星状病毒复制子的方法和组合物与流程

1.本发明涉及用于引发改进的免疫应答的重组复制子和使用所述重组复制子的方法。


背景技术：

2.使用疫苗产生免疫力的一个基本方面是将向受试者递送免疫原性剂以便引发来自所述受试者的免疫系统的应答。具体地，有效刺激受试者的适应性免疫系统在发展出对特定病原体的长期免疫力方面是重要的。针对病毒病原体的免疫的一种方法设计将可独立复制的病毒基因材料，即复制子引入到宿主细胞中，由此引起刺激免疫系统的抗原蛋白的表达和分泌。
3.当前的复制子技术最初是基于将rna复制子包装在具有或不具有包膜糖蛋白的源自病毒的核衣壳(被称为病毒复制子颗粒(vrp))中的能力而概念化和开发的。这种方法必然仅限于具有将允许掺入大量外源基因组信息的足够的包装能力的较大病毒。为了满足这一要求，两种常用的vrp源自α病毒或黄病毒，所述两种病毒具有相对较大的基因组(》11千碱基)和粒径(》60nm)。
4.利用可以防止rna降解的各种调配物的rna非病毒递送的出现使得利用含有感染性rna基因组的正链rna病毒开发裸rna复制子成为可能。无需将复制子包装在病毒颗粒内，也就无需使用源自较大病毒的复制子。然而，这项技术仍然专注于α病毒和黄病毒复制子的使用，这很可能是由于所述两种病毒复制子在历史上的广泛使用。此外，基于α病毒的裸rna复制子已被证明，由于它们具有稳健的抗原表达动力学，因此作为疫苗平台是有效的，所述稳健的抗原表达动力学归因于所述复制子使用了对所关注异源基因进行编码的亚基因组以及对宿主的ifn介导的抗病毒状态的稳健诱导和对宿主的ifn介导的抗病毒状态的抗性。然而，由于为了最佳地避免潜在的毒性问题，降低复制子材料的有效剂量是合乎期望的，因此基因组大小仍然是考虑因素。另外，当采用较小的构建体时，使用重组dna技术的核酸操纵会大大简化，从而导致更大的基因易处理性和更快速的候选疫苗开发。因此，开发具有表现出与现有平台相同或相似的有益特性的较小基因组的复制子仍然是合乎期望的目标。
5.本公开通过提供符合这个期望的特征并且有效诱导增加的免疫应答的重组星状病毒复制子而克服了本领域中的缺点。


技术实现要素：

6.根据描述，各实施例包含一种重组复制子核酸，所述重组复制子核酸包括：第一开放阅读框，所述第一开放阅读框包括a.)对可以由细胞分泌的所关注蛋白质进行编码的亚基因组核酸序列；b.)第二开放阅读框，所述第二开放阅读框包括对第一星状病毒非结构蛋白(nsp1a)进行编码且包含高变区的核酸序列；以及c.)第三开放阅读框，所述第三开放阅读框包括对第二星状病毒非结构蛋白(nsp1b)进行编码且包含亚基因组启动子的核酸序列，所述亚基因组启动子被定位成以便于启动所述亚基因组核酸序列的转录。在一些实施
例中，所述重组复制子核酸具有以下结构：c.
→
b.
→
a.。在一些实施例中，所述重组复制子核酸在其5'端处具有7-甲基鸟苷酸帽。
7.在一些实施例中，所述第一开放阅读框进一步包括对星状病毒结构蛋白(vp90)进行编码的核酸序列的子集。在特定实施例中，所述子集由5到50个核苷酸组成。在其它特定实施例中，所述子集由30个核苷酸组成。
8.在一些实施例中，所述重组复制子核酸进一步包括星状病毒保守序列元件，所述星状病毒保守序列元件在所述第一开放阅读框内开始并且延伸超过所述第一开放阅读框的3'端。
9.在一些实施例中，所述高变区的星状病毒基因型与所述重组复制子核酸的星状病毒基因型不同。在这些实施例中的一些实施例中，所述重组复制子核酸的所述星状病毒基因型是hastv vii，并且所述高变区的所述星状病毒基因型是hastv iv。
10.在一些实施例中，所述第三开放阅读框包含翻译上游核糖体结合位点。
11.在一些实施例中，所述第一开放阅读框进一步包括对具有核糖体跳跃特性的肽进行编码的核酸序列。在特定实施例中，所述肽是来自明脉扁刺蛾(thosea asigna)病毒衣壳蛋白的2a肽(t2a)。
12.其它实施例包含一种纳米颗粒，所述纳米颗粒包括上述重组复制子核酸中的任何重组复制子核酸。在这些实施例中的一些实施例中，所述纳米颗粒基本上由含有所述重组复制子核酸的纳米结构脂质载体组成。其它实施例包含一种调配物，所述调配物包括在药学上可接受的载体中的多个所述纳米颗粒。
13.在一些实施例中，一种治疗受试者以使所述受试者产生免疫力的方法包括向所述受试者施用上述调配物并且由此引发所述受试者的免疫应答。在这些实施例中的一些实施例中，所述免疫应答包含cd4 t细胞活化。
14.在一些实施例中，一种组合物包括在药学上可接受的载体中的上述重组复制子核酸中的任何重组复制子核酸。
15.在一些实施例中，一种分离的细胞包括上述重组复制子核酸中的任何重组复制子核酸。在其它实施例中，一种向受试者递送治疗量的所关注蛋白质的方法包括向受试者施用有效量的所述分离的细胞，其中所述所关注蛋白质是治疗性蛋白质，并且所述细胞分泌所述所关注蛋白质并且由此向所述受试者递送治疗量的所述所关注蛋白质。
16.在一些实施例中，一种从细胞分泌所关注蛋白质的方法包括将上述重组复制子核酸中的任何重组复制子核酸在由此分泌所述所关注蛋白质的条件下引入到所述细胞中，并且其中所述细胞处于细胞培养物中，由此从所述细胞分泌所述蛋白质。一些实施例进一步包括从所述细胞培养物中采集所关注蛋白质的步骤。另一个实施例包含一种组合物，所述组合物包括由这种方法产生的所述所关注蛋白质。在仍其它实施例中，一种向受试者递送所关注治疗性蛋白质的方法包括向所述受试者施用所述组合物。
附图说明
17.图1a-c示出了人类星状病毒基因组的组构和所述组构对于表达所关注蛋白质的重要性。图1a示出了人类星状病毒(hastv)的包含三个开放阅读框(orf)，即orf 1a、orf 1b和orf 2的基因组组构的示意图，并且还示出了被提出在亚基因组转录和翻译中发挥作用
的侧接orf 2的高度保守序列元件的位置。图1b示出了描绘了四个hastv复制子的表格，所述四个hastv复制子对荧光素酶(nluc)进行编码并且各自具有对源自hastv orf 2的侧翼序列和邻近orf 2的3'非翻译区(3'utr)的四个修饰组合之一。图1c示出了由图1b中所描述的复制子在用100ng复制子以及分别作为阳性对照和阴性对照的对nluc或寨卡病毒(zikv)抗原进行编码的α病毒复制子转染并在24小时后采集的293t细胞中对nluc进行的表达。
18.图2a-g示出了在诱导肌内注射的c57bl/6小鼠的免疫应答的能力方面在纳米结构脂质调配的复制子之间进行的比较。图2a示出了以对所关注基因(goi)进行编码的亚基因组为特征的源自α病毒的复制子的示意图。图2b示出了对带有zikv基因的α病毒复制子(四个剂量的nlc调配的复制子)以及裸复制子对照和模拟注射对照进行的蚀斑减少中和测试的结果。图2c示出了由α病毒复制子诱导的两种不同的抗原特异性cd8 t细胞的百分比。图2d示出了由α病毒复制子诱导的两种不同的抗原特异性cd4 t细胞的水平。图2e示出了来自图1b的星状病毒复制子之一(5'-hastv-3')的示意图，所述星状病毒复制子具有对goi进行编码的亚基因组。图2f示出了由对以下两个goi进行编码的α病毒复制子和星状病毒复制子诱导的抗原特异性cd4 t细胞的组合百分比：zikv ns3抗原和结核分枝杆菌抗原id-93。还显示了来自单独的id-93蛋白的结果以及在具有gla-se佐剂的情况下的结果。图2g示出了在给予未经处理的小鼠和先前用对血凝素基因的部分序列进行编码的星状病毒复制子致敏的小鼠单剂量的无佐剂的线性表位(pr8血凝素(ha)亚基)后的抗血凝素免疫球蛋白g elisa滴度。
19.图3a-d示出了orf 2序列长度对预测的复制子二级rna结构和基因表达的影响。图3a示出了涵盖野生型(wt)hastv的orf 1b的3'端和5'端orf 2的400个核苷酸(nt)区的预测的二级结构。用轻量线和中量线描绘了三发夹结构，其中orf 2起始密码子已框出。图3b示出了包含orf 2的前9个nt的5'-3'hastv复制子中的167-nt区的预测二级结构，其描绘了三发夹结构的明显丢失。图3c示出了包含orf 2的前30个nt(在结构的右下方以轻量线描绘)的188-nt区的预测二级结构，其中三发夹结构明显稳定。图3d示出了针对具有orf 2的前9个nt的复制子中的来自图1b的三个复制子和具有以下的包含orf 2的前30个nt的三个复制子在293t细胞中进行的荧光素酶测定的结果：未经修饰的侧翼序列(5'-30nt-3')；经过修饰的5'侧翼序列(δ5'-30nt-3')；和添加了明脉扁刺蛾病毒2a(t2a)核糖体跳跃序列的未经修饰的侧翼序列(5'-30nt-t2a-3')。
20.图4a-c示出了用于检测α病毒复制子和星状病毒复制子中的亚基因组转录和翻译的偶联转录和翻译测定的结果。图4a示出了感染野生型hastv的caco-2细胞中的亚基因组转录。图4b示出了用对nluc进行编码的5'-30nt-t2a-3'复制子以及未封端的对照转染293t细胞后的定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)和荧光素酶测定结果。图4c示出了用对nluc进行编码的α病毒复制子以及未封端的对照转染293t细胞后的qrt-pcr和荧光素酶测定结果。
21.图5示出了在5'-30nt-t2a-3'复制子之间进行的在两种类型细胞中的基因表达的比较，其中orf 1a的高变区(hvr)属于天然基因型(hvr-vii)或发散基因型(hvr-iv)。
22.图6a-b示出了用于研究orf 2翻译控制机制，特别是翻译终止-重新启动的双顺反子报告基因测定的结果。图6a示出了orf 1b的所选择突变的汇总。图6b示出了用100ng图6a
中所描述的每种质粒转染后24小时对bhk细胞裂解物进行的双重荧光素酶测定的结果。
23.图7a-b示出了下游orf表达对上游orf序列的依赖性。图7a示出了在orf 1b中具有缺失的质粒构建体的描绘。图7b示出了在用100ng每种质粒转染后24小时在bhk细胞中进行的双重荧光素酶测定的结果。
具体实施方式
24.如本文所用，“复制子核酸”或“复制子”是指从单个复制起点进行复制的核糖核酸(rna)分子或rna的区域。术语“重组复制子核酸”是指已经通过人为干预发生改变的复制子核酸。作为非限制性实例，重组核酸分子：1)在体外已经合成或修饰，例如使用化学或酶技术(例如，通过使用化学核酸合成或通过使用用于核酸分子的复制、聚合、核酸外切、核酸内切、连接、逆转录、转录、碱基修饰(包含例如甲基化)或重组(包含同源和位点特异性重组)的酶)；2)包含本质上不连接的连接核苷酸序列；3)已经使用分子克隆技术工程化，使得其相对于天然存在的核酸分子序列缺少一个或多个核苷酸；和/或4)已经使用分子克隆技术进行操纵，使得其相对于天然存在的核酸序列具有一个或多个序列改变或重排。
25.术语“核酸序列”是指核酸分子的序列。本文使用如37c.f.r.
§
1.822中阐述的核苷酸碱基命名法。核酸分子可以是任何长度，包含但不限于介于3kb与50kb之间，例如介于3kb与40kb之间、介于3kb与40kb之间、介于3kb与30kb之间、介于3kb与20kb之间、介于5kb与40kb之间、介于5kb与40kb之间、介于5kb与30kb之间、介于5kb与20kb之间或介于10kb与50kb之间，例如介于15kb与30kb之间、介于20kb与50kb之间、介于20kb与40kb之间、介于5kb与25kb之间或介于30kb与50kb之间。核酸分子也可以是例如超过50kb。
26.术语“开放阅读框”(orf)意指由以起始密码子(通常为aug)开始并以终止密码子(通常为uaa、uag或uga)结束的连续的一段密码子组成的核酸序列。单个核酸分子中可以存在多于一个开放阅读框，并且一个开放阅读框可以与同一分子上的另一个开放阅读框重叠。例如，一个开放阅读框的核酸序列可以包含另一个开放阅读框的起始密码子。
27.术语“星状病毒5'非翻译区(5'utr)”意指星状病毒基因组的包括定位于开放阅读框orf 1a的起始aug的上游的核酸序列的片段。
[0028]“星状病毒3'非翻译区(3'utr)”意指星状病毒基因组的包括定位于开放阅读框orf 2的终止密码子的下游的核酸序列的片段。
[0029]“亚基因组启动子”是引导亚基因组信使rna的转录作为复制过程的一部分的启动子。此种启动子可以具有野生型序列或已经从野生型序列进行修饰但保留启动子活性的序列。
[0030]
术语“保守序列元件(cse)”描述了在所有已知人类星状病毒的基因组中具有相似位置、序列和二级结构的rna元件。
[0031]
如本文所用，“分离的细胞”是已从细胞天然存在的环境中移出和/或已经从细胞在其天然环境中存在的状态进行改变或修饰的细胞或细胞群。分离的细胞可以是例如细胞培养物中的细胞。分离的细胞也可以是可以动物体内和/或引入动物体内的细胞，并且其中细胞已经例如通过将α病毒颗粒引入细胞进行改变或修饰。
[0032]“受试者”包含但不限于温血动物，例如人、非人灵长类动物、马、牛、猫、狗、猪、大鼠和小鼠。
[0033]
一些实施例提供了包括包封在超分子结构中以形成纳米颗粒的复制子的组合物(例如，药物组合物)，其中多个此类纳米颗粒分散在药学上可接受的载体中。在特定实施例中，纳米颗粒包括包封在基于脂质的纳米颗粒中的复制子。在具体方面，纳米颗粒包括包封在纳米结构脂质载体(nlc)中的复制子。erasmus等人,《分子治疗学(molecular therapeutics)》26(10):2507-2522(2018)中描述了一个合适的nlc的实例。
[0034]“药学上可接受的”意指在生物学上或其它方面不是不期望的材料，即，所述材料可以与所选择纳米颗粒一起施用于受试者，而不会引起实质性有害的生物效应或以有害的方式与包含其它组分的组合物的所述其它组分中的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载体适于向人类和其它受试者施用或递送。如本领域的技术人员所熟知的，载体将被自然地选择来使活性成分的任何降解减到最少并且使受试者中的任何不良副作用降到最低(参见例如，《雷明顿氏药物科学(remington's pharmaceutical science)》；最新版本)。如疫苗或其它免疫原性组合物等药物调配物可以包括免疫原性量的所公开的星状病毒复制子以及药学上可接受的载体。示例性药学上可接受的载体包含但不限于无菌无热原水和无菌无热原盐水溶液。
[0035]
各种组合物(例如，核酸、纳米颗粒、药物组合物)的施用可以通过几种不同途径中的任一种途径来完成。组合物可以肌内、皮下、腹膜内、皮内、鼻内、颅内、舌下、阴道内、直肠内、口服或局部施用。组合物也可以通过皮肤划痕法或通过贴剂或液体经皮施用。组合物也可以以在一段时间内释放组合物的可生物降解材料的形式皮下递送。组合物也可以通过注射肌内递送。
[0036]
可以在将所分泌的所关注蛋白质递送到细胞的方法中采用核酸、纳米颗粒和药物组合物，所述细胞可以是受试者体内的细胞。因此，一些实施例提供了一种将有效量的所述实施例的核酸、纳米颗粒和/或组合物引入到细胞中的方法。还提供了一种向受试者递送有效量的所述实施例的核酸、纳米颗粒和/或组合物的方法。根据众所周知的基因疗法方案，可以采用此类方法赋予细胞和/或受试者治疗效果。
[0037]
星状病毒复制子通过将所述星状病毒复制子的较小的基因组大小与由α病毒复制子所提供的那些特征组合提供了一种有吸引力的替代方案：亚基因组rna复制策略和有所延迟但稳健的ifn诱导。星状病毒复制子机制由约4kb rna进行编码，而α病毒或黄病毒来源的那些复制子机制由约8kb rna进行编码。这将拷贝数方面的有效剂量降低了大约2倍。
[0038]
如本文所用，“有效量”是指足以产生期望的效果的组合物或调配物的量，所述期望的效果可以是治疗效果。有效量将随以下各项变化：受试者的年龄、一般病状；被治疗的病状的严重程度；施用的特定药剂；治疗的持续时间；任何并行治疗的性质；所使用的药学上可接受载体；以及在所属领域技术人员的知识和专业内的相似因素。适当地，任何个案中的有效量可以由本领域技术人员通过参考相关文本和文献和/或通过使用常规实验来确定。(参见例如，《雷明顿：药学科学与实践(remington,the science and practice of pharmacy)》(第20版2000))。
[0039]
本文所描述的复制子rna组合物以与剂量调配物相容的方式并且以预防和/或治疗有效的量施用。通常在104到10
10
个单位剂量的范围内(例如，104、105、106、107、108、109或10
10
)的要施用的量取决于：要治疗的受试者、施用或递送颗粒的途径、表达产物的免疫原性、所期望的效应免疫应答的类型和所期望的保护程度。需要施用或递送的活性成分的有
效量可能取决于医师、兽医或其它健康从业者的判断并且可能对给定的受试者具有特异性，但此种确定在此类从业者的技能范围内。
[0040]
所公开的组合物和调配物可以以单剂量方案或多剂量方案给予。多剂量方案是这样一种方案：其中主要施用过程可以包含1到10个或更多个单独的剂量，然后按照需要以随后的时间间隔施用其它剂量以维持和/或加强期望的效果(例如，治疗应答)。
[0041]
术语“治疗量”是指足以赋予经受病症、疾病或疾患折磨的受试者调节效果(例如，治疗应答)的量，所述调节效果例如可以是有益效果，包含受试者的病状的改善(例如，一种或多种症状的改善)，病状的进展延迟或减缓，病症、疾病或疾患的发作延迟，和/或病症、疾病或疾患等的如本领域众所周知的临床参数中的任何临床参数的改变。本公开中考虑的治疗应答的另一个实例是通过刺激受试者的免疫系统来增加对病原性疾病的抵抗力。
[0042]
如本文所用，“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”可以意指一个或多于一个，这取决于使用其的上下文。例如，“一个”细胞可以意指一个细胞或多个细胞。此外，如本文所用，“和/或”是指并且涵盖相关所列项中的一个或多个项的任何和所有可能的组合，以及当以替代形式(“或”)解释时组合的缺少。
[0043]
应当理解，前述详细描述仅通过说明的方式给出，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在其中进行修改和变化。
[0044]
实例
[0045]
提供以下实例以说明某些公开的实施例，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
[0046]
实例1-材料和方法
[0047]
复制子rna的制备
[0048]
将各种星状病毒复制子序列合成并克隆到在t7启动子下游和肝炎δ病毒核酶序列、t7终止子和noti限制位点上游的质粒中。为了制备用于下游研究的rna，将经过纯化的质粒通过以下线性化：用noti酶进行限制消化，然后通过苯酚-氯仿和乙醇沉淀进行纯化。然后，将线性化模板用于使用t7聚合酶的rna转录，并通过licl沉淀和乙醇洗涤进行纯化。然后，将rna转录物使用牛痘病毒封端酶进行封端，并通过licl沉淀和乙醇洗涤进行纯化。
[0049]
实例2-由具有所选择修饰的复制子进行蛋白质表达
[0050]
野生型(wt)人类星状病毒(hastv)复制机制由5'和3'非翻译区(utr)以及分别由两个重叠的开放阅读框orf 1a和orf 1b进行编码的非结构蛋白nsp1a和nsp1b组成，所述两个重叠的开放阅读框由核糖体移码机制加工而成。orf 1b的3'端含有假定会启动亚基因组rna的由从orf 1a和1b翻译的蛋白质介导的转录的所提出的亚基因组启动子。由orf 2进行编码的结构蛋白被认为是从这种亚基因组rna翻译而来的，所述亚基因组rna的起始密码子与orf 1b的3'端重叠。另外，存在高度保守的茎环序列，其在orf 2的3'端处开始并在3'utr中结束。参见图1a。
[0051]
开发了含有这些保守序列元件的组合的四个复制子以测试所述四个复制子对orf 2表达是否重要。5'-3'复制子含有完整的5'和3'保守序列元件。其它复制子含有orf 1b中使orf 2的起始蛋氨酸沉默的同义突变，(δ5')、保守的3'orf 2序列的缺失(δ3')或两者(δ5'-δ3')。orf 2包含对荧光素酶(nluc)进行编码的序列。参见图1b。
[0052]
为了测试序列元件对orf 2表达的影响，用100ng每个复制子以及分别作为阳性对
照和阴性对照的对nluc或寨卡病毒(zika virus，zikv)抗原进行编码的α病毒复制子转染293t细胞，并在24小时后对nluc表达进行测量。图1c中示出了这个测试的结果。虽然完整的5'和3'序列使nluc表达相较于δ5'-δ3'对应物增强了5倍且相较于背景增强了约25倍，但表达水平比α病毒阳性对照低约17,000倍，这表明另外的核酸序列可能对增强orf 2表达很重要。
[0053]
实例3-由重组星状病毒复制子进行cd4 t细胞诱导
[0054]
接下来，对5'-3'hastv复制子诱导t细胞对结核分枝杆菌抗原id-93或寨卡病毒ns3抗原的应答的能力进行了评估。为了制备这些构建体，合成了对id-93或寨卡病毒ns3蛋白进行编码的序列，并使用gibson组装将所述序列克隆到在avrii限制位点与pvui限制位点之间的5'-3'hastv复制子(图2e)和在pflmi限制位点与sacii限制位点之间的源自委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus)tc-83菌株的α病毒复制子(图2a)中。然后，如以上实例1中所描述的制备经过封端的rna，并将其转染到bhk细胞中以通过蛋白质印迹确认抗原表达(数据未示出)。在确认抗原表达后，将复制子调配在纳米结构脂质载体中，并通过单次肌内注射向c57bl/6小鼠体内施用1μg每个复制子。对于id-93复制子，将对单独的蛋白亚基以及有佐剂的(gla-se)蛋白亚基的另外的对照包含在内以在所述复制子与更传统的疫苗制备之间进行t细胞应答比较，所述更传统的疫苗制备先前已经示出会诱导小鼠的有效的抗原特异性cd4
t细胞应答。单次注射后十四天，采集脾脏，并用源自寨卡病毒ns3或分枝杆菌id-93抗原的mhc-ii限制性肽刺激，并进行染色以通过流式细胞术进行分析(图2f)。
[0055]
图2中示出的结果证明，虽然对细菌或病毒抗原进行编码的源自α病毒的复制子的非病毒递送在单次肌内注射后驱动了对经过编码的抗原的有效cd8 和抗体应答(图2b-d)，但是对相同抗原进行编码的源自星状病毒的复制子驱动了显著更高的抗原特异性cd4 t细胞应答(图2f)。
[0056]
为了测试对线性表位的这些cd4 t细胞应答是否可以增强对整个蛋白亚基的抗体应答，将c57bl/6小鼠用单剂量的对血凝素(ha)基因的15个氨基酸(aa)序列进行编码的星状病毒复制子致敏，所述ha基因在季节性流感病毒亚型之中是保守的并且先前示出在c57bl/6小鼠中具有反应性。二十一天后，向星状病毒rna致敏的小鼠以及原初小鼠施用单剂量的无佐剂的重组pr8 ha亚基蛋白，并对抗ha igg elisa滴度进行比较。与仅接受蛋白质的小鼠的抗ha elisa滴度(均值＝1:400)相比，用对保守15aa序列进行编码的星状病毒rna致敏的小鼠的抗ha elisa滴度(均值＝1:2200)显著升高更多(5.5倍)(图2g)。
[0057]
实例4-orf 2序列构成对表达和翻译的影响
[0058]
a.orf 2序列长度
[0059]
对预测二级rna结构的wt hastv中的包含所提出的亚基因组rna启动子的400-bp区进行评估，并将所述预测二级rna结构与实例2和3的包含orf 2的前9个核苷酸(nt)的5'-3'nluc复制子的预测结构进行比较。在wt序列(图3a中示出的)中，可以清楚地观察到三发夹结构(表示为用轻量线和中量线呈现的结构)，其中orf 2的起始密码子已加框。在具有orf 2的前9个nt的5'-3'复制子的预测二级结构(图3b中示出的)中，不存在两个发夹结构，只有在wt序列与复制子序列之间保守的发夹(以轻量线描绘的)。通过将来自orf 2的另外的21个nt(以轻量线在图的右下方描绘的)包含在内，三发夹结构似乎在预测中变得稳定
(图3c)。
[0060]
为了评估这30个nt在hastv复制中的作用，构建了含有具有或没有orf 1b中的同义突变的30-nt序列的另外的hastv复制子(分别为5'-30nt-3'复制子或δ5'-30nt-3'复制子)。对于对orf 2的n端10个氨基酸进行编码的5'-30nt-3'复制子，在nluc基因之前插入明脉扁刺蛾病毒2a(t2a)核糖体跳跃序列以制备5'-30nt-t2a-3'复制子。
[0061]
在rna的体外转录和封端后，将293t细胞用相同剂量的每个构建体转染，所述每个构建体包含分别作为阳性对照和阴性对照的两个委内瑞拉马脑炎病毒复制子(包含nluc基因的一个委内瑞拉马脑炎病毒复制子(vee-nluc)和包含zikv抗原基因的另一个委内瑞拉马脑炎病毒复制子(vee-zikv))。在转染后24小时，进行荧光素酶测定以定量异源基因表达。图3d中示出的结果支持以下结论：30个nt增强了异源基因表达并且orf 2起始密码子参与了有效的翻译起始，其中检测到的荧光素酶活性比背景水平高16,000倍以上，接近α病毒复制病毒rna的30倍以内。
[0062]
b.经过鉴定的orf 2序列对翻译的作用
[0063]
已经证明了前30个nt在orf 2表达中的重要性，接下来对这个序列元件在亚基因组转录中的作用进行确定。
[0064]
定量逆转录(qrt)pcr测定旨在定量在星状病毒复制期间累积的基因组和亚基因组拷贝，并在wt星状病毒复制的背景下验证所述测定。将caco-2细胞以0.1的感染复数感染wt星状病毒，并在感染后0小时、4小时、8小时、12小时和24小时采集细胞裂解物。然后提取rna，并在qrt-pcr测定中与要用作标准曲线的来自同一病毒的感染性克隆的t7转录的rna一起运行。与感染后8小时开始的基因组转录相比，可以检测到5倍过量的亚基因组转录(图4a)，重新概括先前公布的rna印迹(northern blot)数据并确认这个测定确实可以检测到亚基因组转录。
[0065]
接下来，在不对结构基因进行编码且不能在细胞之间传播的复制子的背景下应用这个测定，并且所述测定还允许对与转录结合的orf 2表达进行简单定量。作为阳性对照，设计了一种类似的qrt-pcr测定来检测α病毒复制子的基因组和亚基因组。虽然α病毒复制子表现出在转染后8小时开始过量的亚基因组转录，与nluc表达一致(图4b)，但星状病毒复制子(5'-30nt-t2a-3')没有明显表现出亚基因组转录超过基因组转录，并且有趣的是，早在转染后30分钟即可检测到nluc表达(图4b)。
[0066]
这些结果表明：1)测试的序列元件不足以介导亚基因组rna转录，并且2)hastv会利用允许orf 2独立于亚基因组rna转录进行早期翻译的替代性的orf 2表达机制。已经对也利用亚基因组消息来翻译其结构基因的杯状病毒进行了类似的观察。已经描述了牛诺如病毒(bovine norovirus)中结构基因独立于亚基因组转录的早期表达。这也可能表明结构基因表达在rna复制中的重要作用。
[0067]
实例5-orf 1a嵌合体对orf 2基因表达的影响
[0068]
检查了与基因组转录和亚基因组转录的差异相关的orf 1a区，其被称为高变区(hvr)。源自基因型iv hastv的hvr与临床样品中较高的病毒滴度以及亚基因组与基因组的比率的差异有关。
[0069]
使用上文所述的5'-30nt-t2a-3'复制子作为骨架(基因型vii hvr)，将hvr替换为基因型iv hastv的hvr，并转染caco2细胞和bhk细胞。如图5中所示出的，虽然在bhk细胞中
未检测到orf 2表达的差异，但在caco-2细胞上检测到了微小但显著的差异，这支持了先前公布的对caco-2细胞上的wt病毒观察到的数据。细胞系之间结果的差异表明了hvr在宿主范围内的作用。有趣的是，hvr嵌合体证明了大肠杆菌(e.coli)中的毒性较低，从而使得质粒产率较高，这可能会在星状病毒复制子的下游应用中得到证明是有用的。
[0070]
实例6-亚基因组转录-独立的orf 2翻译的机制
[0071]
鉴于杯状病毒和星状病毒之间的进化关系，接下来测试星状病毒是否以与杯状病毒类似的方式利用允许在复制周期早期进行orf 2的亚基因组转录-独立翻译的orf 1b与orf 2之间的翻译终止重新启动(ttr)。为了测试这个假设，分别在第一个orf和第二个orf中产生了对由hastv-1的orf 1b和orf 2的808bp区隔开的海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶进行编码的双顺反子报告基因(图6a)。然后进行了一系列突变以测试orf 1b终止密码子以及orf 2起始密码子的重要性，因为杯状病毒中的ttr已经示出取决于上游orf终止密码子的位置，而不取决于下游orf起始密码子。作为阴性对照，在orf 2起始密码子之前立即在orf 1b的端处插入终止密码子(3'终止)。在用100ng每个质粒转染bhk细胞后，进行双重荧光素酶测定，以首先测量萤火虫活性，然后淬灭并检测海肾活性(图6b)。然后相对于阴性对照(3'终止)将下游orf(萤火虫)表达相对于上游orf(海肾)表达归一化。
[0072]
相对于3'终止阴性对照，wt orf 1b/orf 2序列导致下游orf表达增加12倍。虽然orf1b终止密码子的类型对于下游orf表达似乎并不重要，但通过用编码色氨酸的tgg替换终止密码子来改变位置从而导致orf 1b阅读框在终止前延伸另外的34个密码子似乎消除了下游orf表达。最后，用acg替换orf 2的起始密码子似乎不会影响下游orf 2表达。这些发现与杯状病毒中的ttr一致。
[0073]
杯状病毒中的ttr的机制已经示出取决于宿主18s核糖体rna中的互补序列与杯状病毒基因组中的上游序列(被称为翻译上游核糖体结合位点(turbs))结合，从而允许脱离的核糖体重新启动下游orf的翻译。为了鉴定此种序列在星状病毒orf 1b中的潜在位置，接下来在双顺反子报告基因系统(图7a)中产生了一系列缺失突变体。另外，还在位于del3突变体中的turbs样序列内产生了突变，以查看所述序列是否对下游orf表达很重要。结果表明，虽然turbs样序列似乎没有显著影响下游orf表达，但需要位于del3突变体内的200bp序列(图7b)。有趣的是，这个200bp序列预计会形成图3c中所描绘的三发夹结构。
[0074]
等效物
[0075]
前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践实施例。前述描述和实例详述了某些实施例并描述了发明人设想的最佳模式。然而，应当理解，无论前述内容可以在文本中看起来如何详尽，实施例都可以以许多方式实践并且应当根据所附权利要求以及其任何等同物来解释。
[0076]
如本文所用，术语是指数值，包含例如整数、分数和百分比，无论是否明确指出。术语通常是指本领域的普通技术人员会认为等同于所列举的值(例如，具有相同的功能或结果)的数值范围(例如，所列举范围的 /-5-10％)。当如至少和等术语在数值或范围的列表之前时，所述术语修改列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语可以包含四舍五入到最接近的有效图的数值。
[0077]
序列表
[0078]
以下序列表提供了本文公开的序列列表。应理解的是，如果dna序列(包括ts)是相
对于rna引用的，那么ts应被us替换(可以根据上下文修改或不修改)，反之亦然。
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