利用染料木黄铜增强AAV介导的基因表达的方法与流程

利用染料木黄铜增强aav介导的基因表达的方法
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种利用染料木黄铜增强aav介导的基因表达的方法。


背景技术：

2.细胞治疗作为癌症治疗的新型手段，已经显示出其独有的优势和特点。免疫细胞作为细胞治疗的重要功能细胞，包括淋巴细胞、抗原提呈细胞、粒细胞以及其他参与免疫应答和效应的细胞。在2017年，美国食品药品监督管理局(fda)，批准了两个car-t细胞产品上市，使得t淋巴细胞成为细胞治疗药物的热点目标改造细胞。t淋巴细胞作为主要免疫细胞，可以识别apc提呈的相关抗原，进而活化和增值，最终分化为效应细胞，杀伤表达特异性抗原的靶细胞。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)t细胞疗法，是指通过基因编辑手段，人工使t淋巴细胞携带一个可以识别靶细胞的抗原，进而可以高效特异性的杀伤和识别目标细胞。
3.腺相关病毒(aav)，目前作为对t淋巴细胞进行基因编辑的主要载体之一，如何提高aav对t淋巴细胞的编辑效率，一直是科学家关注的方向。aav来源于细小病毒，具有自然缺陷、无包被和无致病原性等特点。其基因组是由一个4680个核苷酸，线性、单链dna(ssdna)分子组成，在每个末端含有一个145个碱基组成的末端重复序列(itr)。然而，大多数aav对t细胞的转导效率都极低，目前研究发现aav6对t细胞有相对高的趋向性，但也需要比较高的感染复数(moi)才能获得有效转导。当aav进入t细胞后，会受到酪氨酸激酶的影响，抑制其第二条链的合成，最终影响目的蛋白的表达，所以，aav对t细胞相对低下的转导效率限制了其在t细胞免疫治疗中的应用。
4.所以，显著亟需一种能提高aav介导的基因在t淋巴细胞中表达的方法。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种利用染料木黄铜增强aav介导的基因表达的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用染料木黄铜增强aav介导的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：
7.1)制备重组质粒；
8.2)利用步骤1)得到的重组质粒制备重组bacmid；
9.3)利用步骤2)得到的重组bacmid制备杆状病毒；
10.4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组raav病毒，然后进行纯化；
11.5)在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4)得到的纯化后的重组raav病毒转染t淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与t淋巴细胞共孵育，然后用重组raav病毒转染t淋巴细胞。
12.优选的是，所述步骤1)包括：分别制备pfastbacdual-itr-incap6质粒、pfastbacdual-itr-egfp质粒和pfastbacdual-inrep质粒。
13.优选的是，所述步骤2)中，分别利用步骤1)得到的三种质粒，按以下步骤分别制备三种重组bacmid：
14.2-1)在冰上缓慢融化100μl dh10bac感受态细胞于容器中；
15.2-2)向上述容器中加入50ng步骤1)获得的三种质粒中的一种，轻轻混匀；
16.2-3)将容器在冰上放置30min，42℃热休克90s，立即转入冰上放置2min；
17.2-4)再向容器中加入900μl soc培养基，37℃225rpm离心4h，取沉淀，重悬得到菌液；
18.2-5)在含50μg/ml kan、7μg/ml gen、10μg/ml tet的预制的90mm琼脂板中央滴加40μl浓度为20mg/ml的blue-gal和7μl浓度为200mg/ml的iptg，得到琼脂培养板；然后使用无菌涂布器将步骤2-4)获得的菌液分散涂布于琼脂培养板整个表面，于室温孵育直至全部液体消失；
19.2-6)将步骤2-5)获得的细胞用soc培养基按10倍梯度稀释细胞得到若干组细胞悬浮液，每个梯度取100μl涂布在新的琼脂培养板上，在37℃放置48h；
20.2-7)挑取若干个白斑，蘸取到新的琼脂培养板上，37℃过夜；接种到lb液体培养基中，lb液体培养基含50μg/ml kan、7μg/ml gen、10μg/ml tet；
21.2-8)4℃放置过夜；
22.2-9)对白斑进行pcr鉴定，以判断是否为重组bacmid菌种；
23.2-10)取出鉴定正确的重组bacmid菌种，按照1:300的比例接种于3ml lb液体培养基中摇菌12h；再然后按照1:100的比例接种于150ml lb液体培养基中摇菌16h；然后采用质粒提取试剂盒抽提重组bacmid，以备转染细胞制备杆状病毒。
24.优选的是，所述步骤2-9)中，pcr鉴定重组bacmid菌种采用的引物对为：
25.上游引物：5
’-
ccc agt cac gac gtt gta aaa cg-3’，
26.下游引物：5
’-
gct cta gat tac ttg tac agc tcg tcc at-3’。
27.优选的是，所述步骤3)具体包括：
28.3-1)培养sf9细胞；
29.3-2)确保细胞密度在1.5～2.5
×
106cells/ml时，加2ml无抗生素和血清的grace培养基到六孔板中，然后接种8
×
105cells/ml步骤1)得到中的sf9细胞到该六孔板中，让细胞室温贴壁15min；
30.3-3)配制转染试剂：
31.a)将步骤2)得到的重组bacmid在70℃水浴里面温浴20min，12000g离心10min取上清液；
32.b)取5μl步骤a)得到的上清液加入到95μl不含抗生素和血清的grace培养基中，轻轻混匀；
33.c)混匀cellfectinⅱ，加入8μl cellfectinⅱ到92μl不含抗生素和血清的grace培养基中，涡旋混匀；
34.d)将步骤b)和c)得到的两溶液混匀，室温孵育30min，得到dna-lipid混合物；
35.3-4)滴加上述步骤d)得到的dna-lipid混合物到步骤3-2)制备的铺有sf9细胞的六孔板的孔中，27℃孵育细胞5h；
36.3-5)移去六孔板中的培养基，换2ml完全培养基；
37.3-6)在27℃孵育72h，观察杆状病毒感染迹象；
38.3-7)分离p1:证实细胞处于晚期感染阶段后，每孔收集2ml含杆状病毒的培养基到无菌的15ml离心管中，1000g离心5min去除细胞碎片；上清经0.22μm滤器过滤到无菌的15ml离心管中，得到p1，4℃避光保存；
39.3-8)利用p1扩增杆状病毒，备用。
40.优选的是，所述步骤3-8)具体包括：
41.3-8-1)将sf9细胞按2
×
106cells/孔铺六孔板中；
42.3-8-2)每孔加入适量的由步骤3-7)制得的p1，27℃培养48h～72h；
43.3-8-3)每孔收集2ml含杆状病毒的培养基于无菌的15ml离心管中，1000g离心5min；
44.3-8-4)转移上清到无菌的15ml离心管中，该病毒上清为扩增后得到的p2，4℃避光保存，备用。
45.优选的是，所述步骤4)具体包括：
46.通过上述步骤1)-3)得到了三种杆状病毒，将三种杆状病毒共同感染昆虫细胞sf9，包装获得重组raav病毒，然后采用cscl密度梯度离心的方法纯化；
47.采用荧光定量pcr检测重组raav病毒的滴度，采用sds-page检测重组raav病毒的纯度。
48.优选的是，所述步骤5)具体包括：
49.5-1)配制染料木黄铜试剂：称取25mg染料木黄铜溶于92ul的dmso中，保存备用；
50.5-2)采用pbmc分离方法制备pbmc细胞；
51.5-3)t淋巴细胞培养：
52.将步骤5-2)制得的pbmc细胞用rpmi-1640细胞培养基重悬于t25培养瓶中，置于37℃5％co2恒温培养箱，隔48h全量换液，培养得到t淋巴细胞，备用；
53.其中，rpmi-1640细胞培养基中包括质量分数为10％胎牛血清、质量分数1％的青霉素和链霉素双抗，以及浓度为50ng/ml的okt3、50ng/ml的cd28、300u/ml的il-2；
54.5-4)将步骤5-1)得到的染料木黄铜试剂与步骤5-3)得到的t淋巴细胞共孵育2h，然后用完全培养基洗涤两次，最后用步骤4)得到的重组raav病毒转染t淋巴细胞，培养72h。
55.本发明的有益效果是：本发明提供的利用染料木黄铜增强aav介导的基因表达的方法，通过利用染料木黄铜(genistein)的酪氨酸激酶抑制剂的特点，将其与aav介导的基因治疗联合起来使用，显著提高了aav介导的基因在t淋巴细胞的表达效果。
附图说明
56.图1为本发明的实施例1中的sds-page电泳检测raav纯度的结果；
57.图2为本发明的实施例2中的不同染料木黄铜试剂浓度下，促进aav介导的基因在t淋巴细胞的表达的荧光显微镜观察结果；
58.图3为本发明的实施例2中的不同染料木黄铜试剂浓度下，促进aav介导的基因在t淋巴细胞的表达的流式分析结果；
59.图4为本发明的实施例3中的不同染料木黄铜试剂处理时间下，对aav介导的基因在t淋巴细胞的表达的荧光显微镜观察结果；
60.图5为本发明的实施例3中的不同染料木黄铜试剂处理时间下，对aav介导的基因在t淋巴细胞的表达的流式分析结果。
具体实施方式
61.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
62.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
63.本实施例提供了一种利用染料木黄铜增强aav介导的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：
64.1)制备重组质粒；
65.2)利用步骤1)得到的重组质粒制备重组bacmid；
66.3)利用步骤2)得到的重组bacmid制备杆状病毒；
67.4)利用步骤3)得到的杆状病毒制备重组raav病毒，然后进行纯化；
68.5)在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4)得到的纯化后的重组raav病毒转染t淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与t淋巴细胞共孵育，然后用重组raav病毒转染t淋巴细胞。
69.染料木黄铜(genistein)是一种大豆来源的异黄酮和植物雌激素，具有抗肿瘤活性。同时还是一种酪氨酸激酶抑制剂，可以明显的抑制酪氨酸激酶的活性，本发明基于染料木黄铜的特性，提供的方法有效提高了aav介导的基因表达效率。
70.以下提供更为具体的实施例，以对本发明做进一步说明。
71.实施例1
72.一种利用染料木黄铜增强aav介导的基因表达的方法，该方法包括以下步骤：
73.1、制备重组质粒
74.分别制备pfastbacdual-itr-incap6质粒、pfastbacdual-itr-egfp质粒和pfastbacdual-inrep质粒：
75.a.pfastbacdual-itr-incap6的制备
76.质粒包含aav2 cap基因、intron序列，其表达受pfastbacdual质粒载体上的p10启动子和hsv tk polya元件调控，由实验室构建保存。其制备方法按照现有技术，本实施例中按照以下方法获得：参考文献：李泰明等，昆虫细胞制备aav-itr基因表达微载体，生物工程学报，2015,31(8)，1232页，1.2.2方法中的“构建pfastbacdual-incap质粒”。
77.b.pfastbacdual-itr-egfp的制备
78.pfastbacdual-itr-egfp质粒包含aav2的两个itr和cmv启动子、beta-globin内含子、编码egfp基因、hgh polya序列，由实验室构建保存。其制备方法按照现有技术，本实施例中按照以下方法获得：参考文献：李泰明等，昆虫细胞制备aav-itr基因表达微载体，生物工程学报，2015,31(8)，1232页，1.2.1方法中的“构建pfastbacdual-itr-egfp质粒”。
79.c.pfastbacdual-inrep质粒的制备
80.pfastbacdual-inrep质粒包含aav2 rep基因、intron序列，其表达受pfastbacdual质粒载体上的p10启动子和hsv tk polya元件调控，由实验室构建保存。其制备方法按照现有技术，本实施例中按照以下方法获得：参考文献：李泰明等，昆虫细胞制备
aav-itr基因表达微载体，生物工程学报，2015,31(8)，1232页，1.2.2方法中的“构建pfastbacdual-inrep质粒”。
81.2、利用步骤1得到的重组质粒制备重组bacmid；
82.分别利用步骤1)得到的三种质粒，按以下步骤分别制备三种重组bacmid：
83.2-1)在冰上缓慢融化100μl dh10bac感受态细胞于容器中；
84.2-2)向上述容器中加入50ng步骤1)获得的三种质粒中的一种，轻轻混匀；
85.2-3)将容器在冰上放置30min，42℃热休克90s，立即转入冰上放置2min；
86.2-4)再向容器中加入900μl soc培养基，37℃225rpm离心4h，取沉淀，重悬得到菌液；
87.2-5)在含50μg/ml kan、7μg/ml gen、10μg/ml tet的预制的90mm琼脂板中央滴加40μl浓度为20mg/ml的blue-gal和7μl浓度为200mg/ml的iptg，得到琼脂培养板；然后使用无菌涂布器将步骤2-4)获得的菌液分散涂布于琼脂培养板整个表面，于室温孵育直至全部液体消失；
88.2-6)将步骤2-5)获得的细胞用soc培养基按10倍梯度稀释细胞得到若干组细胞悬浮液(10-1
，10-2
，10-3
)，每个梯度取100μl涂布在新的琼脂培养板(同步骤2-5制备的琼脂培养板)上，在37℃放置48h；
89.2-7)挑取10个白斑，蘸取到新的琼脂培养板同步骤2-5制备的琼脂培养板)上，37℃过夜；接种到lb液体培养基中，进行显色反应，lb液体培养基含50μg/ml kan、7μg/ml gen、10μg/ml tet；
90.2-8)4℃放置过夜，使蓝色在这一期间充分显色；
91.2-9)对白斑进行pcr鉴定，以判断是否为重组bacmid菌种；
92.在一种实施例中，该步骤2-9)中，使用omega试剂盒抽提分离重组的杆粒dna，实验方法参照试剂盒说明书，测量杆粒浓度后分装后冻于
–
20℃，避免反复冻融；pcr鉴定重组bacmid菌种采用的引物对为：
93.上游引物：5
’-
ccc agt cac gac gtt gta aaa cg-3’，
94.下游引物：5
’-
gct cta gat tac ttg tac agc tcg tcc at-3’。
95.2-10)取出鉴定正确的重组bacmid菌种，按照1:300的比例接种于3ml lb液体培养基中摇菌12h；再然后按照1:100的比例接种于150ml lb液体培养基中摇菌16h；然后采用大型/大量质粒提取试剂盒抽提重组bacmid，以备转染细胞制备杆状病毒。
96.3、利用步骤2得到的重组bacmid制备杆状病毒；
97.3-1)培养sf9细胞：sf9细胞提前一天铺六孔板，50％的孔密度，使用完全培养基，95％存活度；
98.3-2)确保细胞密度在1.5～2.5
×
106cells/ml时，加2ml无抗生素和血清的grace培养基到六孔板中，然后接种8
×
105cells/ml步骤1)得到中的sf9细胞到该六孔板中，让细胞室温贴壁15min；
99.3-3)配制转染试剂：
100.a)将步骤2)得到的重组bacmid在70℃水浴里面温浴20min，12000g离心10min取上清液；
101.b)取5μl步骤a)得到的上清液(杆状病毒质粒浓度500ng/μl，保证杆状病毒质粒的
量为2～3μg)加入到95μl不含抗生素和血清的grace培养基中，轻轻混匀；
102.c)混匀cellfectinⅱ，加入8μl cellfectinⅱ到92μl不含抗生素和血清的grace培养基中，涡旋混匀；
103.d)将步骤b)和c)得到的两溶液混匀，室温孵育30min，得到dna-lipid混合物；
104.3-4)滴加上述步骤d)得到的dna-lipid混合物到步骤3-2)制备的铺有sf9细胞的六孔板的孔中，27℃孵育细胞5h；
105.3-5)移去六孔板中的培养基，换2ml完全培养基；
106.3-6)在27℃孵育72h，观察杆状病毒感染迹象；
107.3-7)分离p1:证实细胞处于晚期感染阶段后，每孔收集2ml含杆状病毒的培养基到无菌的15ml离心管中，1000g离心5min去除细胞碎片；上清经0.22μm滤器过滤到无菌的15ml离心管中，得到p1，4℃避光保存；若想长期保存，分装冻于
–
80℃；
108.3-8)利用p1扩增杆状病毒，备用。
109.3-8-1)将sf9细胞按2
×
106cells/孔铺六孔板中；室温放置1h使其贴附，显微镜下观察；
110.3-8-2)每孔加入适量的由步骤3-7)制得的p1，27℃培养48h～72h；
111.3-8-3)每孔收集2ml含杆状病毒的培养基于无菌的15ml离心管中，1000g离心5min；
112.3-8-4)转移上清到无菌的15ml离心管中，该病毒上清为扩增后得到的p2，4℃避光保存，备用；若想长期保存，分装冻于
–
80℃。
113.再按上述方法扩增得到p3(通常得到的p1病毒滴度在1
×
106～1
×
107之间，p2滴度在1
×
107～1
×
108之间)。
114.本实施例中，采用噬菌斑法测定病毒滴度，详细实验步骤如下：
115.(1)按2ml/孔细胞(5
×
105cells/ml)种入6孔板，室温孵育1h使其贴壁，孵育后镜检其贴壁程度；
116.(2)将4％agarose gel放入70℃水浴锅融解，将2
×
grace与一个100ml无菌瓶放入40℃水浴锅预热；
117.(3)将杆状病毒用无血清supplemented grace进行梯度稀释：10-1
～10-8
；
118.(4)弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒，1ml/孔(复孔)室温孵育1h。
119.(5)配置上层琼脂：加20ml高温灭活fbs到2
×
grace 100ml培养基中，然后从该2
×
grace 100ml培养基中，然后从该培养基中取25ml加入到至预热的100ml无菌瓶，无菌瓶再加入12.5ml无菌水、12.5ml 4％agarose gel，轻轻混匀，得到上层琼脂，放入37℃水浴锅备用；
120.(6)弃6孔板内上清，快速加2ml上层琼脂，以防菌层干燥，静置10～20min使其凝固；将6孔板放入27℃培养箱，培养5天；
121.(7)配制1mg/ml中性红溶液，在grace完全培养基中，无菌过滤。
122.(8)将1.5ml的中性红溶液、16.5ml grace完全培养基、6ml 4％的琼脂配制成中性红上层琼脂；
123.(9)在病毒感染4天后，加1ml中性红上层琼脂；
124.(10)继续放到培养箱中，4～5天后即可观察噬菌斑，计数噬菌斑的数量，求得病毒
滴度。注：病毒滴度(pfu/ml)＝1/稀释倍数
×
噬菌斑数
×
1/每孔接种体积
125.4、利用步骤3得到的杆状病毒制备重组raav病毒，然后进行纯化：
126.通过上述步骤1-3得到了三种杆状病毒，将三种杆状病毒共同感染昆虫细胞sf9，包装获得重组raav病毒，然后采用cscl密度梯度离心的方法纯化，得到高浓度的重组raav病毒；
127.采用荧光定量pcr检测重组raav病毒的滴度；
128.采用sds-page检测重组raav病毒的纯度，检测结果如图1所示，其中，a为：raav6-cmv-egfp；b为：raav6-s663l-cmv-egfp；c为：raav6-s663l-gfap-egfp。
129.5、在染料木黄铜的促进作用下，利用步骤4)得到的纯化后的重组raav病毒转染t淋巴细胞：先将染料木黄铜试剂与t淋巴细胞共孵育，然后用重组raav病毒转染t淋巴细胞。
130.具体包括：
131.5-1)配制染料木黄铜(genistein)试剂：称取25mg染料木黄铜溶于92ul的dmso中，保存备用；
132.5-2)采用pbmc分离方法制备pbmc细胞；
133.本实施例中，具体方法为：
134.取新鲜抗凝全血(edta、枸橼酸钠或肝素抗凝均可)或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者pbs稀释全血；
135.在离心管中加入适量分离液(当稀释后血液体积小于3ml时，加入3ml分离液；当稀释后血液体积大于等于3ml，加入等体积分离液，但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果)，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰(可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象)；
136.室温，水平转子500～1000g，离心20～30min(血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，离心转速最大不超过1200g)；离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞；
137.小心的吸取白膜层细胞到15ml洁净的离心管中，用10ml pbs或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞；250g，离心10min；弃上清，用5ml的pbs或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min；弃上清，细胞重悬，得到pbmc细胞，备用。
138.5-3)t淋巴细胞培养：
139.将步骤5-2)制得的pbmc细胞用rpmi-1640细胞培养基重悬于t25培养瓶中，置于37℃5％co2恒温培养箱，隔48h全量换液，培养得到t淋巴细胞，备用；
140.其中，rpmi-1640细胞培养基中包括质量分数为10％胎牛血清、质量分数1％的青霉素和链霉素双抗，以及浓度为50ng/ml的okt3、50ng/ml的cd28、300u/ml的il-2；
141.5-4)将步骤5-1)得到的染料木黄铜试剂与步骤5-3)得到的t淋巴细胞共孵育2h，然后用完全培养基洗涤两次，最后用步骤4)得到的重组raav病毒转染t淋巴细胞，培养72h。
142.72h后利用荧光显微镜观察egfp蛋白的表达情况。
143.利用流式细胞仪分析egfp荧光表达百分比和强度：流式细胞分析时细胞处理方法
如下：
144.1)直接吸取细胞，250g离心5min，收集细胞；
145.2)用pbs洗涤两次，去上清；
146.3)ep管中加入500ul pbs，轻轻贴壁吹打润洗细胞后将细胞液转入流式管中，准备上机分析。
147.通过荧光显微镜观察和流式分析发现，染料木黄铜(genistein)促进了aav介导的基因在t淋巴细胞的表达。
148.实施例2
149.不同染料木黄铜(genistein)试剂浓度下，aav介导的基因在t淋巴细胞的表达实验。
150.设置不同的染料木黄铜(genistein)试剂浓度(0.03um,0.1um,,0.3um,0.5um)，按上述所述转染方法将t淋巴细胞先用不同浓度的染料木黄铜(genistein)试剂处理2h，然后用重组raav病毒转染细胞，72h后利用荧光显微镜观察egfp蛋白的表达情况，利用流式细胞仪分析egfp荧光表达百分比，调控结果与单转染aav的结果比较。
151.参照图2和图3，通过荧光显微镜观察和流式分析发现，在试剂低浓度时(0.03um)，增强效果就已经很明显说明，在浓度达到0.1um时达到最高。说明染料木黄铜(genistein)试剂可以促进aav介导的基因在t淋巴细胞的表达。超过0.1um时，表达受到抑制，主要是由于染料木黄铜具有一定的毒性。图2和图3中，aav-egfp为单转染aav的结果(未采用染料木黄铜)。
152.实施例3
153.不同染料木黄铜(genistein)试剂处理时间下，aav介导的基因在t淋巴细胞的表达实验。
154.设置不同的染料木黄铜(genistein)试剂处理细胞的时间(0.5h，1h，2h)，按上述所述转染方法将t淋巴细胞先用染料木黄铜(genistein)试剂处理不同的时间，然后用重组raav病毒转染细胞，72h后利用荧光显微镜观察egfp蛋白的表达情况，利用流式细胞仪分析egfp荧光表达百分比，调控结果与单转染aav的结果比较。
155.参照图4和图5，通过荧光显微镜观察和流式分析发现，在处理时间为0.5h时(0.03um)，增强效果不是很明显，在处理时间1h时增强效果最明显2h时略有下降。说明染料木黄铜(genistein)试剂可以促进aav介导的基因在t淋巴细胞的表达。超过2h时，表达受到抑制，主要是由于染料木黄铜具有一定的毒性。图4和图5中aav-egfp/aav-egfp only为单转染aav的结果(未采用染料木黄铜)。
156.尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。