一种高产乙醇发酵菌株及其诱变育种方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种高产乙醇发酵菌株及其诱变育种方法。


背景技术：

2.乙醇，也称酒精，是一种重要的基础工业原料，被广泛应用于食品、医药、化工和军工等多个领域。目前共有三种乙醇生产方法：化学合成法、煤化工法和生物发酵法。其中化学法以乙烯为原料，水合生产乙醇；煤化工法为将煤高温裂解形成co和h2的混合气，再通过费托反应生产乙醇；而生物发酵法以生物质为原料，通过微生物将其中的糖分发酵转化生产乙醇。生物发酵法具有生产条件温和、产品纯度高等优点，在医药食品领域的得到广泛的应用，目前世界上约90％的乙醇是以发酵法生产。
3.甘蔗渣是一种可再生木质纤维资源，与其他种类的木质纤维相比，甘蔗渣具有来源集中便于利用及相对清洁等优势。据统计，我国每年产生约1000 万吨的甘蔗渣。其成分中纤维素为32％-48％，半纤维素为19％-24％，木质素为23％-32％，灰分约为4％。由于蔗渣转化和利用技术仍然存在不少障碍，除少数用于造纸外，大多数蔗渣被作为燃料直接烧掉，导致全生物量利用率较低，还污染环境。
4.甘蔗渣纤维素水解产物主要是葡萄糖，半纤维素主要组分是木聚糖，其水解产物为五碳糖，主要是木糖及少量阿拉伯糖。故此，利用木糖发酵生产乙醇是当前蔗渣纤维综合利用的一种途径。但是由于野生型酿酒酵母不能利用木糖产乙醇，这便成为当前纤维素乙醇产业化生产的制约因素，为此，需要选育能高效利用木糖发酵生产乙醇的菌株。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于：针对上述存在的问题，提供一种高产乙醇发酵菌的诱变育种方法，该方法经过co
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诱变获得高产菌株，生长速度快，发酵的乙醇产量高。
6.为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
7.一种高产乙醇发酵菌株，保藏编号为cctcc no:m 20211067，菌种学名 pichia stipitis，保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏日期为2021年8月23日。
8.一种上述菌株发酵乙醇的方法，选定培养基后，将菌株活化三次后得到种子液，种子液以10％接种量接种至培养基中，30℃，130rpm培养进行乙醇发酵。
9.进一步地，所述培养基采用15％fm发酵培养基或者蔗渣水解浓缩液。
10.一种高产乙醇发酵菌株的诱变育种方法，包括以下步骤：
11.(1)前期准备：选取原始菌株置于甘油中保存，配制培养基备用；
12.(2)菌种活化：将甘油保存的原始菌株接种与培养基中，摇床培养一段时间后再转接1-3次，同条件培养至对数期；
13.(3)co
60
诱变：吸取菌液离心后，采用无菌生理盐水洗涤若干次，收集菌体使其悬浮在生理盐水中，并控制菌数在108/ml，取适宜剂量进行co
60
照射对菌体细胞进行诱变；
14.(4)菌株筛选：经co
60
诱变后的菌液经生理盐水稀释后涂板接种至平板培养基培养适宜时间后，挑单菌落接种15％fm培养基进行发酵，并分别取样测定发酵液中的乙醇含量，筛选出乙醇产量高的菌株；
15.(5)菌株纯化：将筛选得到菌株ypx平板划线连续纯化多次，得到纯化的高产菌株；
16.(6)驯化选育：将纯化后的高产菌株接种至甘蔗糖蜜中培养驯化后，再次按照步骤(4)和步骤(5)中菌株筛选、菌株纯化的步骤操作后得到诱变完成的高产乙醇发酵菌。
17.进一步地，在步骤(2)中，所述摇床培养温度为30℃，180rpm摇床培养12-16h。
18.进一步地，在步骤(3)中，所述离心是以12000rpm离心5min，所述剂量为0.4-1kgy。
19.进一步地，在步骤(4)中，所述稀释是将菌液稀释至10-5
，培养温度为 30℃，培养时间为3d，所述发酵是在30℃、130rpm培养60-72h。
20.进一步地，在步骤(6)中，所述高产菌株接种至甘蔗糖蜜中培养驯化是接种至10
°
bx、20
°
bx甘蔗糖蜜，30℃，180rpm培养驯化3-6个月。
21.一种上述高产乙醇发酵菌株在酿酒中的应用。
22.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
23.1、树干毕赤酵母是利用木糖乙醇发酵的最优良菌种之一，具有产酒率高、生长快等优点，所以选择树干毕赤酵母进行诱变改良，采用co
60
照射诱变树干毕赤酵母的操作简单，便于实施。
24.2、本发明中采用树干毕赤酵母作为原始菌株，生长速度快，且经过糖蜜驯化后，选育获得的菌株木糖乙醇发酵性能得到较大提高，有利于增加乙醇产量，可广泛运用与酿酒中。
25.3、利用本发明的方法诱变后的菌株木糖乙醇发酵效率为82.61％，乙醇产率为0.78g/(l
·
h)，进行乙醇发酵的产量比原始菌株提高14.13％。
26.4、本发明采用甘蔗糖蜜进行驯化是由于糖蜜呈现黑褐色，除含有机酸、很多的胶体物质如果胶质、焦糖和黑色素、灰分和其它悬浮物质外，还含有少量的呋喃(糠醛、5-羟甲基糠醛)、喹啉、呋喃、哌嗪等，这些物质的存在对酵母的生长有害，会抑制酵母细胞的生长，影响糖酵解；糖蜜含有微量元素等营养成分，所以采用甘蔗糖蜜对选育的木糖乙醇高产树干毕赤酵母菌株进行驯化，以克服这一弊端。
附图说明
27.图1是co
60
诱变的初筛结果比较；
28.图2是木糖乙醇含量及相对呼吸强度比较；
29.图3是生长曲线；
30.图4是生物量(细胞干重)曲线；
31.图5是乙醇曲线；
32.图6是残留木糖曲线。
具体实施方式
33.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本
发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。
34.选取树干毕赤酵母菌株作为原始菌株，保藏编号cicc1960，购自中国工业生物技术菌种保藏中心，简称1960，采用终浓度为25％(v/v)甘油于-80℃超低温保藏。
35.一、培养基制备
36.ypx：2％木糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，121℃灭菌20min，ph自然，固体培养基添加2％琼脂。
37.ypx4：4％木糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，121℃灭菌20min，ph自然。
38.能在未脱毒蔗渣水解液中生长的酵母的选育培养基：经酸处理的未脱毒蔗渣水解液，添加2％蛋白胨，1％酵母粉，硫酸调节ph为3.8-4.0；
39.未脱毒蔗渣水解液发酵产乙醇培养基：未脱毒蔗渣水解浓缩液，添加15％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，硫酸调节ph为3.8-4.0。补料添加30％葡萄糖。
40.培养基所需成分的生产厂家：蛋白胨、酵母粉购自oxoid公司；木糖购自sigma公司；其余均为国药的产品。
41.二、树干毕赤酵母的诱变育种
42.1、菌种活化：将甘油保存的菌株接种于ypx培养基，30℃，180rpm摇床培养12-16h，再转接2次，同条件培养至对数期；
43.2、co
60
诱变：活化的1960菌株接种ypx培养基，30℃，180rpm培养至对数期，吸取菌液离心(12000rpm，5mi n)，无菌生理盐水洗涤3次，收集菌体，悬浮在生理盐水中，控制菌数至108/ml，采用9个剂量(0.4、0.6、0.8、 1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0kgy)对菌体细胞进行诱变，co
60
照射在某辐射照射中心进行
44.3、菌株筛选：经co
60
诱变的菌液经生理盐水稀释至10-5
后涂板接种ypx平板培养基，每个剂量均涂板10个左右，30℃培养3d，挑单菌落接种15％fm培养基进行发酵，30℃，130rpm培养60-72h，分别取样测定发酵液中的乙醇含量(初筛测定48h、60h、72h、80h)，筛选乙醇产量高的菌株。
45.4、菌株纯化：将筛选得到的酵母菌株在ypx平板划线连续纯化3次，得到纯化菌株，于25％(v/v)甘油-80℃保存。
46.5、甘蔗糖蜜驯化选育：将上述经co
60
诱变选育的木糖乙醇高产菌株分别接种至10
°
bx、20
°
bx甘蔗糖蜜(均经过高温灭菌处理)，30℃，180rpm培养驯化3个月以上，按照上述co
60
诱变后菌株筛选的方法进行筛选及菌株纯化保存。
47.三、性能测试
48.1、甘蔗渣水解液制备
49.蔗渣60℃烘干后，粉碎过100目，固液比采用10％(w/v，％)，称取150 g甘蔗渣，加入1.5l 1.5％h2so4(w/w，％)室温放置4h，采用高压蒸汽115℃处理2.5h，经过酸处理的蔗渣滤液，测定总还原糖；经过酸处理后的滤泥，加1.6％naoh(w/v，％)110℃处理1h，水洗3次后添加纤维素酶、beta
‑ꢀ
葡聚糖酶、木聚糖酶进行酶解。
50.2、生长曲线测定
51.菌株经活化后，ypx培养基于30℃，200rpm培养至对数期(菌数2
×ꢀ
108/ml)，以1％接种量接种ypx进行同条件培养，定时取样，以ypx培养基做空白测定od
600
，做2个平行。
52.3、木糖乙醇发酵
53.采用15％fm发酵培养基或者蔗渣水解浓缩液。菌株活化三次后，种子液以10％接种量接种至15％fm发酵培养基或者蔗渣水解浓缩液，250ml三角瓶，装液量为50ml，30℃，130rpm培养进行乙醇发酵。每隔8h进行取样。做2个平行。
54.4、木糖含量测定
55.以dns法测定，4ml反应体系，但测定的是od
520
，做2个平行。
56.5、乙醇含量测定
57.以气相色谱法测定，做2个平行。
58.四、测试结果
59.采用co
60
9个剂量对树干毕赤酵母原始菌株1960进行诱变，然后进行涂板接种ypx平板培养基。结果发现，当剂量增加至1.2kgy时，平板上长出的菌落数量变少，且随着剂量的递增，菌落数量呈现递减。随机挑选平板上的单菌落(每个剂量挑选10个菌株，一共90个菌株)，均进行平板划线纯化三次后进行菌种保藏。90个菌株均进行木糖乙醇发酵(分批次)，发酵条件：30℃，130rpm，84h，取样测定乙醇含量。以原始菌株的乙醇含量作为对照，初筛诱变的效果比较，见图1。菌种通过初筛可知，低剂量(0.4-1kgy) 获得的正突变菌株较多，特别是1kgy剂量，所挑选的10个菌株，仅有1个菌株是负突变菌株。当剂量达到1.2kgy时，所获的突变株大部分是负突变株，且正突变株的木糖乙醇产量比原始菌株提高幅度不多。1.4-2kgy剂量的结果与1.2kgy的类似。如图1所示，co
60
诱变树干毕赤酵母采用低剂量的效果比较理想，获得的正突变株较多。菌株进行复筛，比较优良的是1k-9菌株，复筛结果如表1所示：
60.表1 co
60
突变株复筛结果
[0061][0062]
1k-9菌株为高产菌株31.1的出发菌株；12k-1菌株为低产菌株12.1；结果为二次试验的平均值和标准差。
[0063]
取高产菌株31.1、原始菌株1960和低产菌株12.1，分别利用15％(w/v) 木糖进行发酵，60h的乙醇产量如图2所示。高产菌株31.1乙醇产量比1960 提高14.13％(高度显著，p《0.001)，低产菌株12.1乙醇产量比原始菌株下降25.61％(高度显著，p《0.001)，而高产菌株31.1乙醇产量比低产菌株提高53.42％(高度显著，p《0.001)。
[0064]
三个菌株接种ypx，30℃，180rpm培养，生长曲线如图3所示。结果表明，原始菌株生
长速度最快，而两株突变菌株生长速度相似，均慢于原始菌株。但三个菌株间，差异均不显著(p≥0.05)。实际上，高产菌株31.1 的出发菌株是1k-9，后者的生长速度与原始菌株的相似(差异不显著)。1k-9 经过糖蜜驯化后，选育获得的31.1菌株木糖乙醇发酵性能得到提高。此外，三个菌株接种至15％fm，30℃，130rpm发酵，发酵曲线如图4、图5和图6 所示。结果表明，利用15％木糖(w/v)，原始菌株生长速度仍最快，其次是高产菌株31.1，如图4，但与原始菌株的差异不显著，低产菌株最慢，其比高产菌株略慢，两者间差异不显著，但与原始菌株的差异显著(p《0.05)；高产菌株能快速利用木糖产乙醇，其乙醇产量最高(图5)，其次是原始菌株的，但两者差异不显著，低产菌株最低，其乙醇含量与高产菌株的差异极显著(p《0.01)。高产、原始、低产菌株的木糖乙醇产率分别为0.78 g/(l
·
h)、0.66g/(l
·
h)和0.43g/(l
·
h)，相应的糖醇转化率分别为0.3755 g/g、0.3264g/g和0.2887g/g，发酵效率分别为81.64％、70.96％和62.77％；高产菌株31.1残留木糖含量最低，其次是原始菌株，但两者差异不显著，低产菌株的最高，其与高产菌株差异显著，但与原始菌株差异不显著(图6)。发酵80h，高产、原始、低产菌株的木糖利用率分别为98.52％、97.81％和 86.83％。
[0065]
上述结果表明，高产菌株31.1的木糖乙醇发酵性能优于原始菌株和低产菌株。
[0066]
本实施例采用9个剂量的co
60
对树干毕赤酵母原始菌株1960进行诱变，挑选100个不同剂量诱变的菌落进行木糖乙醇发酵，通过初筛和复筛等途径，选育系列的高产酵母菌株和一些低产菌株，并通过对高产菌株进行甘蔗糖蜜长时间驯化选育出更优良的高产菌株31.1，其乙醇产量比原始菌株提高 14.13％。
[0067]
取现有的多种菌株与本技术所得菌株进行性能比较。目前，以木糖为原料发酵，乙醇含量较高的菌种是拟青霉paecilomycessp.nf1(atcc-20766)。利用该菌种分别进行150g/l、200g/l木糖发酵，酒度分别为7.56％和9.31％，糖醇转化率对应为0.39g/g、0.38g/g，发酵效率均为75％，但发酵周期过长分别需要12d和13d，乙醇产率对应为0.21g/(l
·
h)、0.24g/(l
·
h)。本实施例选育的高产菌株31.1，木糖乙醇发酵效率为82.61％，乙醇产率为0.78 g/(l
·
h)，均高于拟青霉paecilomyces sp.nf1的。
[0068]
表2木糖乙醇发酵性能的比较
[0069]
[0070][0071]
备注：a：发酵84h的平均值；b：发酵60h的平均值。
[0072]
由表中可知，尽管高产菌株31.1的发酵效率低于cbs 5576菌株的 (97.83％)，但
其乙醇产率高于cbs 5576菌株的，后者的为0.34g/(l
·
h)。此外，高产菌株31.1的发酵效率与抑制的两株树干毕赤酵母ufmg-cm-y2303、 ufmg-cm-y2108菌株的相差不大，但这两个菌株的木糖乙醇产率分别为0.39 g/(l
·
h)、0.40g/(l
·
h)，明显低于高产菌株31.1的(如表2)。因此，高产菌株 31.1的木糖乙醇发酵性能在国内同类研究中处于前列水平。
[0073]
采用10％固液比(w/v，％)，称取150g甘蔗渣，加入1.5l 1.5％h2so
4 (w/w，％)室温放置4h，采用高压蒸汽115℃处理2.5h，经过酸处理的蔗渣滤液，测定的总还原糖含量为33.37
±
0.37g/l；经过酸处理后的滤泥继续添加1.6％naoh(w/v，％)，110℃处理1h，水洗3次后添加纤维素酶、 beta-葡聚糖酶、木聚糖酶后酶解，测定蔗渣水解液总还原糖含量为31.98
±ꢀ
0.54g/l。
[0074]
利用上述的经酸处理的未脱毒蔗渣水解液，添加1％酵母粉、2％蛋白胨后，调ph至3.8-4.0，接种高产菌株31.1和原始菌株1960培养72h，结果高产菌株31.1能在其中生长，而对照菌株未能生长。结果表明，选育的木糖乙醇高产菌株31.1能在未脱毒蔗渣水解液中生长。
[0075]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。