二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物及其应用

1.本发明属于化学生物学领域，具体涉及二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物及其应用。


背景技术：

2.电化学核酸传感器是一种用于基因识别和检测的分析技术，具有成本低，仪器简单易携带，结果输出快，灵敏度高，选择性好等优点，在疾病诊断，食品安全检测，环境污染检测，抗癌药物的研发等方面有广泛的应用前景。它基于dna分子杂交的原理以及杂交信号转化和放大，对特定生物大分子进行识别并达到定量检测。根据电信号的来源不同，电化学核酸传感器可以分为标记型和非标记型。其中，非标记型电化学核酸传感器主要由固定在电极表面上的寡核苷酸片段和可识别杂交信息的电化学核酸杂交指示剂两部分构成，通过电化学核酸杂交指示剂在dna分子杂交前后电流响应信号的改变来对靶标dna进行检测。因此，电化学核酸杂交指示剂的灵敏度对非标记型核酸传感器性能有直接影响。构建非标记型电化学核酸传感器的关键问题是使用具有良好电活性并特异性识别双链dna的电化学核酸杂交指示剂。
3.萘二甲酰亚胺基团是高序列选择性的dna嵌入剂，双萘酰亚胺类衍生物与dna相互结合能力及稳定性大于单萘酰亚胺类衍生物，衍生物结构中的链长及柔性对于萘酰亚胺基团与dna结合模式和结合能力影响非常大。但萘二甲酰亚胺衍生物自身电化学活性较差，进而限制了其在电化学核酸传感器领域中的应用。二茂铁是一个优秀的电中性基团，可为电化学核酸传感器提供灵敏的电信号，但与dna结合能力差并在结合时没有选择性。
4.yang等人1合成了一种二茂铁修饰的萘四甲酰亚胺衍生物，结构中两个二茂铁基团通过柔性链与萘四甲酰亚胺连接，将其作为杂交指示剂构建电化学dna传感器，用于检测废水中的人类线粒体dna，检测限仅为1.0
×
10-11
mol/l。kusnin和takenaka等人2采用结构类似的二茂铁-萘四甲酰亚胺衍生物作为杂交指示剂构建电化学dna传感器，并采用硅纳米线和铂纳米颗粒修饰丝网印刷电极，通过增加电极有效面积实现信号放大，该传感器用于检测食物中的野猪线粒体dna，检测限则为2.4
×
10-9
mol/l。上述两种杂交指示剂结构中均只含有一个嵌入基团，其研究结果表明杂交指示剂的结构对于传感器的灵敏度和检测限有关键性的影响。


技术实现要素：

5.为了解决目前传感器的灵敏度和检测限不足的问题，本发明提供了一种二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物，是在双萘酰亚胺类衍生物的结构上引入了双二茂铁基团，其结构如式ⅰ所示：
[0006][0007]
其中，r为c1～c8烷基、氨基、c1～c8烷氧基、n＝1～5，m＝1～4，p＝1～4，n、m和p均为整数。
[0008]
作为本发明的优选方案，r为c1～c8烷基、氨基、n＝1～5；m＝1～4；p＝1～4，n、m和p均为整数。
[0009]
优选的，r为c1～c8烷基、n＝1～5；m＝1～4；p＝1～4，n、m和p均为整数。
[0010]
进一步优选的，r为c1～c6烷基、n＝1～5；m＝1～4；p＝1～2，n、m和p均为整数。
[0011]
最优的，r为c1～c6烷基、n＝1～3；m＝1～2；p＝1，n、m和p均为整数。
[0012]
本发明还提供了上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的中间体，其结构如式ⅱ所示：
[0013][0014]
其中，r1为c1～c8烷基或苄基；n＝1～5。
[0015]
作为本发明的优选方案，r为c1～c4烷基或苄基；n＝1～3。
[0016]
最优的，r为甲基或苄基；n＝1～3。
[0017]
本发明还提供了上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的合成方法，其合成路线
为：
[0018][0019]
其中，r为c1～c8烷基、氨基、c1～c8烷氧基、n＝1～5，m＝1～4，p＝1～4，n、m和p均为整数。
[0020]
上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的合成方法，包括以下步骤：
[0021]
a、将氨基酸的氨基、羧羟基保护后与1,8-萘二甲酰亚胺反应，得到中间体1；或者，将氨基酸与1,8-萘二甲酸酐反应后再酯化保护羧基，得到中间体1；
[0022]
b、中间体1与二茂铁甲醛反应，再经三乙酰基硼氢化钠的还原得到式ⅱ中间体；
[0023]
c、式ⅱ中间体与在tbd(1,5,7-三叠氮双环(4.4.0)癸-5-烯)强碱条件下发生酯的氨解反应得到式ⅰ化合物；
[0024]
上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的合成方法，步骤a所述的氨基酸的氨基、羧羟基保护，是指先在碱性条件下以混合溶剂同boc2o(二碳酸二叔丁酯)反应保护氨基，再于三乙胺为碱性条件下与r1br反应保护羧羟基。所述的混合溶剂是体积比为乙醇︰水＝2︰1的混合物。
[0025]
上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的合成方法，步骤b所述的中间体1、二茂铁甲醛与三乙酰基硼氢化钠的摩尔比为1︰1～2︰2～4。
[0026]
上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的合成方法，步骤c所述的式ⅱ中间体、与tbd的摩尔比为8～10︰3～5︰2～3。
[0027]
本发明还提供了上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物在制备嵌入型电化学核酸杂交指示剂中的用途。
[0028]
本发明还提供了上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物在构建电化学核酸传感器中的用途。
[0029]
本发明通过在双萘酰亚胺类衍生物结构上引入双二茂铁基团，合成了新型二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物。本发明提供的二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物以嵌插方式与dna进行相互作用，与单双链dna具有不同的结合能力，对双链dna具有较高选择性结合能力，各个衍生物与dna的结合常数在104～105l/mol数量级，而且具有良好的电化学活性。在
没有任何信号放大策略的情况下检测mirna-145逆转录cdna片段，检测限达到4.6
×
10-12
mol/l。实验结果表明，本发明提供的二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物对单双链的选择性识别能力均优于常用杂交指示剂——亚甲蓝和道诺霉素。本发明以细胞裂解液为基质进行加样的回收率实验，回收率在99.51％～101.36％之间，表明采用本发明所合成的二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物构建的电化学核酸传感器分析方法准确性好。抗干扰实验结果表明，该电化学核酸传感器分析方法对目标互补链有优异的选择性识别能力，能够区分非互补链和单碱基错配链。本发明提供的二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物，由于结构中的双萘酰亚胺基团能够与双链dna牢固结合，且每个分子中含有两个二茂铁基团，间接起到了信号放大的作用，其独特的结构决定了其可作为一类性能优越的电化学杂交指示剂应用于电化学核酸传感器的构建和目标物的检测。
附图说明
[0030]
图1二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物6a-b和7b-p与ct-dna作用的紫外光谱图。
[0031]
图2二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物6a-b和7b-p的wolfe-shimer图。
[0032]
图3dna滴定二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物7b-p的粘度变化。
[0033]
图4二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物6a-b和7b-p的差分脉冲伏安图。
[0034]
图5构建电化核酸学传感器的检测示意图。
[0035]
图6不同浓度的探针dna电流响应度。
[0036]
图7不同杂交温度的电流响应度。
[0037]
图8不同浓度的电化学核酸杂交指示剂电流响应度。
[0038]
图9不同浓度的靶标dna的dpv曲线图(插图：靶标dna与
△ip
的线性相关曲线,
△ip
指的是sh-ssdna与sh-dsdna的指示剂的氧化峰电流之差)。靶标dna的浓度范围是：6.1
×
10-12
～1.95
×
10-10
mol/l。
[0039]
图10不同干扰物的测定结果。
[0040]
图11二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物7b、7f、7h、7m、7n、7p与不同靶标dna杂交后的dpv曲线。
具体实施方式
[0041]
二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的合成方法，包括以下步骤：
[0042]
a、先将氨基酸在碱性条件下以混合溶剂同boc2o反应保护氨基，再于三乙胺为碱性条件下与r1br反应保护羧羟基后，与1,8-萘二甲酰亚胺反应得到中间体1；或者，将氨基酸与1,8-萘二甲酸酐反应后再酯化保护羧基，得到中间体1；
[0043]
b、中间体1与二茂铁甲醛反应，再经三乙酰基硼氢化钠的还原得到式ⅱ中间体；
[0044]
c、式ⅱ中间体与在tbd强碱条件下发生酯的氨解反应得到式ⅰ化合物；
[0045]
上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的合成方法，步骤a所述的混合溶剂是体积比为乙醇︰水＝2︰1的混合物。
[0046]
上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的合成方法，步骤b所述的中间体1、二茂铁甲醛与三乙酰基硼氢化钠的摩尔比为1︰1～2︰2～4。
[0047]
上述二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物的合成方法，步骤c所述的式ⅱ中间体、
与tbd的摩尔比为8～10︰3～5︰2～3。
[0048]
以下实施例中，l-高丝氨酸购自aladdin公司，l-赖氨酸购自macklin公司，ct-dna购自singma-aldrich公司，5’端巯基标记的dna探针7(5
’‑
sh(ch2)
6-agggattcctgggaaaactggac-3’，核苷酸序列为：5
’‑
agggattcctgggaaaactggac-3’seq id no.1)、与探针完全互补的dna(5
’‑
gtccagttttcccaggaatccct-3’seq id no.2)、ct-dna(小牛胸腺dna)、单碱基错配a(5
’‑
gtccagttttcacaggaatccct-3’seq id no.3)、noncomplementary strand a(与探针完全非互补的dna a，5
’‑
ccgctgctcaggtccccctggg gat-3’seq id no.4)以及noncomplementary strand b(与探针完全非互补的dna b，5
’‑
agccagcccgcacacaaacacagg-3’seq id no.5)均购自上海生工生物工程有限公司。
[0049]
实施例1 n-boc-l-高丝氨酸的合成
[0050][0051]
将l-高丝氨酸(83.96mmol，10g)溶于250ml的乙醇水混合体系中(乙醇:水＝2:1，v:v)，再加入84ml的1n naoh水溶液，在0℃下缓慢滴加84ml(92.36mmol，20.16g)boc2o(二碳酸二叔丁酯)的四氢呋喃溶液，滴加完毕后，室温反应24h，tlc(薄层层析)检测l-高丝氨酸反应完全后，减压真空浓缩除去有机溶剂，冰水浴下用1n稀盐酸水溶液调剩余水溶液ph＝2，用石油醚萃取除去未反应完的(boc)2o，再用乙酸乙酯(250ml)萃取水层，得到有机层用水洗1次，饱和氯化钠水溶液洗2次，适量的无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到n-boc-l-高丝氨酸，为无色油状物，产率为92.65％。
[0052]
实施例2保护羧羟基的n-boc-l-高丝氨酸的合成
[0053][0054]
将n-boc-l-高丝氨酸(83.96mmol，18.41g)溶于丙酮中并且搅拌混匀，加入三乙胺(167.92mmol，24ml)后55℃加热回流，在加热回流情况下缓慢滴加溴化苄(100.75mmol，12ml)继续反应过夜，tlc检测原料反应完全后，减压浓缩，残渣用100ml水溶解并用乙酸乙酯(250ml)萃取多次，用5％柠檬酸水溶液洗有机层两次，水洗1次，饱和氯化钠水溶液两次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到保护羧羟基的n-boc-l-高丝氨酸，为白色固体，产率为90.16％。
[0055]
实施例3前体1a的合成
[0056][0057]
将保护羧羟基的n-boc-l-高丝氨酸(51.72mmol，16g)、1,8-萘二甲酰亚胺(56.8mmol，11.2g)和pph3(三苯基膦，103.44mmol，27.13g)溶于500ml的无水四氢呋喃中搅拌均匀，在0℃下缓慢滴加diad(偶氮二甲酸二异丙酯，103.44mmol，22ml)，滴加完毕后，室
温反应24h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(体积比石油醚：乙酸乙酯＝4:1)分离得到白色粉末的前体1a，产率为74.52％。
[0058]
实施例4中间体1a的合成
[0059][0060]
将前体1a(4.09mmol，2g)溶于10ml的二氯甲烷中并且搅拌均匀，滴加2.5ml三氟乙酸，室温反应5h，tlc检测原料反应完全，减压浓缩，用50ml的二氯甲烷重新溶解残渣，饱和的碳酸氢钠溶液调ph＝7,二氯甲烷(150ml)萃取多次，饱和氯化钠水溶液洗2次，适量的无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离得到无色油状的化合物中间体1a，产率为89.32％。
[0061]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.51(d,j＝7.3hz,2h，-arh),8.14(d,j＝8.4hz,2h,-arh),7.74-7.58(m,2h，-arh),7.30-7.21(m,5h,-arh),5.10-4.93(m,2h，-ch2),4.39-4.23(m,2h,-ch2),3.56(dd,j＝8.9,4.4hz,1h,-ch),2.06-1.85(m,2h,-ch2)。
[0062]
hrms(esi)：c
23h20
n2o4[m h]

理论值为389.1457,实际测得389.1482。
[0063]
实施例5前体1b的合成
[0064][0065]
将l-赖氨酸(31.54mmol，4.61g)、1,8-萘二甲酸酐(12.61mmol，2.5g)溶于400ml的无水乙醇中并且搅拌均匀，85℃时加入三乙胺(25.23mmol，3.51ml)，继续加热回流3h，tlc检测1,8-萘二甲酸酐反应完全，减压浓缩，得到前体1b，直接用于下一步反应。
[0066]
实施例6中间体1b的合成
[0067][0068]
将氯化亚砜(45.99mmol，3.34ml)在冰水浴条件下地加入30ml甲醇溶液，继续冰水浴条件下反应1h，将前体1b(30.66mmol，10g)加入到反应瓶中，转70℃加热回流1.5h，减压除去溶剂后残渣用氯化亚砜-甲醇溶液溶解继续70℃加热回流1.5h，减压除去溶剂后得到中间体1b，产率为100％。熔点：191～194℃。
[0069]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.43(dd,j＝7.3,1.2hz,2h,-arh),8.07(dd,j＝8.3,1.2hz,2h,-arh),7.61(dd,j＝8.2,7.3hz,2h,-arh),4.07(dd,j＝8.4,6.7hz,2h,-ch2),3.63(s,3h，-ch3),3.41(dd,j＝7.6,5.3hz,1h,-ch),1.80-1.53(m,6h,-ch2),1.50-1.38(m,2h,-nh2)。
[0070]
hrms(esi)：c
19h20
n2o4[m h]

理论值为341.1457,实际测得341.1482。
[0071]
实施例7式ⅱ中间体6a的合成
[0072][0073]
将中间体1a(6.95mmol，2.71g)、二茂铁甲醛(7.65mmol，1.64g)溶于30ml二氯甲烷中并且搅拌均匀，将三乙酰氧基硼氢化钠(20.86mmol，4.42g)分批次加入反应液，再滴加1滴三氟甲磺酸后继续反应15min，tlc检测中间体1a消失，加入饱和碳酸氢钠猝灭，二氯甲烷(100ml)萃取反应液3次，饱和碳酸氢钠水溶液洗2次，水洗2次，饱和氯化钠水溶液洗2次，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，柱层析(体积比，石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离得到砖红色粉末中间体6a，产率：75.66％。熔点：95～97℃。
[0074]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.59(dd,j＝7.3,1.2hz,2h,-arh),8.21(dt,j＝8.3,1.7hz,2h,-arh),7.84-7.69(m,2h,-arh),7.50-7.27(m,5h,-arh),5.21-5.05(m,2h,-ch2),4.46(ddd,j＝12.8,8.6,6.3hz,1h,-fch),4.28(ddd,j＝13.1,8.8,5.8hz,1h,-fch),4.14(d,j＝16.7hz,6h,-fch),4.08
–
4.00(m,3h,-fch,ch2),3.58
–
3.45(m,2h,-ch2),3.46
–
3.34(m,1h,-ch),2.20
–
2.00(m,2h,-ch2)。
[0075]
13
c nmr(100mhz,cdcl3δ:174.75,164.30,135.88,134.07,131.73,131.38,128.72,128.57,128.46,128.32,127.08,122.82,86.75,77.36,68.57,68.54,68.43,68.02,67.69,66.75,59.47,47.01,37.78,31.26,1.17。
[0076]
hrms(esi)：c
34h30
fen2o4[m h]

理论值为587.1635，实际测得587.1624。
[0077]
实施例8式ⅱ中间体6b的合成
[0078][0079]
将中间体1b(2.94mmol，1g)、二茂铁甲醛(2.94mmol，0.63g)溶于30ml二氯甲烷中并且搅拌均匀，将三乙酰氧基硼氢化钠(5.87mmol，1.25g)分5次加入反应瓶中，再滴加1滴三氟甲磺酸后继续反应15min，tlc检测反应完全，饱和碳酸氢钠溶液猝灭，加入二氯甲烷(100ml)萃取反应液3次，饱和碳酸氢钠水溶液洗2次，水洗2次，饱和氯化钠水溶液洗2次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，柱层析(体积比，石油醚：乙酸乙酯＝2:1)分离得到砖红色油状物中间体6b，产率：74,56％。
[0080]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.57(dt,j＝7.2,1.0hz,2h,-arh),8.18(dt,j＝8.3,1.0hz,2h,-arh),7.73(dd,j＝8.2,7.3hz,2h,-nh),4.22-4.08(m,9h,-fch),4.06(ddq,j＝5.0,2.4,1.3hz,2h,-ch2),3.77
–
3.64(m,3h,-ch3),1.82(s,1h,-ch),1.72(dp,j＝13.3,7.3,6.8hz,4h,-ch2),1.57-1.44(m,2h,-ch2),1.29-1.20(m,1h,-nh)。
[0081]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.32,164.25,133.99,131.60,131.30,128.17,
126.99,122.66,86.35,68.49,68.29,68.25,68.10,67.95,62.71,48.19,39.94,38.81,33.50,29.48,27.95,24.39,23.45,1.11。
[0082]
hrms(esi)：c
30h30
fen2o4[m h]

理论值为539.1635，实际测得539.1633。
[0083]
实施例9化合物7b的合成
[0084][0085]
将中间体6a(0.85mmol，0.5g)、丙二胺(0.34mmol，28.42μl)、tbd(0.20mmol，28.49mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色固体化合物7b，产率:45.33％。熔点：97～99℃。
[0086]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.45(dt,j＝7.3,1.5hz,4h,-arh),8.10(ddd,j＝8.3,2.7,1.1hz,4h,-arh),7.73
–
7.60(m,4h,-arh),7.55(t,j＝6.3hz,2h,-nh),4.21
–
3.93(m,22h,-fch,-ch2),3.54
–
3.28(m,4h,-ch2),3.23(q,j＝6.5hz,4h,-ch2),3.11(dd,j＝7.7,4.6hz,2h,-ch),1.87
–
1.50(m,12h,-ch2),1.42(p,j＝8.0hz,4h,-ch2,-nh)。
[0087]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.78,164.02,133.81,131.40,131.09,127.95,126.82,122.47,86.33,68.37,68.29,68.18,67.93,67.79,62.59,62.57,60.35,48.05,39.83,35.75,35.72,33.45,30.09,27.85,23.42,14.20,1.01。
[0088]
hrms(esi)：c
57h54
fe2n6o6[m h]

理论值1031.2884，实际测得1031.2882。
[0089]
实施例10化合物7c的合成
[0090][0091]
将中间体6a(0.85mmol，0.5g)、丁二胺(0.34mmol，34.30μl)、tbd(0.20mmol,28.49mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(体积比，乙酸乙酯：甲醇＝20:1)分离得到砖红色固体，产率：56.78％。熔点：96～97℃。
[0092]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.47(dd,j＝7.3,1.2hz,4h,-arh),8.11(dd,j＝8.3,1.2hz,4h,-arh),7.66(dd,j＝8.2,7.3hz,4h,-arh),7.34(t,j＝6.0hz,2h,-nh),4.17
–
3.92(m,22h,-fch,-ch2),3.49
–
3.28(m,4h,-ch2),3.22(h,j＝7.3,6.8hz,4h,-ch2),3.10(dd,j＝7.7,4.6hz,2h,-ch),1.90
–
1.50(m,10h,-ch2),1.54
–
1.32(m,8h,-ch2,-nh)。
[0093]
13
c nmr(101mhz,cdcl3)δ:174.40,164.20,133.95,131.55,131.24,128.11,126.95,122.61,86.34,68.47,68.26,68.23,68.06,67.92,62.66,48.18,39.91,38.60,33.46,27.93,27.29,23.44,1.09。
[0094]
hrms(esi)：c
58h56
fe2n6o6[m h]

理论值1045.304，实际测得1045.3302。
[0095]
实施例11化合物7d的合成
[0096][0097]
将中间体6a(0.85mmol，0.5g)、戊二胺(0.34mmol，40.07μl)、tbd(0.20mmol，28.49mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯：甲醇＝20:1)分离得到砖红色固体，产率：55.33％。熔点：99～101℃。
[0098]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.57(dt,j＝7.3,1.0hz,4h,-arh),8.19(d,j＝8.2hz,4h,-arh),7.74(ddd,j＝8.2,7.2,0.8hz,4h,-arh),7.44(t,j＝5.9hz,2h,-nh),4.30(dt,j＝13.1,7.3hz,2h,-fch),4.21(dq,j＝2.5,1.3hz,2h,-fch),4.19
–
4.10(m,15h,-fch),4.10
–
4.04(m,4h,-ch2),3.49
–
3.39(m,4h,-ch2),3.29
–
3.13(m,6h,-ch2),2.22(dd,j＝13.5,5.9hz,2h,-ch),1.90(dtd,j＝13.4,7.7,5.7hz,4h,-ch2),1.51(q,j＝7.4hz,4h,-ch2)。
[0099]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.32,164.25,133.99,131.60,131.30,128.17,126.99,122.66,86.35,68.49,68.29,68.25,68.10,67.95,62.71,48.19,39.94,38.81,33.50,29.48,27.95,24.39,23.45,1.11。
[0100]
hrms(esi)：c
59h58
fe2n6o6[m h]

理论值1059.3197，实际测得1059.3110。
[0101]
实施例12化合物7e的合成
[0102][0103]
将中间体6a(0.85mmol，0.5g)、己二胺(0.34mmol，41.50μl)、tbd(0.20mmol,28.49mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色固体，产率：59.45％。熔点：98～100℃。
[0104]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.58(dd,j＝7.3,1.1hz,4h,-arh),8.20(dd,j＝8.3,1.1hz,4h,-arh),7.74(dd,j＝8.2,7.3hz,4h,-arh),7.41(t,j＝5.8hz,2h,-nh),4.31(dt,j＝14.0,7.3hz,4h,-fch),4.24
–
4.10(m,14h,-fch),4.07(pd,j＝2.5,1.3hz,4h,-ch2),3.53
–
3.36(m,4h,-ch2),3.27
–
3.10(m,6h,-ch2),2.23(td,j＝13.3,7.4hz,2h,-ch),1.91(dq,j＝13.8,7.0hz,4h,-ch2),1.49(d,j＝7.1hz,4h,-ch2),1.35(d,j＝6.9hz,4h,-ch2)。
[0105]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:173.65,164.33,134.21,131.68,131.48,128.26,127.08,122.62,86.49,68.62,68.31,68.19,68.07,67.96,60.66,47.71,39.05,37.19,
31.98,29.72,26.73,1.16。
[0106]
hrms(esi)：c
60h60
fe2n6o6[m na]

理论值1095.3173，实际测得1095.3184。
[0107]
实施例13化合物7f的合成
[0108][0109]
将中间体6a(0.85mmol，0.5g)、二乙烯三胺(0.34mmol，22.78μl)、tbd(0.20mmol，28.49mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色固体，产率：56.35％。熔点：100～102℃。
[0110]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.48(ddd,j＝7.4,6.2,1.1hz,4h,-arh),8.12(ddd,j＝8.3,4.8,1.1hz,4h,-arh),7.67(ddd,j＝8.2,7.2,4.3hz,6h,-arh,-nh),4.20
–
4.14(m,4h,-ch2),4.12(s,6h,-fch),4.11(d,j＝3.1hz,6h,-fch),4.08(s,1h,-fch),4.06
–
4.01(m,4h,-fch),3.51
–
3.26(m,12h,-ch2),3.19(dd,j＝7.6,5.3hz,2h,-ch),2.85
–
2.71(m,4h,-ch2),2.23(s,6h,-ch2),1.91(dtd,j＝13.5,7.8,5.7hz,2h,-ch2)。
[0111]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.15,174.13,164.14,164.12,134.07,134.05,131.50,131.30,131.28,128.03,126.95,122.43,122.41,86.50,86.48,77.36,68.52,68.27,68.16,67.92,67.83,67.82,60.65,60.46,50.67,48.64,48.60,47.56,38.89,37.14,31.84,21.12,14.25,1.07。
[0112]
hrms(esi)：c
58h57
fe2n7o6[m h]

理论值1060.3149，实际测得1060.2537。
[0113]
实施例14化合物7g的合成
[0114][0115]
将中间体6a(0.85mmol，0.5g)、2,2'-氧双(乙胺)(0.34mmol，22.78μl)、tbd(0.20mmol，28.49mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色固体，产率：45.55％。熔点：87～89℃。
[0116]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.49(dd,j＝11.8,7.3,1.1hz,4h,-arh),8.12(td,j＝8.4,1.1hz,4h,-arh),7.78
–
7.56(m,6h,-arh,-nh),4.33
–
4.23(m,2h,-fch),4.19(dd,j＝9.6,6.3,2.9,1.7hz,4h-ch2),4.14(d,j＝5.4hz,12h,-fch),4.05(dq,j＝7.5,2.2hz,4h,-fch),3.59
–
3.49(m,4h,-ch2),3.48
–
3.40(m,6h,-ch2),3.20(ddd,j＝8.1,5.0,1.7hz,2h,-ch),2.36
–
2.11(m,4h,-ch2),1.93(ddd,j＝13.3,7.9,5.3hz,2h,-ch2)。
[0117]
13c nmr(100mhz,cdcl3)δ:173.85,173.82,164.13,164.09,134.06,134.02,131.47,131.29,131.26,128.05,128.02,126.95,126.92,122.44,122.41,86.47,77.36,69.85,69.81,68.53,68.52,68.22,68.19,68.10,68.07,67.95,67.93,67.84,67.81,60.55,60.53,53.55,47.48,47.46,38.89,37.09,31.85。
[0118]
hrms(esi)：c
58h56
fe2n6o7[m h]

理论值1061.2989，实际测得1061.2846。
[0119]
实施例15化合物7h的合成
[0120][0121]
将中间体6a(0.85mmol，0.5g)、1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷(0.34mmol，22.78μl)、tbd(0.20mmol，28.49mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色固体，产率：56.77％。熔点：95～97℃。
[0122]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.66
–
8.50(m,4h),8.28
–
8.14(m,4h,-arh),7.74(q,j＝7.8,7.2hz,6h,-arh,-nh),4.34
–
4.25(m,2h,-fch),4.22(q,j＝1.6hz,2h,-fch),4.15(s,12h,-fch),4.07(h,j＝2.1hz,4h,-fch,-ch2),3.60(s,6h,-ch2),3.55(t,j＝5.2hz,4h,-ch2),3.52
–
3.41(m,10h,-ch2),3.21(dd,j＝8.1,4.7hz,2h,-ch),2.84(t,j＝5.0hz,4h,-ch2),2.48
–
2.08(m,10h,-ch2),2.01
–
1.78(m,2h)。
[0123]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:173.88,164.19,134.10,131.59,131.35,128.17,126.97,122.53,86.48,72.99,70.29,70.22,70.03,68.49,68.22,68.11,67.88,67.77,60.54,47.47,41.56,38.83,37.09,31.80,1.03。
[0124]
hrms(esi)：c
60h60
fe2n6o8[m h]

理论值1105.3205实际测得1105.3247。
[0125]
实施例16化合物7i的合成
[0126][0127]
将中间体6b(0.93mmol，0.5g)、乙二胺(0.37mmol，24.81μl)、tbd(0.22mmol,31.03mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(体积比，乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色油状物，产率：45.56％。
[0128]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.58
–
8.39(m,4h,-arh),8.13(ddd,j＝8.3,5.5,1.2hz,4h,-arh),7.68(ddd,j＝8.2,7.3,4.4hz,4h,-arh),7.58(q,j＝4.8hz,2h,-nh),4.20
–
3.96
(m,22h,-fch,-ch2),3.45(dd,j＝13.0,3.8hz,2h,-ch2),3.35(ddd,j＝11.0,6.3,2.3hz,6h,-ch2),3.12(ddd,j＝7.5,4.6,2.5hz,2h,-ch),1.89
–
1.52(m,10h,-ch2),1.43(t,j＝7.9hz,4h,-ch2,-nh)。
[0129]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:175.22,175.09,164.21,164.18,133.94,133.92,131.54,131.26,131.23,128.11,126.96,126.94,122.63,86.37,86.35,68.47,68.39,68.36,68.33,68.09,67.92,62.60,62.56,48.22,48.19,39.95,39.19,39.14,33.51,27.98,23.51,14.30,1.11。
[0130]
hrms(esi)：c
60h60
fe2n6o6[m h]

理论值1073.3353实际测得1073.3351。
[0131]
实施例17化合物7j的合成
[0132][0133]
将中间体6b(0.93mmol，0.5g)、丙二胺(0.37mmol，30.91μl)、tbd(0.22mmol，31.03mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(体积比，乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色油状物，产率：47.88％。
[0134]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.45(dt,j＝7.3,1.5hz,4h,-arh),8.10(ddd,j＝8.3,2.7,1.1hz,4h,-arh),7.73
–
7.60(m,4h,-arh),7.55(t,j＝6.3hz,2h,-nh),4.21
–
3.93(m,22h,-fch,-ch2),3.54
–
3.28(m,4h,-ch2),3.23(q,j＝6.5hz,4h,-ch2),3.11(dd,j＝7.7,4.6hz,2h,-ch),1.87
–
1.50(m,12h,-ch2),1.42(p,j＝8.0hz,4h,-ch2,-nh)。
[0135]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.78,164.02,133.81,131.40,131.09,127.95,126.82,122.47,86.33,68.37,68.29,68.18,67.93,67.79,62.59,62.57,60.35,48.05,39.83,35.75,35.72,33.45,30.09,27.85,23.42,14.20,1.01。
[0136]
hrms(esi)：c
61h62
fe2n6o6[m h]

理论值1087.351，实际测得1087.3435。
[0137]
实施例18化合物7k的合成
[0138][0139]
将中间体6b(0.93mmol，0.5g)、丁二胺(0.37mmol，37.86μl)、tbd(0.22mmol,31.03mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯：甲醇＝20:1)分离得到砖红色油状物，产率：53.79％。
[0140]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.47(dd,j＝7.3,1.2hz,4h,-arh),8.11(dd,j＝8.3,1.2hz,4h,-arh),7.66(dd,j＝8.2,7.3hz,4h,-arh),7.34(t,j＝6.0hz,2h,-nh),4.17
–
3.92(m,22h,-fch,-ch2),3.49
–
3.28(m,4h,-ch2),3.22(h,j＝7.3,6.8hz,4h,-ch2),3.10(dd,j＝7.7,4.6hz,2h,-ch),1.90
–
1.50(m,10h,-ch2),1.54
–
1.32(m,8h,-ch2,-nh)。
[0141]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.40,164.20,133.95,131.55,131.24,128.11,126.95,122.61,86.34,68.47,68.26,68.23,68.06,67.92,62.66,48.18,39.91,38.60,33.46,27.93,27.29,23.44,1.09。
[0142]
hrms(esi)：c
62h64
fe2n6o6[m h]

理论值1101.3666，实际测得1101.3667。
[0143]
实施例19化合物7l的合成
[0144][0145]
将中间体6b(0.93mmol，0.5g)、戊二胺(0.37mmol，43.64μl)、tbd(0.22mmol，31.03mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯：甲醇＝20:1)分离得到砖红色油状物，产率：57,89％。
[0146]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.53(dd,j＝7.3,1.2hz,4h,-arh),8.17(dd,j＝8.4,1.2hz,4h,-arh),7.71(dd,j＝8.2,7.3hz,4h,-arh),7.31(t,j＝6.0hz,2h,-nh),4.19
–
4.04(m,22h,-fch,-ch2),3.42(q,j＝13.0hz,4h,-ch2),3.23(qd,j＝7.0,2.0hz,4h,-ch2),3.13(dd,j＝7.6,4.6hz,2h,-ch),1.88
–
1.57(m,10h,-ch2),1.48(dp,j＝30.1,7.7hz,8h,ch2),1.34(qd,j＝8.9,5.6hz,2h,-nh)。
[0147]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.32,164.25,133.99,131.60,131.30,128.17,126.99,122.66,86.35,68.49,68.29,68.25,68.10,67.95,62.71,48.19,39.94,38.81,33.50,29.48,27.95,24.39,23.45,1.11。
[0148]
hrms(esi)：c
63h66
fe2n6o6[m h]

理论值1115.3751，实际测得1115.3819。
[0149]
实施例20化合物7m的合成
[0150][0151]
将中间体6b(0.93mmol，0.5g)、己二胺(0.37mmol，48.50μl)、tbd(0.22mmol，31.03mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层
析(乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色油状物，产率：59.89％。
[0152]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.48(dd,j＝7.3,1.2hz,4h,-arh),8.13(dd,j＝8.3,1.2hz,4h,-arh),7.67(dd,j＝8.3,7.3hz,4h,-arh),7.28(t,2h,-nh),4.20
–
3.99(m,22h,-fch,-ch2),3.49
–
3.33(m,4h,-ch2),3.21(q,j＝6.7hz,4h,-ch2),3.11(dd,j＝7.6,4.6hz,2h,-ch),1.88
–
1.54(m,10h,-ch2),1.54
–
1.37(m,8h,-ch2),1.37
–
1.27(m,4h,-ch2,-nh)。
[0153]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.25,164.25,134.00,131.61,131.30,128.18,126.99,122.68,86.39,68.49,68.27,68.23,68.10,67.94,62.75,48.17,39.95,38.83,33.51,29.76,27.97,26.68,23.47,1.12。
[0154]
hrms(esi)：c
64h68
fe2n6o6[m h]

理论值1129.3979，实际测得1129.3973。
[0155]
实施例21化合物7n的合成
[0156][0157]
将中间体6b(0.93mmol，0.5g)、二乙烯三胺(0.37mmol，39.99μl)、tbd(0.22mmol，31.03mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色油状物，产率：59.11％。
[0158]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.50(dd,j＝7.3,1.1hz,4h,-arh),8.14(dd,j＝8.2,1.2hz,4h,-arh),7.68(t,j＝7.8hz,4h,-arh),7.62(t,j＝5.8hz,2h,-nh),4.11(ddt,j＝8.9,7.1,3.4hz,10h,-fch,-ch2),4.04(d,j＝7.3hz,12h,-fch),3.51
–
3.26(m,8h,-ch2),3.13(dd,j＝7.5,4.9hz,2h,-ch),2.97(s,2h,-ch2),2.78(t,j＝6.1hz,4h,-ch2),1.88
–
1.54(m,8h,-ch2),1.54
–
1.34(m,4h,-ch2,-nh)。
[0159]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.89,164.27,134.01,131.61,131.31,128.18,127.00,122.67,86.23,68.52,68.38,68.10,67.96,62.62,48.68,48.07,40.00,38.59,33.37,27.99,23.51,1.12。
[0160]
hrms(esi)：c
62h65
fe2n7o6[m h]

理论值1116.3729，实际测得1116.3775。
[0161]
实施例22化合物7o的合成
[0162][0163]
将中间体6b(0.93mmol，0.5g)、2,2'-氧双(乙胺)(0.37mmol，39.32μl)、tbd
(0.22mmol，31.03mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色油状物，产率：57.23％。
[0164]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.50(dt,j＝7.2,1.1hz,4h,-arh),8.14(dd,j＝8.3,1.2hz,4h,-arh),7.68(dd,j＝8.3,7.3hz,4h,-arh),7.53(t,j＝5.7hz,2h,-nh),4.20
–
3.98(m,22h,-fch,-ch2),3.53
–
3.46(m,4h,-ch2),3.46
–
3.33(m,8h,-ch2),3.12(dd,j＝7.7,4.7hz,2h,-ch),1.87
–
1.53(m,10h,-ch2),1.50
–
1.35(m,4h,-ch2,-nh)。
[0165]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.51,164.19,133.95,131.55,131.25,128.11,126.95,122.61,86.41,69.95,68.45,68.19,68.04,67.87,62.68,47.98,39.95,38.73,33.44,27.96,23.48,1.09。
[0166]
hrms(esi)：c
62h64
fe2n6o7[m h]

理论值1117.3615，实际测得1117.3612。
[0167]
实施例23化合物7p的合成
[0168][0169]
将中间体6b(0.93mmol，0.5g)、1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷(0.37mmol，54.26μl)、tbd(0.22mmol，31.03mg)溶于5ml超干四氢呋喃，n2保护下加热回流12h，tlc检测反应完全，减压浓缩，柱层析(乙酸乙酯:甲醇＝20:1)分离得到砖红色油状物，产率：46.55％。
[0170]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.48(ddd,j＝6.9,5.6,1.4hz,4h,-arh),8.12(dt,j＝8.0,2.4hz,4h,-arh),7.73
–
7.61(m,4h,-arh),7.55(t,j＝5.8hz,2h,-nh),4.17
–
3.97(m,22h,,-fch,-ch2),3.56(d,j＝1.9hz,4h,-ch2),3.50(dt,j＝5.6,2.9hz,4h,-ch2),3.46
–
3.38(m,6h,-ch2),3.35(dd,j＝12.8,2.0hz,2h,-ch2),3.12(ddd,j＝7.0,4.8,1.8hz,2h,-ch),2.00-1.88(m,2h,-ch2),1.86
–
1.53(m,8h,-ch2),1.44(q,j＝8.0,7.5hz,4h,-ch2)。
[0171]
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:174.38,164.10,164.08,133.88,131.48,131.17,131.16,128.03,128.01,126.88,122.54,122.52,86.32,77.48,77.16,76.84,70.23,70.09,68.38,68.17,68.15,67.96,67.79,62.62,47.88,39.86,38.66,33.36,27.90,23.39。
[0172]
hrms(esi)：c
64h68
fe2n6o8[m h]

理论值1161.3877，实际测得1161.3874。
[0173]
实施例24二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物与ct-dna相互作用实验
[0174]
一、主要溶液配制
[0175]
(1)10mmol/l pbs(磷酸盐)缓冲液(ph＝7.4)：分别精密称取17.907g na2hpo4和7.805g nah2po4，用适量的蒸馏水溶解，转移至250ml的溶液瓶，定容，得到0.2mol/l na2hpo4溶液和0.2mol/l nah2po4溶液。用0.2mol/l nah2po4溶液调节0.2mol/l na2hpo4溶液至ph＝7.4，混合均匀就得到0.2mol/l pbs缓冲液(ph＝7.4)，于4℃储存备用。10mmol/l pbs缓冲液(ph＝7.4)：精密量取25ml的0.2mol/l pbs缓冲液(ph＝7.4)至500ml的容量瓶，定容，即为10mmol/l pbs缓冲液(ph＝7.4)，于4℃储存备用。
[0176]
(2)ct-dna储备液的配制：精密称取10.7mg ct-dna溶解于蒸馏水中并且超声溶解后密封放入冰箱4℃保存过夜，用蒸馏水稀释50倍，利用紫外分光光度计测量已经配制好的ct-dna溶液。ct-dna的浓度按照下面公式计算：[dna]＝k
×a260
/εl。
[0177]
其中k为稀释倍数，a为紫外260nm处的吸光度，ε＝6600l/(mol
·
cm)，l＝1cm，为了保障实验结果的可靠性，将配制好的ct-dna溶液进行分装并且放在-20℃保存，且一周之内使用完。
[0178]
(3)化合物溶液的配制：分别精密称取20～40mg的化合物6a-b和7b-p中间体，以dmso(二甲基亚砜)为溶剂分别溶解化合物，配制浓度为50mmol/l的化合物母液，-20℃储存备用。精密吸取50mmol/l的化合物母液稀释成5mmol/l的化合物溶液，4℃保存备用。
[0179]
(4)tne缓冲液：由10mm tris(三羟甲基氨基甲烷)、1.0mm edta(乙二胺四乙酸二钠)和0.10m nacl配制，并用10mm hcl调至所需ph值。精密称取0.3029g tris、0.0731g edta和1.461g nacl，少量多次加入蒸馏水直至搅拌溶解。将ph酸度计探头没入混合溶液中，边搅拌边缓慢滴加稀hcl溶液，直至ph为7.0。将溶液移入容量瓶定容到250ml,4℃储存备用。
[0180]
(6)tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)缓冲液：由10mm tris和10mm nacl配制，并用10mm hcl调至所需ph值。精密称取0.6057g tris和2.922g nacl，少量多次加入蒸馏水直至搅拌溶解。将ph酸度计探头没入混合溶液中，边搅拌边缓慢滴加稀hcl溶液，直至ph为7.0。将溶液移入容量瓶定容到500ml，4℃储存备用。
[0181]
(7)杂交缓冲液(20
×
ssc(柠檬酸钠)缓冲液)：由3m nacl和0.3柠檬酸钠配制，并用10mm hcl调至所需ph值。精密称取17.532g nacl和8.823g柠檬酸钠，少量多次加入蒸馏水直至搅拌溶解。将ph酸度计探头没入混合溶液中，边搅拌边缓慢滴加稀hcl溶液，直至ph为7.0。将溶液移入容量瓶定容到100ml，4℃储存备用。1
×
ssc缓冲液:准确量取20
×
ssc缓冲液25ml，定容至500ml，4℃储存备用。
[0182]
(8)小分子富集缓冲液：由10mm na2hpo4和10mm nah2po4配制，相互调节至所需ph值。同10mmol/l pbs缓冲液(ph＝7.4)配制方法一样。
[0183]
(9)电化学检测缓冲液：由na2hpo4和nah2po4配制，相互调节至所需ph值。同10mmol/l pbs缓冲液(ph＝7.4)配制方法一样。
[0184]
(10)0.5mmol/l h2so4溶液：在250ml的烧杯中加约150ml水，将6.793ml浓硫酸沿烧瓶壁慢慢注入水中(用玻璃棒引流)，并不断搅拌，使稀释产生的热量及时散出，把此溶液转入250ml的容量瓶中。再用少量蒸馏水荡洗烧杯和玻璃棒，把洗涤液也注入容量瓶中，再如此操作一次。待容量瓶中溶液温度达到室温时，定容，摇匀，4℃储存备用。
[0185]
(11)食人鱼溶液：由98％浓硫酸和30％双氧水按体积比3:1混合而成(食人鱼溶液为强氧化性，在配制和使用过程中注意通风处理操作并且勿使其接触有机溶剂,待混合溶液冷却至室温再用)，用作金电极表面的后处理。
[0186]
(12)探针dna溶液：先将装有5’端巯基标记的dna探针经离心管5000转离心10min，然后慢慢打开盖子，加入ph 7.0的tne缓冲液盖上离心管管盖，上下振荡5分钟，使dna充分溶解，得到一定浓度的母液，为了保证实验准确性应进行分装并且冷冻保存。
[0187]
(13)tbap(四丁基高氯酸铵)溶液：精密称取17.0617g tbap，少量多次加入乙醇水混合溶液(90％乙醇 10％水)直至搅拌溶解。将溶液移入容量瓶定容到500ml，4℃储存备
6by＝0.0006898x 1.834
×
10-8
3.76
×
1037by＝0.0001621x 3.815
×
10-9
4.26
×
1047dy＝0.0001448x 2.247
×
10-9
6.44
×
1047fy＝0.0002745x 1.534
×
10-9
1.79
×
1057gy＝0.0001498x 1.765
×
10-9
8.49
×
1047hy＝0.0001157x 2.357
×
10-9
4.91
×
1047jy＝0.0008810x 1.116
×
10-9
7.89
×
1047ly＝0.0005229x 7.145
×
10-9
7.32
×
1047my＝0.0006081x 1.076
×
10-9
5.65
×
1057ny＝0.0001706x 1.140
×
10-9
1.50
×
1057oy＝0.0006783x 9.160
×
10-9
7.41
×
1047py＝0.0002328x 3.798
×
10-9
6.13
×
104[0200]
从表1可以看出，大部分化合物的结合常数kb值在104～105数量级，与经典的dna嵌入剂溴化乙锭6(eb，kb＝4.94
×
105mol
·
l-1
)相比，本发明提供的衍生物与ct-dna之间属于较强程度的嵌插作用。从衍生物6a-b与衍生物7b-p的结合常数大小相比较可知，双二茂铁修饰的双萘酰亚胺衍生物与dna结合能力大于单二茂铁修饰的单萘酰亚胺衍生物；随着衍生物7b-p的萘酰亚胺基团臂长变化及桥连基团的长度和柔性的变化，其结合常数并没有规律性变化；在萘酰亚胺基团臂长和桥链长度相同下，7f、7g、7d、7n、7o、7l的结合常数大小顺序为7f＞7g＞7d；7n＞7o＞7l,可知衍生物的柔性链对其与dna相互作用强度影响很大，其中柔性链为多胺链时，结合常数最大，有可能是萘酰亚胺基团及氨基结构与dna的多重相互作用产生的。在相同长度及柔性的桥链下通过比较7b、7d、7h与7j、7l、7p的结合常数大小，可知衍生物中萘酰亚胺基团臂长越长越有利于衍生物嵌入到dna中；总体来看，衍生物结构中萘酰亚胺基团臂长和桥链的长度和柔性以及衍生物的溶解度对于衍生物与ct-dna结合能力影响很大。
[0201]
三、粘度滴定
[0202]
在研究小分子与生物大分子相互作用方法中，除了以上光谱研究方法外，检测dna溶液的粘度变化也是研究小分子与dna结合模式至关重要的研究手段。
[0203]
在恒温25℃控制条件下，采用乌氏粘度计测定化合物7b-p对ct-dna溶液的粘度影响。准确量取20ml磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph＝7.4)至粘度计作为底液，用微量注射器准确吸取0.5ml的ct-dna(2.96mmol/l)加入到粘度计中并且吹打混匀，稳定10min,记录反应液流经计时球的上下刻度所需的时间t0。每次给粘度计加入0.2ml的化合物溶液(5mmol/l)直至加完1ml化合物溶液，每次加完后，都需要吹打混匀并且反应10min,重复测量三次并记录每一次反应液流经计时球上下刻度所需的时间t。以(η/η0)
1/3
(η和η0分别为加入和未加化合物时dna溶液的经计时球上下刻度所需的时间)对[complex]/[dna]作图，可以观察到化合物对dna粘度的影响。
[0204]
实验结果如图3所示。在相同浓度下，与经典的dna嵌入剂溴化乙锭相比较，并且随着目标化合物浓度的增加，ct-dna溶液的粘度均呈现增加趋势，这说明目标化合物都是以经典嵌插方式插入到碱基对中；这主要是目标化合物中的萘二甲酰亚胺基团是一个大的大π*电子的平面芳环，可以嵌插到dna的碱基对中，使得相邻碱基对的距离变大，从而导致dna
双螺旋链拉长，以dna其粘度增加。
[0205]
四、电化学表征
[0206]
在0.1mol/l tbap电解质溶液中，设定电位范围为-0.2～ 1v，以循环伏安法(cv)为分析方法测定核酸杂交指示剂6a-b和7b-p的氧化还原性质。
[0207]
化合物电解质溶液配制：将50mmol/l化合物母液用50％的dmso水溶液(50％dmso 50％h2o)，稀释成浓度为10mmol/l的化合物溶液，备用。取1ml 10mmol/l的化合物溶液置于10ml的容量瓶中，用0.10mol/l的tbap溶液作为溶剂，定容至10ml，使化合物的浓度为1mmol/l，电解质tbap的浓度为0.1mol/l,4℃保存备用。
[0208]
工作电极预处理：依次加入0.3μm、0.05μm al2o3粉在麂皮布上打磨工作电极，之后将电极依次在丙酮、乙醇、重蒸水(洗液)中分别超声清洗2min。在100mvs
–1的电势扫描速率下，在0到 1.5v的电势范围内进行扫描，然后在0.5m h2so4水溶液中对电极进行电化学预处理，直至获得纯au电极的循环伏安图特性，并且用蒸馏水彻底清洗au电极，n2吹干后待用。
[0209]
测定方法：以au为工作电极，铂丝电极为对电极，ag-agcl为参比电极。用移液管移取3ml的待测物电解质溶液至电解池中，每次测量前通n2，5min以除去溶液中的o2。将预处理的电极浸入待测物电解质溶液中，记录0v～ 0.7v电位范围内的cv曲线，扫描速度为100mvs
–1，以空白溶液测定所得曲线进行背景校正。epa为氧化峰电位，epc为还原峰电位，e1/2为半波电位，
△
e为克式量电位之差。
[0210]
表2二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物6a-b和7b-p的氧化还原电位
[0211]
ssdna/au上的电流信号均比上的hs-dsdna/au电流信号小(结果如图4所示)。对于ssdna修饰的电极(hs-ssdna/au),电化学核酸杂交指示剂6a-b和7b-p与hs-ssdna主要是静电结合相互作用，产生微弱的氧化峰信号：对于dsdna修饰的电极(hs-dsdna/au),电化学核酸杂交指示剂6a-b和7b-p可以嵌插到dna杂交后形成的双链结构的碱基对中，并在电极表面形成稳定的复合体，从而产生较强的氧化峰电流信号。从电化学核酸杂交指示剂6a-b和7b-p与单双链dna产生的氧化峰电流信号的强弱可以看出其中电化学核酸杂交指示剂7b、7f、7h、7o、7n、7m、7p对双链dna具有非常强的选择性结合能力。
[0222]
为了能够准确直观了解电化学核酸杂交指示剂6a-b和7b-p对单双链dna的选择性结合能力、富集程度以及电流信号强度，我们以dpv方法电化学核酸杂交指示剂6a-b和7b-p与dsdna和ssdna相互作用产生的电流信号大小，计算两者之间的电流信号差(
△ipa
)和电流信号放大倍数(dsdna/ssdna)。
[0223]
表3二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物6a-b和7b-p的氧化峰电流值
[0224][0225][0226]
实验结果如表3所示，由于衍生物6a-b和7b-p在ssdna和dsdna修饰电极上富集程
度不同，氧化峰电流信号响应也应该不同。在相同条件下，衍生物6a-b和7b-p与修饰在电极上的ssdna和dsdna相互作用后产生不同大小的氧化峰电流，与常用的电化学杂交指示剂亚甲蓝(mb)及道诺霉素(dh)相比较，衍生物7b、7d、7f、7h、7j、7m、7n、7o、7p对单双链dna电流信号放大倍数(dsdna/ssdna)在2倍以上，可以明显的区别单双链dna，其中衍生物7b、7f、7h、7m、7n、7p对双链dna选择性结合能力非常强，根据衍生物的结构以及对ssdna和dsdna的电流信号响应的不同，可以推测出衍生物与ssdna和dsdna差异性结合与萘酰亚胺基团臂长及桥胺链长短及柔性有关。比较衍生物7f和7n与7g、7d、7l、7o的氧化峰电流信号差及放大倍数，可以说明在萘酰亚胺基团臂长及桥胺链长度相同下，桥链为柔性链二乙烯三胺时，衍生物可以明显区分ssdna和dsdna。比较衍生物7h和7p与7g、7o的氧化峰电流信号差及放大倍数，可以说明在萘酰亚胺基团臂长及桥链柔性相同下，桥链越长越能明显的区分ssdna和dsdna。
[0227]
通过紫外光谱法和粘度滴定对合成的17个二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物与ct-dna相互作用的方式进行研究，以及通过电化学分析方法对其电化学活性及对单双链dna选择性结合进行研究。在ph7.4的磷酸缓冲液中，所有的二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物均以嵌插方式与ct-dna发生不同程度的相互作用，均具有良好的电化学活性，其中二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物7b、7f、7h、7m、7n、7p对双链dna具有较强选择性结合能力，可用于嵌入型电化学核酸杂交指示剂使用，有望进一步应用到电化学核酸传感器中。
[0228]
实施例25电化学核酸传感器构建及性能实验
[0229]
一、主要溶液配制同实施例24。
[0230]
二、电化学核酸传感器建立
[0231]
1、金电极预处理
[0232]
依次加入0.3μm、0.05μm al2o3粉在麂皮布上打磨工作电极(保持电极与麂皮所在平面垂直；打开打磨机转动)，之后将电极依次在丙酮、乙醇、重蒸水(洗液)中分别超声清洗5min。在100mvs
–1的电势扫描速率下，在0到 1.5v的电势范围内进行扫描，然后在0.5m h2so4水溶液中对电极进行电化学预处理，直至获得纯au电极的循环伏安图特性，并且用蒸馏水彻底清洗au电极，n2吹干后待用。
[0233]
2、电化学核酸传感器的构建
[0234]
首先，将预处理好的au电极倒置，表面滴加10μl探针dna溶液，室温反应12h后电极表面上就通过au-s键修饰上探针dna。用ph 7.0tne溶液彻底清洗未结合在金电极表面的探针dna，再用蒸馏水清洗，n2吹干，将电极标记为为pr/au。然后在电极表面滴加10μl 0.9mm mch溶液(mch会占据电极表面剩下的活性位点)，室温反应75min,用ph 7.0tris-hcl缓冲液彻底清洗未覆盖在金电极表面的mch，再用蒸馏水清洗，n2吹干，将电极标记为ssdna/au。
[0235]
将修饰好ssdna/au电极放置在一定浓度的互补链dna溶液中，30℃下杂交60min,用ph7.0 1
×
ssc缓冲液彻底清洗未杂交的互补链dna，再用蒸馏水清洗，n2吹干备用，将电极标记为dsdna/au。
[0236]
将ssdna/au和dsdna/au分别放入含有一定浓度的嵌入型电化学核酸杂交指示剂7b的ph7.0 pbs缓冲液中避光搅拌富集10min,用ph7.0 pbs缓冲液彻底清洗未反应的杂交指示剂，再用蒸馏水清洗，n2吹干供电化学检测。
[0237]
3、电化学检测
[0238]
以富集好电化学核酸杂交指示剂的ssdna/au和dsdna/au作为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，设置分析方法为差分脉冲伏安法(dpv)每次测量前通n210min以除去溶液中的o2，扫描电位0v～ 0.7v，扫速100mv/s，脉冲幅度50mv/s，脉冲宽度0.05s，静置30s。观察峰形变化，进行背景校正后扣除空白，记录氧化峰电流值差(
△ip
)。
[0239]
4、修饰过的金电极后处理
[0240]
将电化学检测完的金电极浸入食人鱼溶液30min后取出，依次用丙酮、乙醇和超纯水洗涤数次，依次加入0.3μm、0.05μm al2o3粉在麂皮布上打磨工作电极，之后将电极依次在丙酮、乙醇、重蒸水(洗液)中分别超声清洗5min，且用蒸馏水彻底清洗au电极，n2吹干后待用。
[0241]
三、电化学核酸传感器性能检测
[0242]
本实验是利用嵌入型电化学核酸杂交指示剂达到生物识别信号转换及放大的目的。图5展示了电化学核酸传感器具体的构建原理：首先，将预处理好的au电极倒置，通过au-s键修饰上了探针dna，与互补链dna进行杂交，将ssdna/au和dsdna/au分别与电化学核酸杂交指示剂相互作用，使用差分脉冲伏安法(dpv)检测富集在工作电极表面上的电化学核酸杂交指示剂的氧化峰电流信号，通过比较杂交前后的电流信号的差值达到对靶标链的定量检测。
[0243]
1、反应条件优化
[0244]
(1)探针固定的浓度优化：电化学核酸传感器建立过程中最关键的问题之一是dna在电极表面的固定。电极表面要有一定的固定量，且杂交效率要较高是提高传感器的灵敏度、降低检测限要求。因为自组装法可以使探针dna修饰电极表面高度有序，稳定性好，对互补链dna有很高的杂交效率，且该方法操作简便，因此此次实验采用金电极，通过自组装法制作电化学核酸传感器。在预处理的金电极表面分别滴加浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、3.0μmol/l的探针dna各10μl，分别固定12h后，采用dpv法检测探针dna浓度与4.0
×
10-4
mol/l嵌入型电化学核酸杂交指示剂7b的氧化峰电流值差(
△ip
)之间的关系如图6所示。在0.25-3.0μmol/l范围内，氧化峰电流随着探针浓度的增大而增大，超过1.0μmol/l后，氧化峰电流值差(
△ip
)几乎不再改变。该结果表明，在直径3mm的金电极表面探针dna的最大固载量为浓度1.0μmol/l的探针10μl。为了保证金电极表面探针dna固载量尽可能达到饱和，本实验选择探针dna为浓度1.25μmol/l的探针10μl作为探针dna固载量最优条件。
[0245]
(2)杂交温度优化：在一定的高温条件下，自组装探针dna的稳定性会降低，所以在选择杂交条件的时候，必须先考虑不同的温度条件对已固定于电极表面的探针dna稳定性的影响。大量文献报道，dna分子的杂交温度与其变性(即dna分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象)温度(tm)有关。本课题组设计的含23个碱基mirna-145的cdna片段，其tm值为59.3℃。从理论上讲，杂交的最佳条件是比tm低25℃左右的温度，即适宜杂交温度，约为34.3℃，离此温度越远，杂交速度越慢。因此杂交温度的设计应该控制在34.3℃左右范围，我们选择25℃、37℃、50℃、60℃、70℃五个温度，杂交时间为1h，研究杂交条件对建立电化学核酸传感器分析方法的影响。
[0246]
将已修饰有浓度为1.25μmol/l探针dna并经巯基己醇封闭电极表面后的金电极倒置，滴加10μl浓度为2.5μmol/l dna杂交缓冲液(1
×
ssc缓冲液，ph7.0)中，不同温度下加热1h后，取出用1
×
ssc缓冲液清洗电极，蒸馏水清洗，n2吹干后，先后记录嵌入型电化学核酸
杂交指示剂7b的氧化峰电流值差(
△ip
)。如图7所示，在不同杂交温度下指示剂7b的氧化峰电流值差(
△ip
)变化，该结果表明，在杂交温度为37℃时，杂交指示剂的氧化峰电流最高。
[0247]
(3)杂交指示剂的浓度优化：电化学杂交指示剂的选用是电化学传感器的灵敏度和选择性的关键所在。杂交指示剂的浓度大小对电化学信号影响非常大，杂交指示剂的浓度过低，嵌入到dsdna分子之间的指示剂太少，不易检测，反而使电化学传感器的灵敏度降低，杂交指示剂的浓度过高，小分子可能会聚集在一起，dna分子内会嵌入大量的杂交指示剂，甚至不能区分单双链dna。所以我们选择了1.0
×
10-4
mol/l、2.0
×
10-4
mol/l、4.0
×
10-4
mol/l、8.0
×
10-4
mol/l、1.2
×
10-3
mol/l、1.6
×
10-3
mol/l、2.0
×
10-3
mol/l这7个不同的杂交指示剂浓度研究了不同嵌入型电化学核酸杂交指示剂的浓度对电化学核酸传感器分析方法的影响。
[0248]
将已经和互补链dna杂交好的金电极浸入含有不同浓度杂交指示剂的pbs缓冲液(ph7.0)中，避光搅拌富集20min后，取出用pbs缓冲液(ph7.0)清洗电极，蒸馏水清洗，n2吹干后，先后记录嵌入型电化学核酸杂交指示剂7b的氧化峰电流值差(
△ip
)。如图8所示，随着电化学杂交指示剂在1.0
×
10-4
～2.0
×
10-3
mol/l范围增大，杂交指示剂的氧化峰电流值逐渐增大，超过1.2
×
10-3
mol/l后，氧化峰电流值差(
△ip
)变化明显减小。该实验结果表明，杂交指示剂浓度为1.2
×
10-3
mol/l作用20min时，能够较好的区别ssdna和dsdna,检测的灵敏度较高。
[0249]
2、标椎曲线及检测限
[0250]
采用dpv法对互补链dna的浓度进行了测定。在最优的条件下，采用单双链dna修饰电极上嵌入型电化学核酸杂交指示剂7b的氧化峰电流值差(
△ip
)与待测互补链dna浓度线性相关进行定量。实验结果表明，互补链dna浓度在一定范围内(6.1
×
10-12
～1.95
[0251]
×
10-10
mol/l)，随着其浓度的增加，杂交指示剂的氧化峰电流值差(
△ip
)逐渐增大(如图9所示)，呈线性关系，其线性方程为y＝37.22x 1.109，最低检测限为4.59
×
10-12
mol/l。
[0252]
3、干扰物的影响
[0253]
用该传感器对细胞裂解液和血清中的靶dna分别进行检测，其中细胞裂解液和血清中含有许多复杂的成分，检测过程是在1:4稀释的细胞裂解液和血清样本中进行。将不同浓度的互补链dna加入到4t1细胞裂解液和血清中，然后与正常实验步骤一样进行反应。此次实验用的细胞裂解液制备如下：将数量为1.5
×
105个4t1细胞置于离心管中，加入200μl10mm的tris-hcl(ph7.0)裂解液中超声复溶，在冰水浴条件下保持30min使细胞彻底溶胀并超声使细胞破解，再将离心管在4℃12000r的条件下离心30min,轻轻吸取上清液另行保存，即得到4t1细胞裂解液。血清是大鼠眼眶采血，离心取上清液所得。与相同实验条件下的1
×
ssc缓冲液中(图10)观察到的嵌入型电化学核酸杂交指示剂7b的氧化峰电流值差(
△ip
)相比，细胞裂解液中电化学信号一致，而血清中信号降低，这可能是由于在互补链dna和探针杂交过程中受到了样品中复杂成分的干扰。尽管如此，本电化学核酸传感器仍然表现出优异的检测性能。
[0254]
4、加样回收率
[0255]
在优化的最佳条件下，往细胞裂解液中分别加入一定量的互补链dna标准溶液，按实验方法测定并计算回收率(见表4)，结果显示方法的平均回收率为100.90％、101.36％、
99.51％。三个添加浓度水平下精密度实验的相对标准偏差rsd均小于5％，结果令人满意。
[0256]
表4样品回收率测定结果
[0257][0258]
5、精密度实验
[0259]
在最佳的条件下，探针dna固定在10根不同电极表面，与0.0488nm的完全互补dna杂交完全后，以1.2
×
10-3
mol/l的嵌入型电化学核酸杂交指示剂7b为指示剂富集20min，dpv法检测氧化峰电流值差(
△ip
)。结果见表5所示，在对一定浓度互补dna溶液的检验中，电化学核酸传感器有着良好的重复性。
[0260]
表5电化学核酸传感器的精密度实验
[0261][0262]
6、不同的指示剂对传感器特异性的影响
[0263]
目前大多数电化学核酸传感器还不能特异性识别与疾病有关的基因。因此，能够精确识别疾病基因是构建电化学核酸传感器检测分析技术所面临的主要挑战，即如何保证电化学核酸传感器杂交识别的是互补的dna。在电化学核酸传感器的杂交识别的过程中，能与固定的寡核苷酸片段探针发生杂交的dna片段，除了与其完全互补的dna片段外，部分互补的寡核苷酸片段也可能与其发生杂交。因此要排除这种部分互补寡核苷酸片段的干扰，是电化学核酸传感器面临的关键问题。因此，需要建立一种具有高选择性的电化学核酸传感器分析方法。为了研究电化学核酸传感器的特异性，实验对完全非互补dna链(noncomplementary strand a、noncomplementary strand b)和单碱基错配dna链进行杂交，观察富集在电极上的杂交指示剂的氧化峰电流。如图11所示，实验采以筛选出对单双链dna有较强的择性衍生物7b、7f、7h、7m、7n、7p作为嵌入型电化学核酸杂交指示剂与互补或者不互补dna链进行杂交。实验结果证明衍生物7f和7n作为电化学杂交指示剂时，该传感器可以特异性识别互补dna。
[0264]
本发明提供的二茂铁修饰的萘酰亚胺类衍生物，作为优秀的嵌入型电化学核酸杂交指示剂，成功构建了电化学核酸传感器，并用于靶标dna的检测。在模拟样品检测中具有较高的灵敏度和选择性，能特异性识别靶标dna。检测信号与靶标dna浓度在6.1
×
10-12
～
1.95
×
10-10
mol/l范围成线性关系，其线性方程为y＝37.22x 1.109，最低检测限为4.59
×
10-12
mol/l。有望为癌症标志物基因的早期诊断和治疗提供研究方法。
[0265]
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