乌谢尔综合征(ush2a)的基因疗法1.相关申请2.本技术根据35u.s.c.§119(e)要求2019年4月19日提交的题为“genetherapiesforushersyndrome(ush2a)”(乌谢尔综合征(ush2a)的基因疗法)的美国临时申请号62/836,429的申请日的权益，其全部内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术：
：：3.乌谢尔综合征(ushersyndrome，ush)是导致聋盲症(deaf-blindnessdisorder)的主要原因。患者表现出严重和进行性的视网膜变性和感觉神经性耳聋(sensorineuralhearingloss)。ush2a(usherin)基因中的突变与》70％的乌谢尔ii型病例相关。ush2a基因的大尺寸(～15.6kb)限制了使用传统的腺相关病毒(aav)载体介导的基因递送方法的成功疗法的开发。技术实现要素：4.本公开的多个方面涉及可用于向受试者递送小基因(minigene)的组合物和方法。因此，本公开部分基于分离的核酸和基因治疗载体，例如病毒(例如，raav)载体，其包含编码治疗性基因产物例如蛋白或肽的一个或多个基因片段(例如，小基因)。在一些实施方案中，本公开涉及编码ush2a蛋白(例如，ush2a的基因产物)或其部分的基因治疗载体。在一些实施方案中，本公开所描述的组合物可用于治疗与ush2a基因中的突变相关的疾病，例如乌谢尔综合征。5.因此，在一些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其包含编码具有如seqidno:3-14中任一项所示的核酸序列的ush2a小基因的转基因。6.在一些方面，本公开提供了包含具有编码ush2a蛋白的核酸序列的转基因的分离的核酸，其中所述ush2a蛋白包含如seqidno:15-26中任一项所述的氨基酸序列。7.在一些实施方案中，转基因进一步包含与ush2a小基因编码序列有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。在一些实施方案中，启动子包括鸡β-肌动蛋白(chickenbeta-actin，cba)启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是光感受器特异性启动子(photoreceptor-specificpromoter)。在一些实施方案中，光感受器特异性启动子包括视紫红质激酶(rhodopsinkinase)启动子，例如人grk启动子。8.在一些实施方案中，转基因的侧翼是腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)。在一些实施方案中，转基因侧翼的至少一个itr是aav2itr。在一些实施方案中，转基因侧翼的两个itr都是aav2itr。在一些实施方案中，转基因侧翼的至少一个itr缺乏末端解离位点(terminalresolutionsite)，例如δitr。9.在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒dna、或封闭线性dna(closed-lineardna)、或脂质/dna纳米颗粒、或病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(aav)载体、腺病毒(ad)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或杆状病毒载体。10.在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的分离的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物(人)细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞。11.在一些方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(raav)，其包含：如本文所述的分离的核酸；和aav衣壳蛋白。12.在一些实施方案中，衣壳蛋白对眼细胞具有向性(tropism)。在一些实施方案中，衣壳蛋白是aav8衣壳蛋白。13.在一些实施方案中，raav被配制用于递送至眼。在一些实施方案中，raav被配制用于递送至感光细胞(photoreceptorcell)或视网膜色素上皮(retinalpigmentedepithelium，rpe)。14.在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的分离的核酸或raav和药学上可接受的赋形剂的组合物。15.在一些方面，本公开提供了一种将转基因递送至细胞的方法，所述方法包括将本文所述的分离的核酸或raav施用给细胞。16.在一些实施方案中，细胞在受试者中。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者，例如人类受试者。在一些实施方案中，细胞是眼细胞。在一些实施方案中，眼细胞是感光细胞或视网膜色素上皮(rpe)。17.在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的乌谢尔综合征的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的分离的核酸或raav。18.在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。19.在一些实施方案中，受试者的特征在于在ush2a基因中具有一个或多个突变。在一些实施方案中，受试者具有一个或多个选自以下的突变：ush2a基因的c.949c》a、c.2242c》t(p.gln748x)和c.4405c》t(p.gln1468x)。20.在一些实施方案中，施用通过注射进行。在一些实施方案中，注射是视网膜下注射或玻璃体内注射或脉络膜上注射。21.在一些实施方案中，施用是对受试者眼的外用给药。22.附图简要说明23.图1是描绘miniush2a构建体的多个实施方案的示意图。具体实施方式24.在一些方面，本公开涉及可用于治疗某些遗传疾病，例如乌谢尔综合征的组合物和方法。本公开部分基于分离的核酸和基因治疗载体，例如病毒(例如，raav)载体，其包含编码治疗性基因产物例如miniush2a蛋白(例如，ush2a小基因的基因产物)的一个或多个基因片段。[0025]“核酸”序列是指dna或rna序列。在一些实施方案中，本公开的蛋白和核酸是分离的。如本文所用，术语“分离的”意指人工生产的。如本文所用，关于核酸，术语“分离的”意指：(i)通过例如聚合酶链反应(pcr)进行体外扩增；(ii)通过克隆进行重组生产；(iii)进行纯化，如通过裂解和凝胶分离；或(iv)通过例如化学合成进行合成。分离的核酸是通过本领域公知的重组dna技术容易操作的核酸。因此，包含在其中5'和3'限制性位点是已知的或其聚合酶链反应(pcr)引物序列已经公开的载体中的核苷酸序列被认为是分离的，但以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列不是。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必要的。例如，在克隆或表达载体中分离的核酸是不纯的，因为它可能仅占其所在细胞中物质的很小百分比。然而，这样的核酸是分离的，如该术语在本文中所用的，因为它易于通过本领域普通技术人员已知的标准技术进行操作。如本文所用，关于蛋白或肽，术语“分离的”是指已从其天然环境中分离或人工产生(例如，通过化学合成、通过重组dna技术等)的蛋白或肽。在一些实施方案中，分离的核酸编码ush2a蛋白，例如miniush2a蛋白(例如，从ush2a基因或其部分，例如ush2a小基因表达的基因产物)。[0026]在人类中，ush2a基因(也称为rp39)编码usherin蛋白，其是一种基底膜(basementmembrane)蛋白。已经观察到ush2a基因中的突变会导致乌谢尔综合征，这是一种失明(例如，视网膜变性)和耳聋的组合病症。在一些实施方案中，ush2a基因(或由ush2a基因编码的mrna)包含如ncbi参考序列登录号nm_206933.3(seqidno：1)所示的核酸序列。在一些实施方案中，ush2a基因编码具有如ncbi参考序列登录号np_996816.2(seqidno：2)所示的氨基酸序列的蛋白。[0027]如本文所用，“小基因(minigene)”是指编码重组肽或蛋白的分离的核酸序列，其中编码天然存在的肽或蛋白的相应基因的一个或多个非必需元件已被去除并且其中由小基因编码的肽或蛋白保留了相应天然存在的肽或蛋白的功能。“治疗性小基因”是指编码用于治疗遗传疾病的肽或蛋白的小基因，所述肽或蛋白例如抗肌萎缩蛋白(dystrophin)、dysferlin、因子viii、淀粉样前体蛋白(app)、酪氨酸酶(tyr)等。小基因是本领域已知的，并且由例如karpati和acsadi(1994)clininvestmed17(5)：499-509；plantier等人(2001)thrombhaemost.86(2)：596-603；和xiao等人(2007)worldj.gastroenterol.13(2)：244-9描述。在一些实施方案中，小基因不编码天然存在的肽或蛋白的完整氨基酸序列。[0028]在一些方面，本公开涉及编码ush2a小基因的分离的核酸。通常，编码小基因(例如，治疗性小基因，例如ush2a小基因)的分离的核酸相对于编码相应天然存在的野生型蛋白(例如，seqidno：2)截短约10％至约99％(例如，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约90％、约99％等)。截短可以是连续的(例如，氨基酸残基的单个、连续的截短)或不连续的(例如，氨基酸的两个或更多个截短，例如被一个或多个肽分隔开的两个或更多个结构域的截断)。例如，在一些实施方案中，与野生型ush2a基因(例如，seqidno:1)相比，编码miniush2a蛋白的小基因被截短了约61％至(例如，包含约50％的核酸序列)。在一些实施方案中，ush2a小基因包含如seqidno:3-14中任一项所示的核酸序列。在一些实施方案中，ush2a小基因编码包含如seqidno:15-26中任一项所示的氨基酸序列的蛋白(称为miniush2a蛋白)。在一些实施方案中，编码ush2a蛋白(例如，miniush2a蛋白)的核酸在编码ush2a蛋白的核酸序列之前包含起始密码子(例如，核酸序列atg)。在一些实施方案中，编码miniush2a蛋白的核酸序列是密码子优化的。[0029]编码ush2a蛋白的分离的核酸序列可以与启动子有效连接。“启动子”是指被细胞的合成机制(syntheticmachinery)或引入的合成机制识别的、启动基因的特异性转录所需的dna序列。短语“有效定位(operativelypositioned)”、“受控制(undercontrol)”或“受转录控制(undertranscriptionalcontrol)”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制rna聚合酶的起始和基因的表达。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。[0030]组成型启动子的示例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地，具有rsv增强子)、巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地，具有cmv增强子)[参见，例如，boshart等人,cell,41:521-530(1985)]、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子和ef1α启动子[invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子包括鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，启动子是u6启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。[0031]诱导型启动子允许基因表达的调节并且可以通过外源提供的化合物、环境因素例如温度或特定生理状态(例如，急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)的存在来调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于invitrogen、clontech和ariad。已经描述了许多其他系统并且本领域技术人员可以容易地选择这些系统。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的示例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(metallothionine，mt)启动子、地塞米松(dexamethasone，dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、t7聚合酶启动子系统(wo98/10088)；蜕皮激素(ecdysone)昆虫启动子(no等人，proc.natl.acad.sci.usa，93：3346-3351(1996))、四环素抑制型系统(gossen等人，proc.natl.acad.sci.usa，89：5547-5551(1992))、四环素诱导型系统(gossen等人，science，268：1766-1769(1995)，另参见harvey等人，curr.opin.chem.biol.，2∶512-518(1998))、ru486诱导型系统(wang等人，nat.biotech.，15：239-243(1997)和wang等人，genether.，4：432-441(1997))和雷帕霉素诱导型系统(magari等人，j.clin.invest.，100：2865-2872(1997))。在这种情况下可能有用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态(例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)调节的启动子。[0032]在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调节序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调节序列(例如，启动子、增强子等)是本领域公知的。在一些实施方案中，组织特异性启动子是眼特异性启动子。眼特异性启动子的示例包括但不限于视网膜劈裂蛋白启动子、k12启动子、视紫红质启动子、视杆细胞特异性启动子、视锥细胞特异性启动子、视紫红质激酶启动子、grk1启动子、光感受器间视黄醇结合蛋白近端(interphotoreceptorretinoid-bindingproteinproximal，irbp)启动子和视蛋白启动子(例如，红色视蛋白启动子、蓝色视蛋白启动子等)。[0033]在一些实施方案中，启动子是rna聚合酶iii(poliii)启动子。poliii启动子的非限制性示例包括u6和h1启动子序列。在一些实施方案中，启动子是rna聚合酶ii(polii)启动子。polii启动子的非限制性示例包括t7、t3、sp6、rsv和巨细胞病毒启动子序列。[0034]本公开的多个方面涉及包含如本文所述的分离的核酸的基因治疗载体。基因治疗载体可以是病毒载体(例如，慢病毒载体、腺病毒(ad)载体、腺相关病毒载体等)、质粒dna、封闭端dna(例如，cedna)、脂质/dna纳米颗粒等。在一些实施方案中，基因治疗载体是病毒载体。在一些实施方案中，编码小基因的表达盒的侧翼是一个或多个病毒复制序列，例如慢病毒长末端重复序列(ltr)或腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)。[0035]本文所述的分离的核酸还可包含内含子，其理想地位于启动子/增强子序列和转基因之间。在一些实施方案中，内含子是合成的或人工的(例如，异源的)内含子。合成的内含子的示例包括源自sv-40的内含子序列(称为sv-40t内含子序列)和源自鸡β-肌动蛋白基因的内含子序列。在一些实施方案中，本公开描述的转基因包含一个或多个(1个、2个、3个、4个、5个或更多个)人工的内含子。在一些实施方案中，一个或多个人工的内含子位于启动子和编码转基因的核酸序列之间。[0036]在一些实施方案中，raav包含转录后反应元件。如本文所用，术语“转录后反应元件”是指在转录时采用增强基因表达的三级结构的核酸序列。转录后调控元件的示例包括但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelement，wpre)、小鼠rna转运元件(mousernatransportelement，rte)、猴1型逆转录病毒(srv-1)的组成型转运元件(cte)、来自摩-傅猴病毒(mason-pfizermonkeyvirus，mpmv)的cte以及人热休克蛋白70(hsp705′utr)的5′非翻译区。在一些实施方案中，raav载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。[0037]在一些实施方案中，载体进一步包含常规控制元件，其以允许转基因元件在被载体转染或被本公开产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因元件有效连接。如本文所用，“有效连接的”序列包括与目标基因相邻的表达控制序列和以反式或以一定距离作用以控制目标基因的表达控制序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的rna处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化(polya)信号；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(例如，kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以使用。[0038]聚腺苷酸化序列通常在转基因序列之后和任选地在3′aavitr序列之前插入。可用于本公开的raav构建体还可以包含内含子，其理想地位于启动子/增强子序列和转基因之间。一种可能的内含子序列源自sv-40，并且称为sv-40t内含子序列。另一个可以使用的载体元件是内部核糖体进入位点(ires)。ires序列用于从单个基因转录物中产生多于一种的多肽。ires序列将用于产生包含多于一条多肽链的蛋白。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的[参见，例如，sambrook等人和其中在例如第3.183.26和16.1716.27页引用的参考文献，以及ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1989]。[0039]本公开的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(aav)载体(raav载体)。在一些实施方案中，如本公开所描述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)或其变体的区域(例如，第一区域)。可以将分离的核酸(例如，重组aav载体)包装进衣壳蛋白并施用给受试者和/或递送至所选靶细胞。“重组aav(raav)载体”通常至少由转基因及其调节序列以及5′和3′aav反向末端重复序列(itr)组成。如本文别处所公开的，转基因可以包含编码一种或多种蛋白(例如，人ush2a或其片段)的一个或多个区域。转基因还可以包含编码例如mirna结合位点和/或表达控制序列(例如，polv-a尾)的区域。[0040]通常，itr序列的长度为约145bp。优选地，在分子中使用基本上完整的编码itr的序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的微小修饰。修饰这些itr序列的能力在本领域技术范围内。(参见，例如，文本例如sambrook等人，“molecularcloning.alaboratorymanual”，第2版，coldspringharborlaboratory，newyork(1989)；和k.fisher等人，jvirol.，70：520532(1996))。本发明中使用的此类分子的一个示例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选转基因序列和相关调控元件的侧翼是5’和3’aavitr序列。aavitr序列可以从任何已知的aav获得，包括目前鉴定的哺乳动物aav类型。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，raav载体)包含具有选自以下的血清型的至少一种itr：aav1、aav2、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aav.php.b及其变体。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码aav2itr的区域(例如，第一区域)。[0041]在一些实施方案中，分离的核酸进一步包含含有第二aavitr的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)。在一些实施方案中，第二aavitr具有选自以下的血清型：aav1、aav2、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aav.php.b及其变体。在一些实施方案中，第二itr是缺乏功能性末端解离位点(trs)的突变itr。术语“缺乏末端解离位点(lackingaterminalresolutionsite)”可以指包含废除了itr的末端解离位点(trs)的功能的突变(例如，有义突变，例如非同义突变或错义突变)的aavitr，或指缺乏编码功能性trs的核酸序列的截短的aavitr(例如，δtrsitr，或δitr)。不希望受到任何特定理论的束缚，包含缺乏功能性trs的itr的raav载体产生自我互补的raav载体，例如如mccarthy(2008)moleculartherapy16(10)：1648-1656所述。[0042]重组腺相关病毒(raav)[0043]在一些方面，本公开提供分离的aav。如本文所用，关于aav，术语“分离的”是指已人工产生或获得的aav。可以使用重组方法生产分离的aav。这样的aav在本文中称为“重组aav”。重组aav(raav)优选具有组织特异性靶向能力，使得raav的核酸酶和/或转基因将被特异性递送至一种或多种预定组织。aav衣壳是确定这些组织特异性靶向能力的重要因素。因此，可以选择具有适用被靶向的组织的衣壳的raav。[0044]获得具有所需衣壳蛋白的重组aav的方法是本领域公知的。(参见，例如，us2003/0138772)，其内容通过引用以其整体并入本文)。通常，所述方法包括培养含有编码aav衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；包含aav反向末端重复序列(itr)和转基因的重组aav载体；和足以允许将重组aav载体包装到aav衣壳蛋白中的辅助功能的宿主细胞。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由aav的cap基因编码的结构蛋白。aav包含三种衣壳蛋白，病毒粒子(virion)蛋白1至3(命名为vp1、vp2和vp3)，其全部通过可变剪接从单个cap基因转录而来。在一些实施方案中，vp1、vp2和vp3的分子量分别为约87kda、约72kda和约62kda。在一些实施方案中，在翻译时，衣壳蛋白围绕病毒基因组形成球形的60聚体蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组、递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。[0045]在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有选自由以下组成的组的aav血清型：aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav8、aavrh8、aav9、aav10、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43和aav.php。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有源自非人灵长类动物的血清型，例如aavrh8血清型。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有对受试者眼具有向性的血清型，例如相比于其他载体更有效地转导受试者的眼细胞的aav(例如，aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aav.php)。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有aav8血清型。[0046]在宿主细胞中培养以将raav载体包装在aav衣壳中的组分可以反式提供给宿主细胞。或者，任何一种或多种所需组分(例如，重组aav载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定的宿主细胞提供，所述宿主细胞已使用本领域技术人员已知的方法工程化以包含所需组分的一种或多种。最合适的是，此类稳定的宿主细胞将含有在诱导型启动子控制下的所需组分。然而，所需组分可以处于组成型启动子的控制下。在讨论适合与转基因一起使用的调控元件时，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的示例。在另一个替代方案中，所选的稳定的宿主细胞可以包含在组成型启动子控制下的所选组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的其他所选组分。例如，可以产生源自293细胞(其含有在组成型启动子控制下的e1辅助功能)但含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白的稳定的宿主细胞。本领域技术人员可以产生其他稳定的宿主细胞。[0047]在一些实施方案中，本公开涉及包含含有编码蛋白(例如，miniush2a蛋白)的编码序列的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，本公开涉及包含上述宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，包含上述宿主细胞的组合物进一步包含冷冻保存剂。[0048]可以使用任何合适的遗传元件(载体)将产生本公开的raav所需的重组aav载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。所选的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborpress，coldspringharbor，n.y。类似地，产生raav病毒体的方法是公知的，并且合适方法的选择不是对本公开的限制。参见，例如，k.fisher等人，j.virol.，70：520-532(1993)和美国专利号5,478,745。[0049]在一些实施方案中，重组aav可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)产生。通常，通过用待包装到aav颗粒中的重组aav载体(包含转基因)、aav辅助功能载体和附属功能(accessoryfunction)载体转染宿主细胞来生产重组aav。aav辅助功能载体编码“aav辅助功能”序列(即rep和cap)，其以反式发挥作用，用于生产性aav复制和衣壳化。优选地，aav辅助功能载体支持有效的aav载体生产而不产生任何可检测的野生型aav病毒粒子(即，含有功能性rep和cap基因的aav病毒粒子)。适合用于本公开的载体的非限制性示例包括美国专利号6,001,650中描述的phlp19和美国专利号6,156,303中描述的prep6cap6载体，其全部内容通过引用并入本文。附属功能载体编码具有非aav衍生的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，aav的复制依赖于这些功能(即“附属功能”)。附属功能包括aav复制所需的那些功能，包括但不限于参与aav基因转录的激活、阶段特异性aavmrna剪接、aavdna复制、cap表达产物合成和aav衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(单纯疱疹病毒1型除外)和牛痘病毒。[0050]在一些方面，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄取外来dna(foreigndna)，当外来dna被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域公知的。参见，例如，graham等人(1973)virology，52：456、sambrook等人(1989)molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratories，newyork、davis等人(1986)basicmethodsinmolecularbiology，elsevier和chu等人(1981)gene13：197。此类技术可用于将一种或多种外源核酸，例如核苷酸整合载体和其他核酸分子，引入合适的宿主细胞。[0051]“宿主细胞”是指包含或能够包含目标物质的任何细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作aav辅助构建体、aav小基因质粒、附属功能载体或与重组aav生产相关的其他转移dna的受体。所述术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用，“宿主细胞”可以指已用外源dna序列转染的细胞。应当理解，由于自然、偶然或有意的突变，单个亲代细胞的后代在形态学或基因组或总dna补体方面不一定与原始亲本完全相同。[0052]如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群体。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。本领域进一步已知，在此类克隆群体的储存或转移期间，核型可发生自发或诱导的变化。因此，源自所指细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，并且所指细胞系包括此类变体。[0053]如本文所用，术语“重组细胞”是指其中已引入外源dna片段(例如导致生物活性多肽转录或生物活性核酸(例如rna)生产的dna片段)的细胞。[0054]如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒子等，其在与合适的控制元件结合时能够复制并且其可以在细胞之间转移基因序列。因此，所述术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。[0055]递送[0056]本文提供了将转基因递送至受试者的眼(例如，光感受器，例如视杆细胞或视锥细胞、视网膜细胞等)组织或耳的方法。所述方法通常包括向受试者施用有效量的包含用于在受试者中表达转基因(例如，miniush2a蛋白)的核酸的raav。raav的“有效量”是足以感染受试者靶组织的足够数量细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是眼(例如，光感受器、视网膜等)组织。在一些实施方案中，将转基因递送至感光细胞或视网膜色素上皮(retinalpigmentedepithelium，rpe)。[0057]raav的有效量可以是足以在受试者中具有治疗益处，例如改善受试者中的一种或多种疾病症状，例如乌谢尔综合征(例如，与ush2a基因的缺失或突变相关的疾病)的症状的量。ush2a基因中突变的示例包括c.949c》a、c.2242c》t(p.gln748x)和c.4405c》t(p.gln1468x)。有效量将取决于多种因素，例如受试者的物种、年龄、体重、健康状况和要靶向的眼部组织，并因此可能因受试者和组织而异。有效量也可能取决于所使用的raav。[0058]在某些实施方案中，raav的有效量为1010个、1011个、1012个、1013个或1014个基因组拷贝/kg。在某些实施方案中，raav的有效量为每个受试者1010个、1011个、1012个、1013个、1014或1015个基因组拷贝。[0059]有效量还可取决于施用方式。例如，在一些情况下，通过基质内施用或皮下注射靶向眼(例如光感受器、视网膜等)组织可能需要与通过另一种方法(例如，全身施用、局部施用)靶向眼(例如光感受器、视网膜等)组织不同(例如，更高或更低)的剂量。在一些实施方案中，具有某些血清型(例如，aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aavrh.8、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aavphp.b)的raav的基质内(is)注射介导眼(例如，角膜、光感受器、视网膜等)细胞的有效转导。因此，在一些实施方案中，注射是基质内注射(is)。在一些实施方案中，施用是通过注射，任选地视网膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，注射是局部施用(例如，局部施用于眼)。在一些情况下，施用多个剂量的raav。[0060]可以根据本领域已知的任何合适的方法将raav以组合物形式递送给受试者。raav，优选地悬于生理上相容的载体中(即，在组合物中)的，可以施用给受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人类灵长类动物(例如猕猴)。在一些实施例中，宿主动物不包括人。[0061]可以通过例如眼内注射或局部施用(例如，滴眼剂)将raav递送至哺乳动物受试者。在一些实施方案中，眼内注射是基质内注射、结膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，注射不是局部施用。也可以使用施用方法的组合(例如，局部施用和基质内注射)。[0062]本公开的组合物可包含单独的raav，或与一种或多种其他病毒(例如，编码具有一种或多种不同转基因的第二raav)组合的raav。在一些实施方案中，组合物包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的raav，每一种均具有一个或多个不同的转基因。[0063]在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的运载体。鉴于raav所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的运载体。例如，一种合适的运载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起配制。[0064]其他示例性运载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。运载体的选择不构成对本发明的限制。[0065]任选地，除了raav和(一种或多种)运载体之外，本公开的组合物还可包含其他药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛(ethylvanillin)、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。[0066]raav以足够的量施用以转染目标组织(例如，眼组织，例如光感受器、视网膜等组织)的细胞并提供足够水平的基因转移和表达而没有过度的副作用。药学上可接受的施用途径的示例包括但不限于直接递送至所选器官(例如，视网膜下递送至眼)、经口、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、瘤内、脉络膜上和其他肠胃外施用途径。如果需要，可以将施用途径进行组合。[0067]实现特定“治疗效果”所需的raav病毒粒子的剂量，例如以基因组拷贝/每千克体重(gc/kg)为剂量单位，将根据多种因素而变化，所述因素包括但不限于：raav病毒粒子的施用途径、实现治疗效果所需的基因或rna表达水平、所治疗的特定疾病或病症，以及基因或rna产物的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及其他因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的raav病毒粒子的剂量范围。[0068]raav的有效量是足以靶向感染动物、靶向目标组织的量。有效量将主要取决于例如受试者的物种、年龄、体重、健康状况和待靶向的组织等因素，并且因此可因动物和组织而异。例如，raav的有效量通常在含有约109至1016个基因组拷贝的约1ml至约100ml溶液的范围内。在一些情况下，约1011至1013个raav基因组拷贝之间的剂量是合适的。在某些实施方案中，109个raav基因组拷贝可有效靶向眼组织(例如，角膜组织)。[0069]在一些实施方案中，当施用给受试者的眼时，比109个raav基因组拷贝更浓的剂量是有毒的。在一些实施方案中，有效量由多个剂量的raav产生。[0070]在一些实施方案中，以每个日历日(例如，24小时期间)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每2个、3个、4个、5个、6个或7个日历日不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每个日历周(例如，7个日历日)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每两周不超过一次(例如，在两个日历周期间一次)的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每个日历月(例如，每30个日历日)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每六个日历月不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每个日历年(例如，365天或闰年时366天)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。[0071]在一些实施方案中，raav组合物被配制为减少组合物中aav颗粒的聚集，尤其是存在高raav浓度(例如，～1013gc/ml或更高)时。可以使用用于减少聚集的合适方法，包括例如添加表面活性剂、ph调节、盐浓度调节等(参见，例如，wrightfr等人,moleculartherapy(2005)12,171–178，其内容通过引用并入本文。)。[0072]药学上可接受的赋形剂和运载体溶液的配置是本领域技术人员公知的，并且开发用于在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适给药和治疗方案也是本领域技术人员公知的。通常，这些制剂可以包含至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管(一种或多种)活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地是总制剂重量或体积的约1或2％至约70％或80％之间或更多。自然地，每个治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以以在化合物的任何给定单位剂量中将获得合适的剂量的方式制备。制备此类药物制剂领域的技术人员将考虑例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑等因素，并且因此，多种剂量和治疗方案可以是期望的。[0073]在一些实施方案中，将raav以本文公开的适当配制的药物组合物的形式直接递送至靶组织，例如直接递送至眼组织(例如，光感受器、视网膜等组织)。然而，在某些情况下，可能需要单独地或另外地通过另一途径，例如皮下、胰内、鼻内、肠胃外、静脉内、肌内、鞘内或经口、腹膜内或通过吸入递送基于raav的治疗构建体。在一些实施方案中，如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(各自通过引用以其整体具体并入本文)中描述的施用形式可用于递送raav。在一些实施方案中，优选的施用方式是通过玻璃体内注射或视网膜下注射或脉络膜上注射。[0074]适用于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。在许多情况下，该形式是无菌的和流动的，达到容易注射的程度。它在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用包衣剂例如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持合适的流动性。可以通各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。[0075]例如，对于可注射水溶液的施用，如果需要，可以适当地将溶液缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖将液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，可以使用合适的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解于1ml等渗nacl溶液中，并且添加至1000ml皮下灌注液(hypodermoclysisfluid)中或注射在建议的输注部位(参见，例如，"remington'spharmaceuticalsciences"，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据宿主的情况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定用于个体宿主的合适剂量。[0076]通过将所需量的活性raav与本文列举的各种其他成分(需要时)一起并入合适的溶剂中随后进行过滤除菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种已灭菌的活性成分并入包含基础分散介质和来自上述列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。[0077]本文所公开的raav组合物也可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)以及与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。在配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效的量施用。所述制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。[0078]如本文所用，“运载体(carrier)”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物(vehicle)、包衣剂、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、运载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。补充活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用给宿主时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。[0079]例如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等的递送媒介物可用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，raav载体递送的转基因可配制成封装在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中进行递送。[0080]此类制剂可优选用于引入本文公开的核酸或raav构建体的药学上可接受的制剂。脂质体的形成和使用是本领域技术人员通常已知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物运载体的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。[0081]脂质体已成功用于许多通常对其他程序的转染具有抗性的细胞类型。此外，脂质体没有基于病毒的递送系统典型存在的dna长度限制。脂质体已经有效用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入多种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了多项检查脂质体介导的药物递送的有效性的成功临床试验。[0082]脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(multilamellarvesicle，mlv))的磷脂形成。mlv通常具有25nm至4μm的直径。mlv的超声处理导致形成直径在200至范围内的小单层囊泡(smallunilamellarvesicle，suv)，其在核心中含有水溶液。[0083]或者，可以使用raav的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定和可重复的方式捕获物质。为了避免细胞内聚合物过载引起的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细颗粒(大小为约0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。[0084]治疗方法[0085]本公开的多个方面涉及用于将编码miniush2a蛋白的ush2a小基因递送至细胞(例如，受试者中的细胞)的方法。在一些实施方案中，本公开描述的方法可用于治疗患有或怀疑患有疾病(例如，乌谢尔综合征)的受试者。如本文所用，乌谢尔综合征是指与ush2a基因的缺失或突变相关的疾病。在一些实施方案中，患有乌谢尔综合征的受试者可具有c.949c》a、c.2242c》t(p.gln748x)和/或c.4405c》t(p.gln1468x)突变。在一些实施方案中，患有乌谢尔综合征的受试者相对于健康受试者具有降低或减少的ush2a蛋白的表达或活性。在一些实施方案中，患有乌谢尔综合征的受试者的特征在于ush2a蛋白的表达或活性水平比健康受试者低至少1％、5％、10％、20％、50％、75％或100％(例如，没有ush2a蛋白的表达)。在一些实施方案中，患有乌谢尔综合征的受试者的特征在于ush2a的表达或活性水平比健康受试者少至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多倍。受试者可以是人类、小鼠、大鼠、猪、狗、猫或非人灵长类动物。[0086]在一些方面，本公开提供了一种促进编码miniush2a蛋白的ush2a小基因在受试者中表达的方法，包括向患有或怀疑患有乌谢尔综合征的受试者施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物促进编码miniush2a蛋白的ush2a小基因的表达。在一些实施方案中，与对照受试者相比，向受试者施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物促进功能性ush2a蛋白(例如，miniush2a蛋白)的表达为2倍至100倍(例如，2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍等)。在一些实施方案中，与对照受试者相比，向受试者施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物促进受试者中功能性ush2a蛋白(例如，miniush2a蛋白)的表达为2倍至100倍(例如，2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍等)。如本文所用，“对照”受试者可以指未被施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物的受试者；或健康受试者。在一些实施方案中，对照受试者是与被施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物的受试者相同的受试者(例如，在施用之前)。在一些实施方案中，与对照相比，向受试者施用所述分离的核酸、raav或组合物促进功能性ush2a蛋白(例如，miniush2a蛋白)的表达为5倍至100倍(例如，与对照相比，5倍至10倍、10倍至15倍、10倍至20倍、15倍至25倍、20倍至30倍、25倍至35倍、30倍至40倍、35倍至45倍、40倍至60倍、50倍至75倍、60倍至80倍、75倍至100倍)。[0087]如本文所用，术语“治疗”是指将包含编码miniush2a蛋白的ush2a小基因的组合物、分离的核酸、载体或raav应用或施用给患有乌谢尔综合征或具有乌谢尔综合征预先倾向性的受试者，目的为治愈(cure)、愈合(heal)、减轻、缓解、改变、拯救、改善、好转或影响病症、疾病的症状或乌谢尔综合征预先倾向性。[0088]减轻乌谢尔综合征包括延缓疾病的发展或进展，或降低疾病的严重程度。减轻疾病并不一定需要治愈性结果。如本文所用，“延迟”疾病(例如乌谢尔综合征)的发展意指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以是不同的时间长度，取决于疾病病史和/或被治疗的个体。“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法是与不使用该方法相比，在给定的时间范围内降低出现疾病的一种或多种症状的可能性和/或在给定的时间范围内减轻症状的程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，使用的受试者数量足以得出统计学上显著的结果。[0089]疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域公知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法检测的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，乌谢尔综合征的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。[0090]试剂盒和相关组合物[0091]在一些实施方案中，本文所述的药剂可以组装成药物或诊断或研究试剂盒，以促进它们在治疗、诊断或研究应用中的用途。试剂盒可以包括一个或多个装有本公开的组分的容器和使用说明。具体地，此类试剂盒可以包括本文所述的一种或多种药剂，以及描述这些药剂的预期应用和正确使用的说明。在某些实施方案中，试剂盒中的药剂可以是适合于特定应用和药剂施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可以包含合适浓度或数量的组分以进行多种实验。[0092]在一些实施方案中，本公开涉及用于生产raav的试剂盒，所述试剂盒包含装有本文所述的分离的核酸的容器。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含生产raav的说明。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个装有重组aav载体的容器，其中所述重组aav载体包括转基因。[0093]在一些实施方案中，本公开涉及一种包含装有如上文所述的重组aav的容器的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含装有药学上可接受的运载体的容器。例如，试剂盒可以包含一个装有raav的容器和另一个装有适合将raav注射至受试者的缓冲液的容器。在一些实施方案中，容器是注射器。[0094]试剂盒可以设计为便于研究人员使用本文所述的方法并且可以采用多种形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物可以以液体形式(例如，在溶液中)或固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，一些组合物可以是可构成的(constitutable)或以其他方式可加工的(例如，加工为活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他种类(例如，水或细胞培养基)，其可能随或未随试剂盒提供。如本文所用，“说明”可以定义说明和/或推广的组分，并且通常涉及对于或关于本公开的包装的书面说明。说明还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明，使得用户将清楚地认识到说明将与试剂盒相关，例如，视听(例如，录像带、dvd等)、互联网和/或基于网络的通信等。书面说明可以采用监管药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构所规定的形式，该说明也可以反映有关动物监管的制造、使用或销售的机构的批准。[0095]所述试剂盒可以在一个或多个容器中包含本文所述的任意一个或多个组分。例如，在一个实施方案中，试剂盒可以包括关于混合试剂盒的一个或多个组分和/或分离和混合样品并应用于受试者的说明。试剂盒可以包括装有本文所述的药剂的容器。药剂可以是液体、凝胶或固体(粉末)的形式。药剂可以无菌制备、包装在注射器中并冷藏运输。或者，它可以装在小瓶或其他容器中来储存。另一个容器可以装有无菌制备的其他药剂。或者，试剂盒可以包括预先混合并装运在注射器、小瓶、管或其他容器中的活性剂。试剂盒可以具有向动物施用药剂所需的一个或多个或全部组分，例如注射器、局部施用装置或iv注射针管和袋，尤其是在用于产生特定体细胞动物模型的试剂盒的情况下。[0096]在一些情况下，所述方法涉及用从可能含有非常低丰度的前病毒aav基因组的组织中分离的总细胞dna转染细胞，和补充辅助病毒功能(例如，腺病毒)以触发和/或加强aavrep和cap基因在转染细胞中的转录。在一些情况下，来自转染细胞的rna为cdna的rt-pcr扩增和新型aav的检测提供了模板。在用从可能含有前病毒aav基因组的组织中分离的总细胞dna转染细胞的情况下，通常需要向细胞补充促进aav基因转录的因子。例如，也可以用辅助病毒，例如腺病毒或疱疹病毒来感染细胞。在一个具体的实施方案中，辅助功能由腺病毒提供。腺病毒可以是野生型腺病毒，并且可以是人或非人来源，优选非人灵长类动物(nhp)来源。类似地，已知感染非人类动物(例如，黑猩猩、小鼠)的腺病毒也可用于本公开的方法中(参见，例如，美国专利号6,083,716)。除了野生型腺病毒之外，还可以使用携带必要辅助功能的重组病毒或非病毒载体(例如，质粒、附加体等)。此类重组病毒是本领域已知的并且可以根据公开的技术来制备。参见，例如，美国专利号5,871,982和美国专利号6,251,677，其描述了杂合ad/aav病毒。多种腺病毒毒株可以从美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection,manassas,va.)获得，或应请求从多种商业和机构来源获得。此外，许多此类毒株的序列可从多个数据库获得，包括例如pubmed和genbank。[0097]也可以用为aav提供辅助功能的载体(例如，辅助载体)转染细胞。提供辅助功能的载体可以提供腺病毒功能，包括，例如，e1a、e1b、e2a、e4orf6。提供这些功能的腺病毒基因的序列可以从任何已知的腺病毒血清型获得，例如血清型2、3、4、7、12和40，并且进一步包括本领域已知的任何目前鉴定的人类类型。因此，在一些实施方案中，所述方法包括用表达aav复制、aav基因转录和/或aav包装所必需的一种或多种基因的载体转染细胞。[0098]在一些情况下，新的分离的衣壳基因可用于使用本领域公知的方法构建和包装重组aav载体，以确定与所述基因编码的新的衣壳蛋白相关的功能性特征。例如，新的分离的衣壳基因可用于构建和包装包含报告基因(例如，b-半乳糖苷酶、gfp、荧光素酶等)的重组aav(raav)载体。然后可以将raav载体递送至动物(例如，小鼠)，并且可以通过检查报告基因在动物的多种组织(例如，心脏、肝脏、肾脏)中的表达来确定新的分离的衣壳基因的组织靶向特性。用于表征新的分离的衣壳基因的其他方法在本文中公开并且还有其他方法是本领域公知的。[0099]试剂盒可以具有多种形式，例如泡罩袋(blisterpouch)、收缩包裹袋(shrinkwrappedpouch)、真空密封袋、密封热成型托盘或类似的袋或托盘形式(其中附件松散地包装在袋内)、一个或多个管、容器、盒或袋中。可以在添加附件之后对试剂盒进行灭菌，从而允许容器中的各个附件以其他方式被打开。可以使用任何合适的灭菌技术对试剂盒进行灭菌，例如辐射灭菌、热灭菌或本领域已知的其他灭菌方法。根据具体应用，试剂盒还可以包括其他组件，例如，容器、细胞培养基、盐、缓冲液、试剂、注射器、针头、用于施加或去除消毒剂的织物(例如纱布)、一次性手套、在施用前对药剂的支持物等。[0100]试剂盒中包含的说明可以涉及用于检测细胞中潜在aav的方法。此外，本公开的试剂盒可以包含说明、阴性和/或阳性对照、容器、样品稀释剂和缓冲液、样品制备管和用于序列比较的参考aav序列的印刷或电子表格。[0101]实施例[0102]实施例1[0103]这个实施例描述了具有在光感受器中保留功能(例如，部分ush2a功能)的ush2a的14中任一项所示的序列的部分或由其组成。部分可以包含如seqidno:3-14中任一项所示的序列的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，本公开所述的核酸序列是核酸有义链(例如，5'至3'链)，或在病毒序列的上下文中是正( )链。在一些实施方案中，本公开所述的核酸序列是核酸反义链(例如，3'至5'链)，或在病毒序列的上下文中是负(-)链。[0112]等价物[0113]虽然在本文中已经描述和示出了本发明的多个实施方案，但是本领域的普通技术人员将容易地设想用于执行功能和/或获得本文中所述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化和/或修饰均被认为在本发明的范围内。更通常地，本领域技术人员将容易理解，本文中所述的全部参数、尺寸、材料和构型是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本发明的教导的一个或多个具体应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等价物。因此，应当理解，前述实施方案仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等价物的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文中所述的每个单独的特征、系统、物品、材料和/或方法。此外，两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料和/或方法的任何组合，如果这样的特征、系统、物品、材料和/或方法不是相互矛盾的，则包括在本发明的范围内。[0114]在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”，除非明确指明相反，否则应理解为“至少一个”。[0115]说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“其中一个或两者”，即在一些情况下结合存在且在其他情况下不结合存在的要素。除了由“和/或”从句具体标识的元素之外，可以任选地存在其他要素，无论是否与具体标识的那些要素相关或不相关，除非明确指明相反。因此，作为非限制性示例，当与例如“包含”的开放式语言结合使用时，对“a和/或b”的引用在一个实施方案中可以指有a没有b(任选地包含除b之外的要素)；在另一个实施方案中，指有b没有a(任选地包含除a之外的要素)；在另一个实施方案中，指a和b两者(任选地包含其他要素)；等。[0116]如本文在说明书和权利要求中使用的，“或”应该理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项时，“或”或“和/或”应解释为包含性的，即，包含大量要素或要素列表的至少一个，但也包含多于一个，并且任选地包含其他未列出的项。只有明确指明相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或“由……组成”当用于权利要求书中时，将指包含大量要素或要素列表的恰好一个要素。通常，当前面有排他性术语，例如“要么”、“其中之一”、“仅其中之一”或“恰好其中之一”时，本文中所用的术语“或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即，“一个或另一个但不是两者”)。“基本上由……组成”在用于权利要求书中时，应具有其在专利法领域中的普通含义。[0117]如本文在说明书和权利要求中所使用的，短语“至少一个”在指代一个或多个要素的列表时，应理解为意指选自要素列表中的一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表中具体列出的各个和每个要素的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任何组合。这个定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表中具体标识的要素之外的要素可以任选地存在，无论与具体标识的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，“a和b的至少一个”(或等价地，“a或b的至少一个”，或等价地“a和/或b的至少一个”)在一个实施方案中可以指至少一个，任选地包括多于一个，a，而不存在b(并且任选地包含除b之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个，b，而不存在a(并且任选地包含除a之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个，a，和至少一个，任选地包括多于一个，b(和任选地包括其他要素)；等。[0118]在权利要求书以及上述说明书中，所有过渡短语，例如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等应理解为是开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭的或半封闭的过渡短语。[0119]在权利要求书中使用例如“第一”、“第二”、“第三”等顺序术语来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一权利要求要素的任何优先性、居先性或顺序，或方法的行为进行的时间顺序，而是仅用作标记以将具有特定名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一个要素(但用于顺序术语)区分开来以区分权利要求要素。[0120]数值前面的术语“约”和“基本上”代表所述数值的±10％。当前第1页12当前第1页12
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：：3.乌谢尔综合征(ushersyndrome，ush)是导致聋盲症(deaf-blindnessdisorder)的主要原因。患者表现出严重和进行性的视网膜变性和感觉神经性耳聋(sensorineuralhearingloss)。ush2a(usherin)基因中的突变与》70％的乌谢尔ii型病例相关。ush2a基因的大尺寸(～15.6kb)限制了使用传统的腺相关病毒(aav)载体介导的基因递送方法的成功疗法的开发。技术实现要素：4.本公开的多个方面涉及可用于向受试者递送小基因(minigene)的组合物和方法。因此，本公开部分基于分离的核酸和基因治疗载体，例如病毒(例如，raav)载体，其包含编码治疗性基因产物例如蛋白或肽的一个或多个基因片段(例如，小基因)。在一些实施方案中，本公开涉及编码ush2a蛋白(例如，ush2a的基因产物)或其部分的基因治疗载体。在一些实施方案中，本公开所描述的组合物可用于治疗与ush2a基因中的突变相关的疾病，例如乌谢尔综合征。5.因此，在一些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其包含编码具有如seqidno:3-14中任一项所示的核酸序列的ush2a小基因的转基因。6.在一些方面，本公开提供了包含具有编码ush2a蛋白的核酸序列的转基因的分离的核酸，其中所述ush2a蛋白包含如seqidno:15-26中任一项所述的氨基酸序列。7.在一些实施方案中，转基因进一步包含与ush2a小基因编码序列有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。在一些实施方案中，启动子包括鸡β-肌动蛋白(chickenbeta-actin，cba)启动子。在一些实施方案中，组织特异性启动子是光感受器特异性启动子(photoreceptor-specificpromoter)。在一些实施方案中，光感受器特异性启动子包括视紫红质激酶(rhodopsinkinase)启动子，例如人grk启动子。8.在一些实施方案中，转基因的侧翼是腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)。在一些实施方案中，转基因侧翼的至少一个itr是aav2itr。在一些实施方案中，转基因侧翼的两个itr都是aav2itr。在一些实施方案中，转基因侧翼的至少一个itr缺乏末端解离位点(terminalresolutionsite)，例如δitr。9.在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的分离的核酸的载体。在一些实施方案中，载体是质粒dna、或封闭线性dna(closed-lineardna)、或脂质/dna纳米颗粒、或病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是腺相关病毒(aav)载体、腺病毒(ad)载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或杆状病毒载体。10.在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的分离的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物(人)细胞、细菌细胞、酵母细胞或昆虫细胞。11.在一些方面，本公开提供了一种重组腺相关病毒(raav)，其包含：如本文所述的分离的核酸；和aav衣壳蛋白。12.在一些实施方案中，衣壳蛋白对眼细胞具有向性(tropism)。在一些实施方案中，衣壳蛋白是aav8衣壳蛋白。13.在一些实施方案中，raav被配制用于递送至眼。在一些实施方案中，raav被配制用于递送至感光细胞(photoreceptorcell)或视网膜色素上皮(retinalpigmentedepithelium，rpe)。14.在一些方面，本公开提供了包含如本文所述的分离的核酸或raav和药学上可接受的赋形剂的组合物。15.在一些方面，本公开提供了一种将转基因递送至细胞的方法，所述方法包括将本文所述的分离的核酸或raav施用给细胞。16.在一些实施方案中，细胞在受试者中。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物受试者，例如人类受试者。在一些实施方案中，细胞是眼细胞。在一些实施方案中，眼细胞是感光细胞或视网膜色素上皮(rpe)。17.在一些方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者中的乌谢尔综合征的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所述的分离的核酸或raav。18.在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。19.在一些实施方案中，受试者的特征在于在ush2a基因中具有一个或多个突变。在一些实施方案中，受试者具有一个或多个选自以下的突变：ush2a基因的c.949c》a、c.2242c》t(p.gln748x)和c.4405c》t(p.gln1468x)。20.在一些实施方案中，施用通过注射进行。在一些实施方案中，注射是视网膜下注射或玻璃体内注射或脉络膜上注射。21.在一些实施方案中，施用是对受试者眼的外用给药。22.附图简要说明23.图1是描绘miniush2a构建体的多个实施方案的示意图。具体实施方式24.在一些方面，本公开涉及可用于治疗某些遗传疾病，例如乌谢尔综合征的组合物和方法。本公开部分基于分离的核酸和基因治疗载体，例如病毒(例如，raav)载体，其包含编码治疗性基因产物例如miniush2a蛋白(例如，ush2a小基因的基因产物)的一个或多个基因片段。[0025]“核酸”序列是指dna或rna序列。在一些实施方案中，本公开的蛋白和核酸是分离的。如本文所用，术语“分离的”意指人工生产的。如本文所用，关于核酸，术语“分离的”意指：(i)通过例如聚合酶链反应(pcr)进行体外扩增；(ii)通过克隆进行重组生产；(iii)进行纯化，如通过裂解和凝胶分离；或(iv)通过例如化学合成进行合成。分离的核酸是通过本领域公知的重组dna技术容易操作的核酸。因此，包含在其中5'和3'限制性位点是已知的或其聚合酶链反应(pcr)引物序列已经公开的载体中的核苷酸序列被认为是分离的，但以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列不是。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必要的。例如，在克隆或表达载体中分离的核酸是不纯的，因为它可能仅占其所在细胞中物质的很小百分比。然而，这样的核酸是分离的，如该术语在本文中所用的，因为它易于通过本领域普通技术人员已知的标准技术进行操作。如本文所用，关于蛋白或肽，术语“分离的”是指已从其天然环境中分离或人工产生(例如，通过化学合成、通过重组dna技术等)的蛋白或肽。在一些实施方案中，分离的核酸编码ush2a蛋白，例如miniush2a蛋白(例如，从ush2a基因或其部分，例如ush2a小基因表达的基因产物)。[0026]在人类中，ush2a基因(也称为rp39)编码usherin蛋白，其是一种基底膜(basementmembrane)蛋白。已经观察到ush2a基因中的突变会导致乌谢尔综合征，这是一种失明(例如，视网膜变性)和耳聋的组合病症。在一些实施方案中，ush2a基因(或由ush2a基因编码的mrna)包含如ncbi参考序列登录号nm_206933.3(seqidno：1)所示的核酸序列。在一些实施方案中，ush2a基因编码具有如ncbi参考序列登录号np_996816.2(seqidno：2)所示的氨基酸序列的蛋白。[0027]如本文所用，“小基因(minigene)”是指编码重组肽或蛋白的分离的核酸序列，其中编码天然存在的肽或蛋白的相应基因的一个或多个非必需元件已被去除并且其中由小基因编码的肽或蛋白保留了相应天然存在的肽或蛋白的功能。“治疗性小基因”是指编码用于治疗遗传疾病的肽或蛋白的小基因，所述肽或蛋白例如抗肌萎缩蛋白(dystrophin)、dysferlin、因子viii、淀粉样前体蛋白(app)、酪氨酸酶(tyr)等。小基因是本领域已知的，并且由例如karpati和acsadi(1994)clininvestmed17(5)：499-509；plantier等人(2001)thrombhaemost.86(2)：596-603；和xiao等人(2007)worldj.gastroenterol.13(2)：244-9描述。在一些实施方案中，小基因不编码天然存在的肽或蛋白的完整氨基酸序列。[0028]在一些方面，本公开涉及编码ush2a小基因的分离的核酸。通常，编码小基因(例如，治疗性小基因，例如ush2a小基因)的分离的核酸相对于编码相应天然存在的野生型蛋白(例如，seqidno：2)截短约10％至约99％(例如，约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约90％、约99％等)。截短可以是连续的(例如，氨基酸残基的单个、连续的截短)或不连续的(例如，氨基酸的两个或更多个截短，例如被一个或多个肽分隔开的两个或更多个结构域的截断)。例如，在一些实施方案中，与野生型ush2a基因(例如，seqidno:1)相比，编码miniush2a蛋白的小基因被截短了约61％至(例如，包含约50％的核酸序列)。在一些实施方案中，ush2a小基因包含如seqidno:3-14中任一项所示的核酸序列。在一些实施方案中，ush2a小基因编码包含如seqidno:15-26中任一项所示的氨基酸序列的蛋白(称为miniush2a蛋白)。在一些实施方案中，编码ush2a蛋白(例如，miniush2a蛋白)的核酸在编码ush2a蛋白的核酸序列之前包含起始密码子(例如，核酸序列atg)。在一些实施方案中，编码miniush2a蛋白的核酸序列是密码子优化的。[0029]编码ush2a蛋白的分离的核酸序列可以与启动子有效连接。“启动子”是指被细胞的合成机制(syntheticmachinery)或引入的合成机制识别的、启动基因的特异性转录所需的dna序列。短语“有效定位(operativelypositioned)”、“受控制(undercontrol)”或“受转录控制(undertranscriptionalcontrol)”意指启动子相对于核酸处于正确的位置和方向，以控制rna聚合酶的起始和基因的表达。启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子。[0030]组成型启动子的示例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地，具有rsv增强子)、巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地，具有cmv增强子)[参见，例如，boshart等人,cell,41:521-530(1985)]、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子和ef1α启动子[invitrogen]。在一些实施方案中，启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，启动子包括鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，启动子是u6启动子。在一些实施方案中，启动子是鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。[0031]诱导型启动子允许基因表达的调节并且可以通过外源提供的化合物、环境因素例如温度或特定生理状态(例如，急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)的存在来调节。诱导型启动子和诱导型系统可从多种商业来源获得，包括但不限于invitrogen、clontech和ariad。已经描述了许多其他系统并且本领域技术人员可以容易地选择这些系统。由外源提供的启动子调节的诱导型启动子的示例包括锌诱导型绵羊金属硫蛋白(metallothionine，mt)启动子、地塞米松(dexamethasone，dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、t7聚合酶启动子系统(wo98/10088)；蜕皮激素(ecdysone)昆虫启动子(no等人，proc.natl.acad.sci.usa，93：3346-3351(1996))、四环素抑制型系统(gossen等人，proc.natl.acad.sci.usa，89：5547-5551(1992))、四环素诱导型系统(gossen等人，science，268：1766-1769(1995)，另参见harvey等人，curr.opin.chem.biol.，2∶512-518(1998))、ru486诱导型系统(wang等人，nat.biotech.，15：239-243(1997)和wang等人，genether.，4：432-441(1997))和雷帕霉素诱导型系统(magari等人，j.clin.invest.，100：2865-2872(1997))。在这种情况下可能有用的其他类型的诱导型启动子是那些受特定生理状态(例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)调节的启动子。[0032]在一些实施方案中，调节序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况下，组织特异性调节序列结合以组织特异性方式诱导转录的组织特异性转录因子。此类组织特异性调节序列(例如，启动子、增强子等)是本领域公知的。在一些实施方案中，组织特异性启动子是眼特异性启动子。眼特异性启动子的示例包括但不限于视网膜劈裂蛋白启动子、k12启动子、视紫红质启动子、视杆细胞特异性启动子、视锥细胞特异性启动子、视紫红质激酶启动子、grk1启动子、光感受器间视黄醇结合蛋白近端(interphotoreceptorretinoid-bindingproteinproximal，irbp)启动子和视蛋白启动子(例如，红色视蛋白启动子、蓝色视蛋白启动子等)。[0033]在一些实施方案中，启动子是rna聚合酶iii(poliii)启动子。poliii启动子的非限制性示例包括u6和h1启动子序列。在一些实施方案中，启动子是rna聚合酶ii(polii)启动子。polii启动子的非限制性示例包括t7、t3、sp6、rsv和巨细胞病毒启动子序列。[0034]本公开的多个方面涉及包含如本文所述的分离的核酸的基因治疗载体。基因治疗载体可以是病毒载体(例如，慢病毒载体、腺病毒(ad)载体、腺相关病毒载体等)、质粒dna、封闭端dna(例如，cedna)、脂质/dna纳米颗粒等。在一些实施方案中，基因治疗载体是病毒载体。在一些实施方案中，编码小基因的表达盒的侧翼是一个或多个病毒复制序列，例如慢病毒长末端重复序列(ltr)或腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)。[0035]本文所述的分离的核酸还可包含内含子，其理想地位于启动子/增强子序列和转基因之间。在一些实施方案中，内含子是合成的或人工的(例如，异源的)内含子。合成的内含子的示例包括源自sv-40的内含子序列(称为sv-40t内含子序列)和源自鸡β-肌动蛋白基因的内含子序列。在一些实施方案中，本公开描述的转基因包含一个或多个(1个、2个、3个、4个、5个或更多个)人工的内含子。在一些实施方案中，一个或多个人工的内含子位于启动子和编码转基因的核酸序列之间。[0036]在一些实施方案中，raav包含转录后反应元件。如本文所用，术语“转录后反应元件”是指在转录时采用增强基因表达的三级结构的核酸序列。转录后调控元件的示例包括但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(woodchuckhepatitisvirusposttranscriptionalregulatoryelement，wpre)、小鼠rna转运元件(mousernatransportelement，rte)、猴1型逆转录病毒(srv-1)的组成型转运元件(cte)、来自摩-傅猴病毒(mason-pfizermonkeyvirus，mpmv)的cte以及人热休克蛋白70(hsp705′utr)的5′非翻译区。在一些实施方案中，raav载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。[0037]在一些实施方案中，载体进一步包含常规控制元件，其以允许转基因元件在被载体转染或被本公开产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式与转基因元件有效连接。如本文所用，“有效连接的”序列包括与目标基因相邻的表达控制序列和以反式或以一定距离作用以控制目标基因的表达控制序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的rna处理信号，例如剪接和聚腺苷酸化(polya)信号；稳定细胞质mrna的序列；提高翻译效率的序列(例如，kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；以及在需要时增强编码产物分泌的序列。许多表达控制序列，包括天然的、组成型的、诱导型的和/或组织特异性的启动子，是本领域已知的并且可以使用。[0038]聚腺苷酸化序列通常在转基因序列之后和任选地在3′aavitr序列之前插入。可用于本公开的raav构建体还可以包含内含子，其理想地位于启动子/增强子序列和转基因之间。一种可能的内含子序列源自sv-40，并且称为sv-40t内含子序列。另一个可以使用的载体元件是内部核糖体进入位点(ires)。ires序列用于从单个基因转录物中产生多于一种的多肽。ires序列将用于产生包含多于一条多肽链的蛋白。这些和其他常见载体元件的选择是常规的，并且许多这样的序列是可用的[参见，例如，sambrook等人和其中在例如第3.183.26和16.1716.27页引用的参考文献，以及ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1989]。[0039]本公开的分离的核酸可以是重组腺相关病毒(aav)载体(raav载体)。在一些实施方案中，如本公开所描述的分离的核酸包含含有第一腺相关病毒(aav)反向末端重复序列(itr)或其变体的区域(例如，第一区域)。可以将分离的核酸(例如，重组aav载体)包装进衣壳蛋白并施用给受试者和/或递送至所选靶细胞。“重组aav(raav)载体”通常至少由转基因及其调节序列以及5′和3′aav反向末端重复序列(itr)组成。如本文别处所公开的，转基因可以包含编码一种或多种蛋白(例如，人ush2a或其片段)的一个或多个区域。转基因还可以包含编码例如mirna结合位点和/或表达控制序列(例如，polv-a尾)的区域。[0040]通常，itr序列的长度为约145bp。优选地，在分子中使用基本上完整的编码itr的序列，尽管允许对这些序列进行一定程度的微小修饰。修饰这些itr序列的能力在本领域技术范围内。(参见，例如，文本例如sambrook等人，“molecularcloning.alaboratorymanual”，第2版，coldspringharborlaboratory，newyork(1989)；和k.fisher等人，jvirol.，70：520532(1996))。本发明中使用的此类分子的一个示例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选转基因序列和相关调控元件的侧翼是5’和3’aavitr序列。aavitr序列可以从任何已知的aav获得，包括目前鉴定的哺乳动物aav类型。在一些实施方案中，分离的核酸(例如，raav载体)包含具有选自以下的血清型的至少一种itr：aav1、aav2、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aav.php.b及其变体。在一些实施方案中，分离的核酸包含编码aav2itr的区域(例如，第一区域)。[0041]在一些实施方案中，分离的核酸进一步包含含有第二aavitr的区域(例如，第二区域、第三区域、第四区域等)。在一些实施方案中，第二aavitr具有选自以下的血清型：aav1、aav2、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aav.php.b及其变体。在一些实施方案中，第二itr是缺乏功能性末端解离位点(trs)的突变itr。术语“缺乏末端解离位点(lackingaterminalresolutionsite)”可以指包含废除了itr的末端解离位点(trs)的功能的突变(例如，有义突变，例如非同义突变或错义突变)的aavitr，或指缺乏编码功能性trs的核酸序列的截短的aavitr(例如，δtrsitr，或δitr)。不希望受到任何特定理论的束缚，包含缺乏功能性trs的itr的raav载体产生自我互补的raav载体，例如如mccarthy(2008)moleculartherapy16(10)：1648-1656所述。[0042]重组腺相关病毒(raav)[0043]在一些方面，本公开提供分离的aav。如本文所用，关于aav，术语“分离的”是指已人工产生或获得的aav。可以使用重组方法生产分离的aav。这样的aav在本文中称为“重组aav”。重组aav(raav)优选具有组织特异性靶向能力，使得raav的核酸酶和/或转基因将被特异性递送至一种或多种预定组织。aav衣壳是确定这些组织特异性靶向能力的重要因素。因此，可以选择具有适用被靶向的组织的衣壳的raav。[0044]获得具有所需衣壳蛋白的重组aav的方法是本领域公知的。(参见，例如，us2003/0138772)，其内容通过引用以其整体并入本文)。通常，所述方法包括培养含有编码aav衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；包含aav反向末端重复序列(itr)和转基因的重组aav载体；和足以允许将重组aav载体包装到aav衣壳蛋白中的辅助功能的宿主细胞。在一些实施方案中，衣壳蛋白是由aav的cap基因编码的结构蛋白。aav包含三种衣壳蛋白，病毒粒子(virion)蛋白1至3(命名为vp1、vp2和vp3)，其全部通过可变剪接从单个cap基因转录而来。在一些实施方案中，vp1、vp2和vp3的分子量分别为约87kda、约72kda和约62kda。在一些实施方案中，在翻译时，衣壳蛋白围绕病毒基因组形成球形的60聚体蛋白壳。在一些实施方案中，衣壳蛋白的功能是保护病毒基因组、递送基因组并与宿主相互作用。在一些方面，衣壳蛋白以组织特异性方式将病毒基因组递送至宿主。[0045]在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有选自由以下组成的组的aav血清型：aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav8、aavrh8、aav9、aav10、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43和aav.php。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有源自非人灵长类动物的血清型，例如aavrh8血清型。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有对受试者眼具有向性的血清型，例如相比于其他载体更有效地转导受试者的眼细胞的aav(例如，aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aav.php)。在一些实施方案中，aav衣壳蛋白具有aav8血清型。[0046]在宿主细胞中培养以将raav载体包装在aav衣壳中的组分可以反式提供给宿主细胞。或者，任何一种或多种所需组分(例如，重组aav载体、rep序列、cap序列和/或辅助功能)可由稳定的宿主细胞提供，所述宿主细胞已使用本领域技术人员已知的方法工程化以包含所需组分的一种或多种。最合适的是，此类稳定的宿主细胞将含有在诱导型启动子控制下的所需组分。然而，所需组分可以处于组成型启动子的控制下。在讨论适合与转基因一起使用的调控元件时，本文提供了合适的诱导型和组成型启动子的示例。在另一个替代方案中，所选的稳定的宿主细胞可以包含在组成型启动子控制下的所选组分和在一个或多个诱导型启动子控制下的其他所选组分。例如，可以产生源自293细胞(其含有在组成型启动子控制下的e1辅助功能)但含有在诱导型启动子控制下的rep和/或cap蛋白的稳定的宿主细胞。本领域技术人员可以产生其他稳定的宿主细胞。[0047]在一些实施方案中，本公开涉及包含含有编码蛋白(例如，miniush2a蛋白)的编码序列的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中，本公开涉及包含上述宿主细胞的组合物。在一些实施方案中，包含上述宿主细胞的组合物进一步包含冷冻保存剂。[0048]可以使用任何合适的遗传元件(载体)将产生本公开的raav所需的重组aav载体、rep序列、cap序列和辅助功能递送至包装宿主细胞。所选的遗传元件可以通过任何合适的方法递送，包括本文所述的那些。用于构建本公开的任何实施方案的方法是核酸操作技术人员已知的，并且包括基因工程、重组工程和合成技术。参见，例如，sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborpress，coldspringharbor，n.y。类似地，产生raav病毒体的方法是公知的，并且合适方法的选择不是对本公开的限制。参见，例如，k.fisher等人，j.virol.，70：520-532(1993)和美国专利号5,478,745。[0049]在一些实施方案中，重组aav可以使用三重转染方法(在美国专利号6,001,650中详细描述)产生。通常，通过用待包装到aav颗粒中的重组aav载体(包含转基因)、aav辅助功能载体和附属功能(accessoryfunction)载体转染宿主细胞来生产重组aav。aav辅助功能载体编码“aav辅助功能”序列(即rep和cap)，其以反式发挥作用，用于生产性aav复制和衣壳化。优选地，aav辅助功能载体支持有效的aav载体生产而不产生任何可检测的野生型aav病毒粒子(即，含有功能性rep和cap基因的aav病毒粒子)。适合用于本公开的载体的非限制性示例包括美国专利号6,001,650中描述的phlp19和美国专利号6,156,303中描述的prep6cap6载体，其全部内容通过引用并入本文。附属功能载体编码具有非aav衍生的病毒和/或细胞功能的核苷酸序列，aav的复制依赖于这些功能(即“附属功能”)。附属功能包括aav复制所需的那些功能，包括但不限于参与aav基因转录的激活、阶段特异性aavmrna剪接、aavdna复制、cap表达产物合成和aav衣壳组装的那些部分。基于病毒的附属功能可以源自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(单纯疱疹病毒1型除外)和牛痘病毒。[0050]在一些方面，本公开提供了转染的宿主细胞。术语“转染”用于指细胞摄取外来dna(foreigndna)，当外来dna被引入细胞膜内时，细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域公知的。参见，例如，graham等人(1973)virology，52：456、sambrook等人(1989)molecularcloning，alaboratorymanual，coldspringharborlaboratories，newyork、davis等人(1986)basicmethodsinmolecularbiology，elsevier和chu等人(1981)gene13：197。此类技术可用于将一种或多种外源核酸，例如核苷酸整合载体和其他核酸分子，引入合适的宿主细胞。[0051]“宿主细胞”是指包含或能够包含目标物质的任何细胞。通常，宿主细胞是哺乳动物细胞。宿主细胞可用作aav辅助构建体、aav小基因质粒、附属功能载体或与重组aav生产相关的其他转移dna的受体。所述术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，如本文所用，“宿主细胞”可以指已用外源dna序列转染的细胞。应当理解，由于自然、偶然或有意的突变，单个亲代细胞的后代在形态学或基因组或总dna补体方面不一定与原始亲本完全相同。[0052]如本文所用，术语“细胞系”是指能够在体外连续或延长生长和分裂的细胞群体。通常，细胞系是源自单个祖细胞的克隆群体。本领域进一步已知，在此类克隆群体的储存或转移期间，核型可发生自发或诱导的变化。因此，源自所指细胞系的细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同，并且所指细胞系包括此类变体。[0053]如本文所用，术语“重组细胞”是指其中已引入外源dna片段(例如导致生物活性多肽转录或生物活性核酸(例如rna)生产的dna片段)的细胞。[0054]如本文所用，术语“载体”包括任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒粒子等，其在与合适的控制元件结合时能够复制并且其可以在细胞之间转移基因序列。因此，所述术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。[0055]递送[0056]本文提供了将转基因递送至受试者的眼(例如，光感受器，例如视杆细胞或视锥细胞、视网膜细胞等)组织或耳的方法。所述方法通常包括向受试者施用有效量的包含用于在受试者中表达转基因(例如，miniush2a蛋白)的核酸的raav。raav的“有效量”是足以感染受试者靶组织的足够数量细胞的量。在一些实施方案中，靶组织是眼(例如，光感受器、视网膜等)组织。在一些实施方案中，将转基因递送至感光细胞或视网膜色素上皮(retinalpigmentedepithelium，rpe)。[0057]raav的有效量可以是足以在受试者中具有治疗益处，例如改善受试者中的一种或多种疾病症状，例如乌谢尔综合征(例如，与ush2a基因的缺失或突变相关的疾病)的症状的量。ush2a基因中突变的示例包括c.949c》a、c.2242c》t(p.gln748x)和c.4405c》t(p.gln1468x)。有效量将取决于多种因素，例如受试者的物种、年龄、体重、健康状况和要靶向的眼部组织，并因此可能因受试者和组织而异。有效量也可能取决于所使用的raav。[0058]在某些实施方案中，raav的有效量为1010个、1011个、1012个、1013个或1014个基因组拷贝/kg。在某些实施方案中，raav的有效量为每个受试者1010个、1011个、1012个、1013个、1014或1015个基因组拷贝。[0059]有效量还可取决于施用方式。例如，在一些情况下，通过基质内施用或皮下注射靶向眼(例如光感受器、视网膜等)组织可能需要与通过另一种方法(例如，全身施用、局部施用)靶向眼(例如光感受器、视网膜等)组织不同(例如，更高或更低)的剂量。在一些实施方案中，具有某些血清型(例如，aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aavrh.8、aav9.hr、aavrh8、aavrh10、aavrh39、aavrh43、aavphp.b)的raav的基质内(is)注射介导眼(例如，角膜、光感受器、视网膜等)细胞的有效转导。因此，在一些实施方案中，注射是基质内注射(is)。在一些实施方案中，施用是通过注射，任选地视网膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，注射是局部施用(例如，局部施用于眼)。在一些情况下，施用多个剂量的raav。[0060]可以根据本领域已知的任何合适的方法将raav以组合物形式递送给受试者。raav，优选地悬于生理上相容的载体中(即，在组合物中)的，可以施用给受试者，即宿主动物，例如人、小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、兔、马、牛、山羊、猪、豚鼠、仓鼠、鸡、火鸡或非人类灵长类动物(例如猕猴)。在一些实施例中，宿主动物不包括人。[0061]可以通过例如眼内注射或局部施用(例如，滴眼剂)将raav递送至哺乳动物受试者。在一些实施方案中，眼内注射是基质内注射、结膜下注射或玻璃体内注射。在一些实施方案中，注射不是局部施用。也可以使用施用方法的组合(例如，局部施用和基质内注射)。[0062]本公开的组合物可包含单独的raav，或与一种或多种其他病毒(例如，编码具有一种或多种不同转基因的第二raav)组合的raav。在一些实施方案中，组合物包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的raav，每一种均具有一个或多个不同的转基因。[0063]在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的运载体。鉴于raav所针对的适应症，本领域技术人员可以容易地选择合适的运载体。例如，一种合适的运载体包括盐水，其可以与多种缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)一起配制。[0064]其他示例性运载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。运载体的选择不构成对本发明的限制。[0065]任选地，除了raav和(一种或多种)运载体之外，本公开的组合物还可包含其他药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛(ethylvanillin)、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。[0066]raav以足够的量施用以转染目标组织(例如，眼组织，例如光感受器、视网膜等组织)的细胞并提供足够水平的基因转移和表达而没有过度的副作用。药学上可接受的施用途径的示例包括但不限于直接递送至所选器官(例如，视网膜下递送至眼)、经口、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、瘤内、脉络膜上和其他肠胃外施用途径。如果需要，可以将施用途径进行组合。[0067]实现特定“治疗效果”所需的raav病毒粒子的剂量，例如以基因组拷贝/每千克体重(gc/kg)为剂量单位，将根据多种因素而变化，所述因素包括但不限于：raav病毒粒子的施用途径、实现治疗效果所需的基因或rna表达水平、所治疗的特定疾病或病症，以及基因或rna产物的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及其他因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的raav病毒粒子的剂量范围。[0068]raav的有效量是足以靶向感染动物、靶向目标组织的量。有效量将主要取决于例如受试者的物种、年龄、体重、健康状况和待靶向的组织等因素，并且因此可因动物和组织而异。例如，raav的有效量通常在含有约109至1016个基因组拷贝的约1ml至约100ml溶液的范围内。在一些情况下，约1011至1013个raav基因组拷贝之间的剂量是合适的。在某些实施方案中，109个raav基因组拷贝可有效靶向眼组织(例如，角膜组织)。[0069]在一些实施方案中，当施用给受试者的眼时，比109个raav基因组拷贝更浓的剂量是有毒的。在一些实施方案中，有效量由多个剂量的raav产生。[0070]在一些实施方案中，以每个日历日(例如，24小时期间)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每2个、3个、4个、5个、6个或7个日历日不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每个日历周(例如，7个日历日)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每两周不超过一次(例如，在两个日历周期间一次)的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每个日历月(例如，每30个日历日)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每六个日历月不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。在一些实施方案中，以每个日历年(例如，365天或闰年时366天)不超过一次的频率向受试者施用一个剂量的raav。[0071]在一些实施方案中，raav组合物被配制为减少组合物中aav颗粒的聚集，尤其是存在高raav浓度(例如，～1013gc/ml或更高)时。可以使用用于减少聚集的合适方法，包括例如添加表面活性剂、ph调节、盐浓度调节等(参见，例如，wrightfr等人,moleculartherapy(2005)12,171–178，其内容通过引用并入本文。)。[0072]药学上可接受的赋形剂和运载体溶液的配置是本领域技术人员公知的，并且开发用于在各种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适给药和治疗方案也是本领域技术人员公知的。通常，这些制剂可以包含至少约0.1％或更多的活性化合物，尽管(一种或多种)活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地是总制剂重量或体积的约1或2％至约70％或80％之间或更多。自然地，每个治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以以在化合物的任何给定单位剂量中将获得合适的剂量的方式制备。制备此类药物制剂领域的技术人员将考虑例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑等因素，并且因此，多种剂量和治疗方案可以是期望的。[0073]在一些实施方案中，将raav以本文公开的适当配制的药物组合物的形式直接递送至靶组织，例如直接递送至眼组织(例如，光感受器、视网膜等组织)。然而，在某些情况下，可能需要单独地或另外地通过另一途径，例如皮下、胰内、鼻内、肠胃外、静脉内、肌内、鞘内或经口、腹膜内或通过吸入递送基于raav的治疗构建体。在一些实施方案中，如美国专利号5,543,158；5,641,515和5,399,363(各自通过引用以其整体具体并入本文)中描述的施用形式可用于递送raav。在一些实施方案中，优选的施用方式是通过玻璃体内注射或视网膜下注射或脉络膜上注射。[0074]适用于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。在许多情况下，该形式是无菌的和流动的，达到容易注射的程度。它在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用包衣剂例如卵磷脂、在分散剂的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持合适的流动性。可以通各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来实现。[0075]例如，对于可注射水溶液的施用，如果需要，可以适当地将溶液缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖将液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这一点上，可以使用合适的无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解于1ml等渗nacl溶液中，并且添加至1000ml皮下灌注液(hypodermoclysisfluid)中或注射在建议的输注部位(参见，例如，"remington'spharmaceuticalsciences"，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据宿主的情况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定用于个体宿主的合适剂量。[0076]通过将所需量的活性raav与本文列举的各种其他成分(需要时)一起并入合适的溶剂中随后进行过滤除菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种已灭菌的活性成分并入包含基础分散介质和来自上述列举的那些的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。[0077]本文所公开的raav组合物也可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成)以及与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，和例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等的有机碱。在配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以治疗有效的量施用。所述制剂易于以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊等。[0078]如本文所用，“运载体(carrier)”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物(vehicle)、包衣剂、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、运载体溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。补充活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用给宿主时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。[0079]例如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球、脂质颗粒、囊泡等的递送媒介物可用于将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，raav载体递送的转基因可配制成封装在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中进行递送。[0080]此类制剂可优选用于引入本文公开的核酸或raav构建体的药学上可接受的制剂。脂质体的形成和使用是本领域技术人员通常已知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物运载体的各种方法(美国专利号5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。[0081]脂质体已成功用于许多通常对其他程序的转染具有抗性的细胞类型。此外，脂质体没有基于病毒的递送系统典型存在的dna长度限制。脂质体已经有效用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应物引入多种培养的细胞系和动物中。此外，已经完成了多项检查脂质体介导的药物递送的有效性的成功临床试验。[0082]脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(multilamellarvesicle，mlv))的磷脂形成。mlv通常具有25nm至4μm的直径。mlv的超声处理导致形成直径在200至范围内的小单层囊泡(smallunilamellarvesicle，suv)，其在核心中含有水溶液。[0083]或者，可以使用raav的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常可以以稳定和可重复的方式捕获物质。为了避免细胞内聚合物过载引起的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细颗粒(大小为约0.1μm)。考虑使用满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米颗粒。[0084]治疗方法[0085]本公开的多个方面涉及用于将编码miniush2a蛋白的ush2a小基因递送至细胞(例如，受试者中的细胞)的方法。在一些实施方案中，本公开描述的方法可用于治疗患有或怀疑患有疾病(例如，乌谢尔综合征)的受试者。如本文所用，乌谢尔综合征是指与ush2a基因的缺失或突变相关的疾病。在一些实施方案中，患有乌谢尔综合征的受试者可具有c.949c》a、c.2242c》t(p.gln748x)和/或c.4405c》t(p.gln1468x)突变。在一些实施方案中，患有乌谢尔综合征的受试者相对于健康受试者具有降低或减少的ush2a蛋白的表达或活性。在一些实施方案中，患有乌谢尔综合征的受试者的特征在于ush2a蛋白的表达或活性水平比健康受试者低至少1％、5％、10％、20％、50％、75％或100％(例如，没有ush2a蛋白的表达)。在一些实施方案中，患有乌谢尔综合征的受试者的特征在于ush2a的表达或活性水平比健康受试者少至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多倍。受试者可以是人类、小鼠、大鼠、猪、狗、猫或非人灵长类动物。[0086]在一些方面，本公开提供了一种促进编码miniush2a蛋白的ush2a小基因在受试者中表达的方法，包括向患有或怀疑患有乌谢尔综合征的受试者施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物。在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物促进编码miniush2a蛋白的ush2a小基因的表达。在一些实施方案中，与对照受试者相比，向受试者施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物促进功能性ush2a蛋白(例如，miniush2a蛋白)的表达为2倍至100倍(例如，2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍等)。在一些实施方案中，与对照受试者相比，向受试者施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物促进受试者中功能性ush2a蛋白(例如，miniush2a蛋白)的表达为2倍至100倍(例如，2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、75倍、100倍等)。如本文所用，“对照”受试者可以指未被施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物的受试者；或健康受试者。在一些实施方案中，对照受试者是与被施用本文所述的分离的核酸、raav或组合物的受试者相同的受试者(例如，在施用之前)。在一些实施方案中，与对照相比，向受试者施用所述分离的核酸、raav或组合物促进功能性ush2a蛋白(例如，miniush2a蛋白)的表达为5倍至100倍(例如，与对照相比，5倍至10倍、10倍至15倍、10倍至20倍、15倍至25倍、20倍至30倍、25倍至35倍、30倍至40倍、35倍至45倍、40倍至60倍、50倍至75倍、60倍至80倍、75倍至100倍)。[0087]如本文所用，术语“治疗”是指将包含编码miniush2a蛋白的ush2a小基因的组合物、分离的核酸、载体或raav应用或施用给患有乌谢尔综合征或具有乌谢尔综合征预先倾向性的受试者，目的为治愈(cure)、愈合(heal)、减轻、缓解、改变、拯救、改善、好转或影响病症、疾病的症状或乌谢尔综合征预先倾向性。[0088]减轻乌谢尔综合征包括延缓疾病的发展或进展，或降低疾病的严重程度。减轻疾病并不一定需要治愈性结果。如本文所用，“延迟”疾病(例如乌谢尔综合征)的发展意指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以是不同的时间长度，取决于疾病病史和/或被治疗的个体。“延迟”或减轻疾病发展或延迟疾病发作的方法是与不使用该方法相比，在给定的时间范围内降低出现疾病的一种或多种症状的可能性和/或在给定的时间范围内减轻症状的程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，使用的受试者数量足以得出统计学上显著的结果。[0089]疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或随后的进展。可以使用本领域公知的标准临床技术检测和评估疾病的发展。然而，发展也指可能无法检测的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，乌谢尔综合征的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。[0090]试剂盒和相关组合物[0091]在一些实施方案中，本文所述的药剂可以组装成药物或诊断或研究试剂盒，以促进它们在治疗、诊断或研究应用中的用途。试剂盒可以包括一个或多个装有本公开的组分的容器和使用说明。具体地，此类试剂盒可以包括本文所述的一种或多种药剂，以及描述这些药剂的预期应用和正确使用的说明。在某些实施方案中，试剂盒中的药剂可以是适合于特定应用和药剂施用方法的药物制剂和剂量。用于研究目的的试剂盒可以包含合适浓度或数量的组分以进行多种实验。[0092]在一些实施方案中，本公开涉及用于生产raav的试剂盒，所述试剂盒包含装有本文所述的分离的核酸的容器。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含生产raav的说明。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含至少一个装有重组aav载体的容器，其中所述重组aav载体包括转基因。[0093]在一些实施方案中，本公开涉及一种包含装有如上文所述的重组aav的容器的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含装有药学上可接受的运载体的容器。例如，试剂盒可以包含一个装有raav的容器和另一个装有适合将raav注射至受试者的缓冲液的容器。在一些实施方案中，容器是注射器。[0094]试剂盒可以设计为便于研究人员使用本文所述的方法并且可以采用多种形式。在适用的情况下，试剂盒的每种组合物可以以液体形式(例如，在溶液中)或固体形式(例如，干粉)提供。在某些情况下，一些组合物可以是可构成的(constitutable)或以其他方式可加工的(例如，加工为活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他种类(例如，水或细胞培养基)，其可能随或未随试剂盒提供。如本文所用，“说明”可以定义说明和/或推广的组分，并且通常涉及对于或关于本公开的包装的书面说明。说明还可以包括以任何方式提供的任何口头或电子说明，使得用户将清楚地认识到说明将与试剂盒相关，例如，视听(例如，录像带、dvd等)、互联网和/或基于网络的通信等。书面说明可以采用监管药品或生物制品的制造、使用或销售的政府机构所规定的形式，该说明也可以反映有关动物监管的制造、使用或销售的机构的批准。[0095]所述试剂盒可以在一个或多个容器中包含本文所述的任意一个或多个组分。例如，在一个实施方案中，试剂盒可以包括关于混合试剂盒的一个或多个组分和/或分离和混合样品并应用于受试者的说明。试剂盒可以包括装有本文所述的药剂的容器。药剂可以是液体、凝胶或固体(粉末)的形式。药剂可以无菌制备、包装在注射器中并冷藏运输。或者，它可以装在小瓶或其他容器中来储存。另一个容器可以装有无菌制备的其他药剂。或者，试剂盒可以包括预先混合并装运在注射器、小瓶、管或其他容器中的活性剂。试剂盒可以具有向动物施用药剂所需的一个或多个或全部组分，例如注射器、局部施用装置或iv注射针管和袋，尤其是在用于产生特定体细胞动物模型的试剂盒的情况下。[0096]在一些情况下，所述方法涉及用从可能含有非常低丰度的前病毒aav基因组的组织中分离的总细胞dna转染细胞，和补充辅助病毒功能(例如，腺病毒)以触发和/或加强aavrep和cap基因在转染细胞中的转录。在一些情况下，来自转染细胞的rna为cdna的rt-pcr扩增和新型aav的检测提供了模板。在用从可能含有前病毒aav基因组的组织中分离的总细胞dna转染细胞的情况下，通常需要向细胞补充促进aav基因转录的因子。例如，也可以用辅助病毒，例如腺病毒或疱疹病毒来感染细胞。在一个具体的实施方案中，辅助功能由腺病毒提供。腺病毒可以是野生型腺病毒，并且可以是人或非人来源，优选非人灵长类动物(nhp)来源。类似地，已知感染非人类动物(例如，黑猩猩、小鼠)的腺病毒也可用于本公开的方法中(参见，例如，美国专利号6,083,716)。除了野生型腺病毒之外，还可以使用携带必要辅助功能的重组病毒或非病毒载体(例如，质粒、附加体等)。此类重组病毒是本领域已知的并且可以根据公开的技术来制备。参见，例如，美国专利号5,871,982和美国专利号6,251,677，其描述了杂合ad/aav病毒。多种腺病毒毒株可以从美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection,manassas,va.)获得，或应请求从多种商业和机构来源获得。此外，许多此类毒株的序列可从多个数据库获得，包括例如pubmed和genbank。[0097]也可以用为aav提供辅助功能的载体(例如，辅助载体)转染细胞。提供辅助功能的载体可以提供腺病毒功能，包括，例如，e1a、e1b、e2a、e4orf6。提供这些功能的腺病毒基因的序列可以从任何已知的腺病毒血清型获得，例如血清型2、3、4、7、12和40，并且进一步包括本领域已知的任何目前鉴定的人类类型。因此，在一些实施方案中，所述方法包括用表达aav复制、aav基因转录和/或aav包装所必需的一种或多种基因的载体转染细胞。[0098]在一些情况下，新的分离的衣壳基因可用于使用本领域公知的方法构建和包装重组aav载体，以确定与所述基因编码的新的衣壳蛋白相关的功能性特征。例如，新的分离的衣壳基因可用于构建和包装包含报告基因(例如，b-半乳糖苷酶、gfp、荧光素酶等)的重组aav(raav)载体。然后可以将raav载体递送至动物(例如，小鼠)，并且可以通过检查报告基因在动物的多种组织(例如，心脏、肝脏、肾脏)中的表达来确定新的分离的衣壳基因的组织靶向特性。用于表征新的分离的衣壳基因的其他方法在本文中公开并且还有其他方法是本领域公知的。[0099]试剂盒可以具有多种形式，例如泡罩袋(blisterpouch)、收缩包裹袋(shrinkwrappedpouch)、真空密封袋、密封热成型托盘或类似的袋或托盘形式(其中附件松散地包装在袋内)、一个或多个管、容器、盒或袋中。可以在添加附件之后对试剂盒进行灭菌，从而允许容器中的各个附件以其他方式被打开。可以使用任何合适的灭菌技术对试剂盒进行灭菌，例如辐射灭菌、热灭菌或本领域已知的其他灭菌方法。根据具体应用，试剂盒还可以包括其他组件，例如，容器、细胞培养基、盐、缓冲液、试剂、注射器、针头、用于施加或去除消毒剂的织物(例如纱布)、一次性手套、在施用前对药剂的支持物等。[0100]试剂盒中包含的说明可以涉及用于检测细胞中潜在aav的方法。此外，本公开的试剂盒可以包含说明、阴性和/或阳性对照、容器、样品稀释剂和缓冲液、样品制备管和用于序列比较的参考aav序列的印刷或电子表格。[0101]实施例[0102]实施例1[0103]这个实施例描述了具有在光感受器中保留功能(例如，部分ush2a功能)的ush2a的14中任一项所示的序列的部分或由其组成。部分可以包含如seqidno:3-14中任一项所示的序列的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些实施方案中，本公开所述的核酸序列是核酸有义链(例如，5'至3'链)，或在病毒序列的上下文中是正( )链。在一些实施方案中，本公开所述的核酸序列是核酸反义链(例如，3'至5'链)，或在病毒序列的上下文中是负(-)链。[0112]等价物[0113]虽然在本文中已经描述和示出了本发明的多个实施方案，但是本领域的普通技术人员将容易地设想用于执行功能和/或获得本文中所述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且每个这样的变化和/或修饰均被认为在本发明的范围内。更通常地，本领域技术人员将容易理解，本文中所述的全部参数、尺寸、材料和构型是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本发明的教导的一个或多个具体应用。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施例的许多等价物。因此，应当理解，前述实施方案仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等价物的范围内，本发明可以以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本发明涉及本文中所述的每个单独的特征、系统、物品、材料和/或方法。此外，两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料和/或方法的任何组合，如果这样的特征、系统、物品、材料和/或方法不是相互矛盾的，则包括在本发明的范围内。[0114]在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”，除非明确指明相反，否则应理解为“至少一个”。[0115]说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为意指如此结合的要素中的“其中一个或两者”，即在一些情况下结合存在且在其他情况下不结合存在的要素。除了由“和/或”从句具体标识的元素之外，可以任选地存在其他要素，无论是否与具体标识的那些要素相关或不相关，除非明确指明相反。因此，作为非限制性示例，当与例如“包含”的开放式语言结合使用时，对“a和/或b”的引用在一个实施方案中可以指有a没有b(任选地包含除b之外的要素)；在另一个实施方案中，指有b没有a(任选地包含除a之外的要素)；在另一个实施方案中，指a和b两者(任选地包含其他要素)；等。[0116]如本文在说明书和权利要求中使用的，“或”应该理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分隔列表中的项时，“或”或“和/或”应解释为包含性的，即，包含大量要素或要素列表的至少一个，但也包含多于一个，并且任选地包含其他未列出的项。只有明确指明相反的术语，例如“仅一个”或“恰好一个”，或“由……组成”当用于权利要求书中时，将指包含大量要素或要素列表的恰好一个要素。通常，当前面有排他性术语，例如“要么”、“其中之一”、“仅其中之一”或“恰好其中之一”时，本文中所用的术语“或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即，“一个或另一个但不是两者”)。“基本上由……组成”在用于权利要求书中时，应具有其在专利法领域中的普通含义。[0117]如本文在说明书和权利要求中所使用的，短语“至少一个”在指代一个或多个要素的列表时，应理解为意指选自要素列表中的一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括要素列表中具体列出的各个和每个要素的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任何组合。这个定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表中具体标识的要素之外的要素可以任选地存在，无论与具体标识的那些要素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，“a和b的至少一个”(或等价地，“a或b的至少一个”，或等价地“a和/或b的至少一个”)在一个实施方案中可以指至少一个，任选地包括多于一个，a，而不存在b(并且任选地包含除b之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个，b，而不存在a(并且任选地包含除a之外的要素)；在另一个实施方案中，指至少一个，任选地包括多于一个，a，和至少一个，任选地包括多于一个，b(和任选地包括其他要素)；等。[0118]在权利要求书以及上述说明书中，所有过渡短语，例如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”等应理解为是开放式的，即，意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述，只有过渡短语“由……组成”和“基本上由……组成”应分别是封闭的或半封闭的过渡短语。[0119]在权利要求书中使用例如“第一”、“第二”、“第三”等顺序术语来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一权利要求要素的任何优先性、居先性或顺序，或方法的行为进行的时间顺序，而是仅用作标记以将具有特定名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一个要素(但用于顺序术语)区分开来以区分权利要求要素。[0120]数值前面的术语“约”和“基本上”代表所述数值的±10％。当前第1页12当前第1页12
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