重组抗体及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，具体地，涉及重组抗体及其应用，更具体地，涉及重组抗体、免疫细胞、核酸、表达载体、重组细胞、组合物、上述物质在制备药物中的用途、试剂盒。


背景技术：

2.b7h6是属于b7家族的i型跨膜蛋白，它包含了2个免疫球蛋白结构域。b7h6也是nk细胞活化性受体nkp30的配体。b7h6在多种肿瘤细胞上均有表达，但是在人的正常组织和健康外周血单核细胞并没有检测到b7h6的mrna。在炎症环境中，一些促炎性细胞因子如il-1β和tnf可以刺激cd14 和cd16 单核细胞和中性粒细胞上调表达b7h6。b7h6的肿瘤表达谱非常广泛，这包括白血病、淋巴瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌和肝癌等。b7h6的表达与一些癌症的转移也存在关联，但是在多数肿瘤中b7h6的作用目前还不清楚。目前，尽管b7h6在多种肿瘤中表达，但是针对这一分子的肿瘤治疗手段并不多。有研究者开发了针对b7h6的双特异性抗体，它的构建形式是bite，这种形式不含有天然抗体的恒定区，因此也决定了这种分子在体内的半衰期很短，很大程度上限制了其使用。
3.自然杀伤细胞(natural killer cells，nk细胞)是组成固有免疫系统的重要成员，与t细胞不同的是，nk细胞并不表达抗原特异性受体。nk细胞本身具有广谱的肿瘤杀伤能力，在增强抗体和t细胞应答中也起到了重要作用。目前，基于nk细胞的肿瘤免疫治疗形式多样，采用的手段也不尽相同。cd16分子是nk细胞表面重要标志，它可以激活ige nk细胞受体(fcεriγ)和cd3ζ的免疫受体酪氨酸活化基序(itam)发生adcc作用。因此，cd16靶点在基于nk细胞再导向的双特异性抗体中被优先选择。
4.目前在临床和在研发阶段的b7h6双特异性抗体均为基于t细胞开发的，还没有基于nk细胞开发的b7h6双特异性抗体。研究发现t细胞再导向类型的双特异性抗体可以活化t细胞使之释放肿瘤坏死因子(tnf)，tnf可以活化单核细胞产生il-6和il-1β等炎性细胞因子，最终导致临床出现高热等不良反应，这也是目前很多双特异性抗体在临床由于副作用被终止的原因。nk细胞相比t细胞其杀伤能力更强，但分泌细胞因子的水平更低，因此在临床不良事件发生的频率也更低，因此，开发靶向性强的双特异性抗体对肿瘤的预防及治疗具有极大的价值。


技术实现要素：

5.本技术是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
6.本发明中，发明人对cd16、b7h6抗原结合片段进行组合和筛选，设计了重组双特异性抗体，所述重组双特异性抗体可以特异性结合cd16和b7h6，进而靶向性地将b7h6分子带入到肿瘤细胞附近，通过与肿瘤细胞上的b7h6分子结合促使cd16 的淋巴细胞与肿瘤细胞形成免疫突触，从而使淋巴细胞活化杀伤b7h6 的肿瘤细胞，所述重组双特异性抗体具有较高的cd16和b7h6结合活性，较长的体内半衰期，且抗肿瘤活性较高。
7.因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，含有选自下列至少之一的cdr序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：cd16抗体可变区cdr序列：seq id no:1～6；b7h6抗体可变区cdr序列：seq id no:7～12。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与cd16、b7h6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
8.gghnigsknvh(seq id no:1)。
9.qdnkrps(seq id no:2)。
10.qvwdnysvl(seq id no:3)。
11.syymh(seq id no:4)。
12.iinpsggstsyaqkfqg(seq id no:5)。
13.gsayyydfady(seq id no:6)。
14.kasqsvdydgdsymn(seq id no:7)。
15.aastlhs(seq id no:8)。
16.qqskedprt(seq id no:9)。
17.dynmd(seq id no:10)。
18.dinpnnggtlynqkfrg(seq id no:11)。
19.sevfygnyady(seq id no:12)。
20.在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，具有seq id no：20和21所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与cd16、b7h6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
21.qpvltqpssvsvapgqtatiscgghnigsknvhwyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvlggggsggggsggggsevqlvqsgaevkkpgeslkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargsayyydfadywgqgtlvtvssepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：20)。
22.divltqtplslsvtpgqpasisckasqsvdydgdsymnwylqkpgqppqlliyaastlhsgipdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycqqskedprtfgqgtkleikggggsggggsggggsevqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdynmdwvrqapgqglewigdinpnnggtlynqkfrgrvtltvdtsistaymelsrlrsddtavyycarsevfygnyadywgqgttvtvssepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：21)。
23.在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码第一方面所述的重组抗体。根据本发明实施例的核酸编码的重组抗体可以有效与cd16、b7h6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
24.在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带第三方面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序
列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组抗体，进而可有效用于对肿瘤，特别是表达b7h6的肿瘤的特异性治疗或预防。
25.在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第一方面或第二方面所述的重组抗体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达上述重组抗体，所述重组细胞可有效用于对肿瘤，特别是表达b7h6的肿瘤的特异性治疗或预防。
26.在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd16或b7h6蛋白分子结合，进而可特异性识别高表达所述b7h6的肿瘤细胞，并促使t细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的组合物同样具有显著的治疗或预防表达b7h6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
27.在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗或预防肿瘤。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd16和b7h6蛋白结合，进而可特异性识别特异性高表达所述b7h6的肿瘤细胞，利用所述重组抗体及其相应的一系列物质制备的药物同样具有显著的治疗或预防表达b7h6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
28.在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物，包括：第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物，所述药物用于治疗或预防癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd16和b7h6蛋白分子结合，进而可特异性识别高表达所述b7h6的肿瘤细胞，并促使t细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的药物同样具有显著的治疗或预防表达b7h6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
29.在本发明的第九方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，包括：第一方面或第二方面所述的重组抗体。根据本发明实施例的抗体可以有效与cd16和b7h6蛋白分子结合，进而可特异性识别特异性高表达所述b7h6的肿瘤细胞，因此，所述重组抗体可用于制备诊断或检测直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一的试剂盒，所述试剂盒可用于科学研究，如检测生物样本是否携带cd16和/或b7h6蛋白。
30.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
31.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
32.图1是根据本发明实施例的重组双特异性抗体的结构示意图；
id no:13和seq id no:14所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
55.qpvltqpssvsvapgqtatiscgghnigsknvhwyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvl(seq id no:13)。
56.evqlvqsgaevkkpgeslkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargsayyydfadywgqgtlvtvss(seq id no:14)。
57.根据本发明的一些具体实施例，所述抗体含有b7h6抗体的可变区，所述b7h6抗体的可变区具有如seq id no:15所示的轻链可变区，和seq id no:16所示氨基酸序列的重链可变区，或者与seq id no:15和seq id no:16所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。
58.divltqtplslsvtpgqpasisckasqsvdydgdsymnwylqkpgqppqlliyaastlhsgipdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycqqskedprtfgqgtkleik(seq id no:15)。
59.evqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdynmdwvrqapgqglewigdinpnnggtlynqkfrgrvtltvdtsistaymelsrlrsddtavyycarsevfygnyadywgqgttvtvss(seq id no:16)。
60.根据本发明的一些具体实施例，进一步包括连接肽。
61.根据本发明的一些具体实施例，所述连接肽具有seq id no:17所示的氨基酸序列。
62.ggggsggggsggggs(seq id no:17)。
63.根据本发明的一些具体实施例，所述连接肽的n端与所述cd16抗体轻链可变区的c端相连，所述连接肽的c端与所述cd16抗体重链可变区的n端相连。
64.根据本发明的一些具体实施例，所述所述连接肽的n端与所述b7h6轻链可变区的c端相连，所述连接肽的c端与所述b7h6重链可变区的n端相连。
65.根据本发明的一些具体实施例，还含有第一fc区和第二fc区，所述第一fc区和第二fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
66.根据本发明的一些具体实施例，所述第一fc区和第二fc区的至少一部分来自人源igg或其突变体。
67.根据本发明的一些具体实施例，所述第一fc区和第二fc区的至少一部分来自人源igg1或其突变体。
68.根据本发明的一些具体实施例，所述第一fc区与野生型igg1 fc区相比具有s380c突变和t392w突变中的至少之一。
69.根据本发明的一些具体实施例，所述第二fc区与野生型igg1 fc区相比具有y380c突变、t397s突变、l399a突变和y408v突变中的至少之一。
70.根据本发明的一些具体实施例，所述第一抗体fc区具有如seq id no:18所示的氨基酸序列，所述第二抗体fc区具有如seq id no:19所示的氨基酸序列。
71.epkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:18)。
72.epkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgve
vhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:19)。
73.在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组抗体。根据本发明的实施例，具有seq id no：20和21所示的氨基酸序列。根据本发明实施例的重组抗体可以有效与cd16、b7h6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
74.qpvltqpssvsvapgqtatiscgghnigsknvhwyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvlggggsggggsggggsevqlvqsgaevkkpgeslkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargsayyydfadywgqgtlvtvssepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppcrdeltknqvslwclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：20)。
75.divltqtplslsvtpgqpasisckasqsvdydgdsymnwylqkpgqppqlliyaastlhsgipdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycqqskedprtfgqgtkleikggggsggggsggggsevqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdynmdwvrqapgqglewigdinpnnggtlynqkfrgrvtltvdtsistaymelsrlrsddtavyycarsevfygnyadywgqgttvtvssepkscdkthtcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvctlppsrdeltknqvslscavkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflvskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no：21)。
76.药物及组合物
77.在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸，所述核酸编码前面所述的重组抗体。根据本发明一些具体实施例的核酸编码的重组抗体可以有效与cd16、b7h6进行结合，具有较强的体内、外结合活性，以及较长的体内半衰期，抗肿瘤效果显著。
78.根据本发明的一些具体实施例，所述核酸具有seq id no：26和27所示的核苷酸序列。
79.需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本技术中的核酸序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
80.在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体，所述表达载体携带前面所述的核酸分子。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明一些具体实施例所提出的表达载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述重组抗体，进而可有效用于对肿瘤，特别是表达b7h6的肿瘤的特异性治疗或预防。
81.在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞携带第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第一方面或第二方面所述的重组抗体。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的一些具体实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达上述重组抗体，所述重组细胞可有效用于对肿瘤，特别
是表达b7h6的肿瘤的特异性治疗或预防。
82.需要说明的是，本技术说明书中所述的“适合条件”，是指适合本技术所述重组抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合重组抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述重组抗体表达的条件。
83.在本发明的第六方面，本发明提出了一种组合物，包括第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体或第五方面所述的重组细胞。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd16和b7h6蛋白分子结合，进而可特异性识别高表达所述b7h6的肿瘤细胞，并促使t细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的组合物，如食品组合物、药物组合物等，同样具有显著的治疗或预防表达b7h6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
84.在本发明的第八方面，本发明提出了一种药物，包括：第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物，所述药物用于治疗或预防癌症。如前所述，本发明实施例的重组抗体可以有效与cd16和b7h6蛋白分子结合，进而可特异性识别高表达所述b7h6的肿瘤细胞，并促使t细胞选择性地定位到肿瘤局部而不是在外周循环，避免全身活化，包含所述重组抗体的药物同样具有显著的治疗或预防表达b7h6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
85.根据本发明的一些具体实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
86.根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
87.根据本发明的一些具体实施例提供的药物，包括药学上可接受的载体和有效量的所述抗体活性成分。
88.如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
89.如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
90.本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
91.本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药
的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
92.本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
93.用途
94.在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面或第二方面所述的重组抗体、第三所述的核酸分子、第四方面所述的表达载体、第五方面所述的重组细胞或第六方面所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤。如前所述，本发明一些具体实施例提供的重组抗体可以有效与cd16蛋白和b7h6蛋白结合，进而可特异性识别特异性高表达所述b7h6的肿瘤细胞，利用所述重组抗体及其相应的一系列物质制备的药物同样具有显著的治疗或预防表达b7h6的肿瘤的作用，其安全性更高、副作用更小。
95.根据本发明的一些具体实施例，上述用途还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
96.根据本发明的一些具体实施例，所述癌症包括下列中的至少之一：直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌。
97.试剂盒
98.在本发明的第九方面，本发明提出了一种试剂盒，包括：第一方面或第二方面所述的重组抗体。本发明的一些具体实施例提供的所述重组抗体可与b7h6蛋白进行结合，因此，包含所述重组抗体的试剂盒可用于有效诊断或检测高表达所述b7h6蛋白的肿瘤。
99.根据本发明的一些具体实施例，所述试剂盒用于诊断或检测直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一。本发明一些具体实施例提供的重组抗体可以有效与cd16蛋白和b7h6蛋白分子结合，进而可特异性识别特异性高表达所述b7h6的肿瘤细胞，因此，所述重组抗体可用于制备诊断或检测直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和肝癌中的至少之一的试剂盒，所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的cd16和/或b7h6蛋白。
100.下面将对实施例作具体介绍。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
101.实施例1 cd16
×
b7h6双特异性抗体分子的设计及构建
102.本实施例通过对多种构型进行筛选，发明人确定了以scfv-fc构型的双特异性抗体，这个双特异性抗体被命名为cd16
×
b7h6。所述抗体含有两个单价单元，其中一个单价单元为抗cd16的scfv-fc形式，另一个单价单元为抗b7h6的scfv-fc形式，采用一条连接肽将所述cd16抗体的轻链可变区和重链可变区相连，采用与前所述相同的1条连接肽将所述b7h6抗体的轻链可变区和重链可变区相连，所连接肽具有如seq id no：17所示的氨基酸序列，所述cd16抗体具有如seq id no：13所示的轻链可变区，和如seq id no：14所示的重链可变区，所述b7h6抗体具有如seq id no：15所示的轻链可变区，和如seq id no：16所示的重链可变区。其中，发明人对不同的b7h6抗体可变区与cd16抗体的可变区的组合进行筛选，构建了cd16
×
b7h6重组抗体分子；并且对单价单元的fc均进行氨基酸突变改造，抗cd16的
fc区域氨基酸在位置384处变化为半胱氨酸(s384c)及在位置396处变化为色氨酸(t396w)，抗b7h6的fc区域氨基酸在位置380处变化为半胱氨酸(y380c)，在位置397处变化为丝氨酸(t397s)，在位置399处变化为丙氨酸(l399a)及在位置408处变化为缬氨酸(y408v)，使其各自不容易形成同二聚体，而易于形成异二聚体，该异二聚体即为双特异性抗体cd16
×
b7h6，具体结构如图1所示，所述cd16
×
b7h6重组抗体分子具有如seq id no：22所示的cd16单链抗体、如seq id no：23所示的b7h6单链抗体、如seq id no:18所示的第一抗体fc区、如seq id no:19所示的第二抗体fc区。
103.使用常见的分子生物学技术，将编码cd16及b7h6单价单元多肽链的核酸序列分别克隆于表达载体ptt5(优宝生物，货号vt2202)中，具体的核酸序列如seq id no：24和25所示，同时为了使其在cho细胞中高效表达并分泌到培养基中，选择了鼠源抗体kappa链的前导肽作为分泌信号肽，并编码所述信号肽的核苷酸插入到表达载体上，其中，信号肽位于两种抗体可变区的n端，其氨基酸序列为：metdtlllwvlllwvpgstg(seq id no:24)，编码所述信号肽的核苷酸序列如seq id no:28所示，位于编码所述两种抗体可变区的核苷酸的3’端。
104.atggagaccgacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgcccggctccaccggc(seq id no:28)。
105.cd16单链抗体
106.qpvltqpssvsvapgqtatiscgghnigsknvhwyqqrpgqspvlviyqdnkrpsgiperfsgsnsgntatltisgtqamdeadyycqvwdnysvlfgggtkltvlggggsggggsggggsevqlvqsgaevkkpgeslkvsckasgytftsyymhwvrqapgqglewmgiinpsggstsyaqkfqgrvtmtrdtststvymelsslrsedtavyycargsayyydfadywgqgtlvtvss(seq id no:22)。
107.b7h6-1单链抗体
108.divltqtplslsvtpgqpasisckasqsvdydgdsymnwylqkpgqppqlliyaastlhsgipdrfsgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycqqskedprtfgqgtkleikggggsggggsggggsevqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdynmdwvrqapgqglewigdinpnnggtlynqkfrgrvtltvdtsistaymelsrlrsddtavyycarsevfygnyadywgqgttvtvss(seq id no:23)。
109.cd16抗体核苷酸序列
110.cagcccgtgctgacccagccctcctccgtgtccgtggcccccggccagaccgccaccatctcctgcggcggccacaacatcggctccaagaacgtgcactggtaccagcagaggcccggccagtcccccgtgctggtgatctaccaggacaacaagaggccctccggcatccccgagaggttctccggctccaactccggcaacaccgccaccctgaccatctccggcacccaggccatggacgaggccgactactactgccaggtgtgggacaactactccgtgctgttcggcggcggcaccaagctgaccgtgctgggcggcggcggctccggcggcggcggctccggcggcggcggctccgaggtgcagctggtgcagtccggcgccgaggtgaagaagcccggcgagtccctgaaggtgtcctgcaaggcctccggctacaccttcacctcctactacatgcactgggtgaggcaggcccccggccagggcctggagtggatgggcatcatcaacccctccggcggctccacctcctacgcccagaagttccagggcagggtgaccatgaccagggacacctccacctccaccgtgtacatggagctgtcctccctgaggtccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggggctccgcctactactacgacttcgccgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgtcctccgagcccaagtcctgcgacaagacccacacctgccccccctgccccgcccccgaggccgccggcggcccctccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatctccaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccccgaggtgaagttca
actggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagggaggagcagtacaactccacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatctccaaggccaagggccagcccagggagccccaggtgtacaccctgcccccctgcagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgtggtgcctggtgaagggcttctacccctccgacatcgccgtggagtgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgtcccccggcaag(seq id no:26)。
111.b7h6核苷酸序列
112.gacatcgtgctgacccagacccccctgtccctgtccgtgacccccggccagcccgcctccatctcctgcaaggcctcccagtccgtggactacgacggcgactcctacatgaactggtacctgcagaagcccggccagcccccccagctgctgatctacgccgcctccaccctgcactccggcatccccgacaggttctccggctccggctccggcaccgacttcaccctgaagatctccagggtggaggccgaggacgtgggcgtgtactactgccagcagtccaaggaggaccccaggaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggctccggcggcggcggctccggcggcggcggctccgaggtgcagctggtgcagtccggcgccgaggtgaagaagcccggcgcctccgtgaaggtgtcctgcaaggcctccggctacaccttcaccgactacaacatggactgggtgaggcaggcccccggccagggcctggagtggatcggcgacatcaaccccaacaacggcggcaccctgtacaaccagaagttcaggggcagggtgaccctgaccgtggacacctccatctccaccgcctacatggagctgtccaggctgaggtccgacgacaccgccgtgtactactgcgccaggtccgaggtgttctacggcaactacgccgactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgtcctccgagcccaagtcctgcgacaagacccacacctgccccccctgccccgcccccgaggccgccggcggcccctccgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatctccaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccccgaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagggaggagcagtacaactccacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcccgcccccatcgagaagaccatctccaaggccaagggccagcccagggagccccaggtgtgcaccctgcccccctccagggacgagctgaccaagaaccaggtgtccctgtcctgcgccgtgaagggcttctacccctccgacatcgccgtggagtgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccgtgctggactccgacggctccttcttcctggtgtccaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgtcccccggcaag(seq id no:27)。
113.实施例2 cd16
×
b7h6双特异性抗体的表达及纯化
114.2.1cd16
×
b7h6双特异性结合蛋白表达
115.通过用携带有cd16
×
b7h6链编码基因的ptt5载体瞬时转染expicho-s细胞(gibco，货号a29127)来制备结合cd16和b7h6的双特异性分子。转染前一天，将expicho-s细胞调整细胞密度为(3-4)
×
106/ml，37℃，8％co2，120rpm摇动培养过夜。转染当天，细胞生长到7
×
106–1×
107/ml，活率大于95％时准备转染，使用新鲜预热的expicho培养基(gibco，货号a2910002)将细胞稀释到6
×
106/ml，再取可以表达cd16多肽链和b7h6多肽链的质粒以1：1的质量比，利用expifectamine cho转染试剂(gibco，货号a29129)转染到expicho-s细胞中，于37℃，8％co2，120rpm摇动培养。转染后18-22h，将expifectamine cho enhancer和expicho feed混匀后立即加入转染后细胞，混匀，于32℃，5％co2，120rpm摇动培养。转染后第5天，向细胞中再补加8ml expicho feed，混匀后继续培养。每日观察细胞数和细胞活率
变化，待细胞活率下降至80％以下或培养10-14天后离心收获细胞，取上清纯化或冻于-80℃备用。
116.2.2cd16
×
b7h6双特异性结合蛋白纯化
117.将2.1实验获得的上清用0.22μm滤膜过滤，利用mabselect prism a亲和层析柱(ge公司，货号17549854)从表达上清中捕获带有fc结构域的抗体，用ph7.2的磷酸盐缓冲液平衡层析柱后，上清过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(100mm柠檬酸,ph2.7)洗脱，最后用pbs缓冲液浓缩置换，纯化后的抗体通过sds-page鉴定纯度在95％以上。具体的实验结果如图2所示。
118.实施例3 cd16
×
b7h6双特异性抗体与抗原的结合活性检测(elisa)
119.本实施例分别检测所述cd16
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b7h6双特异性抗体与b7h6抗原或cd16抗原的结合活性，具体实验操作如下：
120.将人b7h6(acro biosystems，货号b76-h52h8)、人cd16a抗原(acro biosystems，货号cda-h5220)分别用包被缓冲液(35mm nahco3，15mm na2co3,ph 9.6)稀释至2μg/ml，向酶联板中每孔加入100μl，4℃过夜。之后用pbst清洗3遍(0.05％tween 20-pbs，ph7.2)。向板中加入300μl封闭缓冲液(1％bsa,0.05％tween20-pbs,ph 7.2)，室温静置2h。再用pbst清洗3遍。每孔加入相应双特异性抗体，室温孵育1小时。再用pbst清洗3遍。每孔加入100μl用封闭缓冲液稀释的hrp-兔抗人igg二抗(boster，货号ba1070)，室温孵育1小时。用pbst清洗3遍，每孔加入tmb，室温避光反应2-5分钟，每孔再用2m硫酸终止反应，最后用酶标仪读取od450数值。
121.具体的实验结果如图3a所示，结果显示所述重组双特异性抗体分子可以结合cd16抗原，图3b结果显示cd16
×
b7h6双特异性抗体分子可以结合b7h6抗原。
122.实施例4重组双特异性结合蛋白的体外杀伤检测
123.4.1人外周血单个核细胞(pbmc)的分离
124.将抗凝人外周血加入等体积的无菌pbs中，取50ml无菌离心管，将25ml稀释后的外周血轻轻加到15ml淋巴分离液上(ge healthcare，货号17144003)，整个过程保持界面清晰不晃动，21℃，400g离心30min，离心机升速1，降速0。离心后管内分为三层，中间层为淋巴细胞层，吸取中间的白膜层至新的50ml离心管，吸取完毕后用pbs加满至50ml，500g离心10min。弃上清，加入1ml pbs轻轻吹匀，pbs加满40ml，250g离心10min。
125.离心后弃去上清，用1ml macs缓冲液(0.5％bsa，2.5mm edta-pbs)重悬后稀释计数。
126.4.2纯化nk细胞分离
127.人t细胞使用磁珠分选(miltenyi公司，货号130092657)的方法将其从外周血中分离出来。将pbmc收集后弃尽上清，每107个细胞加入40μl macs buffer重悬细胞后再加入10μl nk cell biotin-antibody cocktail，混匀，4℃孵育10min。每107个细胞再加入30μl macs buffer和20μl nk cell microbead cocktail，混匀，4℃孵育15min。将ls分离柱放入磁场，用3ml macs buffer润湿分离柱，将细胞悬液加入分离柱，1ml macs buffer涮洗离心管后，加入分离柱，收集流出液。3ml macs buffer洗分离柱，收集流出液。混匀后，细胞计数。将细胞悬液于300g，4℃，10min离心后用培养基重悬。
128.4.3构建缺陷b7h6的hct-15细胞
129.利用crispr cas9技术数据库设计了靶向b7h6的sg dna，其序列为：tacccatagacgtgatgttg(seq id no:25)，通过常见的分子生物学克隆技术将sg dna插入到px330质粒上，用脂质体(invitrogen，货号l3000008)转染技术将构建好的质粒转入到hct-15细胞中，转染后48小时通过流式细胞仪检测hct-15表面的b7h6表达水平，出现阴性群细胞后再进行有限稀释，即把细胞消化后稀释密度为每毫升4个细胞，再接种于96孔平底板中，每孔加入200μl，培养2周待细胞明显成为单个细胞团后，再通过流式细胞术检测每个克隆细胞表面b7h6的表达水平，全阴性细胞即为满足需要的缺陷b7h6的hct-15细胞。
130.4.4贴壁肿瘤细胞体外杀伤检测
131.将野生型hct-15和b7h6缺陷的hct-15细胞消化后计数，调整细胞密度为2
×
105/ml。打开rtca仪器(安捷伦)，选择仪器类型dp，选择实验模式，填写细胞信息和药物信息。进入schedule设置实验步骤，将板子加入50μl新鲜培养基(89％rpmi 1640培养基 10％胎牛血清 1％青链霉素)后放入仪器中，关好，点击第一步开始。完成done后取出板子，加入100μl细胞悬液，室温静置15-30min防止边缘效应，放入仪器，点击开始。待生长到对数期后，暂停，加入50μl纯化nk细胞(4
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105/ml)，并加入梯度浓度的双特异性抗体，点击开始，一段时间后分析。
132.具体的实验结果如图4所示，随着cd16
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b7h6双特异性抗体浓度增加，nk细胞对野生型hct-15细胞的杀伤效率逐渐增加，但是对b7h6缺陷的hct-15细胞杀伤效率则没有明显影响，说明重组cd16
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b7h6双特异性抗体可以很好地促进nk细胞特异性地杀伤b7h6 的肿瘤细胞。
133.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
134.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。