一种改性蛋白纳米颗粒、其制备方法及应用

1.本发明涉及植物蛋白加工领域，尤其涉及一种改性蛋白纳米颗粒、其制备方法及应用。


背景技术：

2.随着人们对膳食营养与健康的日益重视，功能性食品的开发已成为食品领域研究者的关注热点。姜黄素(curcumin,cur)是一种脂溶性的天然有机化合物，是从姜黄根茎中提取的生物活性多酚化合物，目前是世界上销量最大的天然食用色素之一。姜黄素除具有多种药理活性(例如抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等活性)外，还在世界范围内被广泛用作香料(例如咖喱)、调味剂等。但姜黄素的水溶性极低，而且稳定性差，易氧化，易受到光照降解，这极大地限制了它的临床效果与实际应用。
3.大量研究表明，通过包埋荷载技术可有效实现姜黄素等功能因子的稳态化。包括纳米颗粒、乳液、脂质体、胶束以及凝胶等多种输送载体不仅可以提高姜黄素的水溶性和环境稳定性，还能增强其在肠道细胞内的渗透性，提高姜黄素的生物利用度。与合成聚合物及其他生物大分子相比，蛋白质在生物相容性及环境友好等方面更具优势。其中通过纳米技术制备纳米级的蛋白载体还利于发挥姜黄素的尺度效应。相比于动物蛋白，植物蛋白来源广泛、价格低廉、资源可再生且营养价值可观，是蛋白基纳米输送载体的理想原料。作为现今食品工业生产和利用最广泛的植物蛋白，大豆蛋白市场可接受度高，其来源丰富、价格低廉，富含必需氨基酸，具有降胆固醇功效，是一种应用价值很高的蛋白。
4.尽管具有相当的优越性，蛋白基生物活性物质输送载体也存在一定的缺点和问题，比如在蛋白质分散液中，蛋白质分子中的疏水区域倾向于“隐藏”在内部，使之与疏水性生物活性小分子的相互作用有限。并且有些方法使用技术比较复杂、成本较高，不符合现代食品工业环保绿色的生产原则。例如，于2020年2月17日申请的、专利号为cn202010095347.4中国专利提供了一种多酚改性的玉米醇溶蛋白纳米粒子包埋缓释姜黄素的方法，此方法通过反溶剂法使其自组装形成载姜黄素的纳米粒子，但反溶剂法会消耗大量的有机试剂以及纯水，对经济环境和社会环境造成负担。还有于2020年7月30日申请的、专利号为202010747823.6中国专利提供了一种用硫酸软骨素和玉米醇溶蛋白负载姜黄素的纳米分散系的制备方法，此方法采用了技术复杂和成本高昂的超声波法和反溶剂法，不适合广泛推广应用。另于2021年6月21日申请的、专利号为cn202110700961.3中国发明专利提供了一种酶辅助乳化制备新型姜黄素脂肪乳的方法，但按其方法生产的姜黄素脂肪乳颗粒大、酶解时间长且姜黄素的包埋率较低。类似的，于2021年6月21日申请的、专利号为202110688741.3中国专利提供了一种治疗脓毒症心肌损伤的白蛋白载药系统，此方法仅是用还原剂简单处理，蛋白展开程度有限，并未最大程度的提高姜黄素包埋率。因此，亟需要探讨一种简易的、荷载量高的包埋方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种简易的、荷载量高的疏水性多酚新型包埋方法。
6.本发明通过碱性ph协同还原剂处理，使蛋白结构最大限度展开有效包埋姜黄素。
7.本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：提供一种断裂二硫键协同碱性ph改性的蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下具体步骤：
8.s1、分散处理：取大豆蛋白以质量浓度2mg/ml均匀分散在水中，并在4℃下保持20h以确保完全水合得到蛋白质分散液1；
9.s2、离心处理：将步骤s1所得蛋白质分散液1离心(4℃、8000～12000
×
g、20～60min)，除去不溶物并收集上清液得蛋白分散液2；
10.s3、展开处理：将步骤s2所得蛋白分散液2的ph调至碱性后再逐滴加入二硫苏糖醇至二硫苏糖醇的终浓度为2.5～40mm并不断搅拌，所得溶液记为蛋白分散液3；
11.s4、透析处理：将步骤s3所得蛋白分散液3透析处理，最后所得复合溶液冷冻干燥(-40℃，20pa，24h)，即得改性蛋白纳米颗粒。
12.作为本发明的一种实施方式，所述步骤s3具体为：将步骤s2所得蛋白分散液2的ph调至12后再逐滴加入二硫苏糖醇至二硫苏糖醇的终浓度为2.5～40mm并不断搅拌，所得溶液记为蛋白分散液3。
13.作为本发明的一种实施方式，所述步骤s3中二硫苏糖醇的终浓度为10mm。
14.作为本发明的一种实施方式，所述步骤s1中的大豆蛋白是采用如下提取方法得到：脱脂豆粕以1:10g/ml的比例加入去离子水，采用1mol/l naoh溶液调至ph 7.0～8.5，室温下搅拌2h；然后以4℃、10000～12000
×
g离心30～40min，取离心后所得上清液用1mol/l hcl调至ph 4～5；然后以4℃、7000～8000
×
g离心15～25min，取离心后所得沉淀用去离子水溶解并调溶液ph至7.0～8.5；然后冷冻干燥即得到大豆蛋白。所述冷冻干燥的参数为-40～-80℃，真空度0.01～50pa、干燥24～48h。
15.本发明的另一目的在于提供前述的方法制得的改性蛋白纳米颗粒。
16.本发明的另一目的在于提供前述的改性蛋白纳米颗粒作为载体在制备疏水性多酚运载体系中的应用。
17.本发明的另一目的在于提供一种大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒的制备方法，包括如下步骤：
18.s1、分散处理：取大豆蛋白以质量浓度2mg/ml均匀分散在水中，并在4℃下保持20h以确保完全水合得到蛋白质分散液1；
19.s2、离心处理：将步骤s1所得蛋白质分散液1离心(4℃、8000～12000
×
g、20～60min)，除去不溶物并收集上清液得蛋白分散液2；
20.s3、展开处理：将步骤s2所得蛋白分散液2的ph调至碱性后再逐滴加入二硫苏糖醇至二硫苏糖醇的终浓度为2.5～40mm并不断搅拌，所得溶液记为蛋白分散液3；
21.s4、包埋处理：将步骤s3所得蛋白分散液3与等体积的0.1～2mg/ml的姜黄素溶液均匀混合后调ph至中性得大豆蛋白-姜黄素复合纳米颗粒4；
22.s5、透析处理：将步骤s4所得大豆蛋白-姜黄素复合纳米颗粒4透析处理，最后所得复合纳米颗粒冷冻干燥(-40～-80℃，真空度0.01～50pa、干燥24～48h)，即得大豆蛋白-姜
黄素复合物颗粒。
23.作为本发明的一种实施方式，所述步骤s4的包埋处理具体条件为：将步骤s3所得蛋白分散液3与等体积的0.1～2mg/ml的姜黄素溶液混合30min后调ph至7得大豆蛋白-姜黄素复合纳米颗粒4。
24.作为本发明的一种实施方式，所述步骤s4中姜黄素溶液浓度为0.1～1mg/ml。
25.本发明的另一目的在于提供前述方法制得的大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒。
26.本发明的另一目的在于提供前述的大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒在制备功能性食品、药品和化妆品中的应用。
27.本发明的有益效果：
28.1、本发明开发了一种简单有效的疏水性多酚新型包埋方法。本发明提供了一种断裂二硫键协同碱性ph改性的蛋白纳米颗粒及其在递送疏水性多酚的运载体系中的应用。采用大豆蛋白为壁材，以姜黄素为疏水性多酚模型，通过在碱性条件下断裂二硫键调控自组装，成功制备得到澄清的呈“棉花状”的大豆蛋白-姜黄素复合纳米颗粒。
29.2、本发明方法在较高的姜黄素浓度下，与不加还原剂的技术相比包埋率更高。且制备的大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒在持续的光照下，大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒仍具有良好的光稳定性，可以作为新型的功能性配料或运载体系，用于包埋、传递和运载如姜黄素等疏水性多酚物质。本发明得到了稳定的澄清透明大豆蛋白-姜黄素复合纳米颗粒，易于实现工业化生产，可广泛应用于功能性食品、药品和化妆品等领域。
30.3、本发明利用断裂二硫键协同碱性ph改性蛋白纳米颗粒，并通过特定的还原剂浓度和特定ph等具体参数，相较于单独碱化处理得到的大豆蛋白-姜黄素结合物颗粒，显著提高了姜黄素的包埋率，特别是在高浓度的姜黄素的包埋率，取得了预料不到的技术效果。
31.4、本发明提供的包埋制备方法简单，易于实现工业化生产，扩大了纳米颗粒在食品工业上的应用。
附图说明
32.图1为本发明实施例1所得碱性条件下还原剂处理的大豆蛋白展开程度的视觉外观；
33.图2为本发明实施例1所得碱性条件下还原剂处理的大豆蛋白荧光强度测量结果；
34.图3为本发明实施例2所得大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒的包埋率测量结果；
35.图4为本发明实施例2所得大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒的包埋率视觉外观；
36.图5为本发明实施例3所得大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒的光稳定性测量结果；
37.图6为本发明对比例1所得大豆蛋白-姜黄素结合物颗粒的包埋率测量结果；
38.图7为本发明对比例2所得大豆蛋白-姜黄素结合物颗粒的光稳定性测量结果。
具体实施方式
39.下面通过具体实施实例对本发明做进一步说明。
40.实施例1
41.s1、脱脂豆粕以1:10(w/v，g/ml)的比例加入去离子水，采用1mol/l naoh溶液调至ph 7.0，室温下搅拌2h后以4℃、10000
×
g离心30min；取离心后所得上清液用1mol/l hcl调
至ph 4后以4℃、7000
×
g离心15min；取离心后所得沉淀用去离子水溶解并调溶液ph至7.0，所述溶液经过冷冻干燥即得到大豆蛋白。其中，所述冷冻干燥的参数为-40℃，真空度20pa、干燥24h；
42.s2、分散处理：取步骤s1所得大豆蛋白，以质量浓度2mg/ml(w/w，g/g)均匀分散在水中，并在4℃下保持20h以确保完全水合得到蛋白质分散液1；
43.s3、离心处理：将步骤s2所得蛋白质分散液1离心(4℃、9000
×
g、30min)，除去其中不溶物并收集上清液得蛋白分散液2；
44.s4、展开处理：将步骤s3所得蛋白分散液2的ph调至12后再将不同量的二硫苏糖醇逐滴加入并不断搅拌至最终浓度为0～40mm，所得溶液记为蛋白分散液3；
45.s5、透析处理：将步骤s4所得大豆蛋白分散液3透析处理，最后所得复合溶液冷冻干燥(-40℃，20pa，24h)，即得改性蛋白纳米颗粒。
46.取本实施例制备的碱性条件下不同浓度还原剂处理过的大豆蛋白测量视觉外观和荧光强度。同时，取160mm处理的大豆蛋白作为对照。展开程度视觉外观和荧光强度测定结果分别如图1和图2所示，160mm还原剂处理的大豆蛋白有明显的絮凝，说明本发明所选的还原剂浓度较为合理，此外碱化后大豆蛋白荧光强度显著降低(其中图2中碱化蛋白即二硫苏糖醇浓度为0mm)，表明结构展开，并且随着还原剂浓度增加，其荧光强度降低程度增加并发生红移，表明结构进一步扩大暴露内部发色基团并向亲水环境靠拢。考虑测量结果和成本问题，选取10mm还原剂浓度做后续实验。
47.实施例2
48.s1、脱脂豆粕以1:10(w/v，g/ml)的比例加入去离子水，采用1mol/l naoh溶液调至ph 7.0，室温下搅拌2h后以4℃、10000
×
g离心30min。取离心后所得上清液用1mol/l hcl调至ph 4后以4℃、7000
×
g离心15min。取离心后所得沉淀用去离子水溶解并调溶液ph至7.0，所述溶液经过冷冻干燥即得到大豆蛋白。其中，所述冷冻干燥的参数为-40℃，真空度20pa、干燥24h；
49.s2、分散处理：取步骤s1所得大豆蛋白，以质量浓度2mg/ml(w/w，g/g)均匀分散在水中，并在4℃下保持20h以确保完全水合得到蛋白质分散液1；
50.s3、离心处理：将步骤s2所得蛋白质分散液1离心(4℃、9000
×
g、30min)，除去不溶物并收集上清液得蛋白分散液2；
51.s4、展开处理：将步骤s3所得蛋白分散液2的ph调至12后再将二硫苏糖醇逐滴加入并不断搅拌至最终浓度为10mm，所得溶液记为蛋白分散液3；
52.s5、包埋处理：将步骤s4所得蛋白分散液3与等体积的不同浓度的姜黄素溶液0.1～2mg/ml混合30min后调ph至7得大豆蛋白-姜黄素复合纳米颗粒4；
53.s6、透析处理：将步骤s5所得大豆蛋白-姜黄素复合纳米颗粒4透析处理，最后所得复合溶液冷冻干燥(-40℃，20pa，24h)，即得大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒。
54.取本实施例制备的大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒溶解后测定包埋率和视觉外观。包埋率和视觉外观测定结果分别如图3和图4所示，与对比例1中仅碱化处理的大豆蛋白-姜黄素结合物相比(图6)，还原剂协同碱化处理的大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒的包埋率在姜黄素溶液为0.1～2mg/ml均处于较高水平，特别是对于0.1-1mg/ml的姜黄素浓度，包埋率几乎达到100％。并且从图4可看出，大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒溶解性也较高。考虑测量结
果，选取1mg/ml姜黄素浓度做后续实验。
55.实施例3
56.s1、脱脂豆粕以1:10(w/v，g/ml)的比例加入去离子水，采用1mol/l naoh溶液调至ph 7.0，室温下搅拌2h后以4℃、10000
×
g离心30min。取离心后所得上清液用1mol/l hcl调至ph 4后以4℃、7000
×
g离心15min。取离心后所得沉淀用去离子水溶解并调溶液ph至7.0，所述溶液经过冷冻干燥即得到大豆蛋白。其中，所述冷冻干燥的参数为-40℃，真空度20pa、干燥24h；
57.s2、分散处理：取步骤s1所得大豆蛋白，以质量浓度2mg/ml(w/w，g/g)均匀分散在水中，并在4℃下保持20h以确保完全水合得到蛋白质分散液1；
58.s3、离心处理：将步骤s2所得蛋白质分散液1离心(4℃、9000
×
g、30min)，除去不溶物并收集上清液得蛋白分散液2；
59.s4、展开处理：将步骤s3所得蛋白分散液2的ph调至12后再将二硫苏糖醇逐滴加入并不断搅拌至最终浓度为10mm，所得溶液记为蛋白分散液3；
60.s5、包埋处理：将步骤s4所得蛋白分散液3与等体积的姜黄素溶液2mg/ml混合5～60min后调ph至7得大豆蛋白-姜黄素复合纳米颗粒4；
61.s6、透析处理：将步骤s5所得大豆蛋白-姜黄素复合纳米颗粒4透析处理，最后所得复合溶液冷冻干燥(-40℃，20pa，24h)，即得大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒。
62.取本实施例制备的大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒溶解后测定光照后60min的光稳定性，如图5所示。同时，取对比例2中仅碱化处理的大豆蛋白-姜黄素结合物作为对照(图7)，碱性条件下还原剂处理的大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒的光稳定性明显高于未处理的大豆蛋白-姜黄素混合物。考虑测量结果，选取30min混合时间做后续实验。综上所述，本实施例所得大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒具有较高的稳定性。
63.对比例1
64.s1、脱脂豆粕以1:10(w/v，g/ml)的比例加入去离子水，采用1mol/l naoh溶液调至ph 7.0，室温下搅拌2h后以4℃、10000
×
g离心30min。取离心后所得上清液用1mol/l hcl调至ph 4后以4℃、7000
×
g离心15min。取离心后所得沉淀用去离子水溶解并调溶液ph至7.0，所述溶液经过冷冻干燥即得到大豆蛋白。其中，所述冷冻干燥的参数为-40℃，真空度20pa、干燥24h；
65.s2、分散处理：取步骤s1所得大豆蛋白，以质量浓度2mg/ml(w/w，g/g)均匀分散在水中，并在4℃下保持20h以确保完全水合得到蛋白质分散液1；
66.s3、离心处理：将步骤s2所得蛋白质分散液1离心(4℃、9000
×
g、30min)，除去大豆蛋白溶液的不溶物并收集上清液得蛋白分散液2；
67.s4、展开处理：将步骤s3所得蛋白分散液2的ph调至12，所得溶液记为蛋白分散液3；
68.s5、包埋处理：步骤s4所得蛋白分散液3与等体积的姜黄素溶液0.1～2mg/ml混合30min后调ph至7得大豆蛋白-姜黄素混合溶液4；
69.s6、冻干处理：将步骤s5所得大豆蛋白-姜黄素混合溶液4冷冻干燥(-40℃，20pa，24h)，即得大豆蛋白-姜黄素结合物颗粒。
70.取本对比例制备的大豆蛋白-姜黄素结合物颗粒溶解后测定包埋率，结果如图6所
示，发现碱性条件下还原剂处理的大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒的包埋率与本对比例相比均较高，说明断裂二硫键协同碱性ph改性可有效提升包埋率。
71.对比例2
72.s1、脱脂豆粕以1:10(w/v，g/ml)的比例加入去离子水，采用1mol/l naoh溶液调至ph 7.0，室温下搅拌2h后以4℃、10000
×
g离心30min。取离心后所得上清液用1mol/l hcl调至ph 4后以4℃、7000
×
g离心15min。取离心后所得沉淀用去离子水溶解并调溶液ph至7.0，所述溶液经过冷冻干燥即得到大豆蛋白。其中，所述冷冻干燥的参数为-40℃，真空度20pa、干燥24h；
73.s2、分散处理：取步骤s1所得大豆蛋白，以质量浓度2mg/ml(w/w，g/g)均匀分散在水中，并在4℃下保持20h以确保完全水合得到蛋白质分散液1；
74.s3、离心处理：将步骤s2所得蛋白质分散液1离心(4℃、9000
×
g、30min)，除去不溶物并收集上清液得蛋白分散液2；
75.s4、展开处理：将步骤s3所得蛋白分散液2的ph调至12，所得溶液记为蛋白分散液3；
76.s5、包埋处理：步骤s4所得蛋白分散液3与等体积的姜黄素溶液1mg/ml混合30min后调ph至7得大豆蛋白-姜黄素混合溶液4；
77.s6、冻干处理：将步骤s5所得大豆蛋白-姜黄素混合溶液4冷冻干燥(-40℃，20pa，24h)，即得大豆蛋白-姜黄素结合物颗粒。
78.取本对比例制备的大豆蛋白-姜黄素结合物颗粒溶解后测定光稳定性，结果如图7所示。与大豆蛋白-姜黄素结合物相比，碱性条件下还原剂处理的大豆蛋白-姜黄素复合物颗粒降解速率缓慢，说明稳定性较高。表明断裂二硫键协同碱性ph改性的蛋白纳米颗粒是稳态递送疏水性多酚的有效方法。
79.综上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。