一种与猪胴体性状相关的SNP分子标记及应用

一种与猪胴体性状相关的snp分子标记及应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学与育种技术领域，涉及一种与猪胴体性状相关的snp分子标记及应用，具体涉及与猪背膘厚、皮厚和胴体长性状相关的分子标记及应用。


背景技术：

2.猪的胴体性状反映猪的产肉性能，属于重要的经济性状，对于这类性状的遗传改良直接影响生猪生产的经济效益，这类性状也一直是猪育种中的目标性状。在猪的胴体性状中，瘦肉率是反映猪产肉量的重要指标，然而瘦肉率的测定一般需要通过屠宰后对胴体进行剥离，实施难度较大，难以进行全群测定，更无法实施个体选择，但其与背膘厚、皮厚、胴体长及其他胴体性状存在较强相关，研究表明背膘厚度越厚瘦肉率越低；相反，则瘦肉率越高(herault et al.2018)。在猪的遗传育种中主要以这些相关性状对瘦肉率进行辅助评定。因此研究猪的背膘厚、皮厚和胴体长等胴体性状，在育种中具有重要研究意义。
3.随着国民生活水平的不断提高，人们对猪肉的需求量越来越大。为了提高猪肉产量，满足市场需求，针对胴体性状这类难以度量的性状的遗传改良，亟需鉴定一些重要的分子标记，进而通过标记辅助选择或基因组选择进行相关性状的选育提高。
4.本发明基于申请人课题组构建的大白猪
×
通城猪高代横交资源群体，通过全基因组测序进行胴体性状全基因组关联分析(genome wide association study，gwas)，进一步对gwas结果进行分析，鉴定出一个同时影响背膘厚、皮厚和胴体长的snp分子标记。目前上述成果尚未见报道，因此该标记的发现对于猪胴体性状的遗传改良具有潜在的重要价值。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供一种与猪胴体性状相关的snp分子标记及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
7.一种与猪胴体性状相关的snp分子标记，该snp分子标记位于猪基因组11.1版本参考序列7号染色体第30263336位碱基，所述第30263336位碱基为g或a，该突变导致多态性，优选地，所述猪胴体性状包括猪背膘厚、皮厚和胴体长性状。
8.本发明基于277头资源群体，通过测定记录胴体性状(背膘厚、皮厚、胴体长)，利用全基因组测序获取的snp分型数据进行胴体性状gwas研究，进一步对gwas结果进行分析，最终鉴定出7号染色体第30263336位核苷酸位点与猪背膘厚、皮厚和胴体长性状均显著关联。研究结果表明，该snp位点的多态性为g/a，并且aa基因型个体背膘厚显著低于gg基因型个体，胴体长和皮厚显著高于gg基因型个体。
9.在育种时优选aa基因型，能显著降低猪背膘厚、增加皮厚和胴体长。
10.优选地，含有上述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，在该序列第319位碱基r为snp分子标记位点，r表示g或a。
11.用于检测如上所述的与猪胴体性状相关的snp分子标记的引物组，其包括内引物
对和外引物对，所述内引物对的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示；所述外引物对的核苷酸序列如seq id no.4和seq id no.5所示。
12.一种检测如上所述的与猪胴体性状相关的snp分子标记的试剂盒，优选地，所述试剂盒包括如上所述引物组。
13.一种检测如上所述的与猪胴体性状相关的snp分子标记的方法，其包括如下步骤：
14.(1)采用如上所述的引物组对提取的猪的基因组dna进行扩增；
15.(2)对pcr扩增产物的多态性位点进行鉴定。
16.如上所述的方法，优选地，在步骤(1)中，猪的基因组dna为从猪耳组织中提取的dna。
17.如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，所述鉴定的方法采用电泳检测：当扩增片段有两条带，大小分别为552bp和344bp，则待测样品的基因型为gg基因型；
18.当扩增片段有两条带，大小分别为552bp和255bp，则待测样品的基因型为aa基因型；
19.当扩增片段有三条带，大小分别为552bp、344bp和255bp，则待测样品的基因型为ga基因型。
20.如上所述的snp分子标记用于在猪胴体性状标记辅助选择中的应用。
21.如上所述的应用，优选地，所述猪胴体性状包括在背膘厚、皮厚和胴体长选择中的应用。
22.如上所述的snp分子标记、所述引物组、如上所述试剂盒或如上所述方法在猪育种中的应用。
23.优选地，所述育种为培育具有低猪背膘厚、皮厚和胴体长显著增长的优势猪的筛选。
24.选择snp分子标记为aa基因型的作为种猪，其具有降低猪背膘厚、增加皮厚和胴体长的优势性状。
25.本发明的有益效果在于：
26.本发明提供的猪胴体性状相关的snp分子标记，该位点多态性同时显著影响猪的背膘厚、皮厚和胴体长等胴体性状，通过测定该多态性的基因型能有效鉴别是否为低背膘厚、胴体长和皮厚显著高的猪胴体性状，为进行早期选育，提高育种效率提供了检测技术手段。本发明也为猪胴体性状的遗传改良提供了可靠的分子标记，对猪的遗传改良具有重要意义。
27.本发明通过对该snp分子位点的检测，可用于选择aa基因型为种猪，来提高猪的胴体性状，有助于提高猪养殖业的经济效益。
附图说明
28.图1为本发明实施例1中平均背膘厚gwas结果的曼哈顿图；
29.图2为本发明实施例1中皮厚gwas结果的曼哈顿图；
30.图3为本发明实施例1中和胴体长gwas结果的曼哈顿图；
31.图4为本发明实施例1中该snp不同基因型个体的表型值，其中，a：背膘厚；b：皮厚；c：胴体长；
32.图5为本发明实施例2中所设计引物对三种基因型的结果判定图；
33.图6为本发明实施例2中所设计引物对三种基因型的猪的基因组dna进行pcr扩增的电泳结果。
具体实施方式
34.本发明基于申请人课题组利用大白猪和通城猪构建的高代横交资源群体，通过测定记录胴体性状，利用全基因组测序获取的snp分型数据进行胴体性状gwas研究，进一步对gwas结果进行分析，鉴定出一个与背膘厚、皮厚和胴体长均显著关联的snp分子标记。利用该snp分子标记可针对猪背膘厚、皮厚和胴体长三个胴体性状指标同时开展标记辅助选择，进行早期选育，提高育种效率。本发明为猪胴体性状的遗传改良提供了可靠的分子标记的检测方法。
35.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
36.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，除另有规定，本发明所用试剂均为分析纯或以上规格。
37.实施例1影响猪平均背膘厚、皮厚和胴体长snp位点的获得
38.1、试验材料
39.以大白猪
×
通城猪高代横交群体为研究对象，通过对277头个体屠宰测定，收集所有个体胴体性状表型测定数据，并采集脾脏组织进行基因组dna提取。
40.2、试验方法
41.2.1、胴体性状测定
42.测定耻骨联合前缘中点至寰椎前窝的上缘的直线距离作为胴体长；平均背膘厚反映猪的脂肪沉积能力，测定肩部最厚处、最后肋骨处和腰荐结合处三点背膘厚，然后取三点平均值作为平均背膘厚；皮厚是在第6～7肋骨处测定皮肤厚度。
43.2.2、dna提取
44.dna提取采用常用的苯酚-氯仿粗提法(苯酚-氯仿粗提法可参见萨姆布鲁克j，弗里奇e f，曼尼阿蒂斯t.分子克隆实验指南[m].第2版.金冬雁，黎孟枫.北京：科学出版社，1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取方法，这些方法都是报道的常用方法。
[0045]
2.3、基于全基因组测序的猪全基因组snp分型方法
[0046]
通过对277头个体进行全基因组测序，测序深度为5
×
，经过read比对、排序、标记重复、碱基质量重校正和变异检测等步骤，初步鉴定出4594万个snp位点。利用plink软件分别计算个体缺失率、snp位点缺失率、和最小等位基因频率maf，并制定质控标准，最终获得1277万个高质量snp标记。
[0047]
3、全基因组关联分析
[0048]
基于rmvp软件的混合线性模型对胴体性状中的胴体长、平均背膘厚和皮厚进行gwas分析。分析模型如下：
[0049]
y＝xb zu e
[0050]
其中，y为性状表型值的向量；b为固定效应，包括性别和宰前活重和前三个主成
分，x和z分别为b和u的关联矩阵；u为所有遗传标记服从分布的向量，g为个体间亲缘关系矩阵；e为随机残差向量。
[0051]
gwas结果如图1-图3所示，平均背膘厚(图1)、皮厚(图2)和胴体长(图3)显著关联snp位点均位于7号染色体。进一步对三个性状显著关联snp位点进行分析，发现与皮厚最显著关联的snp位点(7:30263336)(g/a)即猪基因组11.1版本参考序列7号染色体第30263336位核苷酸位点g/a与胴体长和平均背膘厚均显著关联。对于总样本为277，测得为aa型的有53，ga型有134，gg型有89，有1个个体为基因型缺失，具体检测结果如表1和图4所示，图中a：背膘厚；b：皮厚；c：胴体长。研究结果表明，该snp位点的多态性为g/a，并且aa基因型个体背膘厚显著低于gg基因型个体，胴体长和皮厚显著高于gg基因型个体。aa基因型可作为育种的选择，利用该多态性位点可针对猪背膘厚、皮厚和胴体长三个胴体性状指标同时开展标记辅助选择，进行早期选育，提高育种效率。为猪胴体性状的遗传改良提供了可靠的检测依据。
[0052]
表1不同基因型个体背膘厚、皮厚和胴体长表型值比较
[0053][0054]
表中数值为“均数
±
标准差”，同一行不同大写字母表示差异极显著(p《0.01)，相同字母表示差异不显著。
[0055]
实施例2
[0056]
1、检测引物设计
[0057]
针对实施例1中获得7号染色体第30263336位核苷酸位点g/a，设计检测该位点的引物组合，用于该snp位点的pcr检测。其中引物组合如seq id no.2～seq id no.5所示。上下游内引物对分别如seq id no.2和seq id no.3所示，上下游外引物对分别如seq id no.4和seq id no.5所示。扩增的产物序列即可最为检测胴体性状(背膘厚、皮厚、胴体长)的分子标记，其序列如seq id no.1所示，其中在该序列第319位碱基r为snp位点，r表示g或a，导致了猪的胴体性状(背膘厚、皮厚、胴体长)在该位点的g/a多态性。
[0058]
具体如下：
[0059]
seq id no.1：atccagacttagagagcgagggggagacttttccatacagaggagacacaggtgcaaaggagctgtggtgggaacatagcatggtgtcctccaggaacagaaagggaacagtgcggcaggtgcagagtacacccaggagaggcccagggatgtggtcagcacaccaggtggcccagggcccctccgactggcaagcagtttggaagtttgcattttattttattgttgtcacctattcctgtggcatatggaagtttccaggccaggggtcgaaacagagctgcagcatcagagctgcagctgccagcctgcaccagarccatagcaacaaggcatccaagccacgtctgggacctacaccacagctcagggcaaccctggatcgatccctaactggctgagccaggccaggaaacaaacccacatccccatggatatagctgggttctgggtttgtcaccgctgaactgcaacgggaactcccagaagtttgcattttaatctaagagcaatgcaaa
gtcaataggaaatttaagcagggtgatgagcagc
[0060]
seq id no.2：5
’‑
cagctgccagcctgcaccataa-3’[0061]
seq id no.3：5
’‑
tggcttggatgccttgttgctattgc-3’[0062]
seq id no.4：5
’‑
atccagacttagagagcgaggggg-3’[0063]
seq id no.5：5
’‑
gctgctcatcaccctgcttaaatttc-3
[0064]
2、dna模板
[0065]
根据全基因组dna测序结果，分别选取snp位点为gg、ga和aa基因型各三个个体的基因组dna作为dna模板。
[0066]
3、目的片段pcr扩增
[0067]
pcr反应体系20μl：r-taq 0.1μl，10
×
buffer 2μl，dntp mix 1.6μl，两条外引物(10μmol/l)各0.4ul，两条内引物(10μmol/l)各0.6μl，dna模板2.0μl(50ng/ul)，ddh2o 12.3ul。pcr反应程序为:95℃预变性3min，95℃变性30s，退火64.3℃30s，72℃延伸37s，共33个循环；72℃5min，4℃保存。
[0068]
4、pcr扩增产物的检测
[0069]
具体操作按照：按20g/l的质量浓度称量琼脂糖，加入1
×
tae缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100ml琼脂糖溶液中加入5μl eb溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，置于1
×
tae缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取5μl pcr产物与1μl加样缓冲液(称取250.0mg溴酚蓝，加入10ml水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲苯腈蓝ff，加10ml水溶解；称取50.0g蔗糖，加30ml水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100ml，在4℃下保存)混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入dna分子量标准，接通电源在2v/cm～5v/cm条件下电泳15～30min检测。电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。
[0070]
根据dna分子量标准判断扩增条带的大小，pcr检测结果示意图如图5所示，当个体基因型为gg时，扩增片段有两条带，大小分别为552bp和344bp；当个体基因型为aa时，扩增片段有两条带，大小分别为552bp和255bp；当个体基因型为ga时，扩增片段有三条带，大小分别为552bp、344bp和255bp。
[0071]
针对三种基因型的猪耳组织样品(各取三个样本)提取的dna，按上述目的片段pcr扩增的扩增体系及pcr反应程序，分别检测9个dna样本，电泳检测结果如图6所示，图中条带m为2000marker，标号：1-3为gg基因型，4-6为aa基因型，7-9为ga基因型。检测结果与预期一致，说明本发明提供的引物组对能有效检测三种不同基因型的个体。为选育具有低猪背膘厚、皮厚和胴体长显著增长的优势猪的筛选提供了有效的技术手段。