一种黑曲霉以及一种捕获微藻的方法

1.本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种黑曲霉以及一种捕获微藻的方法。


背景技术：

2.微藻是一类原核或者真核单细胞微生物，生长速度快、适应力强、分布广泛。国内外众多研究人员将微藻用于污水处理。微藻可以用于畜禽废水、猪粪液、含酚废水、重金属废水等污水，以降低氮、磷、有机物和重金属的浓度，且微藻营养价值丰富，富含蛋白质、生物活性物质、微量元素等，可应用于食品、医药、化妆品、饲料等多个行业，开发高价值副产物。随着化石能源日益减少以及燃料燃烧产生的co2会造成温室效应，引发了人们对基于生物质的生物燃料开发的极大关注。由于微藻具有较快的繁殖速度、油脂含量高以及固定co2的特性，它已被公认为有希望的第三代生物燃料原料。
3.目前，限制微藻商业化发展最主要的因素是成本问题，微藻的采收占到生产总成本的20～30％。由于许多藻类个体微小(5～50μm)、藻类的密度与水相近、细胞表面呈负电荷等原因，使得微藻在水中形成稳定的悬浮状态，收集过程变得尤为困难。现行的藻类收集方法主要包括沉降、过滤、离心、气浮和絮凝。但是采用物理、化学原理的方法能耗过大，效率较低，所用试剂造成一定污染，并不适合实际生产，因此高效率、低成本且安全环保的生物絮凝在微藻收集领域具有很大的发展前景，然而具有生物絮凝能力的菌种常出现捕获率低、捕获不稳定的情况，且捕获的微藻种类比较单一、捕获后的共生体高价值物质含量较低，并不利于大规模产业应用。
4.例如nurfarahanamohdnasir在文章中利用黑曲霉捕获小球藻的效率在90％-97％之间(nurfarahana mohd nasir etc.subtopic:advances in water and wastewater treatment harvesting of chlorella sp.microalgae using aspergillus niger as bio-flocculant for aquaculture wastewater treatment[j].journal of environmental management.2019)、顾琼等人在研究卷枝毛霉高效收获小球藻的实验中，得出菌藻共培养后的混合液中多糖质量浓度为0.019g/l(顾琼，金文标等.利用卷枝毛霉成球特性高效收获微藻[j].环境科学，2017)，菌种性能均有待提高。可见，现有技术中缺少一种同时具有多种优良特性的捕获微藻的生物捕获剂。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种黑曲霉以及一种捕获微藻的方法，以解决现有技术中微藻捕获成本高、效率低、不稳定、高价值物质含量低的问题。
[0006]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007]
本发明提供了一种黑曲霉，所述黑曲霉为黑曲霉aspergillus niger hw8-1，于2021年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23233。
[0008]
优选的，所述黑曲霉的its拼接遗传序列如seq:no.1所示。
no.23233。本发明所述黑曲霉的its拼接遗传序列优选如seq:no.1所示。
[0034]
本发明还提供了一种捕获微藻的方法，采用黑曲霉aspergillus niger hw8-1对微藻进行捕获，在本发明中，所述微藻优选包括小球藻、栅藻和/或红球藻，所述微藻的藻细胞浓度优选为2
×
104～1
×
107个/ml，进一步优选为1
×
105～1
×
106个/ml，还优选为2
×
105～8
×
105个/ml。
[0035]
在本发明中，所述捕获优选包括如下步骤：
[0036]
将黑曲霉aspergillus niger hw8-1与微藻共同培养；
[0037]
所述黑曲霉aspergillus niger hw8-1的状态为孢子悬液和/或菌丝球。
[0038]
在本发明中，当黑曲霉aspergillus niger hw8-1的状态为孢子悬液时，所述孢子悬液的孢子浓度优选为1
×
103～1
×
107个/ml，进一步优选为2
×
104～1
×
106个/ml，还优选为8
×
104～5
×
105个/ml。
[0039]
在本发明中，将黑曲霉aspergillus niger hw8-1的孢子悬液与微藻混合后进行共同培养；所述共同培养的温度优选为25～40℃，进一步优选为27～35℃，还优选为30～32℃；所述共同培养的ph优选为5～8，进一步优选为6～7；所述共同培养的时间优选为12～96h，进一步优选为24～72h，还优选为36～48h；所述共同培养采用的培养基优选为bg-11培养基以及在bg-11培养基的基础上得到的改良培养基；所述共同培养优选为在温控摇床中培养，所述温控摇床的转速优选为110～150rpm，进一步优选为120～140rpm。
[0040]
在本发明中，当黑曲霉aspergillus niger hw8-1的状态为菌丝球时，将黑曲霉aspergillus niger hw8-1的菌丝球与微藻混合后进行共同培养；所述共同培养的温度优选为25～40℃，进一步优选为22～38℃，还优选为28～35℃；所述共同培养的ph优选为5～8，进一步优选为7.2～7.8；所述共同培养的时间优选为12～96h，进一步优选为24～72h，还优选为36～48h；所述共同培养采用的培养基优选为bg-11培养基以及在bg-11培养基的基础上得到的改良培养基；所述共同培养优选为在温控摇床中培养，所述温控摇床的转速优选为110～150rpm，进一步优选为120～140rpm。
[0041]
在本发明中，所述菌丝球优选由包含如下步骤的培养方式培养得到：将黑曲霉aspergillus niger hw8-1孢子悬液接种于培养基中进行培养获得菌丝球；在本发明中，用于培养菌丝球的黑曲霉aspergillus niger hw8-1孢子悬液的孢子浓度优选为1
×
104～1
×
107个/ml，进一步优选为2
×
104～1
×
106个/ml，还优选为8
×
104～5
×
105个/ml；所述菌丝球的培养的温度优选为25～35℃，进一步优选为28～32℃；所述菌丝球培养的时间优选为24～72h，进一步优选为36～48h；所述菌丝球的培养采用的培养基优选为pdb培养基、bg-11培养基、f/2培养基或在上述培养基的基础上改良得到的培养基；所述菌丝球优选的在温控摇床中培养，所述温控摇床的转速优选为100～150rpm，进一步优选为120～140rpm；本发明在菌丝球培养结束后，优选的进行菌丝球的收集和清洗；所述收集优选的采用无菌纱布过滤，所述清洗采用无菌水进行，所述清洗的次数优选为2～3次，所述清洗的目的是去除菌丝球表面残留的培养基。
[0042]
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0043]
实施例中用到的改良bg-11培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：nano31.500 g/l，k2hpo4·
3h2o 0.04g/l，mgso4·
7h2o 0.075g/l，cacl2·
2h2o 0.036g/l，柠檬酸
0.006g/l，柠檬酸铁铵0.006g/l，na2co30.02g/l，na2edta 0.001g/l，h3bo30.00286 g/l，mncl2·
4h2o 0.00181g/l，znso4·
7h2o 0.00022g/l，cuso4·
5h2o 0.000079g/l，na2moo4·
2h2o 0.00039g/l，co(no3)2·
6h2o 0.000049g/l，葡萄糖10g/l。
[0044]
实施例中用到的菌种来源如下：
[0045]
实验所用小球藻来自于北京林业大学环境科学与工程学院109生物实验室(专利号：cn201310168216.4)，雨生红球藻来自中国科学院淡水藻种库(藻种编号：fachb-712)。
[0046]
实施例1
[0047]
在超净工作台中，严格按照无菌操作将斜面保存的黑曲霉菌(aspergillus niger hw8-1)菌种用接种环以划线形式接入pda培养基平板表面，放入培养箱中，30℃条件下进行活化扩培。挑选平板上菌落较大的单一菌株，接到种子培养基平板上，放入培养箱中，30℃培养3d，黑曲霉菌(aspergillus niger hw8-1)在固体平板培养基上的生长状态如图1所示。
[0048]
在无菌操作台用接种针从黑曲霉菌(aspergillus niger hw8-1)的平板上刮取一些菌落孢子在5ml无菌水中，然后在显微镜下用细胞计数器计数。
[0049]
向含100ml改良bg-11培养液的锥形瓶中加入1
×
106个黑曲霉菌(aspergillus niger hw8-1)孢子使得孢子浓度为1
×
104个/ml，置于30℃，130rpm的恒温水浴摇床中培养72h，形成均匀菌丝球，然后用医用无菌纱布过滤，无菌水冲洗2遍以便洗掉表面培养基，如图2所示。
[0050]
取小球藻(cholorella vulgaries)藻液转移至改良bg-11中，使得藻液浓度为5
×
106个/ml，将清洗干净的菌丝球转移至含有小球藻藻液的锥形瓶中，并将锥形瓶置于恒温水浴摇床中，在30℃，130r/min的条件下进行捕获，生成颗粒状的小球藻(cholorella vulgaries)—黑曲霉(aspergillus niger hw8-1)菌丝的藻菌共生体，捕获72h后藻菌共生体如图4所示。
[0051]
实施例2
[0052]
向含100ml改良bg-11培养液的锥形瓶中加入黑曲霉菌(aspergillus niger hw8-1)孢子使得孢子浓度为1
×
104个/ml(计数方法同实施例1)，置于30℃，130rpm的恒温水浴摇床中培养72h，锥形瓶中形成均匀菌丝球后用医用无菌纱布过滤，无菌水冲洗2遍以便洗掉表面培养基。
[0053]
取小球藻(cholorella vulgaries)藻液转移至改良bg-11中，使得藻液浓度为1
×
107个/ml，将清洗干净的菌丝球转移至含有小球藻藻液的锥形瓶中，并将锥形瓶置于恒温水浴摇床中，在30℃，130r/min的条件下进行捕获，生成颗粒状的小球藻(cholorella vulgaries)—黑曲霉(aspergillus niger hw8-1)菌丝的藻菌共生体。
[0054]
实施例3
[0055]
向含100ml改良bg-11培养液的锥形瓶中加入黑曲霉菌(aspergillus niger hw8-1)孢子使得孢子浓度为1
×
104个/ml(计数方法同实施例1)，置于30℃，130rpm的恒温水浴摇床中培养72h，锥形瓶中形成均匀菌丝球后用医用无菌纱布过滤，无菌水冲洗2遍以便洗掉表面培养基。
[0056]
取雨生红球藻(haematococcus pluvialis)藻液转移至改良bg-11中，使得藻液浓度为2
×
104个/ml，将清洗干净的菌丝球转移至含有小球藻藻液的锥形瓶中，并将锥形瓶置
于恒温水浴摇床中，在30℃，130r/min的条件下进行捕获，生成颗粒状的雨生红球藻(haematococcus pluvialis)—黑曲霉(aspergillus niger hw8-1)菌丝的藻菌共生体。
[0057]
实施例4
[0058]
吸取黑曲霉菌(aspergillus niger hw8-1)孢子悬液于含有100ml改良bg-11培养基的250ml锥形瓶内，控制真菌孢子接种浓度为1
×
105个/ml(计数方法同实施例1)，同时将小球藻转移至同一锥形瓶中使得藻密度为5
×
106个/ml，将锥形瓶置于温控摇床中共培养，温度为30℃，转速为130rpm，培养96h形成大小均匀的藻菌共生体，如图3所示。
[0059]
实验例1
[0060]
在实施例1、实施例3、实施例3的捕获过程中每隔12h取样检测吸光度，并计算捕获效率；
[0061]
吸光度使用酶标仪(型号：multiskan-k3，thermo，usa)测定。
[0062]
捕获效率计算公式为：r＝[1-(n0/n
t
)]
×
100
[0063]
式中：
[0064]
r—收获效率(％)；
[0065]
n0—收获前藻液在680nm下的吸光度；
[0066]nt
—捕获t时间后藻液在680nm下的吸光度。
[0067]
将结果进行统计，如图5和图6所示。
[0068]
由图5、图6可知，在实施例1中，当接种小球藻的初始藻密度为5
×
106个/ml的情况下，捕获24h即可达到90.8％的捕获效率，后续24-72h均维持在97％左右，72h捕获率最高为97.7％；在实施例2中，即将小球藻的初始藻密度调整为1
×
107个/ml时，捕获率明显升高，捕获12h即可达到92％的捕获效率，后续12-72h的捕获效率维持在97％-98％，最高可达98.124％；在实施例3中，将小球藻更换为雨生红球藻且初始藻密度调整为2
×
104个/ml后，24h的捕获效率即达到92.97％，后续24-72h的捕获效率均维持在93％以上，最高达到95.35％。
[0069]
实验例2
[0070]
在实施例4的共培养捕获过程中每隔24h取样检测吸光度(方法同实验例1)，将结果进行统计，以单独培养小球藻作为对照计算捕获效率，如图7所示。
[0071]
由图7可知，捕获过程中共培养体系的吸光度相较于对照组先增加后显著减少，其原因可能是在成球初期，藻细胞和菌孢子大量繁殖抱团，使得培养体系浑浊，从而导致吸光度增高，在捕获96h时形成均匀稳定的菌藻球粒，从而使培养体系变得清澈，藻细胞被收获，其捕获效率最高达到98.124％。
[0072]
实验例3
[0073]
对实施例2、实施例3、实施例4中捕获后的藻菌共生体进行高价值物质含量测定，其中：
[0074]
油脂测量使用改进的甲醇-氯仿萃取法，具体步骤为：将捕获后的藻菌液离心洗涤两次，以除去残留的培养基.通过超声破碎仪破碎20min，然后取15ml样品加入氯仿、甲醇和水，比例为2：2：1进行充分萃取。萃取后将样品8000rmp进行4℃离心10min，，然后将底层的氯仿层吸出后氮吹至有机溶剂完全挥发，恒重后即得到总油脂。捕获后菌藻球的含油率(％)＝油脂质量/菌丝球干重
×
100％；
[0075]
多糖测量使用改进的硫酸-蒽酮法，具体步骤如下：将捕获后的藻菌液离心洗涤两次，以除去残留的培养基。然后通过超声破碎仪破碎20min，取2ml样本沸水浴20min，以使细胞中多糖释放。然后以8000r/min离心10min，取上清液用蒽酮硫酸法测定多糖含量。捕获后藻菌球的多糖率(％)＝多糖含量/菌丝球干重
×
100％；
[0076]
蛋白质测量使用改进的folin-酚试剂法，具体步骤如下：将捕获后的藻菌液离心洗涤两次，以除去残留的培养基。然后通过超声破碎仪破碎20min，取1ml样品以8000r/min离心10min，取上清液以0.45微米滤膜过滤得到水样，再加入folin-酚甲、乙进行显色，并测吸光度从而计算蛋白质含量。捕获后藻菌球的含蛋白质率(％)：蛋白质含量/菌丝球干重
×
100％。
[0077]
对结果进行统计，如图8所示。
[0078]
由图8可知，本发明中的黑曲霉菌(aspergillus niger hw8-1)捕获微藻，比捕获前能够进一步提高微藻体系的高价值物质含量，更有利于微藻生物柴油工业化应用。其中小球藻的含油率可提高1％～10％，含多糖率可提高1％～6％，含蛋白质率可提高1％～2％。与现有技术中的生物捕获剂相比，能够进一步提高体系的高价值物质含量，更有利于微藻生物柴油工业化应用。
[0079]
由以上实施例可知，本发明提供了一种黑曲霉以及一种捕获微藻的方法，可在短时间内捕获藻细胞并形成微藻-真菌大颗粒以便收获，捕获效率高达98.12％，且体系更为稳定，能够进一步提高体系的高价值物质含量。捕获过程操作简便，条件易于实现和控制，有效降低了微藻收获的成本，满足了微藻商业化生产应用的要求，是一条经济、高效地捕获微藻的新途径，具备良好的应用前景。
[0080]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。