophytres)，包括：表皮癣菌、奥杜安氏小孢子菌、犬小孢子菌、扭曲小孢子菌(microsporumdistortum)、马类小孢子菌、石膏小孢子菌(microsporumgypsum)、猪小孢子菌、同心毛癣菌、马毛癣菌、鸡毛癣菌、石膏样毛癣菌(trichophytongypseum)、麦格毛菌、须毛癣菌、昆克努发癣菌(trichophytonquinckeanum)、红色毛癣菌、许兰黄癣菌、断发毛癣菌、疣状癣菌、疣状发癣菌白色变种、盘状变种、赭黄变种，紫色毛癣菌和/或蜜块状毛癣菌(trichophytonfaviforme)；或衍生自烟曲霉菌、黄柄曲霉(aspergilluskavus)、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、萨氏曲霉(aspergillussydowi)、kavatus曲霉、灰绿曲霉、芽生裂殖菌、白色念珠菌、烯醇酶假丝酵母(candidaenolase)、热带念珠菌、光滑念珠菌、克鲁斯假丝酵母、近平滑念珠菌、类星形念珠菌、克鲁斯假丝酵母、帕拉克斯假丝酵母(candidaparakwsei)、葡萄牙假丝酵母、伪热带念珠菌、季也蒙假丝酵母、卡氏枝孢霉(cladosporiumcarrionii)、粗球孢子菌、皮炎芽生菌、新型隐球菌、棒地霉、荚膜组织胞浆菌、肺炎克雷伯氏菌、微孢子虫目(microsporidia)、脑胞内原虫属(encephalitozoonspp.)、肠隔膜虫和双肠肠虫(septataintestinalisandenterocytozoonbieneusi)、虫属实菌(brachiolaspp)、微孢子虫属、小孢子虫属(nosemaspp.)、匹里虫属(pleistophoraspp.)、人气管普孢虫属(trachipleistophoraspp.)、条抱虫属(vittaformaspp)、巴西副球孢子菌、卡氏肺孢子虫、隐袭腐霉、卵状糠秕孢子菌、酿酒酵母、布拉迪酵母(saccharomycesboulardii)、粟酒裂殖酵母、尖端赛多孢子菌、申克孢子丝菌、白吉利毛孢子菌、弓形虫(toxoplasmagondii)、马尔尼菲青霉、马拉色菌属、着色真菌属、万吉拉菌(wangiellaspp.)、孢子丝菌属、蛙粪霉属、耳霉属、根霉属、毛霉菌属、犁头霉属、被孢霉属、小坎宁安霉属(cunninghamellaspp)、瓶霉属、链格孢菌属、知菌弯孢霉属(curvulariaspp)、长蠕孢霉属、镰胞菌属、曲霉菌属、青霉菌属、链核盘菌属、丝核菌属、拟青霉属、皮司霉属和枝孢霉属。22.衍生自原生动物的蛋白质和肽可以是原生动物抗原。23.所述原生动物抗原可以衍生自原生动物，所述原生动物选自由以下组成的组：痢疾变形虫、贾第鞭毛虫、隐孢子虫、卡耶塔环孢子球虫和弓形体。24.所述治疗性生物分子可以是衍生自植物的蛋白质和肽。优选地，所述蛋白质和肽是植物抗原。所述植物抗原可以衍生自蓖麻。25.在另一实施方案中，所述治疗性生物分子可以是免疫原或抗原。优选地，所述免疫原或抗原是肿瘤免疫原或抗原或癌症免疫原或抗原。所述肿瘤免疫原和抗原可以是含肽的肿瘤抗原，如多肽肿瘤抗原或糖蛋白肿瘤抗原。26.所述肿瘤抗原可是(a)与癌细胞相关的全长分子、(b)其同系物和修饰的形式，包括具有缺失、添加和/或取代部分的分子、和(c)其片段。27.合适的肿瘤免疫原包括：由cd8 淋巴细胞识别的i类限制性抗原或由cd4 淋巴细胞识别的ii类限制性抗原。28.所述肿瘤抗原可是与癌症相关的抗原，所述癌症选自由以下组成的组：睾丸癌、黑色素瘤、肺癌、头颈癌、nsclc、乳腺癌、胃肠癌、膀胱癌、结直肠癌、胰腺癌、淋巴瘤、白血病、肾癌、肝癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌。29.所述肿瘤抗原可选自：30.(a)癌症-睾丸抗原如ny-eso-i、ssx2、scpl以及rage、bage、gage和mage家族多肽，例如，gage-1、gage-2、mage-1、mage-2、mage-3、mage-4、mage-5、mage-6和mage-12(例如，其可以用于解决黑色素瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、nsclc，乳腺肿瘤、胃肠肿瘤和膀胱肿瘤)；31.(b)突变的抗原，例如，p53(与多种实体瘤，例如结直肠癌、肺癌、头颈部癌相关)、p21/ras(与例如黑色素瘤、胰腺癌和结直肠癌相关)、cdk4(与例如黑色素瘤相关)、mum1(与例如黑色素瘤相关)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(与例如头颈癌相关)、cia0205(与例如膀胱癌相关)、hla-a2-r1701、β连环蛋白(与例如黑色素瘤相关)、tcr(与例如t-细胞非霍奇金斯淋巴瘤相关)、bcr-abl(与例如慢性髓性白血病相关)、磷酸丙糖异构酶、kia0205、cdc-27和ldlr-fut；32.(c)过表达的抗原，例如半乳糖凝集素4(与例如结直肠癌相关)、半乳糖凝集素9(与例如霍奇金病相关)、蛋白酶3(与例如慢性粒细胞白血病相关)、wt1(与例如多种白血病相关)、碳酸酐酶(与例如肾癌相关的)、醛缩酶a(与例如肺癌相关)、prame(与例如黑色素瘤相关的)、her-2/neu(与例如乳腺癌、结肠癌、肺癌和卵巢癌相关)、甲胎蛋白(与例如肝癌相关)、ksa(与例如结直肠癌相关)、胃泌素(与例如胰腺癌和胃癌相关)、端粒酶催化蛋白、muc-i(与例如乳腺癌和卵巢癌相关)、g-250(与例如肾细胞癌相关)、p53(与例如乳腺癌、结肠癌相关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌、肺癌和诸如如结直肠癌的胃肠癌症相关)33.(d)共有抗原(sharedantigen)，例如，黑色素瘤-黑色素细胞分化抗原，如mart-1/melana、gploo、mc1r、促黑色素细胞激素受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白-1/trpl和酪氨酸酶相关蛋白-2/trp2(与例如黑色素瘤相关)；34.(e)前列腺相关的抗原，如pap、psa、psma、psh-pl、psm-pl、psm-p2，与例如前列腺癌相关；和/或35.(f)免疫球蛋白个体基因型(例如，与骨髓瘤和b细胞淋巴瘤相关)。36.所述治疗性生物分子可以是真核生物多肽。在一个实施方案中，所述真核生物多肽是哺乳动物多肽。所述哺乳动物多肽可以选自由以下组成的组：酶；酶抑制剂；激素；免疫系统蛋白质；受体；结合蛋白；转录或翻译因子；肿瘤生长抑制蛋白；结构蛋白；和血蛋白。37.所述酶可以选自由以下组成的组：凝乳酶；胃脂肪酶；组织纤溶酶原激活物；链激酶；胆固醇生物合成或降解甾体生成酶；激酶；磷酸二酯酶；甲基酶；去甲基酶；脱氢酶；纤维素酶；蛋白酶；脂肪酶；磷脂酶；芳香酶；细胞色素；腺苷酸或鸟苷酸环化酶和神经酰胺酶。38.所述酶抑制剂可以是金属蛋白酶的组织抑制剂(timp)。所述激素可以是生长激素。39.所述免疫系统蛋白可以选自由以下组成的组：细胞因子；趋化因子；淋巴因子；促红细胞生成素；整合素；地址素；选择素；归巢受体；t细胞受体和免疫球蛋白。40.所述细胞因子可以是白细胞介素，例如il-2、il-4和/或il-6；集落刺激因子(csf)；粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)或肿瘤坏死因子(tnf)。41.所述趋化因子可以是巨噬细胞炎症蛋白-2和/或纤溶酶原激活物。42.所述淋巴因子可以是干扰素。43.所述免疫球蛋白可以是天然的、经修饰的或嵌合的免疫球蛋白或其片段。优选地，免疫球蛋白是具有双重活性的嵌合免疫球蛋白，如抗体酶或抗体-毒素嵌合体。44.所述激素可以选自由以下组成的组：胰岛素、甲状腺激素、儿茶酚胺、促性腺激素、促激素、泌乳素、催产素、多巴胺、牛生长激素、瘦素、生长激素(例如，人生长激素)、生长因子(例如表皮生长因子、神经生长因子、胰岛素样生长因子等)。45.所述受体可以是类固醇激素受体或肽受体。优选地，所述受体是生长因子受体。46.所述结合蛋白可以是生长因子结合蛋白。47.所述肿瘤生长抑制蛋白质可以是抑制血管生成的蛋白质。48.所述结构蛋白可以选自由以下组成的组：胶原蛋白；丝心蛋白；纤维蛋白原；弹性蛋白；微管蛋白；肌动蛋白和肌球蛋白。49.所述血蛋白可以选自由以下组成的组：凝血酶；血清白蛋白；因子vii；因子viii；胰岛素；因子ix；因子x；组织纤溶酶原激活物；蛋白c；血管性假血友病因子；抗凝血酶iii；葡糖脑苷脂酶；促红细胞生成素粒细胞菌落刺激因子(gcsf)或经修饰的因子viii；和抗凝血剂。50.在一个优选的实施方案中，所述治疗性生物分子是能够调节淋巴内稳态的细胞因子，优选地为参与并优选诱导或增强t细胞的发育、启动、扩增、分化和/或存活的细胞因子。因此，优选地，所述细胞因子是白细胞介素。最优选il-2、il-7、il-12、il-15或il-21。51.所述治疗性生物分子可以是能够增强将体细胞重编程为具有干细胞特性的细胞的蛋白质。52.能够增强将体细胞重新编程为具有干细胞特性的细胞的蛋白质可以选自由以下组成的组：oct4、sox2、nanog、lin28、p53、art-4、bage、ss-连环蛋白/m、bcr-ablcamel、cap-1、casp-8、cdc27/m、cd4/m、cea、claudin-12、c-myc、ct、cyp-b、dam、elf2m、etv6-aml1、g250、gage、gnt-v、gaploo、hage、her-2/neu、hpv-e7、hpv-e6、hast-2、htert(或htrt)、lage、ldlr/fut、mage-a、mage-b、mage-c、mart-l/melan-a、mc1r、肌球蛋白/m、muc1、mum-1,-2,-3、na88-a、nf1、ny-eso-1、ny-br-1、pl90minorbcr-abl、plac-1、pml/rara、prame、蛋白酶3、psa、psm、rage、ru1或ru2、sage、sart-1或sart-3、scgb3a2、scp1、scp2、scp3、ssx、survivin、tel/aml1、tpi/m、trp-1、trp-2、trp-2/int2、tpte和wt，优选wt-1。53.优选地，mage-a选自由以下组成的组：mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11或mage-a12。54.优选地，能够增强将体细胞重编程为具有干细胞特性的蛋白质是oct4、sox2、lf4、c-myc、nanog、lin28。55.所述治疗性生物分子可以是用于离体修饰细胞以用于细胞疗法适应症的生物分子。因此，优选的治疗性生物分子可以选自由免疫球蛋白、t细胞受体和nk受体组成的组。56.所述治疗性生物分子可以是能够调节内源宿主基因表达的rna分子，例如干扰rna，如小rna、sirna或microrna。57.优选地，所述rna构建体包含编码至少一种先天抑制剂蛋白(iip)的基因，所述先天抑制剂蛋白能够减少或阻断对rna的先天免疫反应。优选通过iip通过减少或阻断由含有本发明的rna构建体的宿主细胞产生的rna(优选长rna(本领域技术人员将理解为意指长度为至少1kb的rna)或dsrna)的识别实现减少或阻断对rna的先天免疫反应。更优选地，先天抑制剂蛋白是一种先天抑制蛋白，使得能够减少或阻断对rna优选第一方面的rna构建体的rna的先天反应。先天抑制剂蛋白能够减少或防止细胞溶质sarna被模式识别受体的识别，这种识别导致干扰素调节因子3和7(irf3和irf7)以及nf-κb转录因子的激活，直接触发一系列抗病毒基因(例如，已知抑制sarna表达的ifit1-3、mx1、mx2)、其产物协调先天免疫反应的促炎基因以及任何干扰素依赖性级联上游的经典ifn刺激基因(isg)的直接激活。通过诱导i型和iii型干扰素可增强这些途径，所述i型和iii型干扰素提供进一步放大许多抗病毒反应的正反馈回路。58.所述rna可以是单链rna或双链rna。优选地，所述rna是sarna。59.所述至少一种先天抑制剂蛋白能够：(i)减少或阻断黑色素瘤分化相关蛋白5(mda5)的作用，例如通过阻止mda5的寡聚化以及mda5与rna的结合，和/或(ii)阻断或减少pact与rna的结合，也可以称为pkr激活蛋白与rna的结合。本领域技术人员将理解，这些传感蛋白(sensor)传输信号以将信号转导至下游线粒体接合体、线粒体抗病毒信号传导(mavs)激活下游级联，包括转录因子(nf-κb、irf-3、irf-7)的激活。这反过来导致适当的抗病毒信号反应和编码具有抗病毒活性的分子的i型干扰素刺激基因(包括已知抑制sarna表达的ifit1)的激活。60.阻断mda5作用的至少一种先天抑制剂蛋白可以选自由以下组成的组：副粘病毒v蛋白、柯萨奇病毒a16、柯萨奇病毒a6和肠道病毒d68病毒的3c蛋白、双rna病毒的vp3蛋白、猪δ冠状病毒的辅助蛋白ns6；和脑心肌炎病毒的2c蛋白；及其直系同系物。61.优选地，阻断mda5作用的所述至少一种先天抑制剂蛋白是副粘病毒v蛋白。最优选地，阻断mda5作用的所述至少一种先天抑制剂蛋白是副流感病毒5型v蛋白(piv5v)。62.阻断或减少pact与rna的结合的所述至少一种先天抑制剂蛋白可以选自由以下组成的组：任何冠状病毒的orf4a(ns4a)、任何冠状病毒的orf3b或小鼠肝炎病毒和sars(冠状病毒)的核衣壳蛋白；及其直系同系物。63.优选地，orf4a(ns4a)是中东呼吸综合征冠状病毒mers冠状病毒(orf4a)。64.优选地，冠状病毒orf3b是sars-c0v2orf3b。65.以下提供piv5v、orf4a和orf3b的每个的蛋白质、dna和rna序列。66.在一个实施方案中，本文提供为seqidno：11的piv5v多肽，如下：[0067][0068]相应地，优选地，piv5v多肽包含基本上如seqidno：11所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：11或其生物活性变体或片段的rna核苷酸序列。[0069]在一个实施方案中，piv5v多肽由seqidno：12的核苷酸序列编码，如下：[0070][0071]相应地，优选地，piv5v多肽由基本上如seqidno：12所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0072]因此，所述rna构建体可包含seqidno：47的rna核苷酸序列，如下：[0073][0074]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：47所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0075]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：15的mers-covorf4a多肽，如下：[0076][0077]相应地，优选地，mers-covorf4a多肽包含基本上如seqidno：15所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：15或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0078]在一个实施方案中，mers-covorf4a多肽由seqidno：16的核苷酸序列编码，如下：[0079][0080]相应地，优选地，mers-covorf4a多肽由基本上如seqidno：16所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0081]因此，所述rna构建体可包含seqidno：48的rna核苷酸序列，如下：[0082]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：48所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0083]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：20的sars-cov-2orf3b多肽，如下：[0084][0085]相应地，优选地，sars-cov-2orf3b多肽包含基本上如seqidno：20所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：20或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0086]在一个实施方案中，sars-cov-2orf3b多肽由seqidno：55的核苷酸序列(登陆号.nc_045512.2；核苷酸25814-26050)编码，如下：[0087][0088]相应地，优选地，sars-cov-2orf3b多肽由基本上如seqidno：55所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0089]因此，所述rna构建体可包含seqidno：56的rna核苷酸序列，如下：[0090][0091]相应地，因此，优选地，rna构建体包含基本上如seqidno：56所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0092]在另一实施方案中，所述至少一种先天抑制剂蛋白质可以能够抑制mda5激活的下游通路或阻断dsrna的mda/pact识别的下游通路。[0093]能够抑制mda5激活的下游通路或阻断dsrna的mda/pact识别的下游通路的所述至少一种先天抑制剂蛋白可以选自由以下组成的组：hsv-2us1；hsv-1us1；hsv-1us11；ov20.0l；bvdvnpro；兰加特病毒ns5；和流感ns1。[0094]本领域技术人员将理解，能够抑制mda5激活的下游通路或阻断dsrna的mda/pact识别的下游通路的所述至少一种先天抑制剂蛋白可以与阻断mda5的作用的所述至少一种先天抑制剂蛋白和/或阻断或减少pact与rna的结合的所述至少一种先天抑制剂蛋白组合使用。[0095]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：1所示的hsv-2us1多肽，如下：[0096][0097]相应地，优选地，hsv-2us1多肽包含基本上如seqidno：1所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：1或其生物活性变体或片段的rna核苷酸序列。[0098]在一个实施方案中，hsv-2us1多肽由seqidno：2的核苷酸序列编码，如下：[0099][0100]相应地，优选地，hsv-2us1多肽由基本上如seqidno：2所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0101]因此，所述rna构建体可包含seqidno：42的rna核苷酸序列，如下：[0102][0103]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：42所示的rna核苷酸序列或其生物活性变体或片段。[0104]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：3所示的hsv-1us1多肽，如下：[0105][0106]相应地，优选地，hsv-1us1多肽包含基本上如seqidno：3所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：3或其生物活性变体或片段的rna核苷酸序列。[0107]在一个实施方案中，hsv-1us1多肽由seqidno：4的核苷酸序列编码，如下：[0108][0109]相应地，优选地，hsv-1us1多肽由基本上如seqidno：4所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0110]因此，所述rna构建体可包含seqidno：43的rna核苷酸序列，如下：[0111][0112]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：43所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0113]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：5所示的hsv-1us11多肽，如下：[0114][0115]相应地，优选地，hsv-1us11多肽包含基本上如seqidno：5所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：5或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0116]在一个实施方案中，hsv-1us11多肽由seqidno：6的核苷酸序列编码，如下：[0117][0118]相应地，优选地，hsv-1us11多肽由基本上如seqidno：6所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0119]因此，所述rna构建体可包含seqidno：44的rna核苷酸序列，如下：[0120][0121]相应地，因此，优选地，rna构建体包含基本上如seqidno：44所示的rna核苷酸序列或其变体或片段编码。[0122]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：7的ov20.0l多肽，如下：[0123][0124]相应地，优选地，ov20.0l多肽包含基本上如seqidno：7所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：7或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0125]在一个实施方案中，ov20.0l多肽由seqidno：8的核苷酸序列编码，如下：[0126][0127]相应地，优选地，ov20.0l多肽由基本上如seqidno：8所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0128]因此，rna构建体可包含seqidno：45的rna核苷酸序列，如下：[0129][0130]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：45所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0131]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：9所示的bvdvnpro多肽，如下：[0132][0133]相应地，优选地，bvdvnpro多肽包含基本上如seqidno：9所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：9或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0134]在一个实施方案中，bvdvnpro多肽由seqidno：10的核苷酸序列编码，如下：[0135][0136]相应地，优选地，bvdvnpro多肽由基本上如seqidno：10所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0137]因此，所述rna构建体可包含seqidno：46的rna核苷酸序列，如下：[0138]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：46所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0139]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：17的兰加特ns5多肽，如下：[0140]相应地，优选地，兰加特ns5多肽包含基本上如seqidno：17所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：17或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0141]在一个实施方案中，兰加特ns5多肽由seqidno：18的核苷酸序列编码，如下：[0142][0143]相应地，优选地，兰加特病毒ns5多肽由基本上如seqidno：18所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0144]因此，所述rna构建体可包含seqidno：49的rna核苷酸序列，如下：[0145]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：49所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0146]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：13的流感ns1多肽(登录号dq508893)如下：[0147][0148]因此，优选地，所述流感ns1多肽包含基本上如seqidno：13所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。因此，第一方面的rna构建体优选包含编码seqidno：13或其变体或片段的rna核苷酸序列。[0149]在一个实施方案中，所述流感ns1多肽由seqidno：14的核苷酸序列编码，如下：[0150][0151]相应地，优选地，所述流感ns1多肽由基本上如seqidno：14所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0152]因此，所述rna构建体可包含seqidno：19的rna核苷酸序列，如下：[0153][0154]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：19所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0155]优选地，所述先天抑制剂蛋白选自由以下组成的组：hsv-2us1；hsv-1us11；ov20.0l；bvdvnpro；piv5v；mers-covorf4a；sars-cov-2orf3b；兰加特病毒ns5和流感ns1。[0156]优选地，所述先天抑制剂蛋白选自由以下组成的组：hsv-2us1；hsv-1us11；ov20.0l；bvdvnpro；piv5v；mers-covorf4a；和兰加特病毒ns5。[0157]优选地，所述先天抑制剂蛋白选自由以下组成的组：hsv-2us1；hsv-1us11；ov20.0l；bvdvnpro；piv5v；和mers-covorf4a。[0158]如实施例所述，通过筛选多种多样的iip的过程，本发明人鉴定了两种高度有效的iip，令人惊讶地它们能够在体外和体内显著增强sarna的表达：副流感病毒5型v蛋白(piv-5)-mda5激活的抑制剂和中东呼吸综合征(mers)冠状病毒orf4a-pact/mda激活的抑制剂。本发明人使用了这两种新型iip，即piv-5和mers-covorf4a，先前它们没有被用来减弱复制子rna的先天感知。本发明人已经表明，这些构建体可以成为使人类中的rna疫苗和疗法具有更高的效力的下一代rna复制子。本发明人认为，无论是在甲病毒、小核糖核酸病毒、黄病毒还是冠状病毒的复制子中表达，它们都将具有重要的实用性。[0159]因此，最优选地，所述先天抑制剂蛋白是piv-5和/或mers-covorf4a，本领域技术人员将理解它也可以被称为ns4a。[0160]这样的构建体与现有技术中描述的构建体相比显示出许多优势，包括：[0161]i)将piv-5和orf4a蛋白直接插入veev复制子，从而实现vpii蛋白和目的基因的双蛋白表达。[0162]ii)相对于提供一条编码目的基因(goi)(即治疗性生物分子)、另一条编码iip的两条不同rna链，递送一条链，从而确保rna和先天抑制剂蛋白共同定位；[0163]iii)iip抑制rna的先天感知，从而实现更高的蛋白质表达；[0164]iv)iip表达本身由于与goi在亚基因组链上共同表达而被自扩增；和/或[0165]v)与传统的veevrna复制子构建体相比，提高了蛋白质表达量和持续时间两者。[0166]编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列可以设置在rna构建体或复制子序列内的任何地方，例如可以将编码所述至少一种目的肽或蛋白的序列设置在编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'或3'处。[0167]然而，优选地，编码所述至少一种目的肽或蛋白的序列设置在编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'处。[0168]优选地，根据第一方面的rna构建体包含基因组的或亚基因组的至少一个启动子。优选地，所述启动子是亚基因组启动子。[0169]本领域技术人员可以理解，亚基因组启动子是指与编码所述至少一种治疗性生物分子和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列可操作地连接的启动子，从而实现编码治疗性生物分子和至少一种先天抑制剂蛋白的核苷酸序列的转录。[0170]优选地，所述亚基因组启动子是26s，本文提供为seqidno：57的26s，如下：[0171][0172]因此，优选的启动子(优选地亚基因组启动子)是基本上如seqidno：57所示或其变体或片段。[0173]在一个实施方案中，同一启动子与编码所述至少一种目的肽或蛋白质的序列和编码所述至少一种先天抑制剂的序列可操作的连接。[0174]本发明人的设计(其中在一条链上编码goi(即治疗性生物分子)和iip两者)有利地实现了使用更小剂量的rna，因为它确保了在感知rna的同一细胞中表达而且还可以复制蛋白质，因此具有放大先天抑制成分的另外方面。[0175]因此，在一个实施方案中，将启动子设置在编码所述目的肽或蛋白质(即治疗性生物分子)的序列和编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'处，使得所述启动子与这两条序列可操作的连接。[0176]在另一实施方案中，第一启动子与编码所述至少一种目的肽或蛋白质(即治疗性生物分子)的序列可操作的连接，第二启动子与编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列可操作的连接。[0177]所述rna构建体可编码至少两个、三个、四个或五个iip。在其中有一个以上编码先天抑制物蛋白的序列的实施方案中，单个启动子可与编码先天抑制物蛋白的所有序列可操作的连接。或者，启动子可以与编码先天抑制物蛋白的至少一个其他序列中的每个连接，使得每个先天抑制物蛋白可操作的与独立的启动子连接。在这个实施方案中，独立的启动子可以包含相同的启动子序列或不同的启动子序列。在另一实施方案中，将不同的启动子与编码先天抑制剂蛋白的每个序列可操作的连接。[0178]所述rna构建体可进一步包括设置在编码所述至少一种目的肽或蛋白质(即治疗性生物分子)的序列和编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列之间的接头。[0179]在一个实施方案中，所述连接序列包含编码肽间隔的序列，该肽间隔被配置为被消化以由此将目的基因编码的所述至少一种治疗性生物分子和所述至少一种先天抑制剂蛋白分离。因此，优选地，将间隔序列设置在编码所述至少一种目的肽或蛋白的序列和编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列之间。[0180]因此，所述间隔物序列优选为可切割肽，例如2a肽。合适的2a肽包括猪捷申病毒-12a(p2a)-atnfsllkqagdveenpgp(seqidno：21)、东亚细亚(thoseaasigna)病毒2a(t2a)-qctnyallklagdvesnpgp(seqidno：22)、马鼻炎a病毒2a(e2a)以及口蹄疫病毒2a(f2a)vkqtlnfdllklagdvesnpgp(seqidno：23)。优选地，所述2a肽是东亚细亚病毒2a(t2a)。[0181]在另一实施方案中，可切割肽是自切割肽。优选地，所述自切割肽是弗林蛋白酶/2a肽。可以将弗林蛋白酶序列设置在2a序列的3'或5'处。然而，优选地，将弗林蛋白酶序列设置在2a序列的5'处，且优选具有设置在弗林蛋白酶和2a序列之间的gsg间隔。[0182]本领域技术人员将理解，弗林蛋白酶是位于分泌通路中(主要在高尔基体和跨高尔基体网络中)的普遍存在的钙依赖性原蛋白转化酶，在特定识别序列-标准r-x-r/k/x-r(seqidno：24)处切割前体蛋白，在最后的r后切割原蛋白。因此，在一个实施方案中，弗林蛋白酶序列是r-x-r/k/x-r。然而，优选地，弗林蛋白酶序列是优化的序列rrrrrr(seqidno：25)-gsg序列。优选地，gsg间隔设置在弗林蛋白酶序列的3'和2a序列的5'处。[0183]因此，优选地，所述间隔序列是弗林蛋白酶/t2a，如ncbi参考序列genbank：aac97195.1所提供的，本文提供为seqidno：26的间隔物序列，如下：[0184][0185]因此，优选地，所述间隔序列包含基本上如seqidno：26所示的氨基酸序列，或其变体或片段。[0186]在其中rna构建体或复制子包含一个以上编码先天抑制剂蛋白的序列的实施方案中，所述复制子可以具有设置在每个编码先天抑制剂蛋白的序列之间或设置在仅一些iip之间的连接序列。[0187]在一个实施方案中，所述至少一个编码治疗性生物分子的序列和所述至少一个先天抑制剂蛋白可以被后其后是够启动下游序列翻译的内部核糖体进入位点(ires)序列的终止密码子隔开。典型的ires序列包括诸如脑心肌炎病毒或血管内皮生长因子和l型胶原诱导蛋白(vcip)的ires序列的那些序列，并且是本领域技术人员已知的。因此，优选地，ires序列设置在编码所述至少一种目的肽或蛋白的序列和编码所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列之间。在使用多个编码所述至少一个先天抑制剂蛋白的序列时，间隔序列可以包括已知切割序列和/或ires序列的组合。[0188]在另一实施方案中，编码所述至少一种治疗性生物分子和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列可以被其后是能够启动下游序列转录的第二亚基因组启动子序列的终止密码子隔开。[0189]所述rna构建体可以编码至少一种非结构蛋白(nsp)，所述至少一种nsp设置在编码所述至少一种目的肽或蛋白和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'或3'处。优选地，编码所述至少一种nsp的序列设置在编码所述目的肽或蛋白质和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的5'处。因此，优选地，编码所述至少一种nsp的序列设置在rna构建体的5'端。[0190]由所述rna构建体编码的至少一种非结构蛋白可以是rna聚合酶nsp4。优选地，所述构建体编码nsp1、nsp2、nsp3和nsp4。本领域技术人员将理解，nsp1是病毒加帽酶且是复制子复合物(rc)的膜锚定点，nsp2是一种rna解旋酶并为负责ns多聚蛋白加工的蛋白酶。nsp3与几种宿主蛋白相互作用并可以调节蛋白的多聚-和单聚-adp-核糖基化，nsp4是核心病毒rna依赖的rna聚合酶。[0191]在一个实施方案中，本文提供了为seqidno：27的nsp1，如下：[0192][0193]相应地，nsp1优选包含基本上如seqidno：27所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。[0194]在一个实施方案中，nsp1由seqidno：28中定义的核苷酸序列编码，如下：[0195][0196]相应地，nsp1优选地由基本上如seqidno：28中所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0197]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：50所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0198][0199]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：29的nsp2，如下：[0200][0201]相应地，nsp2优选包含基本上如seqidno：29所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。[0202]在一个实施方案中，nsp2由seqidno：30中定义的核苷酸序列编码，如下：[0203][0204]相应地，优选地，nsp2由基本上如seqidno：30中所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0205]因此，所述rna构建体可以包含seqidno：51，如下：[0206][0207]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：51所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0208]在一个实施方案中，本文提供为seqidno：31的nsp3，如下：[0209][0210]相应地，nsp3优选包含基本上如seqidno：31所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。[0211]在一个实施方案中，nsp3由seqidno：32中定义的核苷酸序列编码，如下：[0212]相应地，优选地，nsp3由基本上如seqidno：32中所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0213]因此，所述rna构建体可以包含seqidno：52，如下：[0214][0215]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：52所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。在一个实施方案中，本文提供为seqidno：33的nsp4，如下：[0216][0217]相应地，nsp4优选包含基本上如seqidno：33所示的氨基酸序列或其生物活性变体或片段。[0218]在一个实施方案中，nsp4由seqidno：34中定义的核苷酸序列编码，如下：[0219][0220]相应地，优选地，nsp4由基本上如seqidno：34所示的核苷酸序列或其变体或片段编码。[0221]因此，所述rna构建体可以包含seqidno：53，如下：[0222][0223]相应地，因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：53所示的rna核苷酸序列或其变体或片段。[0224]优选地，与存在于宿主细胞中的蛋白质一起，由本发明的rna构建体编码的非结构蛋白形成酶复合物，所述酶复合物是编码所述至少一种目的肽或蛋白质和所述至少一种先天抑制剂蛋白的序列的基因组复制和转录所必需的。例如，所述一个或多个非结构蛋白可以编码聚合酶，以使构建体能够扩增编码所述至少一种目的肽或蛋白和所述至少一种先天抑制剂蛋白的核苷酸序列。[0225]所述宿主细胞可以是真核生物或原核生物宿主细胞。优选地，所述宿主细胞是真核生物宿主细胞。更优选地，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。[0226]所述rna构建体可进一步包括设置在至少一种非结构蛋白5'处的启动子，使得启动子与编码所述至少一种非结构蛋白的序列可操作的连接，并使所述至少一种非结构蛋白能够在宿主细胞中表达。[0227]优选地，所述启动子包含5'utr保守序列元件，在本文中可以被称为seqidno：54，如下：[0228][0229]相应地，优选地，utr设置在所述至少一种非结构蛋白的5'处，并包含基本上如seqidno：54所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0230]优选地，复制子包含polya尾。优选地，polya尾设置在复制子的3'端。复制子可进一步包括5'帽。在本发明的上下文中，术语“5'-帽”包括5'-帽类似物，其类似于rna帽结构并被修饰为，优选地在体内和/或在细胞中，如果连接在rna上具有稳定rna和/或增强rna翻译的能力。[0231]可以在所述5'-帽存在的情况下通过体外转录dna模板得到带有5'-帽的rna，其中所述5'-帽被共同转录地掺入到生成的rna链中，或者可以例如，通过体外转录等方式生成所述rna，5'-帽可以通过使用加帽酶(例如牛痘病毒的加帽酶)连接到转录后的rna上。在加帽的rna中，(加帽的)rna分子的第一个碱基的3'位置通过磷酸二酯键与rna分子的后续碱基(“第二碱基”)的5'位置连接。[0232]在一个实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列和至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列。[0233]在另一实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、和至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列。[0234]在又一实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列和polya尾。[0235]在再一实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列，任选地在每个至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列之间的间隔序列和polya尾。[0236]在另又一个实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，5'帽，启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列，任选地在每个至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列之间的间隔序列以及polya尾。[0237]在再又一个实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，5'帽、启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列和polya尾。[0238]在又另一个实施方案中，所述rna构建体，优选从5'至3'包含，5'帽、启动子、编码至少一种非结构蛋白的序列、间隔序列、至少一种编码先天抑制剂蛋白的序列、亚基因组启动子、编码至少一种治疗性生物分子的序列、间隔序列、编码至少一种先天抑制剂蛋白的序列，任选地在每个编码至少一种先天抑制剂蛋白的序列之间的间隔序列和polya尾。[0239]据认为piv5的v蛋白直接与mda5结合防止寡聚，而据认为orf4a阻断pact与dsrna的结合。本发明人将这些蛋白编码基因掺入sarna中，在目的基因(goi)(即治疗性生物分子)之后，由t2a切割位点分隔，以产生能够有利地绕过先天感知机制的构建体。将goi和iip配对成在表达时被内源性蛋白酶(t2a)切割的单个开放阅读框，使两者以设定比例和相同动力学在同一细胞内的表达最大化。[0240]因此，优选地，所述rna构建体，从5'至3'包含，5'帽、包含51个核苷酸保守序列元件的启动子、nsp1、nsp2、nsp3v、nsp4、亚基因组启动子26s、编码治疗性生物分子的序列、t2a间隔序列、编码piv5v和/或mers-covorf4a的序列和polya尾。[0241]因此，在一个实施方案中，所述rna构建体可以包含seqidno：38或由seqidno：38组成，如下：[0242][0243][0244][0245][0246]相应地，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：38所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0247]因此，在另一实施方案中，所述rna构建体可以包含seqidno：39或由seqidno：39组成，如下：[0248][0249][0250][0251][0252]因此，优选地，所述rna构建体包含基本上如seqidno：39中所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0253]在本发明的第二方面，提供了编码第一方面的rna构建体的核酸序列。[0254]在一个实施方案中，所述核酸序列可以包含seqidno：40或由seqidno：40组成，如下：[0255][0256][0257][0258][0259]相应地，优选地，所述核酸序列包含基本上如seqidno：40所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0260]在一个实施方案中，所述核酸序列可以包含seqidno：41或由seqidno：41组成，如下：[0261][0262][0263][0264][0265]相应地，优选地，所述核酸序列包含基本上如seqidno：41所示的核苷酸序列或其片段或变体。[0266]在第三方面，提供了包含根据第二方面的核酸序列的表达盒。[0267]本发明的核酸序列优选被包含在重组载体中，例如用于递送到目的宿主细胞中以能够生产rna构建体的重组载体中。[0268]因此，在第四方面，提供了包含根据第三方面的表达盒的重组载体。[0269]在一个实施方案中，所述载体可包括seqidno：35的核酸序列，如下，其中“goi”代表治疗性生物分子编码序列的位置：[0270][0271][0272][0273]相应地，优选地，所述载体包含基本上如seqidno：35所示的核苷酸序列或其变体或片段。[0274]在一个实施方案中，所述载体包含编码包含mers-covorf4a的rna构建体的核酸序列，所述载体可以包含seqidno：36的核酸序列，如下，其中“goi”代表治疗性生物分子编码序列的位置：[0275][0276][0277][0278]相应地，优选地，所述载体包含基本上如seqidno：36所述的核苷酸序列或其变体或片段。[0279]在一个实施方案中，所述载体包含编码包含piv5的rna构建体的核酸序列，所述载体可以包括seqidno：37的核酸序列，如下，其中“goi”代表编码治疗性生物分子的序列的位置：[0280][0281][0282][0283][0284]相应地，优选地，所述载体包含基本上如seqidno：37所示的核苷酸序列或其变体或片段。[0285]可使用图7或8中所示的dna质粒作为模板制作本发明的sarna构建体。然后可通过使用聚合酶(如t7聚合酶)进行体外转录制作rna拷贝，t7启动子显示在图7或8的质粒图中的sarna的上游。因此，可以使用如图7或8所示的具有seqidno：35-37中任一所示的核酸序列或其变体或片段的dna质粒作为模板来制作第一方面的sarna构建体。当然，可以理解的是，可以用其他rna聚合酶，例如sp6或t3聚合酶来代替t7聚合酶，在这种情况下，sarna构建体可以代替的包含sp6或t3启动子。[0286]编码第一方面的rna构建体的第四方面的载体例如可以是质粒、粘粒或噬菌体和/或病毒载体。这样的重组载体在本发明的递送系统中是非常有用的，用于用核苷酸序列转化细胞。核苷酸序列优选是dna序列，正是该dna序列编码形成第一方面的rna构建体的rna序列。[0287]编码第一方面的rna构建体的重组载体也可以包含其他功能元件。例如，它们可以进一步包含各种其他功能元件，包括用于在宿主细胞中引入载体后启动转基因表达的合适启动子。例如，载体优选能够在宿主细胞(如细菌细胞)的细胞核中自主复制。在这种情况下，重组载体中可能需要诱导或调节dna复制的元件。或者，重组载体可被设计成使得其整合到宿主细胞的基因组中。在这种情况下，设想有利于定向整合(如通过同源重组)的dna序列。合适的启动子可包括sv40启动子、cmv、ef1a、pgk、病毒长末端重复以及可诱导启动子，如四环素可诱导系统等。表达盒或载体还可包括终止子，如β球蛋白、sv40聚腺苷酸序列或合成聚腺苷酸序列。重组载体还可包括启动子或调节子或增强子，以根据需要控制核酸的表达。[0288]载体还可以包含编码在克隆过程中可用作可选择标记的基因的dna，即，以实现已经转染或转化的细胞的选择，并实现含有整合了异源dna的载体的细胞的选择。例如，设想氨苄青霉素、新霉素、嘌呤霉素或氯霉素抗性。图7和图8所示的载体包含对在细菌中选择质粒很有用的氨苄青霉素抗性标记。另外，可选择的标记基因可以在与含有转基因的载体同时使用的不同的载体中。表达盒或载体还可以包含参与调节核苷酸序列表达或用于将表达的多肽靶向到宿主细胞的某个部分的dna。[0289]可以通过适当的方式，例如直接内吞摄取将纯化的载体直接插入宿主细胞。可以通过转染、感染、电穿孔、显微注射、细胞融合、原生质体融合或弹道轰击(ballisticbombardment)将载体直接引入宿主细胞(如真核生物细胞或原核生物细胞)。另外，可以用粒子枪将本发明的载体直接引入宿主细胞。[0290]核酸分子可以(但不一定)是被整合到宿主细胞的dna中的一种核酸分子。可以稳定地转化未分化的细胞，从而导致产生基因修饰的子细胞(在这种情况下，可能需要如用特定的转录因子或基因激活剂来调节受试者中的表达)。另外，可以将递送系统设计成有利于分化细胞的不稳定或瞬时转化。在这种情况下，调节表达可能不那么重要，因为当转化的细胞死亡或停止表达蛋白质时，dna分子的表达将停止。[0291]另外，在不将核酸分子整合到载体中的情况下，递送系统可以向宿主细胞提供核酸分子。例如，核酸分子可以被整合到脂质体或病毒颗粒中。另外，“裸”核酸分子可以通过适当的方式(例如直接内吞摄取)插入宿主细胞。[0292]在第五方面，提供了一种药物组合物，其包括第一方面的rna构建体、第二方面的核酸序列、第三方面的表达盒或第四方面的载体以及药学上可接受的赋形剂。[0293]在第六方面，提供了一种用于制造根据第五方面的药物组合物的方法，该方法包括使第一方面的rna构建体、第二方面的核酸序列、第三方面的表达盒或第四方面的载体与药学上可接受的赋形剂接触。[0294]在第七方面，提供了一种制备第一方面的rna构建体的方法，该方法包括：[0295]a)i)将第四方面的载体引入宿主细胞中；以及[0296]ii)在导致产生第一方面的rna构建体的条件下培养宿主细胞；或者[0297]b)转录来自根据第四方面的载体的rna构建体。[0298]步骤a)的宿主细胞可以是真核生物或原核生物宿主细胞。优选地，宿主细胞是真核生物宿主细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，如人胚肾293细胞或中国仓鼠卵巢(cho)细胞。步骤(b)可以在体外或体内进行，优选在体外进行。[0299]在本领域中合适的体外转录方法是众所周知的，本领域的技术人员也是知道的。例如，如《分子克隆，实验室手册》第二版(1989)cnolan编辑，冷泉港实验室出版社中所述的。[0300]第一方面的rna复制子特别适合用于治疗。[0301]虽然本发明人设想将通过体外转录产生在体内用于治疗的第一方面的rna构建体，但本领域技术人员将认识到，通过在体内将根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体递送到受试者体内，也可以在受试者中体内地产生用于治疗的rna构建体。[0302]因此，根据第八方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用作药物或用于治疗中。[0303]在本发明的第九方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用于预防、改善或治疗原生生物、真菌、细菌或病毒感染中。[0304]原生动物、真菌、细菌或病毒感染可能是如第一方面定义的原生动物、真菌、细菌或病毒的感染。[0305]在本发明的第十方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用于预防、改善或治疗癌症。[0306]癌症可以如第一方面所定义。[0307]在本发明的第十一方面，提供了一种治疗原生动物、真菌、细菌或病毒感染的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物。[0308]待治疗的原生动物、真菌、细菌或病毒感染可以是如第一方面定义的原生动物、真菌、细菌或病毒的感染。[0309]在本发明的第十二方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用治疗有效量的根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物。[0310]待治疗的癌症可以如第一方面所定义。[0311]本文所述的rna构建体提供了使受试者接种疫苗以抗病毒感染和癌症的有效方法。[0312]因此，在本发明的第十三方面，提供了一种疫苗，其包含根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物。[0313]优选地，疫苗包含合适的佐剂。[0314]佐剂可以是在第一方面的rna构建体序列、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物中被编码的编码分子佐剂，或者作为佐剂掺入递送制剂中的佐剂。[0315]编码分子佐剂可以编码细胞因子(例如il-12、gm-csf、il-2、ifn-g)或效应蛋白(例如cd40l、flt-3)或微生物蛋白(例如鞭毛蛋白或霍乱毒素b)。[0316]掺入递送制剂的佐剂可选自由以下组成的组：细菌脂肽、脂蛋白和脂磷壁酸；分枝杆菌脂聚糖、酵母聚糖、孔蛋白、脂多糖、脂质a、单磷酰脂质a(mpl)、鞭毛蛋白、cpgdna、疟原虫色素、皂素(quil-a、qs-21、番茄素、iscom、iscomatrixtm)、角鲨烯基乳液、诸如pei的聚合物、卡波姆、脂质纳米颗粒和细菌毒素(ct、lt)。[0317]在本发明的第十四方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用于在受试者中刺激免疫反应。[0318]根据第一方面定义的抗原，可以刺激针对原生动物、细菌、病毒、真菌或癌症的免疫反应。[0319]根据第十五方面，提供了根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物，其用于干细胞疗法中。[0320]干细胞疗法可涉及将体细胞重新编程为具有干细胞特性的细胞。[0321]通过递送能够增强体细胞向具有如第一方面定义的干细胞特性的重编程的一种或多种蛋白来重编程体细胞。[0322]根据第十六方面，提供了一种在离体或体外修饰细胞的方法，所述方法包括将根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物递送至细胞。[0323]优选地，该方法离体进行。[0324]细胞可以是真核生物细胞或原核生物细胞。优选地，细胞是真核生物细胞。更优选地，细胞是哺乳动物宿主细胞。最优选地，细胞是人细胞。[0325]优选地，经修饰的细胞适用于细胞疗法适应症。[0326]在第十七方面，提供了从第十六方面的方法获得的或可通过该方法获得的经修饰的细胞。[0327]在第十八方面，提供了第十七方面的经修饰的细胞，其用于治疗，任选地细胞疗法中。[0328]可以理解的是，根据第一方面的rna构建体、根据第二方面的核酸、根据第三方面的表达盒、根据第四方面的载体或根据第五方面的药物组合物(本文称为活性剂)可用于药物中，该药物可作为单一疗法(即使用活性剂)用于治疗、改善或预防疾病或接种疫苗。另外，根据本发明的活性剂可以作为治疗、改善或预防疾病的已知疗法的辅助手段，或与之组合使用。[0329]取决于特别是组合物的使用方式，可以将本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物组合在具有许多不同形式的组合物。因此，例如，所述组合物可以是粉末、片剂、胶囊、液体、软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、气溶胶、喷雾、胶束溶液、透皮贴剂、脂质体悬浮液、复合物(polyplex)、乳剂、脂质纳米颗粒(表面上具有rna或具有封装的rna)的形式或可以向需要治疗或接种疫苗的人或动物施用的任何其它合适的形式。将理解的是，根据本发明的药物的赋形剂应该是被给予该药物赋形剂的受试者能够很好地耐受的赋形剂。[0330]本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物也可被掺入到缓释或延迟释放装置中。这种装置，例如可以插在皮肤上或皮肤下，可以在几周甚至几个月内释放药物。该装置可至少位于治疗部位的附近。当需要用基因构建体或重组载体进行长期治疗并且通常需要频繁施用(例如至少每天注射)时，这种装置可能是特别有利的。[0331]然而，在优选的实施方案中，可以通过注射到血液、肌肉、皮肤或直接注射到需要治疗的部位来将根据本发明的药物施用至受试者。最优选地，药物，包括rna构建体，被注射到肌肉中。注射可以是静脉注射(团注或输注)或皮下注射(团注或输注)或皮内注射(团注或输注)或肌肉注射(团注或输注)。[0332]可以理解的是，所需的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物的量由其生物活性和生物利用度确定的，而生物利用度又取决于施用方式，rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物的理化性质以及是否作为单一疗法或在联合疗法中使用。施用的频率也将受活性剂在被治疗受试者体内的半衰期的影响。可施用的最佳剂量由本领域技术人员确定，并将随使用的具体rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物；药物组合物的强度；施用方式；以及病毒感染的类型和进展情况而变化。取决于被治疗的特定受试者的其他因素将导致需要调整剂量，包括受试者年龄、体重、性别、饮食和施用时间。[0333]一般来说，根据所用的活性剂，可以将日剂量为0.001μg/kg体重至10mg/kg体重或0.01μg/kg体重至1mg/kg体重的本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物用于治疗、改善或预防疾病。[0334]可以以单次施用的方式(例如，每天单次注射或吸入鼻腔喷雾)给予日剂量。另外，rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物可能需要在一天内施用两次或更多次。作为实例，可以以两个(或更多，取决于被治疗疾病的严重程度)0.07μg至700mg的日剂量(即假设体重为70kg)施用rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。接受治疗的患者可以在醒来时服用第一剂量，然后在晚上或其后间隔3或4个小时服用第二剂量(如果采用两剂量方案)。另外，可以使用缓释装置以向患者提供最佳剂量的根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物，而不需要施用重复剂量。[0335]然而，优选地，可以以每周一次的剂量，更优选的两周一次的剂量给予根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。[0336]可以将已知规程，如制药业常规采用的那些规程(如体内实验、临床试验等)，用于形成根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒或载体的特定制剂和精确治疗方案(如药剂的日剂量和施用频率)。[0337]“受试者”可以是脊椎动物、哺乳动物或家畜。因此，根据本发明的组合物和药物可用于治疗任何哺乳动物，例如牲畜(如马)、宠物，或可以用于其他兽医应用。然而，最优选地，受试者是人。[0338]rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物的“治疗有效量”是指，当对受试者施用时，改善、预防或治疗任何给定疾病所需的前述量的任何量。[0339]例如，可以使用的本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物可以为约0.0001mg至约800mg，优选地为约0.001mg至约500mg。优选地，复制子、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物的量为约0.01mg至约250mg的量，最优选地为约0.01mg至约1mg的量。优选地，以1-200μg的剂量施用根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。[0340]本文所指的“药学上可接受的赋形剂”是本领域技术人员已知的在配制药物组合物中有用的任何已知化合物或已知化合物的组合。[0341]在一个实施方案中，药学上可接受的赋形剂可以是固体，组合物可以是粉末或片剂的形式。固体药学上可接受的赋形剂可包括也可作为调味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、染料、填料、助流剂、压缩助剂、惰性粘合剂、甜味剂、防腐剂、染料、包衣或片剂分解剂的一种或多种物质。赋形剂也可以是封装材料。在粉末中，赋形剂是细碎的固体，其与根据本发明的细碎的活性剂混合在一起。在片剂中，活性剂(例如根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物)可与具有必要的压缩性能的赋形剂按适当比例混合并被压制成所需的形状和大小。粉末和片剂优选含有高达99％的活性剂。合适的固体赋形剂包括，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、聚乙烯吡咯烷、低熔点蜡和离子交换树脂。在另一实施方案中，药物赋形剂可以是凝胶，组合物可以是乳膏等的形式。[0342]然而，药物赋形剂可以是液体，药物组合物则是溶液的形式。液体赋形剂用于制备溶液、悬浮液、乳剂、糖浆、酏剂和压缩组合物。根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物可以溶解或悬浮于药学上可接受的液体赋形剂中，所述液体赋形剂比如水、有机溶剂、两者的混合物或药学上可接受的油或脂肪中。液体赋形剂可以包含其他合适的药物添加剂，比如增溶剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、甜味剂、调味剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服和胃肠外施用的液体赋形剂的合适实例包括水(部分含有上述添加剂，如纤维素衍生物，优选羧甲基纤维素钠溶液)、醇(包括一元醇和多元醇，如乙二醇)及其衍生物以及油(如分馏椰子油和花生油)。对于胃肠外施用，赋形剂也可以是油性酯，如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。在胃肠外施用的无菌液体形式组合物中无菌液体赋形剂是有用的。压缩组合物的液体赋形剂可以是卤代烃或其他药学上可接受的喷射剂(propellant)。[0343]液体药物组合物(为无菌溶液或悬浮液)可以通过例如皮下注射、皮内注射、鞘内注射、硬膜外注射、腹膜内注射、静脉注射，特别是肌肉注射而被利用。本发明的核酸序列或表达盒可以制备成无菌固体组合物，该无菌固体组合物在施用时可以使用无菌水、生理盐水或其他适当的无菌注射介质溶解或悬浮。[0344]可以以含有其他溶质或悬浮剂(例如，足够的盐水或葡萄糖以使溶液等渗)、胆汁盐、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇单油酸酯、聚山梨醇酯80(山梨醇及其酸酐与环氧乙烷共聚的油酸酯)等的无菌溶液或悬浮液的形式口服地施用本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。也可以以液体或固体组合物形式口服地施用根据本发明的rna构建体、核酸序列、表达盒、载体或药物组合物。适合口服施用的组合物包括固体形式和液体形式，所述固体形式比如丸剂、胶囊、颗粒、片剂和粉剂，以及所述液体形式比如溶液、糖浆、酏剂和悬浮液。用于胃肠外施用的形式包括无菌溶液、乳剂和悬浮液。[0345]可以理解的是，本发明延伸到任何核酸或多肽或其变体、其衍生物或其类似物，它们基本上包含本文提及的任何序列的氨基酸或核酸序列，包括其变体或片段。术语“基本上氨基酸/核苷酸/肽序列”、“变体”和“片段”可以是与本文提到的任一序列的氨基酸/核苷酸/肽序列具有至少40％的序列同一性，例如与seqidno：1-55等所定义的序列具有至少40％的序列同一性的序列。[0346]还设想了与本文提及的任何序列具有序列同一性的氨基酸/多核苷酸/多肽序列，所述序列同一性大于65％，更优选大于70％，甚至更优选大于75％，再更优选大于80％序列同一性。优选地，氨基酸/多核苷酸/多肽序列与本文提及的任何序列具有至少85％同一性，更优选至少90％同一性，甚至更优选至少92％同一性，甚至更优选至少95％同一性，甚至更优选至少97％同一性，甚至更优选至少98％同一性，和最优选与本文提及的任何序列具有至少99％同一性。[0347]本领域技术人员将理解如何计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性。为了计算两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比同一性，必须首先准备两个序列的比对，然后计算序列同一性值。两个序列的百分比同一性可以有不同的值，这取决于：(i)用于比对序列的方法，例如clustalw、blast、fasta、smith-waterman(在不同的程序中实现)，或来自3d比较的结构比对；(ii)比对方法使用的参数，例如局部与全局比对，使用的配对-得分矩阵(例如blosum62、pam250、gonnet等)和空位罚分，例如函数形式和常数。[0348]在进行比对之后，有许多不同的方法计算两个序列之间的百分比同一性。例如，我们可以将一致性的数量除以：(i)最短序列的长度；(ii)比对的长度；(iii)序列的平均长度；(iv)非空位位置的数量；或(v)不包括突出粘性末端(overhang)的等价位置的数量。此外，可以理解的是，百分比同一性也是高度依赖于长度的。因此，一对序列越短，可以预期偶然出现的序列同一性就越高。[0349]因此，可以理解的是，蛋白质或dna序列的精确比对是复杂的过程。普遍的多重比对程序clustalw(thompson等，1994,nucleicacidsresearch,22,4673-4680；thompson等，1997,nucleicacidsresearch,24,4876-4882)是生成本发明的蛋白质或dna多重比对的优选方法。clustalw的合适参数可以如下：对于dna比对，空位开放罚分＝15.0,空位延伸罚分＝6.66和矩阵＝identity。对于蛋白质比对：空位开放罚分＝10.0,空位延伸罚分＝0.2和矩阵＝gonnet。对于dna和蛋白质比对：endgap＝-l和gapdist＝4。本领域的技术人员将意识到，可能有必要改变这些和其他参数以达到最佳序列比对。[0350]优选地，两个氨基酸/多核苷酸/多肽序列之间的百分比一致性的计算可以根据(n/t)*100这样的比对进行计算，其中n是序列共享相同残基的位置数量，t是包括空位以及包括或不包括突出粘性末端的比较位置的总数。优选地，计算中包括突出粘性末端。因此，计算两个序列之间的百分比同一性的最优选方法包括：(i)使用clustalw程序使用合适的参数设置(例如如上所述的)准备序列比对；以及(ii)将n和t的值代入以下公式：序列同一性＝(n/t)*100。[0351]对于本领域的技术人员来说识别相似序列的其他方法是已知的。例如，基本相似的核苷酸序列将由在严格条件下与dna序列或其互补物杂交的序列编码。本发明人所说的严格条件是指在约45℃在3×氯化钠/柠檬酸钠(ssc)中核苷酸与滤膜结合的dna或rna杂交，然后在约20-65℃下在0.2×ssc/0.1％sds中洗涤至少一次。另外，基本相似的多肽可以与例如seqidno：1至57中所示的序列有至少1个，但少于5、10、20、50或100个氨基酸不同。[0352]由于遗传密码的简并性，很明显，在不对由此编码的蛋白质的序列产生实质性影响的情况下，可以改变或变化本文所述的任何核酸序列，以提供其功能性变体。合适的核苷酸变体是具有通过替换对序列内相同氨基酸进行编码的不同密码子而改变，从而产生沉默(同义)变化的那些序列。其他合适的变体是具有同源核苷酸序列但包含通过替换对与其所替换的氨基酸相似的生物物理性质的侧链的氨基酸进行编码的不同密码子以产生保守性变化而改变的序列的全部或部分序列的那些。例如，小的非极性、疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。大的非极性疏水氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，可以理解可以用具有类似生物物理性质的氨基酸替换哪些氨基酸，本领域技术人员知道编码这些氨基酸的核苷酸序列。[0353]本文(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)描述的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤，可与上述任何方面进行任何组合，但其中至少一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合除外。附图说明[0354]为了更好地理解本发明，并显示如何实施本发明的实施方案，现借助实施例提及所附的附图，其中：[0355]图1显示了基于委内瑞拉马脑炎病毒(veev)骨架的自扩增rna复制子或构建体的一个实施方案的示意图。所谓的“stealthicon”载体是编码位于goi(目的基因)的上游或下游的非结构蛋白(nsp1-4)和先天抑制蛋白(iip)的sarna复制子/构建体。[0356]图2显示了基因组复制子产生由传感蛋白分子(sensormolecule)mda5和pact所识别dsrna。这些传感蛋白传递信号以激活下游级联，包括转录因子(nf-κb、irf-3、irf-7)、直接抑制rna扩增和蛋白质表达的限制因子(虚线)的激活。piv-v或orf4a的表达阻断了mda5和pact对dsrna的先天识别，从而防止了限制复制子rna的扩增和合成rna的蛋白表达的下游级联的激活。[0357]图3显示了a)在体外筛选编码iip的veev复制子。用两批含有作为报告蛋白的荧光素酶的rna转染细胞，并评估24小时后的蛋白质表达。与hek相比，已知hela和mrc5具有更完整的ifn表达通路，和b)显示为相对于野生型的表达的倍数变化的图3a的数据。[0358]图4显示了在balb/c和bl/6小鼠中使用萤火虫荧光素酶作为报告蛋白筛选编码iip的复制子(#6和#8)。已知bl/6小鼠比balb/c表达更多的ifn，因此iip在3天实现了更高的荧光素酶表达以及更长的表达，持续时间》14天。[0359]图5显示了在balb/c和bl/6小鼠中使用高斯荧光素酶蛋白作为报告蛋白筛选编码iip的复制子(#6和#8)。已知bl/6小鼠比balb/c表达更多的ifn，因此iip实现了可溶性报告蛋白更长的表达，持续时间》14天。[0360]图6显示了编码包含goi的rna构建体的表达载体的一个实施方案的构建图。[0361]图7显示了编码包含goi-mers-covorf4a的rna构建体的表达载体的一个实施方案的构建图。[0362]图8显示了编码包含goi-piv5的rna构建体的表达载体的一个实施方案的构建图。[0363]图9显示了本发明的构建体以及来自野生型和iipveev复制子的体外蛋白质表达的示意图。a)野生型和顺式编码iip的veev复制子的示意图。b)自扩增rna的先天感知的示意图。c)以相对光单位(rlu)测量的hek293t.17、hela和mrc5细胞中的萤火虫荧光素酶sarna的体外转染。棒代表归一化至野生型veev对照的平均倍数变化±标准偏差，n＝3。[0364]图10显示了在c57bl6/j小鼠中wt和merscov-2复制子的剂量调整。在肌肉注射0.2、2或20μg的rna后的第7天和第10天，对蛋白质表达进行定量。每个点代表一只小鼠，棒代表平均值±sem，n＝10。*表示使用带有多重比较的kruskal-wallis检验评估的p《0.05的显著性。[0365]图11显示了在c57bl6/j小鼠中wt和merscov_2复制子与jak抑制剂鲁索替尼的共制剂。在肌肉注射5μgrna与100μg鲁索替尼后的第4、7、10和14天(分别为a、b、c和d)对蛋白质表达进行定量。每个点代表一只小鼠腿，棒代表平均值±sem，n＝10。[0366]图12显示了在人皮肤外植体中egfp±merscov_2rna(对应于mers-covorf4a)(0.2、2或20μg)(a,b)或±鲁索替尼(0.1、1、10或100μg)(c,d)的蛋白质表达。在注射后72小时对egfp表达细胞的数量(％gfp 细胞)(a,c)和每个细胞的总蛋白质表达(gfp中位荧光强度(mfi))(b,d)进行定量。每个点代表平均值±sem，n＝3。*表示使用带有多重比较的kruskal-wallis检验评估的p《0.05的显著性。[0367]图13显示了兔中rabv±mers-cov_2(对应于mers-covorf4a)的免疫原性。a)在第0和4周以20μg初免和加强免疫进行肌肉内免疫后的rabv抗原特异性igg抗体滴度，n＝5。b)针对假型rabv病毒的中和ic50，n＝5，灰色虚线代表检测限。*表示使用带有多重比较的kruskal-wallis检验评估的p《0.05的显著性。[0368]图14显示了以相对光单位(rlu)测量的hek293t.17、hela和mrc5细胞中萤火虫荧光素酶sarna的体外转染。棒代表平均值±标准偏差对照，n＝3。'a'和'b'表示rna的两个单独制备的批次。[0369]图15显示了以相对光单位(rlu)测量的a)小鼠(mef)、b)兔子(rk13)、c)非人灵长类(llc)和d)人类(mrc5)细胞中的wtfluc、mers-cov_2orf4a和piv-5rna的体外转染。棒代表平均值±标准差对照，n＝3。[0370]图16显示了balb/c和c57bl6/j小鼠中的细胞内蛋白(萤火虫荧光素酶)和分泌蛋白(高斯荧光素酶)的体内荧光素酶表达。在第3天(a,b)、第7天(c,d)和第14天(e,f)使用体内成像系统(ivis)对肌肉(a,c,e)中的或血清(b,d,f)中的蛋白质表达进行定量。每个点代表一只小鼠，棒代表平均数±sem，且对于萤火虫荧光素酶(fluc)，n＝10，对于高斯荧光素酶(gluc)，n＝5。[0371]图17显示了用0.2μgegfprna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0372]图18显示了用2μgegfprna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0373]图19显示了用20μgegfprna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0374]图20显示了用0.2μgegfp-piv-5rna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0375]图21显示了用2μgegfp-piv-5rna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞(绿色)的门控的、按表型(蓝色)分开的无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0376]图22显示了用20μgegfp-piv-5rna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0377]图23显示了用0.2μgegfp-mers-cov_2rna(对应于mers-covorf4a)处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0378]图24显示了用2μgegfp-mers-cov_2rna处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0379]图25显示了用20μgegfp-mers-cov_2rna(对应于mers-covorf4a)处理的人皮肤外植体中，叠加有egfp 细胞的门控的(绿色)、按表型分开的(蓝色)无监督活细胞簇(灰色)的t-分布随机邻域嵌入(tsne)图。[0380]图26显示了在皮内(id)注射egfp±ruxo制剂后如通过流式细胞术测定的人皮肤外植体中存在的细胞和gfp 细胞的表型鉴定，a)从人皮肤外植体提取的总细胞群中的和用2μgegfp编码sarna±0.1、1、10或100μgruxo处理的外植体的gfp-表达皮肤细胞群中的细胞鉴定，n＝3。b)表达gfp的每种表型的细胞百分比。使用以下抗体鉴定的细胞：上皮细胞(cd45-)、纤维母细胞(cd90 )、nk细胞(cd56 )、白细胞(cd45 )、朗格汉斯细胞(cd1a )、单核细胞(cd14 )、树突细胞(cd11c )、t细胞(cd3 )和b细胞(cd19 )。[0381]图27显示了在小鼠和大鼠中rabv±mers-cov_2(对应于mers-covorf4a)的免疫原性。a)在第0周和第4周以1μg的初免和加强免疫对小鼠进行肌肉内免疫后的rabv抗原特异性igg抗体滴度，n＝5。b)针对假型rabv病毒的小鼠的中和ic50，n＝5，灰色虚线代表检测限。a)在第0周和第4周以20μg的初免和加强免疫对大鼠进行肌肉内免疫后的rabv抗原特异性igg抗体滴度，n＝5。b)针对假型rabv病毒的大鼠的中和ic50，n＝5，灰色虚线代表检测限。[0382]图28显示了piv-5v和mers-covorf4a对sarna感知的拟定机制的示意图。[0383]图29显示了中位荧光强度(mfi)数据，该数据表明在hela细胞中，当与仅编码sars-cov-2糖蛋白(即没有iip)的sarna相比，来自根据本发明的一个实施方案的sarna的sars-cov-2糖蛋白当与先天抑制蛋白mers-orf4a共同表达时表达增加。实施例[0384]本发明人假设，已知抑制sarna的先天识别的来自病毒的顺式编码蛋白抑制先天感知并提高sarna疫苗的蛋白质表达和免疫原性。因此，本发明人设计并测试了一系列含有先天抑制蛋白(iip)和目的基因的rna复制子，然后表征了这些复制子是否增强细胞内蛋白表达和(由目的基因编码的)分泌蛋白的表达。[0385]材料和方法[0386]先天抑制蛋白(iip)复制子的克隆[0387]如先前所述(53)，将编码萤火虫荧光素酶、高斯荧光素酶、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、狂犬病病毒糖蛋白(rabv)和来自委内瑞拉马脑炎的复制酶的自扩增rna克隆到质粒载体上。干扰素抑制蛋白文库被克隆到这些载体骨架上作为具有t2a切割位点的目的基因(fluc、gluc、egfp或rabv)的一部分(genbank登录号#aac97195.1)。以如下genbank登录号可以找到干扰素抑制蛋白：hsv-2us1(z86099.2)、hsv-1us1(awo69381.1)、hsv-1us11(yp_009137147.1)、ov20.0l(af053969.1)、bvdvnpro(aie38066.1)、piv-5v(yp_138513.1)、mers-covm(ahc74104.1)、mers-covorf4a(ahc74090.1)、兰加特病毒ns5(af253420)和流感病毒ns1(dq508893.1)。在小鼠的研究中，使用了具有n100d突变的piv-5v蛋白(45)。[0388]sarna的体外转录[0389]使用体外转录生产自扩增rna。将质粒dna(pdna)转化到大肠杆菌(e.coli)(newenglandbiolabs,uk)中，并在100ml具有100μg/ml的羧苄青霉素(sigmaaldrich,uk)的luriabroth(lb)中培养。随后使用plasmidplusmaxiprep试剂盒(qiagen，uk)分离pdna，并在nanodropone(thermofisher,uk)上测量pdna的终浓度。在37℃下使用mlul使pdna线性化达3小时。在mmachinetmt7转录仪(invitrogen,uk)中使用1μg线性化的pdna模板制备用于体外转染的rna，并使用megacleartm转录清理试剂盒(invitrogen,uk)按照制造商的说明进行纯化。如先前所述(2)制备用于离体和体内实验的rna。使用1μg线性化pdna模板，使用megascripttmt7转录仪(invitrogen,uk)按照制造商的说明在37℃下来生产未加帽的rna转录物达2小时。然后通过在-20℃下通过过夜licl沉淀法来纯化转录物，在4℃下以14,000rpm离心20分钟以沉淀rna，用70％etoh冲洗一次，在4℃再次以14,000rpm离心5分钟，然后将其重悬于ultrapureh2o(ambion,uk)中。使用scriptcaptmcap1加帽系统试剂盒(cellscript,wi,usa)按照制造商的说明在37℃将纯化的转录物加帽2小时。然后如上所述用licl沉淀法最后一次纯化加帽转录物，并将其重新悬浮在rna储存缓冲液(10mmhepes、0.1mmedta和100mg/ml海藻糖)中，并储存在-80℃下直至进一步使用。[0390]sarna配制[0391]使用如先前所述的滴定法(titrationmethod)(2)，将用于蛋白质表达实验的fluc、gluc和egfpsarna与100kdapabol复配。将用于体内免疫原性实验的rabvsarna与8kdapabol复配。简言之，将rna和pabol稀释在hepes缓冲液(20mmhepes，5wt.％葡萄糖水溶液，ph7.4)中，并在nanoassemblr台式配制装置(precisionnanosystems,inc.,vancouver,canada)上以4:1(rna比聚合物)的体积比和10ml/min的流速结合。聚合物与sarna的最终比例为45:1(w/w)。多聚物(polyplexes)是新鲜制备的，在制备后1小时内使用。对于共制剂(co-formulation)，将鲁索替尼(ruxo，selleckchemicals，uk)以指定剂量直接添加到多聚物(polyplexes)中。[0392]体外转染[0393]在hek293t.17细胞(atcc,usa)、hel细胞(atcc,usa)、mrc5细胞(atcc,usa)、小鼠胚胎纤维母细胞(mef)细胞(sigmaaldrich,uk)、rk13兔肾细胞(publichealthengland，uk)和llc-mk2恒河猴肾细胞(atcc,usa)中进行转染。在含有10％(v/v)胎牛血清(fbs)、5mg/mll-谷氨酰胺和5mg/ml青霉素/链霉素(thermofisher,uk)的完全dulbecco改良eagle培养基(cdmem)(gibco,thermofisher,uk)(hek,hela,mef细胞)；含有10％(v/v)胎牛血清(fbs)、5mg/mll-谷氨酰胺和5mg/ml青霉素/链霉素(thermofisher，uk)的完全改良eagle培养基(cmem)(mrc5、rk13细胞)；或含有1％马血清(gibco，thermofisher，uk)的完全培养基199(cm199，sigmaaldrich,uk)(llc细胞)中培养细胞。在转染前24小时，将细胞以每孔50,000个细胞的密度铺在透明的96孔板中。然后完全去除培养基，并替换成50μl预热的转染培养基(dmem 5mg/mll-谷氨酰胺，mem 5mg/mll-谷氨酰胺或m199)。然后将100μl多聚物(polyplexes)溶液(含100ngsarna)添加到每个孔中并温育4小时。然后完全去除转染培养基，替换成cdmem、cmem或cm199。24小时后，从每个孔中取出50μl培养基，并添加50μlone-glod-荧光素底物(promega,uk)，并通过移液混合均匀。然后将每个孔的总体积转移到白色96孔板(costar)上进行分析，并在fluostaromega酶标仪(bmglabtech,uk)上进行定量。从每个孔中减去对照孔的背景荧光。[0394]小鼠体内荧光素酶表达[0395]所有动物的处理都符合1986年uk内政部动物科学程序法，并有当地伦理委员会和uk政府批准的项目许可证(p63fe629c)和个人许可证(ic37cbb8f)。食物和水是自由供应的。雌性babl/c小鼠(charlesriver,uk)或c57bl/6小鼠(charlesriver,uk)，6-8周龄，分组饲养(每笼5只)，并饲养在一个完全适应的房间里。向小鼠肌肉内注射(im)50μl总体积的与pabol复合的5μgflucsarna(双后腿)或5μggluc(单后腿)。在3、4、7、10或14天后，按照先前描述的(54，55)针对fluc对小鼠进行成像，或采集血液用于gluc分析，该分析使用gaussialuciferaseglow分析试剂盒(pierce,thermoscientific,uk)根据制造商的说明进行。在fluostaromega酶标仪(bmglabtech,uk)上对血清中的蛋白质表达进行定量。从每个孔中减去对照孔的背景荧光。对于fluc分析，向小鼠腹腔内注射(ip)150μlxenolightredijectd-荧光素底物(perkinelmer,uk)并允许小鼠休息10分钟。然后用异氟醚对小鼠进行麻醉，在装有分子成像软件5.0版(carestreamhealth，usa)的体内成像系统(ivis)fxpro(kodakco.,rochester,ny,usa)上成像2分钟。使用分子成像软件对每个注射点的信号进行定量，并以总通量(flux)(p/s)表示。[0396]小鼠体内高斯荧光素酶的表达[0397]将6-8周龄的雌性balb/c小鼠或c57bl/6小鼠(charlesriver,uk)分为几组(n＝5)，并饲养在完全适应的房间里。小鼠肌肉内注射(im)50μl总体积的5μg的gluc(单后腿)。在3、7和14天后，通过尾静脉给小鼠放血。允许血液凝固并在10,000rpm下离心5分钟，然后取出血清。然后使用piercetmgaussialuciferaseglow分析试剂盒使用20μl血清和根据制造商的说明准备的100μl工作溶液在单个96孔白板(costar)上检测所有时间点的血清。用fluostaromega酶标仪(bmglabtech,uk)分析荧光素，并从每个样品中减去原始(naive)动物的背景。[0398]小鼠、大鼠和兔子的疫苗接种[0399]在一条后腿上以50μl(小鼠)或100μl(大鼠、兔子)的总体积用与pabol一起配制的1μg(小鼠)或20μg(大鼠、兔子)编码rabv的sarna肌肉内注射(im)免疫balb/c小鼠、spraguedawley大鼠和新西兰白兔。初免4周后，再给予一次加强注射。在研究开始后的0、4和6周后收集血液并在10,000rpm下离心5分钟。然后将血清倒出并保存在-80℃下直到进一步分析。[0400]rabv特异性elisa[0401]按照先前的描述(56)进行半定量的免疫球蛋白elisa方案。简而言之，用1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)和0.05％(v/v)tween-20的pbs溶液封闭0.5μg/mlrabv包被的elisa板。洗涤后，向板中添加稀释的血清样品，温育2小时。然后洗涤板，对于小鼠elisa，向板中添加1:4000稀释的抗小鼠igg-hrp(southernbiotech,uk)，对于大鼠elisa，向板中添加1:4000稀释的山羊抗大鼠igg-hrp(southernbiotech,uk)，对于兔elisa，向板中添加1:10000稀释的鼠抗兔igg-hrp(sigma,uk)。小鼠标准品通过以下制备：用抗小鼠κ(1:1,000)和λ(1:1,000)轻链(serotec,uk)包被elisa板孔，用1％(w/v)bsa/0.05％(v/v)tween-20的pbs溶液封闭，洗涤，并添加纯化的igg(southernbiotech,uk)，从1000ng/ml开始，用5倍的稀释系列向下滴定。大鼠标准品通过以下制备：用纯化的大鼠igg(r&dsytems,uk)包被elisa板孔，从1000ng/ml开始，用5倍的稀释系列向下滴定。兔标准品通过以下制备：用1:1250的抗兔iggfc(milipore)包被elisa板孔，用1％(w/v)bsa/0.05％(v/v)tween-20的pbs溶液封闭，洗涤，并添加纯化的rabiitigg(abdserotech,uk)，从1000ng/ml开始，用5倍的稀释系列向下滴定。使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)对样品和标准品进行显影。5分钟后用终止液(insightbiotechnologies,uk)停止反应。用采用softmaxprogxpv5软件的分光光度计(versamax,moleculardevices,uk)读取吸光度。[0402]rabv微中和分析[0403]对第0、4和6周的样本进行假型狂犬病病毒微中和。在96孔板中的cdmem中以10,000个细胞/孔接种bhk-21细胞。将血清在56℃下热灭活，然后在cdmem中以1:5连续稀释。然后将样品用等体积的浓度为50μl中100tcid50的伪病毒稀释，在37℃温育1小时，然后添加到bhk-21细胞中，在37℃下培养48小时。然后裂解细胞，用bright-glo荧光素酶检测法(promega,uk)对荧光素酶活性进行定量。然后将每个孔的总体积转移到白色96孔板(costar)上进行分析，并在fluostaromega酶标仪(bmglabtech,uk)上进行定量，并计算每个样品的ic50。[0404]人皮肤外植体培养和注射[0405]在离体研究中，在英国伦敦的charingcrosshospital，imperialnhstrust收集手术切除的人皮肤组织标本。所有组织都是在收到接受选择性腹部整形手术或乳房切除手术的患者签署知情同意书后在伦敦帝国学院的localresearchethicscommittee(med_rs_ii_014)批准的方案下收集的。皮肤组织在使用前被冷藏，并被切成1cm2的部分，并在12孔板中在37℃和5％co2下用2mlcdmem培养。使用micro-finedemi0.3ml注射器(bectondickinson,uk)以50μl总体积中的2μgsarna的剂量皮内注射(id)外植体。在培养过程中，每天更换培养基。[0406]流式细胞术[0407]注射72小时后，修剪皮肤外植体以去除皮下脂肪层，用剪刀将表皮和真皮层剪碎，并在2ml补充有1mg/ml胶原酶p(sigmaaldrich,uk)和5mg/ml分散酶ii(sigmaaldrich,uk)的dmem中在旋转摇床上于37℃下培养4小时。然后将消化物通过70μm细胞过滤器进行过滤，并在1,750rpm下离心5分钟。然后将细胞重新悬浮在100μlfacs缓冲液(pbs 2.5％fbs)中，在冰上用facs缓冲液中的1:400稀释的可固定aqua活/死细胞染色剂(thermofisher,uk)染色20分钟。然后将样品用1ml的facs缓冲液洗涤，在1,750rpm下离心5分钟，并用下列抗体的混合物进行染色：cd3-v450(biolegend,uk)、cd14-qdot605(biolegend,uk)、cd19-bv650(biolegend,uk)、cd56-bv711(biolegend,uk)、cd1a-percp-efluor710(biolegend,uk)、cd11c-pe(biolegend,uk)、cd90-pe-cy7(biolegend,uk)和cd45-af700(biolegend,uk)。然后将样品用1mlfacs缓冲液进行洗涤，以1,750rpm离心5分钟，重新悬浮在250μlpbs中，然后用250μl3％多聚甲醛进行固定，多聚甲醛的终浓度为1.5％，并进行冷藏直到进行流式细胞仪分析。在带有facsdiva软件(bdbiosciences,uk)以及10万个获得细胞事件的lsrfortessa(bdbiosciences,uk)流式细胞仪上分析样品。如先前所述(58)进行门控策略，并使用flowjo版本10(flowjollc,oregon,usa)对gfp 细胞的表型鉴定进行量化。在flowjo中使用1000次迭代、30的困惑度(perplexity)、15196的学习率、exact(优势树)knn算法和barnes-hut梯度算法进行无监督的活细胞簇的t-分布式随机邻域嵌入(tsne)分析。[0408]sars-cov-2糖蛋白的体外工作[0409]基于特立尼达(trinidad)驴委内瑞拉马脑炎病毒株(veev)α病毒基因组，本发明人使用质粒载体合成了自扩增rna(sarna)复制子。将亚基因组启动子驱动的病毒结构蛋白由新型严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的表面'刺突'糖蛋白(genbank登录号qhd43416.1)取代。发明人用寡核苷酸串(strings)(geneart,德国)合成了编码sars-cov-2基因的寡核苷酸片段，并用gibson组装法(nebltd,uk)将这些片段组装到质粒载体上。在sars-cov-2复制子载体的进一步修饰中，合成了编码mers-covorf4a(ahc74090.1)的寡核苷酸串(geneart,德国)，并将其3'插入sars-cov-2编码区，该区使用弗林蛋白酶/t2a的变体序列(seqidno：26)连接在连续开放阅读框中，产生新的sars-cov-2orf4a载体。用sars-cov-2和sars-cov-2orf4asarna分别转染细胞，然后用多克隆抗体进行染色以检查表达。简而言之，转染后24小时，收获细胞并以1×107个细胞/ml的浓度将其重悬于1mlfacs缓冲液(pbs 2.5％fbs)中。将100μl重悬的细胞加入到facs管中，在冰上用50μl活/死固定aqua死细胞染色剂(thermofisherscientific,uk)以1:400的稀释度染色20分钟。然后将细胞用2.5ml的facs缓冲液洗涤，并在1750rpm下离心7分钟。离心后，将细胞在冰上用2.5μg的sars-cov刺突蛋白多克隆抗体(pa1-41165,thermofisherscientific,uk)染色30分钟，然后用2.5mlfacs缓冲液洗涤，并在1750rpm下离心7分钟。然后将细胞在冰上用0.4μgfitc山羊抗兔igg(bdpharmigen,uk)染色30分钟。孵育后，将细胞用2.5mlfacs缓冲液洗涤，在1750rpm下离心7分钟，并用250μlpbs重新悬浮。用250μl3％的多聚甲醛固定细胞，多聚甲醛的终浓度为1.5％。在带有facsdiva软件(bdbiosciences,uk)的lsrforterssa(bdbiosciences,uk)上分析样品。使用flowjo版本10(flowjollc,usa)分析数据，并测量阳性细胞群的中位荧光强度(mfi)，其中阴性/阳性截止值设置在门控为活的且单个的以及使用与上述相同的方法进行模拟转染但不含有sars-cov-2或sars-cov-2orf4a复制子sarna的细胞上。[0410]统计学分析[0411]在graphpadprism,版本8中制作图表和统计。使用双因素anova或调整用于多重比较的kruskal-wallis检验来分析统计学差异，并用p《0.05表示显著性。[0412]结果和讨论[0413]据认为rna复制子是用于疫苗和疗法中递送和表达目的基因的潜在工具。然而，双链rna(dsrna)在细胞内由触发抑制蛋白质翻译的信号级联的先天感知机制检测。结果，在复制子中编码的目的基因的表达显著受损，并因此限制了rna复制子的治疗潜力。[0414]本发明人通过开发编码先天抑制剂蛋白的rna复制子以减弱sarna的先天识别来着手克服这一问题。先前发表的唯一用sarna减弱干扰素反应的方法是使用来自疫苗病毒的干扰素抑制蛋白，e3、k3和b18。然而，在这项研究中，干扰素抑制蛋白作为与sarna组合的单独mrna分子被递送和配制。这需要制造sarna和mrna两者，并需要使用复制子rna的3-6倍的疫苗mrna，以确保共递送到同一细胞中，并提供任何可观察到的蛋白质表达增强。此外，mrna和sarna的表达动力学不同，因此从mrna表达的iip的任何有益效果与伴随的复制子相比都是短暂的。[0415]鉴于目前在治疗中使用sarna的困难，本发明人设计了将比现有技术方法更有效地限制对其的免疫反应的新型sarna，从而提高其在接种疫苗和治疗中的效用。[0416]使用piv-5和orf4a作为新型iip[0417]已知piv-5和orf4a阻断mda-5，mda-5是一种细胞质rna螺旋酶，通过称为mav的接合体(apator)分子发出信号，导致干扰素调节因子3和7(irf3和irf7)的诱导，这分别导致产生降低引入的合成sarna的翻译的限制因子(图l)。这2个iip是在对来自一系列不同病毒的10个iip进行初步体外筛选中鉴定的。[0418]l.hsv-2us1-通过抑制irf-3与ifn-β启动子的结合来抑制ifn-b的产生[1]。[0419]2.hsv-1us1(来自hsv-1的调节因子)[0420]3.hsv-1us11-阻止rig-i信号传导[2,3]。[0421]4.ov20.0l-与dsrna结合，并抑制pkr和pact两者，阻断rig-i信号传导[4,5]。[0422]5.bvdvnpro：阻断irf3磷酸化和s100a9信号传导[6,7]。[0423]6.piv5v：通过与mda-5结合阻断mda-5和irf3[8,9][0424]7.mers-covm：与traf3相互作用，破坏traf3-tbk1结合，导致irf3激活减少[10-12]。[0425]8.mers-covorf4a：与dsrna结合(对长rna有偏好)，抑制mda5和rig-i、pkr的pact触发和应激反应[13,14]。[0426]9.兰加特病毒ns5：下调ifna1r，损害jak-stat信号传导[15-16]。[0427]10.流感ns1：与dsrna结合，阻断rig-i信号传导[17]。[0428]这些iip连同作为goi并用作表达标记物的荧光素酶被整合在本发明人的标准veevsarna复制子中(图1)。在三种人类细胞系：具有受损的先天感知通路的hek293t细胞、hela细胞和原代mrc5胚胎上皮细胞中评估这些构建体(图3a和b)。在没有先天识别的情况下，在hek293t细胞中所有iip候选sarna都以与野生型sarna类似的方式复制。一系列的iip(除mers-covm和流感ns1外)能够增强hela细胞中的表达，但是观察到piv-v和orf4a的增强最显著(3logs)。在原代mrc5细胞中最重要的评估表明，仅piv-v和orf4a能够将荧光素酶的表达提高2logs。这些数据表明，在增强人类原代细胞中goi表达的能力方面piv-v和orf4a是独一无二的。鉴定包含在rna载体中的piv-5和orf4a是基于这些实验数据，考虑到据认为被评估的其他iip通过类似的机制工作，它们的活性是不可预测的。为了进一步支持它们在基因递送中的应用，本发明人在小鼠中进行了体内实验。本文中，本发明人利用了black6(bl6)小鼠，已知此类小鼠具有比balbc小鼠更强健的先天感知机制和下游干扰素反应，因此在这两种模型中的比较是有启发性的。本发明人使用萤火虫荧光素酶(fluc)作为报告蛋白，评估了在bl/6小鼠中wt、piv-5和orf4a复制子的相对表达(图4)。[0429]由于fluc在细胞内表达，因此可以在用底物d-荧光素腹膜内(ip)注射后将目的基因的表达可视化为基于荧光素酶的表达，并表示为总通量(p/s)(参见方法)。这些体内实验证明piv5和orf4a将bl/6细胞中荧光素酶表达的持续时间延长至14天，而wt构建体在这个时间点是阴性的。在进一步的研究中，本发明人评估了这两种rna复制子构建体对gluc(作为goi)的高斯荧光素酶(图5)的表达的影响。gluc作为可溶性蛋白质被分泌，在血液中测量其活性(参见方法)。这些体内实验证明piv5和orf4a将bl/6细胞中荧光素酶表达的持续时间延长至14天。在第14天，piv5和orf4arna复制子两者的gluc表达显著更高(分别p＝0.0244和0.00422)。超过14天的“曲线下面积”的计算表明以下auc值，如下：flucbalbc＝1950；piv5balbc＝2742；orf4abalbc＝1596；flucbl6＝2012；piv5bl6＝4513；orf4abl6＝6972(总通量(p/s))。虽然这些体内实验是支持性的，但重要的是要注意人类和小鼠之间在先天限制因子和干扰素刺激基因(其中有》100)的特异性方面存在显著差异，因此，基于对人类细胞系的体外观察，这些数据很可能低估了对人类可能产生的影响。[0430]干扰素抑制蛋白在体外增强sarna的蛋白质表达[0431]本发明人试图确定干扰素抑制蛋白文库是否能增强萤火虫荧光素酶(fluc)的体外蛋白质表达。他们制备了具有各种各样的细胞质干扰素靶标(表1)，包括irf-3、mda5、rig-i和jak/stat(图9b)的sarnaveev复制子库，其中用t2a切割位点将iip与fluc分开(图9a)。[0432][0433]表l.干扰素抑制veev复制子和相关的ifn靶标。[0434]然后，本发明人使用pabol(图9c，补充图1)将sarna转染到hek293t.17、hela和mrc5细胞中，pabol是一种聚合物递送系统，其先前已经被表征为产生相对较高的蛋白质表达，但由于其生物可还原性质，是相对免疫沉默的(2)。本发明人选择这三种细胞系是因为它们在ifn通路的完整性方面存在差异；hek293t.17细胞没有完整的通路，因为它们缺乏内源性rig-i和mda5的表达(37)，因此对影响该通路的蛋白质应该不太敏感，而hela和mrc5则更具有鉴别性(38，39)。本发明人观察到，在hek293t.17细胞中，没有iip复制子增强了蛋白质表达(图lc)，但有趣的是兰加特和流感iip都明显降低了蛋白质表达0.06倍，其中分别为p＝0.0097和0.0061。在hela细胞中，许多iip都增强了蛋白质表达；在fluc表达上，hsv-2、hsv-1_1、hsv-1_2、orf和bvdv增加范围为20-150倍。然而，piv-5v和mers-covorf4a蛋白增强的蛋白质表达最大，分别为796倍和893倍，尽管只有piv-5组具有统计学意义(p＝0.0272)，而orf4a组没有(p＝0.0689)。在mrc5细胞中，本发明人同样观察从piv-5v和mers-covorf4a蛋白中观察到了最大增强，分别具有72倍和109倍更高的fluc表达，其中p＝0.0485和0.025。在所有细胞类型和每个构建体中，来自两批单独制备批次的rna(图14)的表达水平之间存在良好的一致性。[0435]本发明人进一步研究了在小鼠(mef)、兔子(rk13)、非人灵长类(llc)和人类细胞(mrc5)中piv-5v和mers-covorf4a蛋白的两个突变如何影响蛋白质表达(图15a-d)。piv-5v中的r172a突变消除了阻断mda5而不是stat的能力(40)，而mers-covorf4a中的k63a/k67a突变阻断了与dsrna的结合(41)。本发明人观察到，在mef或rk13细胞中piv-5v和mers-covorf4a蛋白没有增强蛋白质表达。在llc和mrc5细胞中mers-covorf4a蛋白确实增强了蛋白质表达(图15c,d)，k63a/k67a突变极大降低了蛋白质表达。在mrc5细胞中piv-5v蛋白增强了蛋白质表达，但在llc细胞中没有增强，而在mrc5细胞中r172a突变降低了蛋白质表达。总的来说，这些数据表明，在干扰素感受态人类细胞中piv-5v和mers-covorf4a蛋白增强了蛋白质表达，而以k63a/k67a和r172a替换来突变蛋白则使sarna表达变弱。[0436]mers-covorf4a蛋白部分地减弱了体内剂量非线性的增加。[0437]鉴于piv-5v和mers-covorf4a蛋白对体外蛋白质表达的增强，随后本发明人试图确定这些构建体是否能增强体内蛋白质表达并减弱增加sarna剂量的非线性。本发明人测试了编码萤火虫荧光素酶(一种细胞内蛋白)和高斯荧光素酶(一种体内分泌蛋白)两者的sarna(表2)。[0438][0439]表2.在14天的过程中balb/c和c57bl6/j中总荧光素酶表达的曲线下面积(auc)，n＝5。[0440]由于干扰素生成能力的差异，本发明人选择在balb/c和c57bl/6小鼠中测试这些构建体：balb/c是ifn的不良生产者，而先前已发现c57bl/6小鼠是ifn-α/β和ifn-γ的高生产者(42)，类似于体外hek293t.17和hela/mrc-5细胞的差异性。本发明人观察到，在balb/c小鼠中整合piv-5v和mers-covorf4a蛋白并没有增强fluc或gluc的蛋白质表达(表2，图16)。本发明人观察到，在具有mers-covorf4a蛋白的c57bl/6小鼠中fluc蛋白质表达的总曲线下面积(auc)略有增强，而具有piv-5v和mers-covorf4a蛋白的c57bl/6小鼠中gluc蛋白质表达的总曲线下面积(auc)略有增加，尽管这种差异不是统计显著性的。[0441]本发明人先前已经观察到，增加sarna的剂量最终导致较低的蛋白质表达水平，因此试图表征mers-covorf4a蛋白是否能减弱sarna的体内非线性剂量依赖性。本发明人测试了剂量为0.2、2和20μg的野生型fluc和fluc mers-covorf4a复制子，并在肌肉内注射(im)后的第7天和第10天对蛋白质表达进行定量(图10)。本发明人观察到，7天后，两种构建体在0.2μg剂量下具有相似的蛋白质表达(～5000p/s)，当剂量增加到2μg时，两种构建体的蛋白质表达都提高(wt为～5,0000p/s，mers-covorf4a构建体为～200,000p/s)，但mers-covorf4a蛋白的整合使蛋白质表达增强了4倍，p＝0.0029。有趣的是，7天后，两种构建体在剂量为20μg时都表现出较低的蛋白质表达，但wt比mers-cov构建体低18倍，p《0.0001。10天后，2μg剂量的蛋白质表达水平已经相等，在0.2和20μg剂量下没有观察到表达。在不希望被任何特定理论束缚的情况下，这些数据表明mers-covorf4a蛋白能够部分拯救sarna的体内非线性剂量依赖性。[0442]鲁索替尼增强了体内sarna的蛋白质表达。[0443]鉴于jak/stat通路在下游干扰素反应中的作用，本发明人随后试图表征将sarna、mers-covorf4a干扰素抑制蛋白和鲁索替尼(一种jak1和jak2蛋白激酶的强效、选择性抑制剂(36))组合如何影响体内的蛋白质表达(图3)。发明人向小鼠im注射与100μg鲁索替尼或不与100μg鲁索替尼共同配制的5μg编码fluc±mers-covorf4a的sarna，并在注射后4、7、10和14天对蛋白质表达进行定量。4天后(图11a)，与wt或mers-covorf4a构建体(～5x105p/s)相比，含有鲁索替尼的两种制剂具有略高的蛋白质表达(～106p/s)，尽管不是统计学上显著的。然而，7天后，与仅sarna的平行组相比，含有鲁索替尼的两种制剂都具有更高的蛋白质表达量，其中分别为p＝0.0347和0.0447。到第10天，这些组仍有轻微的升高，但差异不再是统计学上显著的。14天后，在不含鲁索替尼的sarna组中没有观察到蛋白质表达，而鲁索替尼组只有少数阳性样本。在不希望被任何特定理论所束缚的情况下，这些数据表明，鲁索替尼能使sarna蛋白质表达深度提高，但当mers-covorf4a蛋白与鲁索替尼组合时，mers-covorf4a蛋白与鲁索替尼之间并没有协同效应。[0444]在人皮肤外植体中piv-5v和mers-covorf4a蛋白减弱了离体剂量非线性增加。[0445]由于本发明人观察到在体外iip根据细胞类型的种类表现出蛋白质表达差异，他们试图在更具临床意义的人皮肤外植体模型中测试sarnaiip构建体。本发明人表征了在整合了piv-5v和mers-covorf4a蛋白(图中称为mers-cov_2)以及与鲁索替尼共配制的驻留人皮肤细胞中的蛋白质表达的数量(egfp 细胞的百分比)和质量(每个细胞的中值egfp荧光强度)(图12)。本发明人测试了剂量为0.2、2和20μg具有piv-5v和mers-covorf4a蛋白的egfpsarna(图12a，b)，并观察到将wt构建体的剂量从0.2μg增加到2μg导致egfp 细胞的百分比从10％增加到18％，但当剂量增加到20μg时，egfp 细胞的百分比骤降到～5％。然而，对于piv-5和mers-covorf4a构建体，随着sarna剂量增加，剂量线性增加。对于这两种国构建体，0.2μg的剂量同样导致egfp 为～12％，2μg时进一步提高到15％，20μg时提高到25％，此时piv-5和mers-covorf4a构建体均具有统计学上显著更高的egfp 细胞百分比，其中对于两者，p《0.0001。有趣的是，无论是剂量还是piv-5或mers-covorf4a蛋白的整合与否都不影响egfpmfi，对于所有样品，都为～350(图12b)。[0446]本发明人使用t-分布随机邻域嵌入进一步表征了哪些细胞正在表达sarna，t-分布随机邻域嵌入是一种用于流式细胞术数据的原理成分分析类型，其允许通过采用叠加的限定的蛋白质和表型门控的无监督的细胞聚类的可视化(图17-25)(43)。本发明人观察到，在sarna的最高剂量下(20μg)，piv-5v和mers-covorf4a蛋白实现了在包括t细胞、树突细胞、单核细胞、b细胞、朗格汉斯细胞、白细胞和nk细胞的免疫细胞中而不是驻留上皮细胞和纤维母细胞中的蛋白质表达。[0447]接下来，本发明人测试了鲁索替尼的整合剂量(0-100μg)如何影响人皮肤驻留细胞中的sarna表达。他们观察到鲁索替尼与sarna的共制剂对egfp 细胞的百分比没有任何影响(图4c)，尽管有增加鲁索替尼的剂量实际上使egfp 细胞的百分比从～8％下降到～5％的轻微趋势。然而，本发明人确实观察到对每种细胞egfp表达的质量的深度影响(图12d)；增加鲁索替尼的剂量，在10μg剂量的鲁索替尼下，egfpmfi从～100增加到～2000，尽管在100μg剂量的鲁索替尼下，mfi下降到～1000。与表达sarnapiv-5和mers-covorf4a蛋白的细胞类似，发明人发现鲁索替尼增强了免疫细胞而不是上皮细胞和纤维母细胞中的蛋白质表达，尤其增加了t细胞、朗格汉斯细胞、白细胞和nk细胞中的摄取(图26a,b)。[0448]综上所述，在不希望被任何特定理论束缚的情况下，这些数据显示iip复制子通过增加表达sarna的细胞比例来增强免疫细胞中的表达，而鲁索替尼则在每个细胞的基础上增强蛋白质表达。[0449]在兔体内mers-covorf4a蛋白增强rabv糖蛋白的免疫原性[0450]由于核酸制剂的蛋白质表达并不总是免疫原性的直接预测(2)，随后本发明人试图表征作为治疗性生物分子的模型蛋白质(即由genebankid号np_056796.i代表的狂犬病病毒糖蛋白(rabv))在本发明的sarna构建中与mers-covorf4a蛋白(作为先天抑制蛋白或iip)组合时的免疫原性。此外，使用具有氨基酸替换的，即阻止与细胞p75ntr表面受体结合的f318v修饰的rabv蛋白。本发明人给兔子注射了20μgsarna的初级剂量并在4周后注射了加强剂量，然后在0、4和6周后对其血液中的rabv特异性igg抗体进行采样(图13a)。本发明人观察到，对于野生型和mers-covorf4a构建体两者的所有兔子在一次注射后都发生了血清转化。4周后，mers-cov组的igg滴度(～104ng/ml)比野生型(～5×103ng/ml)略高，但不是统计学上显著的。然而，6周后，mers-covorf4a组的动物的抗体滴度(～105ng/ml)与wt组(～104ng/ml)相比显著更高，其中p＝0.0061。rabv假型中和反映了抗体的趋势(图13b)。4周后，wt组的平均ic50为～103，而mers-cov组的ic50为～104。6周后，mers-cov组的ic50高得多，为～105，而wt组已稳定在～103。发明人还比较了在小鼠和大鼠中wtrabv和rabv-mers-covorf4asarna的免疫原性(图27)，但在这些物种中没有观察到抗体滴度之间和中和ic50之间的任何差异。在不希望被任何特定的理论所束缚的情况下，这些数据表明在兔子中mers-covorf4a蛋白增强了由sarna编码的rabv糖蛋白的免疫原性。[0451]mers-covorf4a蛋白增强sars-cov-2糖蛋白的体外表达[0452]本发明人还表征了另一种模型蛋白(即治疗性生物分子，即由genbankidno:qhd43416.1代表的sars-cov-2糖蛋白)在本发明的sarna构建中与mers-covorf4a蛋白(即先天抑制剂蛋白或iip)组合时的免疫原性。[0453]在转染到hela细胞系24小时后，比较了sars-cov-2(无iip)和与mers-covorf4a(iip)组合的sars-cov-2的表面表达水平。参照图29，测量了阳性细胞群的中位荧光强度，其中阴性/阳性截止值设置在门控为活的单个的且被模拟转染的细胞上。令人惊讶的是，与只编码sars-cov-2糖蛋白(即无iip)的sarna相比，mers-covorf4a蛋白几乎使每细胞sars-cov-2糖蛋白的表达水平翻了一倍。[0454]讨论[0455]本发明人筛选了带有顺式编码的干扰素抑制蛋白的自扩增rna文库，用于在小鼠、兔子、非人灵长类动物和人类细胞中体外、在人皮肤外植体中离体以及在小鼠体内的蛋白质表达，以及在小鼠、大鼠和兔子体内的免疫原性。本发明人观察到，在ifn感受态hela和mrc5细胞中piv-5v和mers-covorf4a蛋白在体外增强蛋白质表达100-500倍。他们发现mers-covorf4a蛋白在体内部分减弱了剂量非线性，鲁索替尼而非iip在体内增强了sarna的蛋白质表达。在表达sarna的人皮肤外植体中发现piv-5v和mers-covorf4a蛋白都提高驻留细胞的百分比，并完全拯救了sarna的剂量非线性，而鲁索替尼在每个细胞基础上提高了蛋白质表达。最后，本发明人观察到在兔子中mers-covorf4a使rabv特异性igg滴度和中和ic50提高了10倍，但在小鼠或大鼠中未观察到这种结果。[0456]在这些实验中表征的蛋白质设计、细胞和突变提供了对piv-5v和mers-covorf4a蛋白提高蛋白质表达机制的见解。piv-5v蛋白通过与mda-5结合阻断mda-5和irf3(26，27)，而mers-covorf4a蛋白与dsrna结合并抑制mda-5和rig-i的pact触发(29-31)。在我们的体外筛选后，本发明人选择继续使用mers-covorf4a复制子，因为在体内筛选所有10个候选者是不可行的，而且piv-5v蛋白在物种间并不保守(例如适应小鼠所需的n100d突变(44))，而orf4a蛋白在物种间更高度保守(29-31)。本发明人观察到，piv-5v蛋白的r172a突变(其消除了阻断与mda-5而不是与stat结合的能力(45))轻微抑制了mrc5细胞中的蛋白质表达(图15d)，从而表明与mda5的结合是增强蛋白质表达的部分原因。同样，mers-covorf4a蛋白的k63a/k67a突变限制了结合dsrna的能力(46，47)，并观察到该种突变在非人灵长类和人类细胞中降低蛋白质表达(图15c，d)。虽然各种iip通过与piv-5v和mers-covorf4a类似的机制抑制干扰素，但观察到的作用机制不一定能预测可以增强蛋白质表达。[0457]本发明人先前已经观察到sarna制剂的蛋白质表达不一定能预测免疫原性(2)，因此还表征了在小鼠、大鼠和兔子中mers-covorf4a蛋白如何影响狂犬病病毒糖蛋白的免疫原性。本发明人在兔子中观察到采用编码rabv和mers-covorf4a的sarna，抗体滴度和中和ic50都增加(图13a，b)，但在小鼠或大鼠中没有观察到免疫原性的提高。虽然没有任何临床前动物模型能完美预测人类的反应，但认为兔子比小鼠或大鼠在免疫学上与人类更相似(48-50)。此外，本发明人没有观察到在鼠细胞中由piv-5v或mers-covorf4a蛋白带来的任何蛋白质表达增强(图15a)，因此免疫原性没有增强并不意外。本发明人将临床前动物模型中的特征与人类移植模型配对，其中细胞处于原生组织结构中，拥有人类固有的ifn反应。据他们所知，本发明人是第一个观察到iip提高了表达sarna的细胞的百分比，而鲁索替尼则增强了每个细胞的表达。鉴于这些有希望的结果，本发明人认为在人类中mers-covorf4a蛋白可增强sarna疫苗的免疫原性，对sarna应用于蛋白质替代疗法中也是有用的(51，52)。[0458]这些实验提供了，iip可以被直接编码到sarna载体中并有效地减弱非线性剂量依赖性并增强免疫原性的概念验证。正如机理研究所表明的，干扰素通路的不同方面可以成为靶标，并提高sarna的表达，从而促使探究iip与其他ifn抑制策略(如鲁索替尼)的组合。[0459]财政支持声明[0460]交托本技术的项目得到了mariesklodowska-curie授权协议no.794059下的欧盟horizon2020研究和创新计划的资金资助。[0461]参考文献[0462]1.s.perrietal.,analphavirusrepliconparticlechimeraderivedfromvenezuelanequineencephalitisandsindbisvirusesisapotentgene-basedvaccinedeliveryvector.jvirol77,10394-10403(2003).[0463]2.a.k.blakneyetal.,bigisbeautiful：enhancedsarnadeliveryandimmunogenicitybyahighermolecularweight,bioreducible,cationicpolymer.acsnano10.1021/acsnano.0c00326(2020).[0464]3.l.a.britoetal.,acationicnanoemulsionforthedeliveryofnext-generationrnavaccines.moleculartherapy：thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy22,2118-2129(2014).[0465]4.a.k.blakney,p.f.mckay,b.i.yus,y.aldon,r.j.shattock,insideout：optimizationoflipidnanoparticleformulationsforexteriorcomplexationandinvivodeliveryofsarna.genetherapy10.1038/s41434-019-0095-2(2019).[0466]5.a.j.gealletal,nonviraldeliveryofself-amplifyingrnavaccines.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica109,14604-14609(2012).[0467]6.j.s.chahaletal,dendrimer-rnananoparticlesgenerateprotectiveimmunityagainstlethalebola,h1n1influenza,andtoxoplasmagondiichallengeswithasingledose.procnatlacadsciusa113,e4133-4142(2016).[0468]7.a.b.vogeletal.,self-amplifyingrnavaccinesgiveequivalentprotectionagainstinfluenzatomrnavaccinesbutatmuchlowerdoses.mol.ther.26,446-455(2018).[0469]8.k.j.kallenetal,anovel,disruptivevaccinationtechnology：self-adjuvantedrnactivevaccines.humvaccinimmunother9,2263-2276(2013).[0470]9.n.pardi,m.j.hogan,f.w.porter,d.weissman,mrnavaccines—anewerainvaccinology.naturereviewsdrugdiscovery10.1038/nrd.2017.243(2018).[0471]10.c.deharo,r.méndez,j.santoyo,theeif-2alphakinasesandthecontrolofproteinsynthesis.fasebj10,1378-1387(1996).[0472]11.s.l.liang,d.quirk,a.zhou,rnasel：itsbiologicalrolesandregulation.iubmblife58,508-514(2006).[0473]12.m.albereretal.,safetyandimmunogenicityofamrnarabiesvaccineinhealthyadults：anopen-label,non-randomised,prospective,first-in-humanphaselclinic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