可用于促进产奶的组合物和方法

可用于促进产奶的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年4月23日提交的美国临时专利申请第62/837,590号的优先权权益，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
3.通过引用并入作为文本文件提供的序列表
4.序列表在本文中作为于2019年2月15日创建并且大小为130kb的文本文件ucsc-383prv2 seq list_st25.txt提供。文本文件通过引用整体并如本文。


背景技术：

5.哺乳动物的乳腺或乳房是负责产奶的动态上皮器官1。乳腺从位于乳头处的原基开始，在出生后响应于青春期产生的激素信号发育，从而形成分支到下面的基质脂肪垫的导管结构。每个导管都是双层的，包括外层的基底细胞/肌上皮细胞(在本文中被称为bc)和内层的腔细胞(在本文中被称为lc)。腔细胞可以进一步细分为两个亚群：包围内腔的导管亚群和在妊娠期间产生产奶乳腺泡的乳腺泡亚群(图1a)。一旦后代脱离母乳，乳腺就会在被称为退化的过程中重塑到其孕前状态。乳腺泡细胞亚群内有乳腺泡祖细胞(avp)。目前认为，妊娠期间乳腺泡的产生是由乳腺泡祖细胞分化为产奶乳腺泡细胞(av)引起的。
6.notch是调节干/祖细胞维持和命运决定的主要信号传导途径。notch受体有四种：notch1、notch2、notch3和notch4——所有这些受体都在乳腺中表达2。在乳腺发育期间，notch信号传导以牺牲基底细胞命运为代价促进腔细胞命运
3-6
。另外，抑制notch4活性似乎是乳腺泡扩张和分化所必需的，因为研究结果表明组成性活性notch4胞内结构域(icd)的过表达大大减少了乳腺泡发育
7-9
。这表明必须在乳腺泡祖细胞中抑制通过notch4的信号传导，以使其分化为乳腺泡细胞。
7.环岛(robo)受体是参与许多发育过程的保守免疫球蛋白(ig)超家族成员。其与被称为slit(例如乳腺中的slit2和slit3)的保守的、分泌的糖蛋白细胞外基质配体家族结合，所述配体家族在整个乳腺上皮中表达(图1b)
10,11
。此信号传导系统已被证明调节鼠类神经系统和果蝇肠道中的细胞命运决定
12,13
。


技术实现要素：

8.为了在每次妊娠时供应母乳，需要显著加速的细胞生长和分化。本文公开了通过用影响去抑制信号传导回路的药剂进行处理由此robo2抑制robo1进而抑制notch4活化来促进加速的细胞生长和分化的方法。robo1在原始乳腺的bc和lc两者上表达，但在妊娠期间在lc中上调。robo2表达仅限于腔细胞的子集。本文首次公开了以下发现：robo1基因的丢失(或缺失)导致对乳腺乳腺泡分化的抑制。这已经在hc11细胞泌乳模型和体内乳腺两者中得到证实。robo2的丢失(或缺失)在两种模型中产生致相反的表型——即更大的乳腺乳腺泡分化。robo1已被证明与notch4特异性结合并抑制其信号传导。robo2已被证明与robo1特异性结合并阻止robo1抑制notch4。robo1与robo2之间的相互作用通过slit2增强。本文公开了robo1受体片段，其包括抑制notch4信号传导的robo1胞外结构域的部分。本文所公开的
实验证明，slit/robo信号传导通过管理notch4活化和控制分化为产奶乳腺泡细胞的乳腺泡祖细胞的数量来调节乳腺乳腺泡产生。
9.提供了用于促进哺乳动物产奶的方法、药剂和组合物。可用于促进产奶的药剂可以包含抑制notch4活性的药剂。药剂可以是可溶性robo1胞外结构域，或者药剂可以通过与robo2结合和/或通过与notch4结合来抑制notch4活性。药剂可以通过与robo1竞争不与robo2结合来抑制notch4，由此使robo1可用于抑制notch4活性。药剂可以是抑制notch4活性的抗notch4抗体。药剂可以是抑制notch4的表达的rnai构建体。药剂可以是抑制robo2的表达的rnai构建体。本文还提供了转基因哺乳动物，所述转基因哺乳动物被基因修饰以表达可溶性robo1胞外结构域；抑制robo2的表达；和/或抑制notch4的表达。还提供了通过施用本文所公开的药剂中的一种或多种药剂来促进此类转基因哺乳动物产奶的方法。
附图说明
10.图1：robo1表达。(a)包括基底(肌上皮和干)细胞(bc)、腔乳腺泡祖细胞(avp)和乳腺泡(av)细胞的双层乳腺泡的草图。(b)slit/robo1的草图。(c)原始和pd18腔祖细胞(lp)、成熟腔细胞(ml)和基底细胞(bc)中robo1的rt-qpcr示出在妊娠期间腔细胞(lc)上调(n＝3)。(d-g)成熟原始导管(d，e)和pd16乳腺泡(f)的腔细胞亚群(箭头)中的robo1免疫组织化学(d)或β-半乳糖苷酶(lacz)染色(e)。robo1也在pd16(f)和泌乳日(ld3)(g)乳腺泡的基底细胞(箭头)中表达。(sem，t测试p《0.01)。
11.图2：robo1增强乳腺泡产生。(a)hc11分化方案的草图表示。(b)与scr、敲低(kd)(箭头)hc11细胞相比，在地塞米松(1μg/ml)、胰岛素(5μg/ml)和催乳素(prl，5μg/ml)(dip培养基)中分化(dif)后8天，robo1中的圆顶形成减少
14
。圆顶形成通过robo1过表达(o/e)挽救。无差异条件下(undif)可忽略的圆顶形成。相对于scr对照归一化的rt-qpcr示出robo1敲低后robo1和wap减少(n＝3)。(c，d)pd18 robo1 wt和ko完整乳腺的代表性h&e染色切片(c)和对侧移植的生长物(d)，其中图表示出乳腺泡面积减少(10个图像，n＝3)。(e)相对于robo1 / ，rt-qpcr示出了ld1 robo1-/-乳腺中的乳基因表达降低(n＝3)。(f)针对wap免疫染色的pd18 robo1 / 、robo1-/-乳腺的代表性免疫组织化学和图表(n＝10个图像，n＝1)。(g)妊娠第18天对侧移植的robo1 wt/ko生长物中plin2和sma的代表性免疫组织化学，其中图表示出ko中的plin2强度降低(10个图像，n＝3)。(h)对侧移植妊娠第18天robo1 wt/ko生长物的cubic方法elf5和cdh1免疫组织化学，其中图表示出elf5强度降低(10个图像，n＝1)。(i)通过监测幼崽体重来测量产奶量的测定的草图表示。(j)当前数据示出了由robo1-/-母畜喂养的幼崽的幼崽体重增益减少(n＝2)。(sem，**p《0.01，***p《0.001)。
12.图3：robo1通过直接相互作用调节notch4的活化。(a)robo1调节的基因hey1的基因组浏览器快照，其中robo1 / 和robo1-/-腔祖细胞(lp)样品的rna-seq读段覆盖被绘制为直方图(n＝3)。(b，c)对robo1调节的基因表达的rt-qpcr验证示出，notch效应基因在相对于wt(b)(n＝3)归一化的robo1 ko 1
°
乳腺泡祖细胞(avp)和相对于对照(scr)细胞(c)(n＝3)归一化的robo1敲低hc11细胞中增加。(d)rt-qpcr示出，与原始乳腺(n＝3)相比，从妊娠期收获的avp中notch效应基因hey1和hes1的表达显著降低。(e)gsi处理挽救了robo1敲低(kd)hc11细胞中减少的圆顶形成(n＝3)。(f)gsi处理(sir1 gsi)挽救了robo1敲低(sir1)hc11细胞中降低的wap和lalba表达。notch4敲低(sin4)增加了wap和lalba表达，
notch4和robo1的双重敲低(dkd)也是如此(n＝1)。(g)robo1减少了hc11圆顶形成，这一结果可以通过notch4和robo1/notch4双重敲低(dkd)的敲低来挽救(n＝2)。(h)内源性robo1与notch4共免疫沉淀，但不与mda-mb-231细胞裂解物中的notch1共免疫沉淀(n＝3)。(i-k)细胞分级蛋白质印迹(i)和定量示出了robo1敲低(sin4)分化的hc11细胞的细胞核部分中的notch4胞内结构域(n4-icd)(j)和hes1(k)增加。robo1过表达(sir1 r1o/e)和gsi处理(sir1 gsi)挽救了效果(n＝3)。(l)与未分化(undif)的hc11细胞(n＝1)相比，分化的(dif)细胞中robo1和pstat5增加，但notch4胞内结构域(n4-icd)减少。(m)内源性notch4与来自分化的(dif)和后期致敏的(-egf)hc11细胞的robo1共免疫沉淀。slit似乎不影响分化的hc11细胞中的复合物形成，但是在后期(-egf)致敏的细胞中观察到复合物减少。从早期致敏的细胞( egf)开始或当使用对照igg时(n＝1)，没有robo1/notch4复合物沉淀。(sem，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
13.图4：经facs纯化的robo1-/-avp菌落较小并且很少/不表达wap：(a)在基质胶中用rho激酶抑制剂y-27632(10μm，tocris公司)、nrg1(100ng/ml，r&d公司)、r-脊椎蛋白1(600ng/ml，r&d公司)、催乳素(5μg/ml，nhpp公司)培养5天的robo1-/-经facs纯化的乳腺泡祖细胞(avp)比robo1 / avp小，并且几乎不表达wap(n＝2)。(b)与原代(1
°
)腔上皮细胞robo1 / 相比，robo1-/-的细胞核中的notch4 icd(n4-icd)的水平增加。(n＝2)。(c)通过用γ-分泌酶(gsi)抑制剂处理robo1 / 和robo1-/-小鼠来测试notch抑制的测定的草图表示。(d)从用媒剂或gsi处理的robo1 / 和robo1-/-小鼠中收集的经facs纯化的avp的数量。(n＝3)。(e)fac纯化的avp的rt-qpcr示出了robo1 / 乳腺泡祖细胞(avp)中的hey1、hes1表达降低，从而表明gsi抑制了notch信号传导。与robo1 / 细胞相比，robo1-/-细胞中的hey1、hes1表达增加并且elf5表达降低，这种效应通过gsi处理挽救(n＝1)。(sem，***p《0.001)。
14.图5：robo2抑制乳腺泡产生。(a)分化三天后通过robo2敲低增加圆顶形成和wap表达(箭头)，这种表型通过robo1和2双敲低(dkd)挽救，(b)dp16 robo2 wt和ko乳腺的代表性h&e染色切片。完整robo2-/-乳腺和移植的robo2-/-生长物中乳腺泡的定量示出，与robo2 / 组织相比，robo2-/-中的乳腺泡面积增加(n＝10个图像，n＝1)。(c)相对于robo2 / 对照归一化的robo2-/-乳腺(mg)中乳汁(顶部)和notch效应(底部)基因的rt-qpcr。(d)β-半乳糖苷酶(lacz)染色示出了dp16乳腺泡的腔细胞子集(顶部)和来自退休繁育者的导管中的基底细胞子集(底部)中的robo2。(e)经facs纯化的乳腺上皮细胞亚群中的robo2和robo1的rt-qpcr。robo1表达在所有种群中发生，而robo2表达仅限于乳腺泡祖细胞(avp)和基底(bc)细胞，(f)草图模型示出robo2抑制robo1，从而允许notch4(n)活化减少乳腺泡分化(左)。robo1胞外结构域(ecd)结合robo2，从而释放robo1，然后抑制notch4，和/或ecd结合并直接抑制notch4；这两种情景都促进了差异化。表示针对项目生成的不同构建体的ecd的分图(右)。(g)hek293裂解物中robo2与robo1共免疫沉淀的内源性水平和共免疫沉淀通过slit2/slit3处理增强，*是robo2，#是糖基化robo2(n＝1)。(sem，n＝3，*p《0.05)。
15.图6：robo1胞外结构域。(a)示出robo1胞外结构域(ecd)分图的结构域结构的草图(b)robo1 ecd和对照dcc ecd在过表达质粒构建体的hek细胞的裂解物和条件培养基中的蛋白质印迹。(c)在不存在和存在肝素(300ng/ml)的情况下从过表达robo-ig5的hek细胞分泌的robo1-ig5的培养基的斑点印迹测定(左)和定量(右)。肝素适度地增加分泌(n＝1)。
(d)在不存在和存在肝素(300ng/ml)的情况下裂解物滴定的蛋白质印迹显示没有蛋白质降解。(e)hc11圆顶形成测定显示，ecd robo1-ig2和robo1-ig5的功能在存在肝素的情况下减弱(n＝1)。(f)使用robo1-ecto和过表达robo2的细胞(顶部，绿色)和过表达dcc的细胞(底部，绿色)的ecd结合测定。robo1-ecto-ha(红色)与robo2结合，但不与dcc结合。
16.图7：robo1胞外结构域增强分化。(a)在不存在和存在robo1-ecto处理的情况下hc11细胞的代表性相位对比(顶部)和bodipy 493/503染色(底部)。(c-g)测量robo1 ecd对hc11分化的影响的滴定测定显示，随着ecd浓度的增加，robo1-ecd使hc11圆顶形成增加，而不是dcc-ecd(除非另有说明，否则n＝3)。(h)测量牛robo1-ig5对hc11分化的影响的滴定测定显示随着浓度的增加圆顶形成增加(n＝2)。(i-k)rt-qpcr示出了相对于对照处理，在robo1-ecd处理之后wap(n＝1)和lalba(n＝2)基因表达增加。wap(n＝1)表达在dcc-ig4(0.7μm)处理之后没有变化。(l-o)robo1 ecd滴定示出使用robo1-ig5(l，m)增加了wap(n＝1)和plin2(n＝4)表达，并且使用robo1-ecto(n，o)处理增加了wap(n＝3)和plin2(n＝2)。(sem，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)
17.图8：robo1胞外结构域抑制notch活化。(a)rt-qpcr示出在用robo1-ig5和robo1-ecto处理的hc11细胞中hey1和hes1表达降低，但用robo1-ig2处理时没有降低(n＝1)。(b)通过蛋白质印迹分析的分级(细胞质/细胞核)致敏hc11细胞示出用robo1-ig5处理的hes1和notch4-icd(n4-icd)在细胞核部分中降低，其中notch4-icd(n4-icd)在细胞质部分中也有所降低。(c)hc11分化测定示出在scramble kd(scr)条件下用robo1-ig5处理增加了圆顶形成。robo1(shrobo1)的敲低减少未经处理的细胞(对照)中的圆顶形成，这种效应通过robo1-ig5处理挽救。notch4(shnotch4)的敲低增加未经处理的细胞(对照)中的圆顶形成，这种增加不受robo1-ig5处理的影响(n＝2)。
18.图9：robo1胞外结构域片段的皮下注射增加了支化：(a)wt原代鼠类乳腺泡祖细胞(avp)是经facs纯化的，并且在不存在(对照)和存在robo1 ecd的情况下在基质胶中生长。所有robo1 ecd片段增加了类器官的数量，其中代表性图片示出了在存在robo1-ig5的情况下生长的avp(n＝3)。(b)wt原代牛乳腺泡祖细胞(avp)是经facs纯化，并且在不存在(对照)和存在robo1-ig5的情况下在基质胶中生长，这增加了类器官的大小(n＝2)。(c)robo1-ig5注射方案的草图表示。切除动物的卵巢(ovx)，然后用激素处理并注射pbs或robo1-ig5片段。(d)注射了robo1-ig-5的动物的乳腺大小和一级(1
°
)分支的数量增加(n＝3)。(e)注射了robo1-ig5的乳腺的二级/三级(2
°
，3
°
)分支的数量增加，但支化密度没有增加(n＝3)。(sem，*p《0.05)。
19.图10：robo1胞外结构域片段增加小叶乳腺泡乳腺发育。(a)robo1 ecd-fc片段皮下注射方案的草图表示。robo1 / (wt)或robo1-/-动物在妊娠时期(pd)第8.5天、第11.5天和第14.5天皮下注射pbs或robo1 ecd-fc。在pd 17.5时采集乳腺。(b，c)模拟注射、wt和robo1-/-腺体(对照)的代表性h&e染色显示出先前观察到的小叶乳腺泡发育减少(箭头)和较小的稠密乳腺泡(星号)的robo1-/-表型。(d，e)皮下注射了robo1 ecd-fc片段的wt(d)和robo1-/-(e)腺体中小叶乳腺泡发育和乳滴产生增加。(f)乳腺泡百分比(％)的定量示出了与对照robo1 / 组织相比，模拟注射的robo1-/-乳腺组织中的乳腺泡面积显著减少，并且随着robo1 ecd-fc(r1ecd)片段注射到robo1 / 或robo1-/-动物中乳腺泡面积显著增加。(sem，*p《0.05，***p《0.001)。
20.图11：robo1胞外结构域片段增加产奶量。(a-c)rt-qpcr示出了与robo1 / 动物相比，模拟注射的robo1-/-中wap(a)、xdh(b)和csn2(c)的表达显著降低。在注射了robo1 ecd-fc(r1ecd)的robo1 / 动物中，wap、csn2的表达显著增加并且xdh呈增加趋势。在注射了robo1 ecd-fc(r1ecd)的robo1-/-动物中，wap、xdh和csn2的表达显著增加。(d-h)免疫组织化学(d-g)和定量(h)证明，与对照robo1 / 组织相比，模拟注射的robo1-/-乳腺组织中的乳蛋白表达显著降低，并且随着robo1 ecd-fc(r1ecd)片段注射到robo1 / 或robo1-/-动物中，乳蛋白表达显著增加。(sem，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
21.图12：乳腺的基底细胞需要robo1来进行乳腺泡分化和产奶。(a-d)嵌合类器官通过重新构建纯化的内腔和基底细胞群产生。对于wt组织(gfp / )，使用actb-egfp小鼠。(a)重新构建为乳腺类器官的gfp / 基底细胞和gfp / 腔细胞在分化后产生csn2(β-酪蛋白)。(b)重新构建为乳腺类器官的robo1-/-基底细胞和robo1-/-腔细胞在分化后很少/不产生csn2。(c)重新构建为乳腺类器官的robo1-/-基底细胞和gfp / 腔细胞在分化后很少/不产生csn2。(d)重新构建为乳腺类器官的gfp / 基底细胞和robo1-/-腔细胞在分化后产生csn2。
22.图13：robo1抑制基底细胞中的jagged1表达。(a)来自表达增加量的robo1质粒(robo1)的细胞的hek293裂解物的免疫印迹和定量示出了jagged1表达水平降低。gapdh是负载对照。(b)来自robo1敲低(shrobo1)细胞的hek293裂解物的免疫印迹和定量示出了jagged1表达增加而jagged2表达无变化。(c)原代乳腺上皮细胞从robo1 / 和robo1-/-动物中进行facs纯化。与wt相比，robo1-/-基底细胞中的jagged1表达增加。(d)jagged1和基底标志物细胞角蛋白15(ck14)的免疫组织化学示出了与robo1 / 乳腺类器官相比，robo1-/-基底细胞中的jagged1表达增加。(***p《0.001)。
23.序列表
24.seq id no:1-家牛robo1-ecto
25.seq id no:2-家牛robo1-ig5
26.seq id no:3-家牛-robo1-ig2
27.seq id no:4-智人robo1-ecto
28.seq id no:5-智人robo1-ig5
29.seq id no:6-智人robo1-ig2
30.seq id no:7-野牛robo1-ecto
31.seq id no:8-野牛robo1-ig5
32.seq id no:9-野牛robo1-ig2
33.seq id no 10-双峰驼robo1-ecto
34.seq id no:11-双峰驼robo1-ig5
35.seq id no:12-双峰驼robo1-ig2
36.seq id no:13-山羊robo1-ecto
37.seq id no:14-山羊robo1-ig5
38.seq id no:15-山羊robo1-ig2
39.seq id no:16-绵羊robo1-ecto
40.seq id no:17-绵羊robo1-ig5
41.seq id no:18-绵羊robo1-ig2
42.seq id no:19-野牦牛robo1-ecto
43.seq id no:20-野牦牛robo1-ig5
44.seq id no:21-野牦牛robo1-ig2
45.seq id no:22-小家鼠robo1-ecto
46.seq id no:23-小家鼠robo1-ig5
47.seq id no:24-小家鼠robo1-ig2
48.seq id no:25-褐家鼠robo1-ecto
49.seq id no:26-褐家鼠robo1-ig5
50.seq id no:27-褐家鼠robo1-ig2
51.seq id no:28-褐家鼠dcc ig2
52.seq id no:29-褐家鼠dcc ig4
53.seq id no:30-robo1 shrna正向链
54.seq id no:31-robo1 shrna反向链
55.seq id no:32-notch4 shrna正向链
56.seq id no:33-notch4 shrna反向链
57.seq id no:34-robo2 shrna正向链
58.seq id no:35-robo2 shrna反向链
具体实施方式
59.提供了用于促进哺乳动物产奶的方法、药剂和组合物。可用于促进产奶的药剂可以包含抑制notch4活性的药剂。药剂可以是可溶性robo1胞外结构域，药剂可以通过与robo2结合和/或通过与notch4结合来抑制notch4活性。药剂可以通过与robo1竞争不与robo2结合来抑制notch4，由此使robo1可用于抑制notch4活性。药剂可以是抑制notch4活性的抗notch4抗体。药剂可以是抑制notch4的表达的rnai构建体。药剂可以是抑制robo2的表达的rnai构建体。本文还提供了转基因哺乳动物，所述转基因哺乳动物被基因修饰以表达可溶性robo1胞外结构域；抑制robo2的表达；和/或抑制notch4的表达。还提供了通过施用本文所公开的药剂中的一种或多种药剂来促进此类转基因哺乳动物产奶的方法。
60.在本说明书中引用的所有公开和专利通过引用并入本文，如同每个单独的公开或专利被具体和单独地指示通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的公开有关的材料和/或方法。任何出版物的引用均为其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本方法、组合物和转基因哺乳动物无权先于此类出版物，因为所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，所述实际出版日期可能需要独立确认。
61.应当注意的是，除非上下文另有明确规定，否则如本文以及所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指代物。另外注意，权利要求可以撰写为排除任何可选的要素。因此，所述陈述旨在用作前置基础，用于结合权利要求要素的叙述使用诸如“单独地”、“仅”等排他性术语或使用“负面”限制。
62.如对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在阅读本公开时，本文所描述和展示的单独方面中的每一个都具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏
离本方法的范围或精神的情况下易于与任何其它若干方面的特征分离或组合。任何所述的方法可以以所述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序执行。
63.定义
64.如本文所使用的，术语“抗体”是指通过至少一个抗原结合位点识别并结合靶标的免疫球蛋白分子。“抗体”在本文中以最广泛的含义使用并涵盖各种抗体结构，所述抗体结构包含但不限于多克隆抗体、重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(例如，来自诸如人、牛、绵羊、山羊、骆驼等两个或多个不同物种的抗体序列的嵌合体)、人源化抗体、人抗体、牛化抗体、绵羊化抗体、山羊化抗体、骆驼化抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体、单链fv(scfv)抗体、单结构域抗体(例如，骆驼科动物/美洲驼抗体)和抗体片段。
65.术语“完整抗体”或“全长抗体”是指具有基本上类似于天然抗体结构的结构的抗体。其包含包括两条轻链和两条重链的抗体，每条轻链包括可变区和轻链恒定区(cl)，并且每条重链包括可变区和至少重链恒定区ch1、ch2和ch3。
66.如本文所使用的，术语“抗体片段”是指包括抗体的一部分并且通常包括抗原结合位点的除完整抗体以外的分子。抗体片段的实例包含但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv、二硫键连接的fv(sdfv)、fd、线性抗体、单链抗体分子(例如scfv)、双抗体、三抗体、四抗体、微型抗体、双可变结构域抗体(dvd)、单可变结构域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
67.如本文所使用的，术语“可变区”是指抗体与抗原结合所涉及的抗体轻链的区域或抗体重链的区域。抗体重链和抗体轻链的可变区具有类似的结构，并且通常包括四个框架区和三个互补决定区(cdr)(也称为高变区)。
68.术语“框架区”是指除可变区内的cdr残基以外的氨基酸残基。可变区通常包括四个框架区fr1、fr2、fr3和fr4。
69.如本文所使用的，术语“单克隆抗体”是指涉及高度特异性识别并且结合单抗原决定簇或表位的基本上均质的抗体群。除了可能少量存在的可能天然发生的突变之外，包括所述抗体群的单个抗体是相同的。术语“单克隆抗体”涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(例如，fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(scfv)抗体、包括抗体片段的融合蛋白，以及包括抗原结合位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指通过任何数量的技术制备的此类抗体，所述技术包含但不限于杂交瘤生产、噬菌体文库展示、重组表达和转基因动物。
70.如本文所使用的，术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分源自于特定来源或物种而重链和/或轻链的其余部分源自于不同来源或物种的抗体。
71.如本文所使用的，术语“人源化抗体”是指通常包括人免疫球蛋白(例如受体抗体)的嵌合抗体，在所述嵌合抗体中，天然cdr残基被来自如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等非人物种(例如，供体抗体)的对应cdr的残基替换，其中供体抗体具有期望的特异性、亲和力和/或活性。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个框架区内的一个或多个残基被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可以进行这些修饰以进一步改进和/或优化抗体特性。人源化抗体可以包括可变区，所述可变区含有对应于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的cdr和对应于人免疫球蛋白的全部或基本上全部的框架区。在一些方面，人源化抗体将包括免疫球蛋白fc区(例如，铰链区、ch1、ch2和/或ch3)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。类似的定义适用于牛化、绵羊
化、山羊化和骆驼化抗体。
72.如本文所使用的，术语“人抗体”是指具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体和/或使用本领域技术人员已知的用于制造人类抗体的技术中的任何技术制造的抗体。这些技术包含但不限于噬菌体展示文库、酵母展示文库、转基因动物和b细胞杂交瘤技术。本文所定义的人抗体不包含包括来自非人来源的残基的人源化抗体。
73.术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用，并且是指抗原或靶标中能够被特定结合剂或结合剂(例如，抗体)识别并结合的部分。当抗原或靶标是多肽时，表位可以由连续氨基酸和通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在蛋白质变性后保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在蛋白质变性后丢失。在独特的空间构象中，表位典型地包含至少3个并且更通常地至少5个、6个、7个或8-10个氨基酸。可以使用互联网上可用的大量软件生物信息学工具中的任何一种来预测表位。x射线晶体学可以用于通过分析抗原/抗体复合物的氨基酸残基相互作用来表征靶蛋白上的表位。
74.如本文所使用的，术语“特异性结合”是指与特定抗原、表位、蛋白质或靶分子更频繁地、更快地、持续时间更长地、更具亲和力地或以上的一些组合相互作用而不与替代物质相互作用的结合剂(例如，抗体)。特异性结合抗原的抗体可以例如通过免疫测定、elisa、表面等离子体共振(spr)技术(例如，biacore)、facs或本领域普通技术人员已知的其它技术来鉴定。
75.术语“多肽”和“肽”以及“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合物。术语“肽”可以用于指少于50个氨基酸例如5-50个氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，其可以包括经修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖已天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰。定义内还包含例如含有一种或多种氨基酸类似物(包含但不限于非天然氨基酸)以及本领域已知的其它修饰的多肽。应当理解的是，因为本公开的多肽中的一些多肽可能基于抗体，所以术语“多肽”涵盖作为单链的多肽和两条或更多条相关链的多肽。
76.术语“多核苷酸”和“核酸”以及“核酸分子”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包含dna和rna。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可以通过dna或rna聚合酶并入到聚合物中的任何底物。
77.在两个或更多个核酸或多肽的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当针对最大对应性进行比较和比对(如果必要，引入空位)时，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑任何保守氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量同一性百分比。可以用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件是本领域众所周知的。这些算法和软件包含但不限于blast、align、megalign、bestfit、gcg wisconsin package和其变体。在一些方面，当针对最大对应性进行比较和比对，本公开的两个多核苷酸或多肽基本上相同，这意味着其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，并且在一些方面，至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性，如使用序列比较算法或通过目视检查测量的。在一些方面，在长度为至少约10个、至少约20个、至少约40-60个核苷酸或
氨基酸残基、至少约60-80个核苷酸或氨基酸残基或其间的任何整数值的序列的区域上存在同一性。在一些方面，在超过60-80个核苷酸或氨基酸残基如至少约80-100个核苷酸或氨基酸残基的较长区域上存在同一性，并且在一些方面，在进行比较的序列的全长上序列基本上相同，所述进行比较的序列例如是(i)核苷酸序列的编码区或(ii)氨基酸序列。
78.如本文所使用的，短语“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基被具有类似侧链的另一个氨基酸残基替换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中大体上定义，所述侧链包含基本侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸被认为是保守取代。通常，多肽和/或抗体序列中的保守取代不会消除多肽或抗体与靶结合位点的结合。鉴定不消除结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域众所周知的。
79.如本文所使用的，术语“载体”意指能够在宿主细胞中递送并通常表达一种或多种所关注基因或序列的构建体。载体的实例包含但不限于病毒载体、裸dna或rna表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂缔合的dna或rna表达载体以及包封在脂质体中的dna或rna表达载体。
80.如本文所使用的，术语“分离的”是指在自然界中未发现的形式的多肽、肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。“分离的”抗体基本上不含来自其所来源的细胞来源的材料。在一些方面，分离的多肽、肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是已经纯化到不再处于其在自然界中存在的形式的程度的那些物质。在一些方面，分离的多肽、肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物基本上是纯的。多肽、肽、可溶性蛋白质、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物可以从天然来源或从如工程化细胞系等来源分离。
81.如本文所使用的，术语“基本上纯的”是指至少50％纯的(即，不含污染物)、至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的材料。
82.如本文所使用的，术语“源自”在多肽的上下文中是指具有基于来自特定来源的蛋白质的序列的多肽。源自于来自特定来源的蛋白质的多肽可以是来自特定来源的蛋白质的变体。例如，源自于来自特定来源的蛋白质的多肽可以具有相对于其所来源的蛋白质序列进行修饰的序列。源自于来自特定来源的蛋白质的多肽与其所来源的蛋白质共享至少50％的序列同一性、至少60％的序列同一性、至少70％的序列同一性、至少80％的序列同一性或至少90％的序列同一性。
83.如本文所使用的，术语“有效量”是指足以在如哺乳动物等受试者中产生预期效果的药剂(例如，抗体、多肽、核酸等)的量。
84.如本文所使用的，对“约”或“大约”值或参数的提及包含(并描述)涉及所述值或参数的方面。例如，提及“约x”的描述包含对“x”的描述。
85.如本公开和权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数形式。
86.在本文中，在如“a和/或b”等短语中使用的术语“和/或”旨在包含：a和b两者；a或
b；a(单独)；以及b(单独)。同样，在如“a、b和/或c”等短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每个方面：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
87.如本文所使用的，术语rnai构建体涵盖rna分子和载体，所述rna分子和载体在细胞内的存在造成rna干扰(rnai)并导致rnai构建体所靶向的转录物的表达降低。术语包含sirna、shrna以及rnai诱导载体。
88.如本文所使用的，rnai诱导载体是载体在细胞内的存在造成一种或多种自杂交或彼此杂交以形成shrna或sirna的rna的转录的载体。此术语涵盖质粒，例如，dna载体或病毒载体。载体可以包含可操作地连接到表达信号使得当载体存在于细胞内时杂交或自杂交以形成sirna或shrna的一种或多种rna分子被转录的核酸。因此，载体提供了用于一个或多个rna或其前体的细胞内合成的模板。
89.短干扰rna(sirna)包括长度为大约19个碱基对的rna双链体，并且任选地进一步包括一个或两个单链突出端。sirna可以由两个杂交在一起的rna分子形成，或者可以可替代地由包含自杂交部分的单个rna分子产生。sirna的双链体部分可以包含一个或多个未配对的核苷酸。sirna的一条链包含与具有完全互补性或者一个两或个错配的靶转录物杂交的部分。在未达到完全互补性的方面，任何错配都可能定位在sirna端处或附近。
90.术语短发夹rna是指包括至少两个互补部分和至少一个单链部分的rna分子，所述至少两个互补部分杂交或能够杂交形成足够长以介导rnai的双链(双链体)结构(长度通常为至少19个碱基对)，所述至少一个单链部分形成环，其长度通常在大约1个与10个核苷酸之间。双链体部分可以但通常不含有由一个或多个未配对的核苷酸组成的一个或多个凸起。
91.本文公开了对robo受体在乳腺乳腺泡产生期间的作用的检查。具体地，robo1的丢失抑制乳腺泡产生，而robo2的丢失增强乳腺泡产生。细胞系的生化研究公开了robo1特异性结合notch4并抑制notch4活化。robo1被示出为在整个乳腺上皮区室中广泛表达，而robo2的表达仅限于乳腺泡祖细胞和基底/肌上皮细胞(bc)。还公开了robo1受体片段，其包括抑制notch4信号传导和促进乳腺泡产生的robo1胞外结构域(ecd)的部分。还公开了乳腺泡产生是通过用抑制robo2与robo1结合的抗体处理细胞和哺乳动物来增强的。不受理论束缚，本文所公开的发现表明了调节notch4信号传导并因此调节每次妊娠分化为产奶乳腺泡的乳腺泡祖细胞的数量的去抑制回路机制(robo2-|robo1-|notch4)。
92.用于增强哺乳动物产奶的方法
93.本公开提供了促进哺乳动物产奶的方法。在某些方面，所述方法可以包含向哺乳动物施用抑制notch4活性的第一药剂，其中第一药剂以足以抑制notch4活性的量施用，由此促进产奶。第一药剂可以通过直接与notch4蛋白结合、通过抑制robo2与robo1的结合、通过促进robo1与notch4的结合、通过抑制notch4的表达或通过抑制robo2的表达来抑制notch4活性。
94.在某些方面，第一药剂可以包括可溶性robo1胞外结构域(ecd)。在某些方面，可溶性robo1 ecd可以包含robo1的整个胞外结构域或其robo2结合片段。在某些方面，可溶性robo1 ecd可以包含robo1的至少两个免疫球蛋白(ig)结构域，例如，robo1的前两个ig结构域。在某些方面，可溶性robo1 ecd可以包含robo1的至少五个免疫球蛋白结构域。在某些方
面，可溶性robo1 ecd可以源自于鼠类、牛、绵羊、山羊或人robo1的胞外结构域。在某些方面，可溶性robo1 ecd可以包含与seq id no:1-27中任一项所述的氨基酸序列至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在某些方面，可溶性robo1 ecd可以包含seq id no:1-27中任一项的具有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或至多20个)保守氨基酸取代的序列。在某些方面，施用于哺乳动物的可溶性robo1 ecd可以源自于由哺乳动物表达的robo1蛋白的序列，以减少对可溶性robo1 ecd的免疫应答。
95.可以包含robo1的整个胞外区或其robo2结合片段的可溶性robo1 ecd可以通过任何方式来鉴定。例如，有效抑制notch4活性的可溶性robo1 ecd可以通过执行用于测量可溶性robo1 ecd与robo2的结合的测定来鉴定。测定可以包含确定在存在竞争剂的情况下可溶性robo1 ecd是否与robo2结合，所述竞争剂如全长robo1或具有seq id no:1-27中任一项所述的氨基酸序列的可溶性robo1 ecd。在某些方面，有效抑制notch4活性的可溶性robo1 ecd可以通过执行用于测量可溶性robo1 ecd与notch4的结合的测定来鉴定。可溶性robo1 ecd与robo2和/或notch4的结合可以通过检测robo1 ecd::robo2复合物和/或robo1 ecd::notch4复合物的形成来测量。也可以使用其它用于鉴定可溶性robo1 ecd与robo2和/或notch4的结合的方法。
96.在一些方面，可溶性robo1与异源多肽融合或连接。在一些方面，异源多肽连接到可溶性robo1 ecd的氨基端、羧基端或两个端。如本文所使用的，在robo1 ecd的上下文中使用的术语可溶性意指robo1 ecd未定位，本文所述的ecd可以并且不能定位于细胞表面，因为其缺少细胞表面定位所需的跨膜区。可溶性robo1 ecd也没有robo1的胞内区的序列。在某些方面，可溶性robo1 ecd多肽可以与免疫球蛋白fc多肽(例如，人igg fc，如igg1 fc)、血清白蛋白(例如，人血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白或牛血清白蛋白)或麦芽糖结合蛋白融合。在某些方面，可溶性robo1 ecd可以与促进多肽的纯化或追踪的蛋白质标签融合。此类蛋白质标签包含his标签、血凝素标签、fc区(源自于来自人、牛、绵羊或山羊抗体的ig，例如，igg、igm、iga、ige或igd)或myc标签。
97.在一些方面，第一药剂可以是抑制notch4活性的抗notch4抗体或其notch4结合片段。如本文所使用的，除非上下文另有明确规定，否则术语抗体涵盖其抗原结合片段。在一些方面，抗体包括与抗原上的不同表位结合的多种多克隆抗体。在一些方面，抗体是重组抗体。在一些方面，抗体是单克隆抗体。在一些方面，抗体是嵌合抗体。在某些方面，抗体被修饰成在接受抗体的哺乳动物中提供降低的免疫原性。在一些方面，抗体是人源化抗体。在一些方面，抗体是人抗体。在一些方面，抗体是牛化抗体。在一些方面，抗体是牛抗体。在一些方面，抗体是绵羊化抗体。在一些方面，抗体是绵羊抗体。在一些方面，抗体是山羊化抗体。在一些方面，抗体是山羊抗体。在一些方面，抗体是骆驼化抗体。在一些方面，抗体是骆驼抗体。在一些方面，抗体是iga、igd、ige、igg或igm抗体。在一些方面，抗体是igg抗体。在一些方面，抗体是igg1、igg2、igg3或igg4抗体。在一些方面，抗体是包括至少一个抗原结合位点的抗体片段。在一些方面，抗体是scfv。在一些方面，抗体是二硫键连接的scfv。在一些方面，抗体是fab。在一些方面，抗体是双特异性抗体或多特异性抗体。
98.在一些方面，第一药剂是与notch4结合的多克隆抗体。多克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备。在一些方面，多克隆抗体是通过使用多次皮下或腹膜内
注射用所关注的抗原(例如，纯化的肽片段、重组蛋白或融合蛋白)使动物(例如，牛、绵羊、骆驼、兔、大鼠、小鼠、山羊、驴)产生)免疫而产生的。在一些方面，抗原与如钥孔虫戚血蓝蛋白(klh)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂等载体缀合。将抗原(具有或不具有载体蛋白)稀释在无菌盐水中并通常与佐剂(例如，完全或不完全弗氏佐剂(freund's adjuvant))组合以形成稳定的乳液。一段时间后，从经免疫的动物(例如，从血液或腹水)回收多克隆抗体。在一些方面，根据本领域的标准方法从血清或腹水中纯化多克隆抗体，所述标准方法包含但不限于亲和色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳和/或透析。
99.在一些方面，第一药剂是与notch4结合的单克隆抗体。单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的任何方法制备。在一些方面，使用本领域技术人员已知的杂交瘤方法制备单克隆抗体。如上所述对小鼠、大鼠、兔、仓鼠或其它合适的宿主动物进行免疫。在一些方面，淋巴细胞在体外进行免疫。在一些方面，免疫抗原是人蛋白或其片段。在免疫后，分离淋巴细胞并使用例如聚乙二醇将淋巴细胞与合适的骨髓瘤细胞系融合。使用本领域已知的专用培养基选出杂交瘤细胞，并且未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞在选择过程中没有存活。产生针对选定抗原的单克隆抗体的杂交瘤可以通过多种方法来鉴定，所述方法包含但不限于免疫沉淀法、免疫印迹法和体外结合测定(例如，流式细胞术、facs、elisa、spr(例如，biacore)以及放射免疫测定)。鉴定出产生具有期望的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可以通过有限稀释或其它技术对克隆进行亚克隆。杂交瘤可以使用标准方法在体外培养物中繁殖，也可以在动物体内作为腹水肿瘤繁殖。单克隆抗体可以根据本领域的标准方法从培养基或腹水液中纯化，这些标准方法包含但不限于亲和色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳以及透析。
100.在一些方面，使用本领域技术人员已知的重组dna技术制备单克隆抗体。例如，如通过rt-pcr使用特异性扩增对抗体的重链和轻链进行编码的基因的寡核苷酸引物从成熟b细胞或杂交瘤细胞中分离出对抗体进行编码的聚核苷酸，并使用标准技术确定其序列。然后将对重链和轻链进行编码的经分离的聚核苷酸克隆到合适的表达载体中，所述合适的表达载体在转染到如大肠杆菌、猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞等不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞中时产生单克隆抗体。
101.在一些方面，重组单克隆抗体从表达期望物种(例如，牛或人)的可变结构域或cdr的噬菌体展示文库中分离。噬菌体文库的筛选可以通过本领域已知的各种技术来完成。
102.在一些方面，单克隆抗体通过使用重组dna技术来修饰，以产生替代抗体。在一些方面，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域被人抗体、绵羊抗体、牛抗体、山羊抗体或骆驼抗体的恒定区替换以产生嵌合抗体。在一些方面，恒定区被截短或去除以产生单克隆抗体的期望抗体片段。在一些方面，可变区的定点诱变或高密度诱变用于优化单克隆抗体的特异性和/或亲和力。
103.在一些方面，抗notch4抗体是人源化抗体。用于产生人源化抗体的各种方法是本领域已知的。在一些方面，人源化抗体包括已从非人来源引入到其序列中的一个或多个氨基酸残基。在一些方面，通过用来自非人抗体(例如，小鼠抗体)的对应氨基酸取代人抗体的cdr序列的一个或多个氨基酸来执行人源化。在一些方面，通过用来自非人抗体(例如，小鼠抗体)的cdr的对应氨基酸取代人抗体的所有六个cdr来构建人源化抗体。
104.可以基于多种因素并通过本领域已知的多种方法来选择使用哪种人重链可变区
和/或轻链可变区来产生人源化抗体。在一些方面，在针对已知人可变区序列的整个文库筛选非人(例如，啮齿动物)抗体的可变区的序列的情况下使用“最佳拟合”方法。选择与非人(例如，啮齿动物)序列最相似的人序列作为人源化抗体的人可变区框架。在一些方面，选择源自于轻链或重链的特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定可变区框架作为可变区框架。在一些方面，可变区框架序列源自于最丰富的人亚类的共有序列。在一些方面，人种系基因用作可变区框架序列的来源。
105.在一些方面，抗notch4抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来制备人抗体。在一些方面，人抗体由体外免疫的永生化人b淋巴细胞产生。在一些方面，人抗体由从经免疫的个体中分离的淋巴细胞产生。产生针对靶抗原的抗体的细胞可以在任何情况下产生和分离。在一些方面，人抗体选自噬菌体文库，其中所述噬菌体文库表达人抗体。可替代地，可以使用噬菌体展示技术从来自未免疫的供体的免疫球蛋白可变区基因谱系在体外产生人抗体和抗体片段。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术是本领域众所周知的。鉴定出抗体后，可以采用本领域已知的包含但不限于链改组和定点诱变的亲和力成熟策略来产生具有更高亲和力的人抗体。在一些方面，人抗体在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中产生。在免疫后，这些小鼠能够在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生完整的人抗体库。
106.在某些方面，抗体可以是牛化抗体或全牛抗体。用于从非牛抗体产生牛化抗体的方法可以包括形成保留来自非牛抗体的cdr而抗体的其它区域可以用来自牛抗体的对应序列替换的嵌合抗体，从牛抗体将一个或多个氨基酸残基引入到所述嵌合抗体中。在某些方面，非牛抗体可以通过用来自牛抗体的恒定区替换其恒定区来进行牛化。在某些方面，非牛抗体可以通过用来自牛抗体的恒定区替换其恒定区和用来自牛抗体的框架区替换其框架区来进行牛化。在某些方面，可以通过用来自非牛抗体的cdr替换牛抗体的cdrs来产生牛化抗体。在某些情况下，抗体可以是使用对牛抗体进行编码的基因序列产生的全牛抗体。全牛抗体可以在牛、在牛细胞系、被基因修饰以表达牛抗体的非牛细胞系或被基因修饰以表达牛抗体的转基因非牛动物中产生。类似的方法可以用于产生物种特异性抗体，所述物种特异性抗体当施用于物种时产生对抗体的降低的免疫应答。例如，为了将抗体分别施用于绵羊、山羊和骆驼，可以产生绵羊化抗体、山羊化抗体、骆驼化抗体。
107.抗体的cdr由本领域技术人员使用多种方法/系统定义。这些系统和/或定义已经过多年的开发和完善，并且包含kabat、chothia、imgt、abm和contact。kabat定义基于序列可变性并且普遍使用。chothia定义基于结构环区的位置。imgt系统基于可变结构域的结构内的序列可变性和位置。abm定义是kabat与chothia之间的折衷。contact定义基于对可用抗体晶体结构的分析。示例性系统是kabat和chothia的组合。用于抗体序列的分析和cdr的确定的软件程序(例如，abysis)对于本领域技术人员来说是可用的和已知的。
108.本文所定义的特定cdr序列通常基于kabat和chothia定义的组合(示例性系统)。然而，应当理解的是，对特定抗体的一个或多个重链cdr和/或一个或多个轻链cdr的提及将涵盖本领域技术人员已知的所有cdr定义。
109.在一些方面，抗notch4抗体包括恒定区中的至少一个或多个恒定区已修饰或缺失的抗体。在一些方面，抗体可以包括对三个重链恒定区(ch1、ch2或ch3)中的一个或多个重链恒定区和/或轻链恒定区(cl)的修饰。在一些方面，经修饰的抗体的重链恒定区包括至少
一个人恒定区。在一些方面，经修饰的抗体的重链恒定区包括多于一个人恒定区。在一些方面，对恒定区的修饰包括一个或多个区域中一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。在一些方面，一个或多个区域从经修饰的抗体的恒定区中部分或全部缺失。在一些方面，已从抗体(δch2构建体)中去除整个ch2结构域。在一些方面，缺失的恒定区被提供通常由不存在的恒定区赋予的分子灵活性中的一些的短氨基酸间隔子替换。在一些方面，经修饰的抗体包括直接融合到抗体铰链区的ch3结构域。在一些方面，经修饰的抗体包括插入铰链区与经修饰的ch2和/或ch3结构域之间的肽间隔子。
110.本领域已知抗体的恒定区介导几种效应子功能，并且这些效应子功能可以根据抗体的同种型而变化。例如，补体的c1组成部分与igg或igm抗体的fc区的结合(与抗原结合)使补体系统活化。补体的活化在细胞病原体的调理作用和裂解中很重要。补体的活化还会刺激炎症反应，并且可能与自身免疫性超敏反应有关。另外，抗体的fc区可以结合表达fc受体(fcr)的细胞。有许多fc受体对不同类别的抗体具有特异性，所述不同类别的抗体包含igg(γ受体)、ige(ε受体)、iga(α受体)和igm(μ受体)。抗体与细胞表面的fc受体的结合触发了许多重要且多样的生物反应，包含抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、杀伤细胞对抗体包被靶细胞的裂解(称为抗体依赖性细胞毒性或adcc)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。
111.在一些方面，抗notch4抗体包括变体fc区。人igg1、igg2、igg3和igg4的fc区的氨基酸序列是本领域普通技术人员已知的。在一些方面，变体fc区提供改变的效应子功能，所述效应子功能进而影响抗体的生物学特征。例如，在一些方面，恒定区的缺失或失活(通过点突变或其它方式)减少或消除了经修饰的抗体在循环时与fc受体的结合。在一些方面，恒定区修饰增加了抗体的血清半衰期。在一些方面，恒定区修饰减少了抗体的血清半衰期。在一些方面，恒定区修饰降低、减少或去除了抗体的adcc和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)。在一些方面，在人igg1 fc区中用对应的igg2或igg4残基取代特定氨基酸可以降低经修饰的抗体中的效应子功能(例如，adcc和cdc)。在一些方面，抗体不具有一种或多种效应子功能。在一些方面，抗体没有adcc活性和/或没有cdc活性。在一些方面，抗体不结合fc受体和/或补体因子。在一些方面，抗体没有效应子功能(例如，“无效应子”抗体)。在一些方面，恒定区修饰增加或增强了抗体的效应子功能。在一些方面，恒定区修饰增加或增强了抗体的adcc和/或cdc。在一些方面，恒定区被修饰成消除二硫键或寡糖部分。在一些方面，恒定区被修饰成添加/取代一种或多种氨基酸以提供一种或多种细胞毒素、寡糖或碳水化合物附着位点。
112.可以使用众所周知的生物化学技术或分子工程技术对本文所述抗体的恒定区进行修饰。在一些方面，通过将适当的核苷酸变化引入到编码dna和/或通过合成期望的抗体或多肽来制备抗体变体。使用这种技术，有可能破坏由特定序列或区域提供的活性或效应子功能，同时基本上维持经修饰的抗体的结构、结合活性和其它期望特性。
113.本公开进一步包含与本文所述的重组抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体或其抗体片段基本上同源的另外的变体和等效物。在一些方面，期望提高抗体的结合亲和力。在一些方面，期望调节抗体的生物学性质，包含但不限于特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化、免疫原性和/或溶解性。本领域技术人员将理解的是，氨基酸变化可以改变抗体的翻译后过程，如改变糖基化位点的数量或位置，或者改变膜锚定特性。变
化可以是对抗体或多肽进行编码的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，所述取代、缺失或插入导致氨基酸序列相对于天然抗体或多肽序列发生变化。在一些方面，氨基酸取代是将一种氨基酸用具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸替换的结果，如用丝氨酸替换亮氨酸，例如保守氨基酸取代。本文所述的变体抗体或多肽可以使用本领域已知的方法产生，所述方法包含但不限于定点诱变、丙氨酸扫描诱变和pcr诱变。
114.在一些方面，如本文所述的抑制notch4活性的药剂被化学修饰。在一些方面，可溶性robo1 ecd和/或抗notch4抗体已通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解和/或与细胞配体或其它蛋白质的连接进行化学修饰。许多化学修饰中的任何一种都可以通过已知技术进行。
115.在一些方面，所述方法可以涉及增加哺乳动物物种的产奶量，其中哺乳动物物种包括人、牛、绵羊、山羊或骆驼，并且所述方法可以包含向哺乳动物物种施用分别源自于人robo1、牛robo1、绵羊robo1、山羊robo1或骆驼robo1的可溶性robo1 ecd。在某些方面，哺乳动物是处于适合产奶的发育阶段的雌性。例如，哺乳动物可以是已经发育出乳腺的雌性。在某些方面，哺乳动物是女性、母牛、母鹿、母羊或母骆驼。在某些方面，当向哺乳动物施用抑制notch4活性的药剂时，哺乳动物可能怀孕。在某些方面，哺乳动物可能在施用抑制notch4活性的药剂之前已经分娩。例如，哺乳动物可能在施用的1-2年内，例如在3个月、6个月、1年或18个月内分娩。在其它方面，哺乳动物没有怀孕。在一些方面，哺乳动物在施用抑制notch4活性的药剂之前未分娩。例如，哺乳动物在施用的1-2年内，例如在3个月、6个月、1年或18个月内未分娩。
116.在一些方面，如本文所述的抑制notch4活性的药剂可以是与notch4 mrna结合并降低notch4的表达的rnai构建体。在一些方面，如本文所述的抑制robo2活性的药剂可以是与robo2 mrna结合并降低robo2的表达的rnai构建体。rnai构建体可以是短干扰rna(sirna)。sirna可以是短发夹rna(shrna)。rnai构建体可以是微型rna(mirna)。用于制备rnai构建体以抑制任何已知基因序列的表达的方法是本领域技术人员已知的。在某些方面，用于降低notch4的表达的sirna可以包含seq id no:32或33中所述的核酸序列。在某些方面，用于降低robo2的表达的sirna可以包含seq id no:34或35中所述的核酸序列。在某些方面，可以将rnai构建体施用于哺乳动物。在其它方面，核酸
117.在某些方面，用于促进哺乳动物产奶的方法可以涉及施用抑制notch4活性的药剂中的一种或多种药剂。在某些方面，所述方法可以包含施用第一药剂和第二药剂中的至少一种，其中第一药剂和第二药剂独立地选自可溶性robo1 ecd、抗notch4抗体、抑制notch4的表达的rnai构建体或抑制robo2的表达的rnai构建体。在某些方面，所述方法可以包含施用第一药剂、第二药剂和第三药剂中的至少一种，其中第一药剂、第二药剂和第三药剂独立地选自可溶性robo1 ecd、抗notch4抗体、抑制notch4的表达的rnai构建体或抑制robo2的表达的rnai构建体。在某些方面，所述方法可以包含施用第一药剂、第二药剂、第三药剂和第四药剂，其中第一药剂、第二药剂、第三药剂和第四药剂独立地选自可溶性robo1 ecd、抗notch4抗体、抑制notch4的表达的rnai构建体或抑制robo2的表达的rnai构建体。
118.用于抑制notch4活性的一种或多种药剂可以通过任何合适的途径施用于哺乳动物以促进产奶，所述合适的途径包含肠胃外(例如，肌肉内、静脉内、皮下(例如，注射或植入)、腹膜内、脑池内、关节内、腹膜内、脑内(脑实质内)和脑室内)、口腔、鼻腔、阴道、舌下、
眼内、直肠、局部(例如，透皮)、舌下和吸入。在某些方面，所述一种或多种药剂可以通过直接注射施用，例如，注射到乳腺组织中，例如导管内注射。
119.用于抑制notch4活性的药剂和其组合物
120.本文还提供了可以用于执行本文所公开的方法的药剂和其组合物。
121.在某些方面，提供了包括如本文所公开的可溶性robo1 ecd多肽的多肽。可溶性robo1 ecd多肽可以与如本文所公开的异源多肽融合。在某些方面，提供了对如本文所公开的可溶性robo1 ecd多肽进行编码的核酸。对可溶性robo1 ecd多肽的描述在先前章节和本文别处提供，并且为简洁起见此处不再重复。可溶性robo1 ecd可以使用本领域已知的方法产生。多肽可以使用标准重组dna技术或使用化学方法全部或部分地产生。用于合成多肽的化学方法可以涉及使用可使用自动肽合成器(例如，biotage仪器)执行的各种固相技术。用于合成多肽的化学方法可以涉及使用组合方法。另外，多肽可以通过本领域技术人员已知的多种化学方法进行修饰。还可以使用如定点诱变、丙氨酸扫描和/或基于pcr的诱变等方法来进行多肽序列变化、取代和/或修饰。可以对克隆的dna执行定点诱变、盒式诱变、限制性选择诱变和其它技术，以产生其可溶性robo1 ecd、变体、融合体、嵌合体和其它衍生物。“产生的”或“合成的”多肽序列是通过涉及人工操作的任何方法制成的多肽。此类方法包含但不限于化学合成、重组dna技术、较大分子的生化或酶促破碎，以及上述方法的组合。
122.在使用重组技术产生多肽例如可溶性robo1 ecd多肽的情况下，可以分别使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞产生作为胞内蛋白质或分泌蛋白质的多肽，所述构建体和宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，如细菌(例如，大肠杆菌)或酵母宿主细胞。在某些方面，用作产生多肽的宿主细胞的真核细胞包含昆虫细胞、哺乳动物细胞和/或植物细胞。在某些方面，使用哺乳动物宿主细胞并且其可以包含人细胞(例如，hela、293、h9和jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，nih3t3、l细胞和c127细胞)；灵长类动物细胞(例如，cos 1、cos 7和cv1)和仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(cho)细胞)。在具体方面，本文所公开的多肽在cho细胞或hek细胞中产生。在某些方面，本公开的多肽，例如可溶性robo1ecd，在存在肝素的情况下培养的细胞中产生。例如，培养基中可以包含约300ng/ml的肝素。在其它方面，本公开的多肽，例如可溶性robo1 ecd，在不含有显著量的肝素的培养基中培养的细胞中产生，例如，培养基可以含有少于300ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml或1ng/ml的肝素或者不含肝素。
123.可以根据本领域已知的标准程序采用适合于表达多肽的多种宿主-载体系统。参见例如sambrook等人,1989《分子生物学实验指南(current protocols in molecular biology)》纽约冷泉港出版社(cold spring harbor press,new york)；以及ausubel等人,1995《分子生物学实验指南》威利父子公司(wiley and sons)编辑。用于将遗传物质引入到宿主细胞中的方法包含例如转化、电穿孔、缀合、磷酸钙方法等。可以选择转移方法以提供引入的多肽编码核酸的稳定表达。多肽编码核酸可以作为可遗传的附加型元件(例如，质粒)提供或者可以在基因组上整合。用于产生所关注多肽的各种适当的载体是商购可得的。
124.载体可以在宿主细胞中提供染色体外维持或者可以提供宿主细胞基因组中的整合。表达载体提供转录和翻译调控序列并且可以提供诱导型或组成型表达，其中编码区在转录起始区以及转录和翻译终止区的转录控制下可操作地连接。通常，转录和翻译调节序列可以包含但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止
序列以及增强子或活化子序列。启动子可以是组成型或诱导型，并且可以是强组成型启动子(例如，t7)。
125.本文还提供了对本文所公开的多肽进行编码的核酸。在某些方面，对本文所公开的多肽进行编码的核酸可操作地连接到赋予多肽表达的启动子序列。在某些方面，核酸序列是针对多肽在哺乳动物细胞中的表达而优化的密码子。在某些方面，核酸是脱氧核糖核酸(dna)。在某些方面，核酸是核糖核酸(rna)。本文还提供了包括对用于促进产奶的多肽进行编码的核酸的载体，如本文所描述的。在某些方面，载体是病毒载体。
126.在某些方面，提供了如本文所公开的抗notch4抗体。对抗notch4抗体的描述在先前章节和本文别处提供，并且为简洁起见此处不再重复。用于抑制notch4活性的抗notch4抗体可以通过使用如本文所公开的测定和/或细胞和动物模型等任何合适的方式来鉴定。
127.在某些方面，提供了如本文所公开的抑制notch4的表达的rnai构建体或抑制robo2的表达的rnai构建体。对此类rnai构建体的描述在先前章节和本文别处提供，并且为简洁起见此处不再重复。用于抑制notch4活性的rnai构建体可以通过使用如本文所公开的测定和/或细胞和动物模型等任何合适的方式来鉴定。
128.本文还公开了包括如本文所公开的一种或多种notch4活性抑制剂以及药学上可接受的载体的药物组合物。如本文所使用的，术语“药学上可接受的”是指经监管机构批准或可由其批准的或在美国药典、欧洲药典或其它公认药典中列出的用于动物包含人类的物质。
129.如本文所使用的，术语“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”或“可接受的药学载体”是指可以与至少一种药剂一起施用于受试者并且对药剂的药理活性没有影响的赋形剂、载体或佐剂。通常，本领域技术人员和美国fda将药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂视为任何调配物的非活性成分。
130.如本文所使用的，术语“药物调配物”或“药物组合物”是指其形式使得药剂(例如，抗体)的生物活性发挥作用的制剂。药物调配物或组合物通常包括另外的组分，如药学上可接受的赋形剂、载体、佐剂、缓冲剂等。
131.在某些方面，多肽和核酸(例如，对多肽或rnai进行编码)以治疗有效量存在于药物组合物中。治疗有效量可以基于观察到的组合物的有效性来确定。治疗有效量可以使用测量细胞中的期望效应的测定来确定，所述细胞例如是报告子的表达响应于本公开的多肽被调节的报告子细胞系。药物组合物可以离体或在体内施用于哺乳动物，以实践本文所述的方法和用途。
132.本公开的药物组合物可以被调配成与预期方法或施用途径相容；示例性施用途径在本文中阐述。合适的药学上可接受或生理学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂包含但不限于核酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、如生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水等合适的媒剂。
133.用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调整张力的药剂，如氯化钠或葡萄糖。ph可以用如盐酸或氢氧化钠等酸或碱调整。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
134.适合于可注射用途的药物组合物通常包含无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf，新泽西州帕西波尼)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。
135.无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起掺入适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备。通常，分散液通过将活性化合物掺入无菌媒剂中来制备，所述无菌媒剂含有基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述方法从其先前的无菌过滤溶液中产生具有活性成分和任何另外的期望成分的粉末。
136.口服组合物通常包含惰性稀释剂或可食用载体。出于口服治疗性施用的目的，活性化合物可以掺入赋形剂并且以片剂、锭剂或胶囊剂例如明胶胶囊剂的形式使用。口服组合物还可以使用用作漱口水的液体载体进行制备。可以包含药学上相容的结合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有以下成分中的任一种或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。用于口服递送的调配物可以有利地掺入药剂以提高胃肠道内的稳定性和/或增强吸收。
137.对于通过吸入施用，组合物与递送剂一起调配，用于以气溶胶喷雾的形式从含有合适的推进剂(例如，二氧化碳等气体)或雾化器的加压容器或分配器递送。
138.也可以通过透粘膜或透皮的方式进行全身施用。对于透粘膜或透皮施用，在调配物中使用适于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域众所周知的，并且对于透粘膜施用，包含例如洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于透皮施用，将活性化合物和递送剂调配成本领域众所周知的软膏、油膏、凝胶或乳膏。组合物也可以制备成栓剂形式(例如，用常规的栓剂基质，如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠施用的保留灌肠剂。
139.一方面，组合物与将保护化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，所述载体如控释调配物，包含植入物和微囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备此类调配物的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。这些材料也可以从阿尔扎公司(alza corporation)和新星制药有限公司(nova pharmaceuticals,inc.)商购获得。脂质体悬浮液(包括以抗病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。
140.为了方便施用和剂量的均匀性，口服或肠胃外组合物可以按剂量单位形式调配。如本文所使用的，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算以产生期望效果的预定量的活性化合物以及所需的药物载体。
141.如上所述，可以将用作sirna或shrna转录模板的核酸分子插入到可以用作基因疗法载体的载体中。对可溶性robo1 ecd进行编码的核酸分子也可以被插入到可以用作基因疗法载体的载体中。通常，基因疗法载体可以通过例如静脉注射、局部施用或立体定向注射
递送给受试者。在某些方面，包括基因疗法载体和递送剂的组合物可以口服或通过吸入递送，并且可以封装或以其它方式操作以保护其免于降解等。包括基因疗法载体的药物组合物可以包含可接受的稀释剂，或者可以包括其中嵌入基因递送媒剂的缓释基质。可替代地，在完全的基因递送载体可以从例如逆转录病毒或慢病毒载体的重组细胞完整地产生的情况下，药物制品可以包含产生基因递送系统的一个或多个细胞。
142.药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
143.转基因哺乳动物
144.在某些方面，提供了包括产生以下表型中的一种或多种表型的基因修饰的转基因哺乳动物：表达可溶性robo1胞外结构域；抑制robo2的表达；以及抑制notch4的表达。在某些方面，转基因哺乳动物可以是鼠类、牛、绵羊、山羊或骆驼。
145.在某些方面，表型限于乳腺组织。在某些方面，通过使用乳腺组织特异性启动子来诱导表型的表达，表型限于乳腺组织。
146.在某些方面，转基因哺乳动物可以包含产生所列表型中的两种表型的两种基因修饰。在某些方面，转基因哺乳动物可以包含产生所列表型中的所有三种表型的三种基因修饰。
147.在某些方面，如本文所公开的用于促进产奶的方法可以涉及向转基因哺乳动物施用抑制notch4活性的药物组合物中的至少一种药物组合物，如本文所公开的。
148.在某些方面，转基因动物可以包含使可溶性robo1胞外结构域表达的基因修饰，方法可以进一步包含向转基因动物施用包括抗robo1抗体和抗notch4抗体或抑制robo2和/或notch4的表达的rnai构建体的药物组合物。
149.在某些方面，转基因动物可以包含使对robo2和/或notch4的表达抑制的基因修饰，方法可以进一步包含向转基因动物施用包括如本文所公开的可溶性robo1 ecd的药物组合物。
150.转基因哺乳动物可以使用本领域已知的方法产生。用于制备转基因哺乳动物的示例性方法可以包含以下步骤：1)产生含有对可溶性robo1 ecd进行编码的核酸或转录成在启动子的控制下靶向notch4或robo2的sirna或shrna的核酸序列的基因构建体。启动子可以是乳腺特异性启动子或广泛活性启动子。2)将基因构建体转染到来自哺乳动物的细胞例如牛细胞中，并选择已掺入基因构建体的转基因细胞。3)(例如，通过施加电脉冲)将转基因细胞与来自与转基因细胞相同物种(例如牛)的去核卵母细胞融合，并允许卵母细胞发育成胚胎。4)将胚胎移植到与胚胎相同物种的受体哺乳动物(例如牛)中。5)确认胚胎发育成转基因哺乳动物。
151.实验
152.robo1在内腔区室和基底区室两者中表达并且在妊娠期间上调：
153.先前发表的研究聚焦于slit/robo1信号传导在原始动物的分枝形态发生期间的作用
11,15,16
。为了研究robo1在妊娠期间的作用，使用rt qpcr测量了从乳腺分离的细胞中的robo1 mrna水平(图1c)。从成年原始小鼠和妊娠第18天(pd18)的野生型(wt)小鼠采集细胞(如图1c所指示的)，并且然后通过荧光活化细胞分选(facs)将细胞纯化为三个亚群：内腔祖细胞亚群(lp，lin-cd24
lo
cd29

cd61

)、成熟内腔亚群(ml，lin-cd24
lo
cd29

cd61)和基底亚群(bc，lin-cd24

cd29
hi
)
17,18
。结果示出robo1在内腔祖细胞和成熟内腔亚群中上调，但在
基底亚群中未上调(图1c)。
154.为了评估robo1和robo2蛋白在组织中的表达，对来自小鼠的wt和robo1
lacz/
成熟原始乳腺的组织切片执行免疫组织化学(图1d)和β-半乳糖苷酶(lacz)染色(图1e)。对妊娠第16天(pd16)(图1f)和泌乳第3天(ld3)(图1g)的乳腺切片也执行免疫组织化学和β-gal染色。robo1蛋白在成熟的原始乳腺和妊娠期乳腺的腔细胞亚群中表达(图1d-f箭头)。在妊娠期间，在妊娠和泌乳期乳腺中也观察到基底肌上皮robo1表达(图1f，g箭头)。
155.robo1增强乳腺泡产生：
156.为了研究乳腺泡产生期间的robo1功能，抑制了robo1基因在hc11细胞(robo1 kd)中的表达。hc11细胞是成熟的催乳素反应性泌乳模型
19,20
。robo1基因表达未被抑制的细胞在本文中被称为wt或robo1 / 。为了测量产奶量，使细胞生长至汇合，并且然后通过用表皮生长因子(egf，10ng/ml)处理来引发。将egf与炭剥离胎牛血清组合施用三天，随后在不存在egf的情况下施用一天炭剥离胎牛血清。然后通过用地塞米松(1μg/ml)、胰岛素(5μg/ml)和催乳素(prl，5μg/ml)培养基(dip培养基)处理3到5天(图2a)来使这些致敏细胞分化。分化(dif)导致充满奶的圆顶发育(图2b)。响应于用dip培养基进行处理，观察到乳圆顶形成在统计上显著减少并且乳清酸性蛋白(wap)基因表达在统计上显著减少(图2b)。如果细胞未分化(undif)，则wt或robo1-/-细胞中几乎没有圆顶形成(图2b)。接下来分析了来自robo1敲除小鼠(robo1-/-)和野生型小鼠(wt或robo1 / )的组织。从妊娠第18天的wt和robo1-/-动物中收集乳腺，并通过连续切片、胭脂红染色并且然后对定位在组织顶部、中部和底部的切片中乳腺泡所占的区域进行定量来分析乳腺泡产生。此分析揭示了与wt乳腺相比，robo1-/-的乳腺泡面积显著减少(图2c)。
157.为了确保此缺陷是由于乳腺上皮细胞中的robo1抑制而不是由于其可能影响激素产生的整体缺失
21
，来自robo1-/-和同窝出生的robo1 / 小鼠的组织被对侧移植到已按照标准方案预先清除了内源性乳腺上皮的宿主中
22
。十周后，使动物交配并在妊娠第18天检查组织。在移植的robo1-/-ko乳腺中观察到乳腺泡面积显著减少(图2d)，其结果与在完整robo1-/-动物的乳腺中观察到的结果类似(图2c)。为了评估受妊娠调节的特定标志物的表达，在泌乳第1天采集robo1-/-和robo1 / 组织，提取rna，并对已知参与产奶的基因执行rt-qpcr。观察到robo1-/-组织中的wap、乳清蛋白α(lalba)、黄嘌呤脱氢酶(xdh)、嗜乳脂蛋白(btn1)的表达显著降低(图2e)。
158.使用免疫组织化学进一步评估所选择的标志物。robo1-/-和wt妊娠第18天的乳腺中的wap表达在robo1-/-组织中显示出较少的wap免疫染色(图2f)。用特异于脂质结合蛋白围脂滴蛋白2(plin2)的抗体对经移植的妊娠第16天的组织进行免疫染色。在robo1-/-乳腺组织中观察到较少的plin2免疫染色(图2g)。
159.另外，使用全器官组织清除来优化组织的光学清晰度和形态保存。随后使用特异于乳腺泡产生6所必需的转录因子elf5的抗体并且使用特异于细胞-细胞粘附蛋白e-钙粘蛋白(cdh1)的抗体进行双重免疫组织化学(图2h)。相对于robo1 / 组织，在robo1-/-中观察到的elf5染色显著减少(图2h)。
160.robo1的丢失阻碍了体内产奶：
161.为了评估robo1表达对产奶量的影响，执行杂交以产生杂合幼崽，然后由robo1-/-或wt母畜喂养所述杂合幼崽。通过使wt雄性与robo1-/-雌性杂交以及通过使robo1-/-雄性
与wt雌性杂交来产生杂合幼崽。同窝产仔数限制为五只幼崽，并且每天对这些幼崽进行称重(图2i)。由wt母畜喂养的杂合幼崽的体重呈线性增长，而由robo1-/-母畜喂养的杂合幼崽的体重增加较少(图2j)。
162.robo1与notch4信号传导相互作用并对齐进行抑制：
163.notch信号传导对剂量非常敏感，其结果取决于受体活性水平
23
。配体结合后，notch受体通过切割活化。首先是细胞外切割，随后是释放notch胞内结构域(icd)的γ-分泌酶介导的细胞内切割，所述胞内结构域进入细胞核并调节转录。从原始乳腺中分离的经facs纯化的亚群的rna测序分析揭示了相对于robo1 / ，robo1-/-内腔祖细胞(lp)亚群中notch信号传导效应子hey1的表达更高(图3a)。
164.使用sca/cd54标志物从经facs纯化的内腔祖细胞池中富集乳腺泡祖细胞(avp)。类似于来自大量内腔祖细胞的数据(图3a)，对乳腺泡祖细胞(avp)的rt-qpcr分析揭示了三个下游notch效应子(hey1、hes1和hey2)中的robo1-/-的表达相对于robo1 / 显著更大(图3b)。类似地，在hc11细胞中，在抑制robo1表达后观察到hey1、hes1和hey2的表达相对于wt细胞显著更大(图3c)。抑制robo1在hc11细胞中的表达还导致促分化标志物elf5的表达相对于wt显著降低(图3c)。这些数据表明，抑制robo1在原代细胞和组织培养细胞中的表达导致notch效应基因的上调和促分化elf5基因的下调，并且进一步表明在不存在robo1的情况下notch信号传导活化。
165.先前的研究表明，乳腺泡产生需要下调notch信号传导6，特别是notch4
7-9
。乳腺泡祖细胞(avp)从原始动物(virg)和妊娠第18天(pd18)的动物中进行facs纯化，并通过rt-qpcr检测notch4靶基因hes1和hey1的表达(图3d)。据观察，与从原始动物的腺体中分离的乳腺泡祖细胞相比，从妊娠动物的腺体中分离的乳腺泡祖细胞中的两个notch靶基因显著下调。
166.还评估了notch在hc11细胞分化测定中的作用。robo1表达(kd)的抑制导致hc11乳圆顶形成相对于对照(scr)显著更少(图3e)。robo1表达受到抑制的hc11细胞(sir1)也显示出相对于对照(scr)较少的wap和lalba表达(图3f)。这两种效应通过用γ-分泌酶抑制剂(gsi，ro4929097)(sir1 gsi)处理细胞来挽救(图3e，f)。这种γ-分泌酶抑制剂可以阻止notch信号传导，这进一步支持了robo1的丢失增强notch4信号传导的观点，从而产生γ-分泌酶处理可以挽救的效应。
167.在另外的实验中，hc11细胞(sin4)中的notch4表达被抑制。相对于对照细胞(scr)，这些细胞显示出更大的wap和lalba表达。在仍其它实验中，hc11细胞(dkd)中的robo1和notch4表达均受到抑制，从而导致wap和lalba表达相对于对照细胞(scr)增加，类似于通过robo1抑制加gsi处理(sir1 gsi)观察到的wap和lalba表达水平(图3f)。notch4敲低导致相对于对照细胞(scr)圆顶数量显著增加(图3g)——结果与奶基因中更高的表达一致(图3f)。这些数据支持notch4抑制乳腺泡产生的模型。相对于对照细胞(scr)，抑制robo1(sir1)的表达导致形成的乳圆顶显著更少(图3g)，但同时抑制robo1和notch4表达(dkd)导致形成更多的乳圆顶——这与单独抑制notch4表达(sin4)观察到的效果相同(图3g)。总之，这些数据表明，robo1和notch4在调节乳腺泡产生的同一途径中起作用，其中robo1抑制notch4，并且notch4抑制乳腺泡产生。
168.notch受体活化可以通过与结合配偶体的直接相互作用来调节
24
。因此，robo1可能
结合并直接抑制notch4的切割和活化。为了解决这种可能性，使用表达所有四种notch受体(notch1-4)的可检测水平的mba-md-231细胞裂解物执行免疫共沉淀实验。内源性robo1与notch4免疫共沉淀，而不是notch1、notch2或notch3(图3h，并且数据未示出)。接下来，检查了对照(scr)和robo1(sir1)敲低hc11细胞中notch4胞内结构域(n4-icd)和hes1的表达和亚细胞定位。robo1的表达在hc11细胞中被抑制，所述细胞然后如上所述准备分化。robo1敲低细胞显示出细胞核notch4胞内结构域(n4-icd)和hes1的表达相对于对照细胞(scr)显著更高。在工程化为过表达robo1(sir1 o/e)的对照robo1敲低细胞或用γ-分泌酶抑制剂gsi(sir1 gsi)处理的细胞中未观察到这种效果(图3i-3k)。
169.另外的工作解决了如何在hc11分化的时间过程中调节robo1/notch4复合物的形成。在hc11分化阶段(汇合、引发、乳圆顶形成)期间执行表达分析
19,20
。在这段时间过程内通过蛋白质印迹分析robo1、pstat5和notch4的胞内结构域揭示了与其它阶段相比，乳圆顶形成阶段期间的robo1(r1)和pstat5水平较高。相比之下，notch4胞内结构域(n4-icd)在乳圆顶形成阶段期间以较低水平表达(图3l)。这一发现与之前的研究一致，从而表明notch4信号传导在乳腺泡产生过程中减弱
7-9
。在存在和不存在slit2和slit3的两种情况下，使用与抗robo1的免疫共沉淀来下拉早期( egf)和晚期(-egf)阶段中的notch4、致敏和分化(dif)的hc11细胞(图3m)。robo1/notch4复合物形成似乎不受分化(dif)的hc11细胞中的slit2/slit3处理的影响。然而，相对于未经处理的细胞，在存在晚期致敏细胞(-egf)中的slit2和slit3的情况下观察到较少的robo1/notch4复合物形成。robo1/notch4复合物在早期致敏细胞( egf)中未检测到，在对照igg免疫沉淀物中也未检测到。综上所述，这些数据表明，robo1在乳腺泡产生期间直接结合并抑制notch4切割和信号传导，从而阻碍乳腺上皮细胞分化为产奶细胞。
170.robo1抑制原代细胞和哺乳动物中的notch信号传导：
171.由于robo1的丢失增强notch4信号传导并抑制hc11细胞的分化，因此在原代细胞和动物中进一步评估了这一过程。乳腺泡祖细胞经facs纯化，以单细胞密度接种在基质胶中，并且然后使其在补充有神经调节蛋白(100ng/ml)和r-脊椎蛋白(42.5ng/ml)的培养基中生长5天。然后将细胞切换到dip培养基并使其另外分化5天
25
。观察到从robo1-/-乳腺泡祖细胞生长的菌落比从wt乳腺泡祖细胞生长的菌落小，并且robo1-/-菌落不产生wap(图4a)。对经过培养的wt和robo1-/-原代腔细胞执行免疫染色。相对于wt细胞，在robo1-/-原代细胞的细胞核中检测到显著更高水平的notch4胞内结构域(n4-icd)(图4b)。这些研究表明，robo1-/-乳腺泡祖细胞(avp)在细胞核中含有高水平的notch4胞内结构域，并且不像其wt对应物那样产生产奶类器官。这一发现与在robo1-/-乳腺中观察到的被破坏的乳腺泡产生一致(图2)。
172.在另外的工作中，notch信号传导被抑制以试图逆转robo1-/-表型。γ选择了先前已在体内成功地用于抑制包含乳腺
29
的若干不同器官
26-28
中的notch的抑制剂。将成熟的原始动物用10mg/kg的gsi或媒剂对照物处理七天
29
(图4c)。在处理后，采集乳腺并通过facs和qpcr进行分析。据观察，相对于wt对照，robo1-/-乳腺含有更多数量的乳腺泡祖细胞(图4d)。用γ分泌酶抑制剂处理robo1-/-动物导致这些动物具有与wt动物相同数量的乳腺泡祖细胞(图4d)。gsi处理对wt动物中的乳腺泡祖细胞的数量没有影响(图4d)。
173.对notch效应基因(hey1和hes1)的表达的检查揭示了与媒剂处理的动物相比，gsi
处理的动物中notch效应子的表达较少(图4e)。尽管gsi抑制剂不会特异性地靶向notch受体，但此结果表明药物在乳腺中起作用以减少notch信号传导。与来自媒剂处理的wt动物的avp相比，通过媒剂处理的robo1-/-乳腺泡祖细胞(avp)表达了更高水平的hey1和hes1(图4e)。此结果类似于在原代乳腺泡祖细胞和hc11细胞中观察到的结果(图3b、c)。媒剂处理的robo1-/-乳腺泡祖细胞(avp)表达的elf5水平低于来自媒剂处理的wt动物的avp(图4e)。这与robo1-/-乳腺的elf5表达水平低于robo1 / 乳腺(图2h)以及robo1敲低细胞的elf5低于对照(scr)hc11细胞(图3c)的观察结果一致。另外的观察表明，相对于媒剂处理的robo1-/-动物，用gsi处理robo1-/-动物逆转了改变的avp基因表达——来自gsi处理的robo1-/-动物的avp的hey1和hes1表达低于媒剂处理的robo1-/-动物，而来自gsi处理的robo1-/-动物的avp的elf5表达高于媒剂处理的robo1-/-动物(图4e)。综上所述，这项工作表明robo1限制了notch4信号传导。在不存在robo1的情况下，notch4是活化的——这种效应由notch信号传导的药理学抑制(图4e、3e、3f、3i-k)或notch4基因表达的敲低(图3f、g)逆转。
174.robo2抑制乳腺泡产生：
175.抑制动物和细胞中的robo2导致了与抑制robo1表达所产生的表型相反的表型。与对照细胞(scr)相比，在hc11细胞中，抑制robo2表达(robo2 kd)导致更快的分化、更高的wap表达和更大的乳圆顶数量。抑制同一细胞中的robo1和robo2导致乳圆顶数量与阴性对照无法区分(图5a)。
176.在完整的robo2-/-乳腺和对侧移植的robo2-/-生长物两者中评估了乳腺泡产生。相对于通过乳腺泡面积测量的robo2 / 对照乳腺，在完整的robo2-/-乳腺和robo2-/-移植物中观察到显著更快的乳腺泡产生(图5b)。奶基因在完整的原始robo2-/-乳腺(mg)中的表达高于robo2 / 对照，而notch效应基因(hey1、hes1和hey2)在来自robo2-/-完整乳腺的经facs纯化的乳腺泡祖细胞(avp)中的表达低于robo2 / 对照(图5c)。
177.通过rt-qpcr对来自原始乳腺上皮细胞的经facs纯化的亚群中的robo2表达进行评估。与在所有亚群中表达的robo1不同，robo2表达受到更多限制——其在乳腺泡祖细胞(avp)中以高水平表达并且在基底细胞(bc)中以较低水平表达(图5d)。导管祖细胞(dp)中的表达无法与成熟腔细胞(ml)中的表达区分；ml中的表达用于标准化。通过对来自robo2
lacz/
腺体的乳腺切片进行β-半乳糖苷酶(lacz)染色来检查组织中的robo2表达。在妊娠第18天的乳腺泡中的腔细胞亚群(图5e，顶部)中以及沿退休繁育者的导管的基底定位细胞亚群(图5e，底部)中观察到robo2表达。
178.对这些表型和表达数据的一种解释是robo2抑制乳腺泡祖细胞中的robo1。在分化期间，robo2被下调，释放了robo1，其然后抑制notch4，从而形成去抑制回路(robo2-|robo1-|notch4)(图5f左侧)。换句话说，对robo2表达的抑制允许robo1增强乳腺泡分化。对robo1表达的抑制允许notch4抑制乳腺泡分化。
179.robo1与robo2之间的相互作用通过slit增强：
180.slit与robo蛋白之间的相互作用在进化上是保守的，如通过表明人slit2以与类似于其哺乳动物受体的亲和力与果蝇robo1结合并且反之亦然果蝇slit与大鼠robo1和robo2结合的研究所证明的
30
。生化研究表明，此受体/配体对之间的相互作用涉及slit的高度保守的第二lrr结构域和robo的保守ig1结构域，而ig2-ig5结构域和robo1的所有fn3结构域对于结合似乎是不必要的
31-34
。另外，研究表明，robo1和robo2可以以顺式
32
,35
,36
和反
式
37
两者相互结合。这种相互作用还取决于ig结构域。最近的晶体学实验表明，未配体的robo形成了响应于slit打开的紧凑的同型二聚体，从而允许在robo之间形成二聚体的二聚体
38
。
181.所公开的模型表明robo2抑制robo1。为了研究这种抑制是否是由于直接相互作用，使用robo1抗体对hek细胞中的内源性蛋白质执行免疫共沉淀实验。由robo2抗体结合的似乎呈糖基化形式的条带与robo1免疫共沉淀。当使用robo1表达被抑制的细胞执行免疫沉淀时，此条带的强度较低(图5g)。在裂解物制备和使用抗robo1抗体进行免疫共沉淀之前，当用slit2和slit3(各1μg)将细胞处理四小时，观察到robo2的两条强染色条带。这表明slit2和slit3促进了robo1与robo2之间更高效的相互作用(图5g)。
182.robo1受体胞外结构域片段结合robo2：
183.本文所公开的实验表明，robo1和notch4形成抑制notch4活化的复合物，从而表明这两种蛋白质之间的直接相互作用。先前的研究表明，许多跨膜受体的可溶性胞外结构域片段可以阻断跨膜受体之间的同嗜性和异嗜性相互作用以及跨膜受体与其配体之间的相互作用
39
。可以假设可溶性robo1胞外结构域(ecd)可以类似地干扰robo1与robo2之间的相互作用。包括robo1 ecd的构建体可以与内源性robo1竞争与robo2结合，由此允许内源性robo1结合notch4并抑制notch4活化，由此增强乳腺泡分化并促进产奶(图5f右侧)。可溶性robo1 ecd还可以以非互斥的方式直接结合和抑制notch4活化，这也具有增强乳腺泡分化的结果(图5f右侧)。因此，robo1 ecd可以直接和间接抑制notch4活化。
184.构建了三个重组robo1 ecd构建体：一个包括两个免疫球蛋白(ig)结构域(robo1-ig2)，另一个包括所有五个ig结构域(robo1-ig5)，并且另一个包括整个胞外结构域(robo1-ecto)(图6a)。在其它构建体中，ha(血凝素)、myc以及人和小鼠免疫球蛋白fc与robo1 ecd融合(图6a、5f右侧)。构建了结直肠癌(dcc)中缺失的胞外结构域以用作阴性对照，所述胞外结构域是结构上类似于robo1的ig超家族成员，包括两个ig(dcc-ig2)或四个ig(dcc-ig4)结构域并用ha标记(图6a、5f右侧)。构建体的表达分泌通过在hek293细胞中过表达构建体并对细胞裂解物和培养基执行蛋白质印迹证实(图6b)。先前的研究表明，用硫酸乙酰肝素的高度硫酸化变体温育细胞增强了一些细胞外蛋白质的分泌
40
。本文所使用的robo1-ig5在不存在和存在肝素(300ng/ml)的情况下在hek-293细胞中表达。在质粒转染后第二天、第四天和第六天从这些过表达细胞的robo1-ig5中收集培养基。对收集的培养基执行斑点印迹稀释测定，以评估此可溶性robo1 ecd的相对分泌(图6c)。可溶性robo1-ig5分泌在这段时间过程内增加，其中肝素处理导致分泌增加的趋势(图6c)。来自这些robo1-ig5转染细胞的培养基样品也经过tca沉淀并通过蛋白质印迹进行分析，所述蛋白质印迹在不存在和存在肝素的情况下6天后在培养基中显示出完整的robo1-ig5蛋白(图6d)。
185.在存在肝素的情况下产生的可溶性robo1 ecd片段robo1-ig2和robo1-ig5用于圆顶测定。结果表明，在存在肝素的情况下产生的可溶性robo1 ecd片段比在不存在肝素的情况下产生的相同片段形成的圆顶更少(图6e)。因为用肝素处理对robo1 ecd产生只有适度的积极影响并且对其功能具有有害影响(图6c、e)，所以没有继续使用肝素来产生可溶性robo1 ecd片段。通过在cos7细胞中过表达robo2，用叠氮化钠处理细胞以防止蛋白质内在化，并且然后在固定和免疫染色之前用robo1-ecto-ha 1h温育细胞来测试robo1 ecd片段结合robo2受体的能力。结果表明，robo1-ecto-ha与robo2结合，但dcc-ig2-ha不与robo2结
合(图6g)。
186.robo1胞外结构域片段增强hc11细胞分化：
187.为了确定robo1 ecd片段是否影响notch4信号传导，使用相位对比显微镜(图7a、b顶部)以及使用结合中性脂质的疏水性bodipy493/503的荧光显微镜(图7a、b)执行hc11测定以监测圆顶形成。未分化(undif)细胞与相位对比中可见的相互连接的突起不同，并且几乎没有/没有bodipy染色(图7a)。在分化和催乳素处理后，小脂滴积聚，在相位对比中显示为暗边圆圈(图7b，顶部)，并通过bodipy染色显示为点状绿色圆圈(图7b，底部)。bodipy493/503染色揭示了用robo1-ecto处理导致更多数量的细胞完全被脂滴包围(图7b)。
188.对响应于robo1 ecd片段滴定的圆顶数形成进行了定量。较高浓度的robo1-ig2、robo1-ig5和robo-1-ecto与较高的圆顶形成率显著相关。在响应于用dcc-ig2或dcc-ig4对照ecd片段进行处理时未观察到此结果(图7c-g)。在此测定中还测试了牛robo1-ig5构建体，并且与大鼠构建体一样，在响应于用更高浓度的robo1-ecto ecd进行处理时形成了更多的圆顶(图7h)。这些研究共同表明robo1-ecd促进了hc11细胞中的圆顶形成。
189.为了确定促进圆顶形成是否也导致更高的产奶量，在存在或不存在robo1-ecd片段的情况下对hc11细胞进行分化，所述片段与dip培养基同时添加到细胞中。采集细胞并通过rt-qpcr评估wap和lalba的表达。相对于没有处理的对照，用不同的robo1-ecd处理导致表达增加6-9倍(图7i，j)。在用dcc-ig4处理的细胞中，wap表达水平没有增加(图7k)。接下来，对用robo1-ig5和robo1-ecto处理的细胞执行wap和plin2的蛋白质印迹分析。在用robo-1ecd处理的细胞中观察到wap和plin2蛋白表达增加了大约两倍(图7l-o)。
190.robo1胞外结构域片段抑制notch信号传导：
191.为了检查robo1-ecd片段对notch信号传导的影响，用robo1-ecd片段处理hc11细胞并评估notch效应子表达。robo1-ig5和robo1-ecto处理导致hey1和hes1的表达较低(图8a)，尽管在用robo1-ig2处理的细胞中未观察到这种效应(图8a)。另外，在分化期间用robo-ig5处理hc11细胞。然后将这些细胞分级并执行蛋白质印迹以检测hes1和notch4-icd(图8b)。相对于对照处理，用robo1-ig5处理导致细胞核部分中的hes1和notch4-icd(n4-icd)蛋白的水平较低；robo1-ig5处理的细胞质部分中的notch4-icd也较低。综上所述，这些结果表明robo1-ecd抑制notch信号传导。
192.本文公开了一种模型，通过所述模型可溶性robo1 ecd片段结合robo2，从而防止其结合内源性跨膜robo1，并且由此促进干扰notch信号传导的robo1/notch复合物的形成(图5f右侧)。然而，robo1-ecd片段也可能直接结合并抑制notch4。因此，为了测试在不存在robo1的情况下robo1-ecd片段是否抑制notch，hc11细胞中的robo1表达被抑制。然后用robo1-ecd片段处理缺乏robo1表达的细胞，并评估其形成圆顶的能力。如先前观察到的(图7c-e、h)，用robo1-ecd片段处理增加了对照细胞(scr)中的圆顶形成(图8c)。对robo1表达(shrobo1)的抑制也抑制了对照细胞中的圆顶形成(图8c)，如先前观察到的(图1b、3e)。然而，用robo1-ig5处理robo1表达受到抑制的细胞(shrobo1)导致圆顶形成水平与用robo1-ecd片段处理的对照细胞(scr)的圆顶形成水平相同(图8c)。与对照细胞(scr)相比，在不存在robo1-ig5片段的情况下抑制notch4(shnotch4)的表达导致更大的圆顶形成(图8c)，如先前观察到的(图3g)。用robo1-ig5处理这些细胞(shnotch4)导致了与未经处理的notch4
敲低细胞(shnotch4)相同的圆顶形成水平(图8c)。这表明在不存在notch4的情况下，robo1-ig5处理不会进一步增加hc11圆顶形成。综上所述，结果表明notch4是robo1-ig5的直接靶标。
193.robo1胞外结构域片段增强类器官形成和乳腺支化：
194.测试了robo1 ecd片段在体外对原代乳腺泡祖细胞生长以及在体内对分枝形态发生的影响。经facs纯化的鼠类和牛乳腺泡祖细胞(avp)作为单细胞接种在基质胶中，并在不存在和存在robo1-ecd片段的情况下生长10天(图9a、b)。与未经处理的对照相比，用robo1-ecd处理产生更多的鼠类器官(图9a)。与未经处理的对照相比，用robo1-ig5处理产生更大的牛类器官(图9b)。还通过将robo1-ig5片段(7.5个乳腺/kg/天)皮下注射到卵巢切除的动物体内来对其进行体内测试，所述卵巢切除的动物口服nutella中的激素:雌激素(e，1μg/天)、孕酮(p，1mg/天乳腺/天)和催乳素(prl，0.2mg/天乳腺/天)(图9c)。在robo1-ig5片段处理14天后采集乳腺，进行胭脂红染色和评估。相对于未经处理的对照，robo1-ig5处理产生显著更大的面积和更多数量的一级(1
°
)分支(图1d)。还观察到腺体的更多二级(2
°
)和三级(3
°
)分支；然而，因为腺体区域的大小在支化较大的腺体中更大，所以经处理的腺体的总支化密度与对照组的没有差异(图1e)。综上所述，这项研究表明，体内robo1-ig5处理导致乳腺具有显著更多的分支。其它方面可以涉及用鼠类-fc序列标记的robo1-ecd构建体。此标签由促进转运到组织中的内源性受体识别
41
。
195.robo1胞外结构域片段增加小叶乳腺泡乳腺发育和产奶：
196.研究了体内robo1 ecd-fc片段对妊娠期间小叶乳腺泡发育的影响。在妊娠期间皮下注射三次(妊娠日期(pd)第8.5天、pd 11.5和pd 14.5)robo1 ecd片段(7.5mg/kg)和模拟注射的对照(图10a)。在pd 17.5时采集乳腺，并通过连续切片、苏木精和伊红(h&e)染色分析乳腺泡产生，并且然后对定位于组织顶部、中部和底部的切片中乳腺泡所占据的区域进行定量。如先前观察到的，与wt、模拟注射的乳腺相比，robo1-/-的乳腺泡面积显著减少，并且robo1-/-乳腺泡大小减小(图10b、c、f箭头、星号)。与模拟注射的对照相比，将robo1 ecd-fc片段注射到wt和robo1-/-动物中导致乳腺泡面积和充满乳滴的乳腺泡显著增加。
197.为了进一步评估产奶量，对奶蛋白基因乳清酸性蛋白(wap)、黄嘌呤脱氢酶(xdh)和β-酪蛋白(csn2)执行了rt-qpcr。与对照处理相比，用robo1 ecd-fc处理的奶蛋白基因表达显著增加(图11a-c)。还使用针对乳汁的抗体(#ynrmtm，精密化学科技公司(accurate chemical and scientific corp))通过切片组织的免疫组织化学在蛋白质水平上评估乳汁表达。同样，通过将robo1 ecd注射到wt或robo1-/-动物中，观察到乳汁显著增加(图11d-h)。这些数据共同表明，将robo1 ecd片段皮下注射到妊娠动物体内增加了小叶乳腺泡发育、奶蛋白基因和产奶量。
198.乳腺的基底细胞需要robo1来进行乳腺泡分化和产奶：
199.乳腺是由外基底细胞(基底区室)和内腔细胞(内腔区室)构成的双层组织(图1a)。在乳腺的内腔和基底细胞两者中均检测到robo1表达(图1d-g)。为了确定robo1在哪种细胞类型中起作用以使乳腺泡祖细胞分化为产奶乳腺泡细胞，产生了在robo1的表达中嵌合的类器官，使得包括基底区室或内腔区室的细胞由robo1-/-细胞构成(图12c、d)。作为对照，wt和robo1-/-类器官由包括基底区室和内腔区室(wt/wt和ko/ko)的wt和ko细胞产生(图12a、b)。对于wt组织(gfp / )，使用actb-egfp小鼠以区分wt与ko细胞。类器官是通过差异
胰蛋白酶消化以分离两个种群，随后混合分离的基底亚群和内腔亚群以产生类器官(wt/wt，ko/ko，wt/ko，ko/wt)而产生的，所述类器官然后在基质胶中培养，随后分化5天。包括gfp / 基底细胞和gfp / 腔细胞两者的wt/wt类器官形成大的双层类器官，其在分化后产生充满内腔的乳汁(图12a)。相比之下，包括robo1-/-基底细胞和robo1-/-腔细胞的ko/ko类器官产生较小的双层结构，其在分化后很少或不产生乳汁(图12b)。当robo1-/-基底细胞与wt腔细胞(ko/wt)混合时，所得的嵌合类器官在分化后很少/不产生乳汁(图12c)。然而，当wt基底细胞与robo1-/-腔细胞(wt/ko)混合时，所得的类器官产生乳汁(图12d)，类似于wt/wt类器官中的产奶量(图12a)。这些数据表明，为了使腔细胞在激素刺激后产生乳汁，需要在乳腺的基底区室而不是内腔区室中表达robo1。
200.robo1抑制基底细胞中的jagged1表达：
201.用于调节notch表达的一种方法是控制notch配体jagged1、jagged2或delta的表达水平。为了研究robo1是否调节notch配体表达，用表达robo1的增加数量的质粒转染细胞。48小时后，采集细胞并用针对robo1、jagged1(jag1)和gapdh(上样对照)的抗体执行免疫印迹(图13a)。数据显示增加robo1表达导致jagged 1表达降低。接下来使用sirna敲低robo1表达。48小时细胞后，通过免疫印迹评估jagged1和jagged表达。观察到jagged1的表达增加而jagged2的表达没有变化(图13b、c)。为了检查jagged1的这种调节是否在体内发生，使用荧光活化细胞分选(facs)将原代wt和robo1-/-乳腺上皮细胞亚群纯化为基底亚群、内腔亚群和基质亚群，并且然后通过免疫印迹分析jagged1和细胞角蛋白14(ck14)(上样对照)(图13d)。与robo1 / 基底细胞相比，在robo1-/-中观察到更多的jagged1。腔细胞中没有可检测到的表达，并且基质细胞中仅有适度的表达；这些数据类似于通过敲低细胞系中的robo1表达而获得的结果(图13b)。还通过对robo1 / 和robo1-/-类器官进行免疫染色来评估jagged1表达(图13e、f)。与robo1 / 类器官相比，在robo1-/-的基底细胞中观察到更多的jagged1表达。综上所述，这些数据表明robo1抑制乳腺基底细胞中的jagged1表达，并且robo1的丢失导致jagged1增加。jagged1表达增加将增强邻近乳腺泡祖细胞中的notch信号传导，从而抑制其分化为产奶乳腺泡细胞。因此，robo1调节产奶量的一种机制是控制乳腺的基底区室中notch配体jagged1的水平。
202.材料与方法
203.动物：
204.所有动物程序均根据加利福尼亚大学圣克鲁斯分校(ucsc)机构动物护理和使用委员会(iacuc)执行。所有robo1小鼠如前所述产生并进行基因分型
11
。
205.乳腺脂肪垫清除和移植：
206.来自8周龄wt和robo1 ko小鼠的小乳腺组织片段被对侧移植到foxn1
nu
的预先清除的脂肪垫中。在妊娠第18.5天采集对侧的生长物并进行胭脂红染色。
207.乳腺整体胭脂红-明矾测定：
208.小鼠乳腺被手术解剖，铺在载玻片上，并固定在卡诺依氏(carnoy's)溶液(25％冰醋酸和75％乙醇)中。短暂脱水后，腺体在0.2％胭脂红和0.5％硫酸铝钾中染色过夜，在乙醇分级溶液(70％、95％和100％)中脱水，在甲苯中澄清；并用封片剂装载。
209.脂肪垫填充分析：
210.将石蜡包埋的robo1 ko或wt同窝组织或对侧生长物切片并进行苏木精和伊红(h&
e)染色。使用imagej分析图像，并通过测量乳腺泡所占据的面积来计算脂肪垫填充百分比。
211.免疫组织化学和β-半乳糖苷酶染色：
212.将组织固定在4％多聚甲醛中。石蜡包埋的组织以6μm切片并连续装载。根据标准方案进行免疫组织化学。对于β-半乳糖苷酶染色，在含有1m mgcl2和10mm亚铁氰化钾的1m磷酸盐缓冲液中制备40mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳吡喃糖苷。将组织的冷冻切片在37℃下用获得的溶液处理1.5-24小时，用pbs洗涤，通过乙醇脱水，用二甲苯固定并盖上盖玻片
42
。
213.显微镜检查：
214.在biorevo bz-9000数码显微镜(基恩士公司(keyence))上执行明场成像，并且在尼康(nikon)c2共聚焦显微镜、莱卡(leica)sp5共聚焦显微镜上执行共聚焦显微镜检查。使用imagej分析收集的数据。
215.免疫共沉淀：
216.粘附细胞在1ml 1x裂解缓冲液(137nm nacl、10mm tris-hcl ph8、2nm edta、1mm原钒酸钠)中裂解，所述裂解缓冲液中补充有1％igepal np40(西格玛公司(sigma))、1mm苯甲磺酰氟(pmsf)、1mm亮抑酶肽、1mm抑肽酶和磷酸酶抑制剂(roche complete)。将细胞裂解物在4℃下轻轻摇动温育15分钟，随后以12,000rpm离心10分钟。用与1μg抗体缀合的戴诺磁珠蛋白a(赛默飞世尔公司(thermo-fisher))将可溶性相在室温下温育1小时或在4℃下温育4小时。按照方案洗涤和洗脱样品。将洗脱的蛋白质复合物与2x裂解缓冲液混合，并在70℃下温育10分钟，在100℃下温育5分钟。
217.蛋白质印迹：
218.通过在补充有5％β-巯基乙醇的1x样品缓冲液中直接裂解粘附细胞来制备蛋白质裂解物，并将其煮沸5分钟。通过sds-page解析蛋白质裂解物，并将其在400ma下转移到pvdf持续90分钟或在30ma下过夜。一级抗体按表1中指示的浓度使用，并在4℃下温育过夜。以1:3000使用hrp缀合的二级抗体(杰克森实验室(jackson labs))，并将其在室温下温育45分钟。如前所述，所有蛋白质均通过使用biorad chemi-doc mp成像仪的clarity ecl(伯乐公司(biorad))进行检测，并使用imagelab软件进行定量
43
。
219.2d细胞培养物：
220.所有细胞系均从美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)获得。mda-mb-231细胞在补充有10％热灭活fbs(seradigm)和1x抗生素抗真菌剂(gibco)的dmem生长培养基(gibco)中培养。未分化的hc11细胞在rpmi-1640生长培养基(gibco)中培养并补充有10μg/ml牛胰岛素(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))和10ng/ml人egf(派普泰克公司(peprotech))。如前所述，从8周龄robo1 ko或wt同窝幼崽中采集原代lec
15
。
221.3d细胞培养物：
222.经facs纯化的avp在基质胶(bd生物科学公司(bd bioscience))中以5000个细胞/100ul的密度培养，并在基础培养基dmem：补充有100ng/ml神经调节蛋白(r&d公司)、42.5ng/ml r-脊椎蛋白1(派普泰克)的f12无酚、10mm hepes、n2(gibco)、b27(gibco)中培养5天。为了进行区分，使培养出的avp在补充有10-6
m地塞米松(西格玛公司)、10μg/ml牛胰岛素(西格玛公司)和5μg/ml催乳素(国家激素和肽计划)的基础培养基中另外生长5天。腺
泡如前所述进行固定和处理
44
。
223.hc11圆顶测定：
224.hc11细胞在补充有10％胎牛血清(生物流体技术公司(biofluid technologies))、5μg/ml胰岛素(西格玛公司)和10ng/ml表皮生长因子(egf；西格玛公司)的rpmi 1640培养基(gibco)中生长。为了在hc11细胞中诱导分化，向汇合板提供新鲜培养基(补充有5％炭剥离胎牛血清(生物流体技术公司)、5μg/ml胰岛素和10ng/ml表皮生长因子(egf；西格玛公司)的rpmi 1640培养基)持续3天，随后在引发培养基(补充有5％炭剥离胎牛血清(生物流体技术公司)和5μg/ml胰岛素的rpmi 1640培养基)中引发24小时。引发后，每24小时向dip培养基(补充有5％炭剥离胎牛血清(生物流体技术公司)、10-6
m地塞米松(西格玛公司)、5μg/ml胰岛素和5μg/ml催乳素(国家激素和肽计划)的rpmi 1640培养基)添加新鲜培养基。
225.慢病毒产生：
226.用于加扰的robo1、robo2和notch4敲低实验的慢病毒颗粒的产生涉及将pspax2、pmd2.g和plvthm-加扰-gfp(scr)或plvthm-sh-target gfp组合转染到hek293t细胞中。然后将过滤的(0.45um)病毒颗粒稀释在培养基中以感染靶乳腺系(mda-mb-231和hc11细胞)。
227.乳腺上皮细胞的分离和流式细胞术：
228.如所描述的，将机械解离的腹股沟和胸部乳腺脂肪垫制备成细胞悬浮液以用于facs
17
。如所描述的，使用fitc-cd14(克隆sa14-2；生物传奇公司(biolegend))和acp-cy7-cd117(克隆2b8；生物传奇公司)分离avp
14
。
229.体内γ分泌酶抑制剂(gsi)：
230.如所描述的，gsi抑制剂(ro4929097；medchemexpress)以10mg/kg的剂量口服施用5天
29
。在gsi或媒剂处理5天后采集乳腺，并制备用于单细胞分析。收集纯化的种群，并针对rna进行处理。使用flowjo分析纯化的种群数量。
231.rna提取和rt-qpcr：
232.从在trizol试剂(英杰公司(invitrogen))中裂解的细胞中采集总rna，并根据制造商的方案将相位与乙醇中另外的过夜rna沉淀茎分离(macias等人，2011)。用turbo dnase(安柏恩公司(ambion))处理进一步纯化rna。通过琼脂糖凝胶电泳分析rna总质量，并用nd-1000分光光度计(nanodrop)定量。使用iscript cdna合成试剂盒(伯乐公司)从1μg总rna中制备cdna文库。使用light cycler 480sybr green i混合器(roche)一式三份地执行定量rt-pcr，并使用伯乐公司cfx'connect实时系统和cfx manager软件(伯乐公司)进行定量。结果归一化为gapdh。
233.robo1胞外结构域产生：
234.为了产生蛋白质片段，用对应于所关注片段的质粒转染hek细胞。根据cytographica方案执行pei转染。转染24小时后，将培养基更换为optimem。转染后8天，收集培养基并以3000xg离心10分钟。然后将上清液通过0.45μm pvdf过滤器进行过滤。
235.tca沉淀：
236.将1体积的tca储液添加到4体积的蛋白质样品中。在4℃下温育10分钟。将试管在微量离心机中以14k rpm的速度旋转5分钟。去除上清液，保持蛋白质沉淀物完整，用200μl冷丙酮清洗沉淀物。在微量离心机中以14k rpm的速度旋转5分钟。重复步骤4-6，总共进行2
次丙酮洗涤。在悬浮在样品缓冲液中之前干燥沉淀物。
237.bodipy 493/503染色：
238.将细胞放置在半体积的缓冲液或培养基中。制备invitrogen
tm
bodipy
tm
493/503染料在0.5ml体积的相同预热缓冲液或培养基(无细胞、无bsa或血清)中的2x溶液(2μg/ml＝7.6μm)，并剧烈混合以机械乳化此溶液。立即添加到细胞溶液中，混合并温育至多30分钟。
239.cubic免疫荧光：
240.采集腺体，并用10％中性缓冲福尔马林(西格玛公司)在4℃下固定过夜。用含有0.2％甘氨酸(飞世尔科技公司(fisher scientific))的pbst(0.1％triton x-100；西格玛公司)淬灭固定，持续2
×
10分钟。然后将腺体在cubic试剂1a中在37℃下温育48小时，随后如所描述的用pbst洗涤3
×
10分钟
45
。将腺体在4℃下用pbst/10％驴血清(西格玛公司)封闭过夜，并且然后用pbst/5％驴血清中的一级抗体在4℃下温育48小时。然后用pbst将腺体洗涤3
×
1小时，并用稀释在pbst/5％驴血清中的二级抗体在4℃下温育24小时。为了复染dna，将腺体用稀释在pbst中的hoechst温育1小时，然后用pbst洗涤2
×
1小时。最后，将腺体用cubic试剂2在4℃下温育，直到其被清除，这通常需要24小时。
241.导管内注射：
242.注射准备：使用异氟醚室和涂抹的眼部润滑剂麻醉小鼠。通过鼻锥用含2-4％异氟醚的氧气连续麻醉小鼠。用nair化学脱毛剂去除乳头区域的毛发。注射：在妊娠第7天，用附接到50μl注射器的33号斜端针头(hamilton)将pbs或robo2 mab双侧注射到腺体#3、#4、#5的乳头中。注射执行得非常缓慢(大约40微升/分钟)，以最大程度地减少导管内腔内快速流动的流体造成的潜在损害。注射后：将动物从鼻锥中取出，并移到单独的笼子中进行恢复
46
。
243.卵巢切除术、激素处理和皮下注射：
244.双侧切除c57bl小鼠(8-10周龄)的卵巢，并允许恢复1周
47
。在恢复期间，小鼠接受口服nuttella的训练。给小鼠投喂混合有17β-雌二醇(e，1μg，西格玛公司) 孕酮(p，1mg，西格玛公司)的nutella持续三周(每天)。对于robo1-ig5 ecd，催乳素(prl，200μg，nhpp)通过nutella口服施用在从1周e p后开始的一周(每天)内给予。对于robo2 mab，催乳素(prl，50μg)通过腹膜内注射在从1周e p后开始的2.5周(每天)内进行注射。robo1-ig5 ecd在从1周e p后开始的2周时段内进行皮下注射(7.5mg/kg robo1-ig5 ecd或pbs；每天)。robo2 mab或igg同种型对照mab(250μg/小鼠)在从1周的e p后开始的17天内每周两次进行皮下注射
48
。
245.引物：
[0246][0247]
抗体：
[0248][0249]
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[0298]
尽管本文中已经示出并且描述了本发明的优选方面，但是对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，此类方面仅通过举例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应当理解的是，本文所描述的本发明的各方面的不同替代方案可以用于实践本发明。以下权利要求旨在限定本发明的范围以及由此覆盖在这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
[0299]
出于完整性的原因，本公开的多肽、组合物和方法的某些方面在以下编号的条款中阐述：
[0300]
1.一种促进哺乳动物产奶的方法，所述方法包括：
[0301]
以足以抑制notch4活性的量向所述哺乳动物施用抑制notch4活性的第一药剂，由此促进产奶。
[0302]
2.根据条款1所述的方法，其中所述第一药剂通过直接与notch4蛋白结合、通过抑制robo2与robo1的结合、通过促进robo1与notch4的结合、通过抑制notch4的表达或通过抑制robo2的表达来抑制notch4活性。
[0303]
3.根据条款1所述的方法，其中所述第一药剂包括可溶性robo1胞外结构域(ecd)。
[0304]
4.根据条款3所述的方法，其中所述可溶性robo1 ecd是鼠类、牛、绵羊、山羊、骆驼或人robo1 ecd。
[0305]
5.根据条款3或4所述的方法，其中所述robo1 ecd包括异源多肽。
[0306]
6.根据条款5所述的方法，其中所述异源多肽包括his标签、血凝素标签、免疫球蛋白(ig)fc区或myc标签。
[0307]
7.根据条款1所述的方法，其中所述第一药剂包括抑制notch4或robo2的表达的rnai构建体。
[0308]
8.根据条款7所述的方法，其中所述rnai构建体是短干扰rna。
[0309]
9.根据条款1所述的方法，其中所述第一药剂包括抗notch4抗体或其notch4结合片段。
[0310]
10.根据条款9所述的方法，其中所述第一药剂包括多种多克隆抗notch4抗体。
[0311]
11.根据条款9所述的方法，其中所述抗notch4抗体或其notch4结合片段是单克隆抗体或其notch4结合片段。
[0312]
12.根据条款10所述的方法，其中所述多克隆抗notch4抗体是鼠类、牛、绵羊、山羊、骆驼或人多克隆抗体，并且其中产生所述多克隆抗体的物种与施用所述第一药剂的哺乳动物的物种相匹配。
[0313]
13.根据条款11所述的方法，其中所述单克隆抗体或其notch4结合片段是牛、绵羊、山羊或人单克隆抗体或其notch4结合片段，并且其中所述单克隆抗体源自于的物种与施用所述第一药剂的哺乳动物的物种相匹配。
[0314]
14.根据条款13所述的方法，其中所述抗notch4单克隆抗体或其notch4结合片段是牛化的、绵羊化的、山羊化的、骆驼化的或人源化的。
[0315]
15.根据条款1所述的方法，其中所述第一药剂包括可溶性robo1胞外结构域，所述方法进一步包括以足以抑制notch4活性的量向所述哺乳动物施用抑制notch4活性的第二药剂。
[0316]
16.根据条款15所述的方法，其中所述第二药剂包括抑制notch4或robo2的表达的rnai构建体。
[0317]
17.根据条款16所述的方法，其进一步包括第三药剂包括抑制notch4或robo2的表达的rnai构建体。
[0318]
18.根据条款1所述的方法，其中所述方法包括施用抑制notch4活性的第一药剂、第二药剂、第三药剂和第四药剂中的至少一种，其中所述第一药剂、所述第二药剂、所述第三药剂和所述第四药剂中的每种药剂独立地选自可溶性robo1 ecd、抗notch4抗体、抑制notch4的表达的rnai构建体以及抑制robo2的表达的rnai构建体。
[0319]
19.一种多肽，其包括：
[0320]
与异源多肽融合的可溶性robo1胞外结构域。
[0321]
20.根据条款19所述的多肽，其中所述可溶性robo1 ecd是鼠类、牛、绵羊、山羊或人robo1 ecd。
[0322]
21.根据条款20所述的多肽，其中所述异源多肽包括his标签、血凝素标签、人或鼠类fc区、myc标签或荧光蛋白。
[0323]
22.一种药物组合物，其包括：
[0324]
根据条款19到21中任一项所述的多肽以及药学上可接受的载体。
[0325]
23.根据条款22所述的药物组合物，其用于促进哺乳动物产奶。
[0326]
24.一种抑制notch4活性的抗notch4抗体或其notch4结合片段。
[0327]
25.根据条款24所述的抗体，其中所述抗体包括多种多克隆抗体。
[0328]
26.根据条款24所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或其notch4结合片段。
[0329]
27.根据条款24到26中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括牛、绵羊、山羊、骆驼或人多克隆抗体或单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的至少一部分包括来自牛、绵羊、山羊
或人抗体的抗体序列。
[0330]
28.根据条款26所述的抗体，其包括牛化、绵羊化、山羊化、骆驼化或人源化抗体或其任何抗原结合片段。
[0331]
29.一种药物组合物，其包括根据条款24到28中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。
[0332]
30.根据条款29所述的药物组合物，其用于促进哺乳动物产奶。
[0333]
31.一种多核苷酸，其包括抑制robo2或notch4的表达的rnai构建体。
[0334]
32.根据条款31所述的多核苷酸，其包括至少一种非天然存在的核苷酸。
[0335]
33.根据条款31或32所述的多核苷酸，其包括seq id no:32到seq id no:35中的一个或多个。
[0336]
34.一种药物组合物，其包括根据条款31到33中任一项所述的多核苷酸。
[0337]
35.根据条款34所述的药物组合物，其用于促进哺乳动物产奶。
[0338]
36.一种转基因哺乳动物，其包括产生以下表型中的一种或多种表型的基因修饰：表达可溶性robo1胞外结构域；抑制robo2的表达；以及抑制notch4的表达。
[0339]
37.根据条款36所述的转基因动物，其中所述表型仅限于乳腺组织。
[0340]
38.根据条款36或37所述的转基因哺乳动物，其中所述转基因动物是牛、绵羊、山羊或骆驼。
[0341]
39.根据条款36到38中任一项所述的转基因哺乳动物，其包括产生所列出的表型中的两种表型的两种基因修饰。
[0342]
40.根据条款36到38中任一项所述的转基因哺乳动物，其包括产生所列出的表型中的所有三种表型的三种基因修饰。
[0343]
41.一种促进产奶的方法，所述方法包括：
[0344]
向根据权利要求36到40中任一项所述的转基因哺乳动物施用抑制notch4活性的药物组合物。
[0345]
42.根据条款41所述的方法，其中所述药物组合物是根据条款22到23、29到30和34到35中任一项所述的组合物。
[0346]
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述转基因动物包括使可溶性robo1胞外结构域表达的基因修饰，所述方法进一步包括向所述转基因动物施用根据条款22到23、29到30和34到35中任一项所述的药物组合物。
[0347]
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述转基因哺乳动物包括使对robo2和/或notch4的表达抑制的基因修饰，所述方法进一步包括向所述转基因动物施用根据条款34或35所述的药物组合物。