一种脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法与流程

1.本发明属于肌腱/韧带损伤修复技术领域，具体涉及一种脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法。


背景技术：

2.现代日常所造成的不同程度急慢性肌腱损伤包括跟腱断裂、慢性的肩袖损伤、交叉韧带损伤等尤为常见，传统治疗主要包括缝合、自体移植物、同种异体移植物、人工合成材料等。其中自体肌腱重建有骨腱愈合早、组织兼容性好、组织塑形快等优点，但是在临床应用中发现，自体肌腱具有长度和直径不可控、取腱处并发症、影响美观等不足。人工合成材料多为高分子有机物，不易降解，同时降解产物可能会引起局部微环境的改变，从而引发局部炎症不利于组织的愈合。同种异体肌腱存在免疫排斥反应和感染风险等，而且也会受到供体来源的影响。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法。
4.一种脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法，包括如下操作步骤：
5.(1)取猪肌腱原材料，采用纯化水清洗处理、剔除多余组织，然后采用表面活性剂处理，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
6.(2)naoh溶液摇床处理0.5-2h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
7.(3)α-gal抗原酶摇床处理12-24h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
8.(4)dna酶摇床处理12-24h，处理完毕后采用纯化水超声清洗，得到脱细胞去抗原肌腱。
9.所述表面活性剂为sds和/或triton，质量浓度为1％。
10.所述步骤(1)处理完毕后加0.5％胰酶消化1-3h，处理完毕后采用纯化水超声清洗。
11.所述α-gal抗原酶的浓度为5mg/ml。
12.所述dna酶的浓度为1mg/ml。
13.所述naoh溶液的质量浓度为1％。
14.本发明的有益效果：本发明脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法，采用猪肌腱原材料，经过表面活性剂处理，naoh溶液处理，α-gal抗原酶和dna酶处理，制备的猪肌腱脱细胞完全，细胞相容性好，免疫排斥反应小，具有较强的力学性能，材料来源广。
附图说明
15.图1为脱细胞后he染色结果；
16.图中，a为猪肌腱原材料，b为实施例1脱细胞去抗原肌腱，c为实施例2脱细胞去抗原肌腱，d为实施例3脱细胞去抗原肌腱。
17.图2为不同工艺处理后肌腱细胞毒性结果。
具体实施方式
18.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
19.实施例1
20.一种脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法，按照如下操作步骤进行：
21.(1)取猪肌腱原材料，采用纯化水清洗处理、剔除多余组织，然后采用1％sds摇床处理1h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；然后采用0.5％胰酶消化2h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
22.(2)采用5mg/ml α-gal抗原酶摇床处理16h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
23.(3)采用1mg/ml dna酶摇床处理16h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
24.(4)采用质量浓度为1％naoh溶液摇床处理1h，处理完毕后采用纯化水超声清洗，得到脱细胞去抗原肌腱。
25.实施例2
26.一种脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法，按照如下操作步骤进行：
27.(1)取猪肌腱原材料，采用纯化水清洗处理、剔除多余组织，然后采用1％triton摇床处理72h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；然后再采用1％triton摇床处理24h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
28.(2)采用5mg/ml α-gal抗原酶摇床处理16h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
29.(3)采用1mg/ml dna酶摇床处理16h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
30.(4)采用质量浓度为1％naoh溶液摇床处理1h，处理完毕后采用纯化水超声清洗，得到脱细胞去抗原肌腱。
31.实施例3
32.一种脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法，按照如下操作步骤进行：
33.(1)取猪肌腱原材料，采用纯化水清洗处理、剔除多余组织，然后采用1％triton摇床处理72h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；然后再采用1％triton摇床处理24h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
34.(4)采用质量浓度为1％naoh溶液摇床处理1h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
35.(2)采用5mg/ml α-gal抗原酶摇床处理16h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；
36.(3)采用1mg/ml dna酶摇床处理16h，处理完毕后采用纯化水超声清洗，得到脱细胞去抗原肌腱。
37.实验例1：
38.将实施例1-3制备好的猪肌腱经过40g/l多聚甲醛固定48h后，常规脱水、包埋、切片、脱蜡，苏木精-伊红染色，显微镜下观察。结果如图1所示，实施例1和实施例2制备的猪肌腱有一定的脱细胞效果，实施例3制备的猪肌腱脱细胞彻底，效果最好，实施例2与实施例3相比，大体处理步骤相同，实施例3将naoh溶液摇床处理在酶液处理之前，实施例2是在酶液处理之后，证明naoh溶液摇床处理的时机为关键步骤。
39.实验例2：
40.利用l929细胞评价猪肌腱的细胞相容性。取实施例1-3(工艺1-3)及未处理猪肌腱(对照)样品按0.2ml/1ml的比例加入培养基中，37℃下浸提24h，得到浸提液。取正常培养l929细胞，调整细胞密度为2
×
104/ml，接种到96孔培养板中，培养24h，弃去原培养基，加入对应的浸提液；72h后，弃去原培养基，每孔加入100ul含10％cck8的培养基，30min后450nm波长下检测吸光度。各样品组及对照组的相对增值率见图2。
41.实验例3：
42.使用拉伸(压缩)试验机，将实施例1-3制备好的猪肌腱及未处理猪肌腱(对照)裁剪成试样，裁剪后在相对湿度为50％，温度为22℃
±
2℃的条件下放置2h后立即进行试验。将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度依次向外拉伸直到试样断裂，纵向试样和横向试样分别进行试验。以n为单位记录下试样断裂时的力，测定结果见表1：
43.表1
[0044][0045]
注：*代表与实施例1组比较p《0.05。
[0046]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。


技术特征：
1.一种脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法，其特征在于，包括如下操作步骤：(1)取猪肌腱原材料，采用纯化水清洗处理、剔除多余组织，然后采用表面活性剂处理，处理完毕后采用纯化水超声清洗；(2)naoh溶液摇床处理0.5-2h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；(3)α-gal抗原酶摇床处理12-24h，处理完毕后采用纯化水超声清洗；(4)dna酶摇床处理12-24h，处理完毕后采用纯化水超声清洗，得到脱细胞去抗原肌腱。2.根据权利要求1所述脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为sds和/或triton，质量浓度为1％。3.根据权利要求1所述脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法，其特征在于，所述步骤(1)处理完毕后加0.5％胰酶消化1-3h，处理完毕后采用纯化水超声清洗。4.根据权利要求1所述脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法，其特征在于，所述α-gal抗原酶的浓度为5mg/ml。5.根据权利要求1所述脱细胞去制备方法，其特征在于，所述dna酶的浓度为1mg/ml。6.根据权利要求1所述脱细胞去制备方法，其特征在于，所述naoh溶液的质量浓度为1％。

技术总结
本发明公开了一种脱细胞去抗原的异种肌腱制备方法。该方法采用猪肌腱原材料，经过表面活性剂处理，NaOH溶液处理，α-Gal抗原酶和DNA酶处理，制备的猪肌腱脱细胞完全，细胞相容性好，免疫排斥反应小，具有较强的力学性能，材料来源广。料来源广。料来源广。


技术研发人员：赵子腾 韩丽伟 胡先同 刘永进 袁军林 李晋 衷鸿宾 徐健龙
受保护的技术使用者：北京鑫康辰医学科技发展有限公司
技术研发日：2021.12.23
技术公布日：2022/4/26