亲和树脂、制备方法及其在分离纯化藻蓝蛋白中的应用与流程

1.本发明属于生物化学和海洋产物资源开发利用领域，特别是涉及一种亲和树脂、制备方法及其在分离纯化藻蓝蛋白中的应用。


背景技术：

2.亲和层析是蛋白质纯化的一种重要方法，具有很高的选择性、分离效果以及较大的载量。亲和层析填料的配基在一定条件下可特异性识别并结合目标蛋白，之后改变结合条件将目标蛋白从亲和填料中洗脱下来，即可实现的目标蛋白的纯化。往往一次层析即可从混合物获得较高纯度的目的蛋白，并保持较高的活性。亲和层析纯化的关键在于层析填料中配基的选择。目前市场上可选购多种类型的亲和填料商品试剂，为亲和纯化的广泛应用提供了便利。具体应用于纯化特定蛋白时，常需要在现有亲和填料的基础上连接特定分子(配基)，构成某一类蛋白亲和纯化的专用亲和填料(树脂)。
3.藻蓝蛋白(phycocyanin,pc)是蓝藻和红藻在水中捕获和传递光能的色素蛋白。藻蓝蛋白可以作为天然色素用于食品、化妆品行业，也可以作为荧光探针用于免疫检测、流式细胞荧光测定、荧光激活细胞分选、共聚焦荧光显微镜和单分子检测等多项技术中，在临床诊断、免疫化学及生物工程等研究领域发挥作用；藻蓝蛋白还具有抗氧化和抗肿瘤活性。藻蓝蛋白具有很高的开发利用价值，其应用与其纯度(最大吸收峰处的光吸收和280nm光吸收的比值)密切相关。一般认为纯度大于0.7为食品级,大于1.5为化妆品级,大于4.0为分析级。藻蓝蛋白用于荧光标记物时，需要其纯度达到4以上。
4.目前藻蓝蛋白的制备纯化方法主要是从藻类中分离提取天然蛋白，制备工艺有离子交换、羟基磷灰石和凝胶过滤柱层析，疏水作用膨胀床色谱，聚偏氟乙烯膜层析法等。这些工艺普遍存在流程繁冗，重复性不佳，纯度不够高，难以放大等问题，仍需研发新的从藻体中快速纯化藻蓝蛋白的工艺。


技术实现要素：

5.本发明目的在于根据上述分析，制备出植物色素亲和树脂并建立用其纯化藻蓝蛋白的柱层析工艺。所述方法制备的藻蓝蛋白的纯度达到4以上，符合分析级的标准。
6.本发明是通过如下技术方案来实现的：
7.一种亲和树脂，其特征在于所述亲和树脂是氨基树脂的氨基和植物色素(phytochromobilin，cas：143392-71-6)分子的羧基共价连接形成，植物色素分子作为亲和基团通过酰胺键结合到氨基树脂上。
8.所述亲和树脂的制备方法，取植物色素溶于有机溶剂，浓度40-50mmol/l，用相同有机溶剂清洗过的氨基树脂，将清洗后的氨基树脂和植物色素溶液混合，体积比为1：0.6-1：2.5，向混合物中加入终浓度为0.05-0.1mol/l的n，n'-二异丙基碳二亚胺(dic)偶联剂粉末，避光振荡混匀4-24h，植物色素结合到氨基树脂上，离心去除上清，以相同的有机溶剂清洗沉淀物，再以纯水清洗，之后以酸性和碱性溶液交替清洗，获得亲和树脂，用0.02％叠氮
钠溶液保藏亲和树脂。
9.进一步，所述的有机溶剂为无水乙醇或无水异丙醇。
10.本发明还提供利用所述亲和树脂分离纯化藻蓝蛋白的方法，所述方法具体如下：
11.1)制备藻蓝蛋白粗提液，以ph偏酸性的结合缓冲液流过亲和树脂的层析柱，平衡两个以上柱体积，将藻蓝蛋白粗提液加到亲和树脂层析柱上，先以结合缓冲液冲洗去杂蛋白，平衡至蛋白检测基线(280nm吸光值)稳定，再加入ph 4-5的洗脱缓冲液，以不超过2ml/min的流速洗脱，根据洗脱液的颜色变蓝或检测到620nm吸光值形成吸收峰，收集洗脱液，向收集液加入高浓度的ph缓冲液使溶液ph升至中性，计算含藻蓝蛋白的收集液的620nm和280nm吸光值的比值，确定藻蓝蛋白的纯度；
12.2)亲和树脂的再生，收集藻蓝蛋白洗脱峰后，改用结合缓冲液冲洗亲和树脂至流出液ph为中性，以含1mol/l nacl的结合缓冲液冲洗亲和树脂，洗去结合的杂蛋白；再以结合缓冲液冲洗至流出液电导稳定，即可进行下次藻蓝蛋白粗提液纯化；如暂不使用，则以纯水冲洗，再以0.02％叠氮钠冲洗，4℃冷藏。
13.本发明与现有技术相比的有益效果：
14.本发明提供了一种亲和树脂，所述树脂能够分离纯化藻蓝蛋白至分析纯以上级别。
附图说明
15.图1在植物色素亲和层析柱上分别以ph 6和ph 4(柠檬酸)缓冲液结合和洗脱藻蓝蛋白。
具体实施方式
16.本发明用下列实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明保护范围并非限于下列实施例。
17.植物色素(phytochromobilin，cas：143392-71-6)或英文名:3-[(2e,5z)-2-[[4-(2-carboxyethyl)-5-[(z)-[(3z,4r)-3-ethylidene-4-methyl-5-oxopyrrolidin-2-ylidene]methyl]-3-methyl-1h-pyrrol-2-yl]methylidene]-5-[(4-ethenyl-3-methyl-5-oxopyrrol-2-yl)methylidene]-4-methylpyrrol-3-yl]propanoic acid。
[0018]
实施例1
[0019]
亲和树脂及其制备方法：取伯乐(bio-rad)公司affi gel 102氨基琼脂糖5ml(含氨基约75μmol)转入15ml离心管中，倾倒或吸取上清，使用10ml分析纯的无水异丙醇洗五次，去除上清。加入现配的5ml 50mmol/l植物色素的异丙醇溶液(含植物色素250μmol)，再加入50mg dic，不断搅拌，避光，摇床振荡过夜。离心除去上清即植物色素溶液，保留新合成的亲和树脂，再以过量异丙醇洗，以洗去植物色素，再以含0.5mol/l nacl的0.1mol/l ph 4乙酸盐缓冲液和ph 8tris-hcl缓冲液交替洗三次。水洗亲和树脂，再以0.02％叠氮钠水溶液避光4℃保存。
[0020]
实施例2
[0021]
亲和树脂及其制备方法：取东曹(tosoh bioscience)公司toyopearl af-amino-650m氨基树脂5克(含氨基约500微摩尔)转入15ml离心管中，倾倒或吸取上清，使用10ml分
析纯的无水乙醇洗五次，去除上清。加入12.5ml40mmol/l植物色素的乙醇溶液(含植物色素500μmol)，加入dic粉末0.15克，不断混匀，25℃避光反应24h。离心，弃去上清即植物色素溶液，保留植物色素树脂并以过量无水乙醇清洗，再以纯水洗几次植物色素树脂，去除无水乙醇。向植物色素树脂中加入0.2mol/l乙酸钠4ml和乙酸酐2ml，0℃(冰水)摇动振荡混匀30min，加入乙酸酐2ml，在25℃振荡混匀30min。使用纯水清洗填料后，再使用0.1mol/l naoh清洗，最后再次使用纯水清洗。转入0.05％叠氮钠水溶液避光暂存。
[0022]
实施例3
[0023]
藻蓝蛋白粗提液制备：向冷冻的钝顶螺旋藻藻泥中加入纯水，于室温解冻，以湘仪h2050r离心机10000rpm低温离心20min，去上清，收集藻泥沉淀。取7g藻泥加入70ml ph 7的10mmol/l磷酸钠缓冲液，充分混匀后反复冻融：在-20℃和室温之间冻融两次，每次2h，最后冷冻-20℃过夜，第二天加入1％果胶酶，在4℃放置24h。低温离心10000rpm，20min，取上清即为藻蓝蛋白粗提液，测得藻蓝蛋白纯度(a615/a280)为0.9，含量为0.49mg/ml，4℃保存。
[0024]
实施例4
[0025]
藻蓝蛋白粗提液制备：将1.25l螺旋藻培养液以湘仪h2050r离心机10000rpm低温离心20min，去上清，收集藻体沉淀约10g，加入70ml ph 7的10mmol/l磷酸钠缓冲液，充分混匀后反复冻融：在-20℃冷冻过夜后置于室温复溶2h，再置于-20℃冷冻过夜。3次冻融处理后，加入5％果胶酶，在4℃放置24h。以10000rpm低温离心20min，取上清即为藻蓝蛋白粗提液，测得藻蓝蛋白纯度0.8，含量为0.38mg/ml，4℃保存。
[0026]
实施例5
[0027]
藻蓝蛋白粗提液的亲和树脂柱层析纯化工艺：取5ml伯乐公司affi gel 102氨基琼脂糖制备的亲和树脂，装入重力流塑料层析柱。先用50ml水冲洗平衡，待液面降至高于亲和树脂0.5cm(下同)，加入20ml 20mmol/l ph 5.5磷酸钠缓冲液(以下简称a液)冲洗平衡。加入10ml a液，同时加入5ml藻蓝蛋白粗提液。再加入30ml的a液冲洗平衡。之后加入40ml 20mmol/l ph 4的乙酸盐缓冲液洗脱藻蓝蛋白。当蓝色溶液流出时用10ml离心管收集。收集后立即加入0.5ml 0.5mol/l ph 8磷酸钠缓冲液调至中性。
[0028]
洗脱液不再呈蓝色后，以20ml含1mol/l nacl的a液冲洗亲和树脂，再用80ml的水冲洗，进行下一轮上样。如暂不使用，以30ml 0.05％的叠氮钠冲洗，液面降至高于亲和树脂2cm时封住出口，4℃冰箱保存。
[0029]
藻蓝蛋白收集液可以先用默克公司amicon ultra-15离心浓缩管(截留分子量3kda)浓缩。测得收集液中藻蓝蛋白纯度为4.2，超过分析级藻蓝蛋白纯度要求，可用于荧光标记物等。
[0030]
实施例6
[0031]
藻蓝蛋白粗提液的亲和树脂柱层析纯化工艺：将15ml亲和树脂装入思拓凡公司的xk16/20空层析柱，将层析柱连接到思拓凡公司的10s蛋白质快速纯化工艺开拓系统，检测280nm,620nm和650nm三个波长的吸光值。以20mmol/l ph 6磷酸钠缓冲液作为结合缓冲液，以2ml/min流速冲洗平衡亲和树脂后，加入预先通过0.22微米滤膜过滤的藻蓝蛋白粗提液10ml，约含2.4mg藻蓝蛋白，上样流速1ml/min。继续以该结合缓冲液冲洗亲和树脂，流速2ml/min，穿透峰中杂蛋白被洗去，冲洗至检测基线稳定。以20mmol/l ph4柠檬酸盐缓冲液洗脱，流速2ml/min(图1)，以10ml塑料离心管收集620nm的洗脱峰，收集3管蓝色
洗脱液。向每管收集液加入约0.5ml 0.5mol/l ph 8磷酸钠缓冲液使溶液ph升至中性。测得藻蓝蛋白纯度为4.4，超过分析级藻蓝蛋白纯度要求，可用于荧光标记物等。
[0032]
ph 4缓冲液洗脱至检测基线稳定后，改用结合缓冲液以2ml/min流速冲洗亲和树脂，流出液ph升至中性后，再以含1mol/l nacl的结合缓冲液冲洗亲和树脂，洗脱杂蛋白，洗脱液电导升至55ms/cm后趋于稳定，改用不含nacl的结合缓冲液冲洗，待电导降至原基线后停止洗脱，准备进行下次藻蓝蛋白粗提液的纯化。如暂不使用，则以纯水冲洗2个柱体积，再以0.02％叠氮钠冲洗2个柱体积，低温保藏。