杀虫蛋白的用途的制作方法

1.本发明涉及一种杀虫蛋白的用途，特别是涉及一种ace1蛋白质通过在植物中表达来控制亚洲玉米螟为害植物的用途。


背景技术：

2.亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis(hubern))为鳞翅目螟蛾科全变态型昆虫。主要为害玉米、高粱、谷子等，也能为害棉花、甘蔗、大麻、向日葵、水稻、甜菜、甘蔗豆类等作物，属于世界性害虫。在中国所有玉米产区都有为害发生，是玉米生产上的第一大害虫。一般年份春玉米受害减产7-10％，大发生年减产30％以上。夏玉米由于生长季节短，因玉米螟为害造成的损失更大。玉米是中国最大粮食作物之一，年种植面积在6亿亩。按亩单产400公斤计算，每年因玉米螟为害而减产达240亿公斤，折合人民币约300亿元。
3.亚洲玉米螟一生经历卵、幼虫、蛹和成虫共4个虫态，一般一年可发生1-7代(根据纬度不同)。其幼虫期是为害玉米的时期，在玉米生产的黄淮和东北区，一年至少有两代幼虫可为害玉米。在北方春玉米区，第一代幼虫主要为害玉米苗期，幼虫一经孵化即潜入心叶丛蛀食心叶或在叶片间隙取食幼嫩叶片的叶肉造成针孔或窗户纸状的花叶，若3龄以上的幼虫蛀入未展开心叶，取食心叶造成排孔。幼虫取食心叶发育至3龄前后，此时玉米进入喇叭口期，幼嫩的雄穗对玉米螟比心叶更具有吸引力，所以幼虫将转移至雌穗取食。抽雄后幼虫被带出心叶，此时除少数老熟幼虫可在雄穗上化蛹外，所有幼虫开始向下转移，由于此时幼虫基本已是4-5龄，开始明显地发挥其“钻蛀”的特性。其中雌穗着生及其上下节是最易遭受袭击的部位。此时玉米雌穗已开始发育，如其附近茎节被蛀食，会明显地影响其正常发育甚至中止发育。此外由于玉米螟在植株中下部蛀茎，遇风极易造成倒折，使损失更大。第二代虫发生在玉米吐丝期，初孵幼虫大多集中潜藏到雌穗顶端地花丝基部内，取食花丝继而取食幼嫩籽粒，也有少数至叶腋处取食积存的花粉或叶腋组织。幼虫发育到3龄后，开始出现钻蛀行为，或直接从穗头蛀入穗轴，或继续取食正在灌浆的籽粒，或从雌穗顶向下转移再次蛀入雌穗、雌穗柄或茎秆。此时玉米雌穗己经充分发育到其应有的大小，并己进入乳熟期。因此穗期为害不会影响雌穗大小，但影响玉米正常灌浆，从而降低千粒重。如果雌穗柄被蛀空将会造成穗折而脱落。幼虫取食籽粒除直接造成产量损失外，常引发玉米穗、茎腐病的感染，更加重了产量损失和品质下降。
4.在中国，亚洲玉米螟的防治工作始于50年代。其所采用的主要防治方法有：农业防治、化学防治、物理防治、性信息素防治和生物防治等。
5.农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因素，创造一个有利于作物生长而不利于亚洲玉米螟发生的农田生态环境。如利用处理玉米螟越冬寄主、改革耕作制度、种植抗螟品种、设置诱集田和间作等措施减少玉米螟的为害。因农业防治必须服从作物布局和增产的要求，应用有一定的局限性，不能作为应急措施，在螟害爆发时就显得无能为力。
6.化学防治即农药防治，是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是玉米螟综合治理的重要
组成部分，它具有速效、方便、简便和高经济效益的特点，特别是在害虫大发生的情况下，是必不可少的应急措施，它可以在害虫造成为害前将其消灭。如目前推广面积最大的颗粒剂防治方法，效果最为稳定和可靠，但高效施颗粒剂的工具仍远未过关，严重影响其作用的发挥。此外还有撒毒土、药液喷雾、敌敌畏封垛熏蒸秸秆垛内越冬代成虫等药剂防治方法。但化学防治也有其局限性，如使用不当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性，以及杀伤天敌，污染环境，使农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。
7.物理防治主要根据害虫对环境条件中各种物理因素的反应，利用各种物理因素如光、电、色、温湿度等及机械设备进行诱杀、辐射不育等方法来防治害虫。目前应用最广泛的是高压汞灯诱杀，它利用越冬代幼虫集中在村屯中的玉米秸秆垛中越冬的特点，在越冬代成虫羽化期，大范围连片在村屯设置高压汞灯，对玉米螟成虫进行诱杀，防治效果明显。高压汞灯必须是保证夜间连续供电的村屯方能应用，且操作有一定难度。
8.性信息素防治是利用人工合成的玉米螟性信息素直接诱杀玉米螟雄虫和干扰螟虫交配，减少田间雌蛾受精率，减轻螟害。
9.其中的诱杀法是利用人工合成的玉米螟性信息素在玉米螟的交尾栖息场所如长势好的麦田或菜地等诱杀玉米螟雄蛾。此法的缺点是水盆诱捕器管理费工，并且必须大面积连片使用才有效。
10.其中的迷向法是在越冬代玉米螟成虫羽化10％时，在其交尾场所每公顷用性信息素散发器4500～6000个挂在作物上，干扰螟蛾的交尾。利用性信息素防治一代玉米螟，方法简便，效果良好，不污染环境，不伤害天敌。不足之处是诱芯的投放费工。
11.生物防治是利用某些有益生物或生物代谢产物来控制害虫种群数量，以达到降低或消灭害虫的目的。其特点是对人、畜安全，对环境污染少，对某些害虫可达到长期控制的目的。最常见的生物防治有赤眼蜂和白僵菌等。但赤眼蜂防治受气候因素影响大，效果常不稳定，并且不论螟虫发生轻重均需同样投资进行。
12.为了解决农业防治、化学防治、物理防治和生物防治在实际应用中的局限性，科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基因植物以防治植物虫害。
13.ace1是一类全新杀虫蛋白，其与传统bt蛋白完全不同。通过蛋白二级结构的分析，推测该蛋白属于β-开孔蛋白。该类蛋白的作用机制一般为酶切活化、与受体结合、形成寡聚体、在膜表面开孔。其中昆虫肠道内的酶切活化、与昆虫肠道上的受体结合以及肠道内的理化环境决定了该蛋白能否在昆虫肠道细胞膜上完成开孔。该类蛋白由菌体分泌之后，需要在作用对象体内经酶切形成活性蛋白，酶切过程主要在蛋白的氨基端或羧基端进行，将该蛋白变成活性片段。活性蛋白与昆虫肠道上皮细胞膜上的受体结合，形成寡聚体，插入肠膜，导致细胞膜出现穿孔病征，破坏细胞膜内外的渗透压变化及ph平衡等，扰乱昆虫的消化过程，最终导致其死亡。
14.已报道ace1蛋白对鞘翅目玉米根虫害虫有抗虫效果。然而，至今尚无关于通过产生表达ace1蛋白的转基因植株来控制亚洲玉米螟对植物危害的报道。


技术实现要素：

15.本发明的目的是提供一种杀虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达ace1蛋白来控制亚洲玉米螟的方法，且有效克服现有技术农业防治、化学防治、物理防治和生物防治等技术缺陷。
16.为实现上述目的，本发明提供了一种控制亚洲玉米螟害虫的方法，包括将亚洲玉米螟害虫至少与ace1蛋白接触。
17.进一步地，所述ace1蛋白存在于至少产生所述ace1蛋白的宿主细胞中，所述亚洲玉米螟害虫通过摄食所述宿主细胞至少与所述ace1蛋白接触。
18.更进一步地，所述ace1蛋白存在于至少产生所述ace1蛋白的细菌或转基因植物中，所述亚洲玉米螟害虫通过摄食所述细菌或所述转基因植物的组织至少与所述ace1蛋白接触，接触后所述亚洲玉米螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对亚洲玉米螟危害植物的控制。
19.所述转基因植物可以处于任意生育期。
20.所述转基因植物的组织为根、叶片、茎秆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝。
21.所述对亚洲玉米螟危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
22.所述植物为玉米和高粱。
23.所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述ace1蛋白的多核苷酸的植物。
24.在上述技术方案的基础上，所述ace1蛋白为ace1_3蛋白、ace1_4蛋白、ace1_5蛋白、ace1_6蛋白、ace1_8蛋白、ace1_9蛋白、ace1_10蛋白、ace1_11蛋白、ace1_12蛋白、ace1_13蛋白、ace1_14蛋白、ace1_15蛋白、ace1_16蛋白、ace1_17蛋白、ace1_18蛋白、ace1_19蛋白、ace1_20蛋白或ace1_21蛋白。
25.优选地，所述ace1蛋白氨基酸序列具有seq id no:1至seq id no:18所示的氨基酸序列。
26.在上述技术方案的基础上，所述植物还包括至少一种不同于编码所述ace1蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
27.进一步地，所述第二种核苷酸编码cry类杀虫蛋白质、vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。
28.优选地，所述第二种核苷酸编码cry1ab、cry2ab、cry1a.105蛋白。
29.更进一步地，所述cry1ab、cry2ab、cry1a.105蛋白的氨基酸序列具有seq id no:37、seq id no:38、seq id no:39所示的氨基酸序列。所述第二种核苷酸具有seq id no:40、seq id no:41、seq id no:42所示的核苷酸序列。
30.可选择地，所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsrna。
31.为实现上述目的，本发明还提供了一种ace1蛋白质控制亚洲玉米螟害虫的用途。
32.为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制亚洲玉米螟害虫的植物的方法，包括向所述植物的基因组中引入编码ace1蛋白的多核苷酸序列。
33.为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制亚洲玉米螟害虫的植物种子的方法，包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码ace1蛋白的多核苷酸序列的种子。
34.为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制亚洲玉米螟害虫的植物的方法，
包括：
35.种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因组中包括编码ace1蛋白的多核苷酸序列；
36.使所述植物种子长成植株；
37.使所述植株在人工接种亚洲玉米螟害虫和/或亚洲玉米螟害虫自然发生危害的条件下生长，收获与其他不具有编码ace1蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤和/或具有增加的植物产量的植株。
38.本发明中所述的“接触”，是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达杀虫蛋白，还可以是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或具有产生杀虫蛋白的微生物。
39.本发明术语“控制”和/或“防治”是指亚洲玉米螟害虫至少与ace1蛋白接触，接触后亚洲玉米螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地，亚洲玉米螟害虫通过摄食植物组织至少与ace1蛋白接触，接触后全部或部分亚洲玉米螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种效应，如生长发育缓慢和/或停止。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，含有编码ace1蛋白的多核苷酸序列的控制亚洲玉米螟害虫的植物和/或植物种子，在人工接种亚洲玉米螟害虫和/或亚洲玉米螟害虫自然发生危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，具体表现包括但不限于改善的茎秆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。ace1蛋白对亚洲玉米螟的“控制”和/或“防治”作用是可以独立存在的，不因其它可“控制”和/或“防治”亚洲玉米螟害虫的物质的存在而减弱和/或消失。具体地，转基因植物(含有编码ace1蛋白的多核苷酸序列)的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生，ace1蛋白和/或可控制亚洲玉米螟害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响ace1蛋白对亚洲玉米螟的“控制”和/或“防治”作用，也不能导致所述“控制”和/或“防治”作用完全和/或部分由所述另一种物质实现，而与ace1蛋白无关。通常情况下，在大田，亚洲玉米螟害虫摄食植物组织的过程短暂且很难用肉眼观察到，因此，在人工接种亚洲玉米螟害虫和/或亚洲玉米螟害虫自然发生危害的条件下，如转基因植物(含有编码ace1蛋白的多核苷酸序列)的任何组织存在死亡的亚洲玉米螟、和/或在其上停留生长受到抑制的亚洲玉米螟害虫、和/或与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤，即为实现了本发明的方法和/或用途，即通过亚洲玉米螟害虫至少与ace1蛋白接触以实现控制亚洲玉米螟害虫的方法和/或用途。
40.在本发明中，ace1蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个cry类杀虫蛋白质和/或vip类杀虫蛋白质的表达。这种超过一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外，一种植物(第1亲本)可以通过遗传工程操作表达ace1蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达cry类杀虫蛋白质和/或vip类杀虫蛋白质。通过第1亲本和第2亲本杂交获得表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
41.rna干扰(rna interference，rnai)是指在进化过程中高度保守的、由双链rna(double-stranded rna，dsrna)诱发的、同源mrna高效特异性降解的现象。因此在本发明中
可以使用rnai技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
42.本发明所述的亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis(hubern))为我国玉米生产中为害最广泛也最严重的害虫，其属于鳞翅目螟蛾科全变态型昆虫。雄成虫体长13-14mm，翅展22-28mm，体背黄褐色，前翅内横线为黄褐色波浪纹，外横线暗褐色，呈锯齿状纹。雌成虫体长约14-15毫米，翅展28-34毫米，体鲜黄色，各条线纹红褐色。老熟幼虫，体长20-30毫米，圆筒形，头黑褐色，背部淡灰色或略带淡红褐色幼虫中、后胸背面各有1排4个圆形毛片，腹部1～8节背面前方有1排4个圆形毛片，后方两个，较前排稍小。
43.亚洲玉米螟为我国分布最广，为害最严重的玉米害虫，根据中国农技推广中心的统计，其每年为害面积可达3.5亿亩，分布于东北、黄淮以及西南等各地。普遍可造成5-10％的损失，严重地区可造成30％的损失。
44.本发明所述的小地老虎(agrotis ypsilon(rottemberg))是一种常见农业害虫，属于鳞翅目夜蛾科杂食性昆虫。主要为害玉米，大豆，棉花，油菜等。以幼虫取食作物茎基部，造成倒伏或死亡，严重时可造成缺苗断垄。
45.本发明所述的东方黏虫(mythimna separate(walker))是鳞翅目夜蛾科迁飞性杂食性害虫，为害玉米、水稻、高粱等作物。东方黏虫喜食叶，3龄后能将整片叶咬食成缺刻状，或吃光心叶，形成无心苗；5至6龄达暴食期，能将幼苗地上部分全部吃光，或将整个植株叶片吃掉只留下叶脉，造成严重减产，甚至绝收。
46.本发明中所述的ace1蛋白是一类β-开孔蛋白，而昆虫肠道内的酶切活化、与昆虫肠道上的受体结合以及肠道内的理化环境是β-开孔蛋白起作用的关键点，只有能够将β-开孔蛋白进行酶切成活性片段后，并与昆虫肠道上皮细胞膜上的受体结合，才有可能使得某个β-开孔蛋白对该害虫具有抗虫效果。受体结合过程需要精确匹配，往往开孔蛋白或受体蛋白上的一个氨基酸差异就能造成与同一受体的结合发生改变。例如同属于β-开孔蛋白的气溶素蛋白(aerolysin)在r336a突变后，对ctll-2细胞系的毒力产生了质的变化(osusky,teschk等，2008)。同样由于受体发生了变化也可导致同一个β-开孔蛋白的毒力发生变化。例如采用dsrna将mdck细胞系上的havcr1基因进行抑制，导致了ε-毒蛋白(epsilon-toxin)对细胞的毒力产生了百倍差异(ivie,fennessey等，2011)。这充分说明了β-开孔蛋白与昆虫体内酶和受体的相互作用方式是复杂且难以预料的。
47.本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。
48.本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。
49.本领域技术人员所熟知的，dna典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于dna在植物中复制产生了dna的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将dna的一条链转录为一条mrna的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mrna实际上是从dna的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(orf)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的dna有相当功能的rna。
50.本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明ace1基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明ace1基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。
51.本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进dna杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0
×
氯化钠/柠檬酸钠(ssc)处理，然后在50℃条件下用2.0
×
ssc洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0
×
ssc、50℃到高度严格条件的约0.2
×
ssc、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6
×
ssc、0.5％sds溶液中，在65℃下发生特异性杂交，然后用2
×
ssc、0.1％sds和1
×
ssc、0.1％sds各洗膜1次。
52.因此，具有抗虫活性并在严格条件下与本发明seq id no:19至seq id no:36杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40％-50％同源，大约60％、65％或70％同源，甚至至少大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性。
53.本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗亚洲玉米螟害虫的生物活性的蛋白。
54.本发明中所述的dna分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始dna或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。
55.使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体。例如，本领域熟知制造点突变的技术。又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用dna重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长基因的片段，并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。例如，可以使用酶诸如bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。还可以使用多种限制性内切酶获取编码活性片段的基因。可以使用蛋白酶直接获得
这些毒素的活性片段。
56.本发明可以从β-开孔蛋白分离物和/或dna文库衍生出等价蛋白和/或编码这些等价蛋白的基因。有多种方法获取本发明的杀虫蛋白。例如，可以使用本发明公开和要求保护的杀虫蛋白的抗体从蛋白质混合物鉴定和分离其它蛋白。特别地，抗体可能是由蛋白最恒定和与其它β-开孔蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(elisa)或western印迹方法使用这些抗体专一地鉴定有特征活性的等价蛋白。可使用本领域标准程序容易的制备本发明中公开的蛋白或等价蛋白或这类蛋白的片段的抗体。然后可以从微生物中获得编码这些蛋白的基因。
57.由于遗传密码子的丰余性，多种不同的dna序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代dna序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的dna序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段。
58.本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。
59.保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，n.neurath和r.l.hill在1979年纽约学术出版社(academic press)出版的《protein》中进行了描述。最常见的互换有ala/ser，val/ile，asp/glu，thu/ser，ala/thr，ser/asn，ala/val，ser/gly，tyr/phe，ala/pro，lys/arg，asp/asn，leu/ile，leu/val，ala/glu和asp/gly，以及它们相反的互换。
60.对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见，cunningham和wells，1989，science 244：1081-1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的抗虫活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定(参见，如de vos等，1992，science 255：306-312；smith等，1992，j.mol.biol 224:899-904；wlodaver等，1992，febs letters 309：59-64)。
61.在本发明中，ace1蛋白包括但不限于seq id no:1至seq id no:18，与seq id no:1至seq id no:18所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于78％，优选的大于85％，更优选的大于90％，甚至更优选的大于95％，并且可以大于99％。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％的相同性和/或类似性。
62.本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、内含子以及其它可操作地连接到所述ace1蛋白的调节序列。
63.所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内进行表达的启动子。植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于，来源于花椰菜花叶病毒的35s启动子、玉米ubi启动子、水稻gos2基因的启动子等。备选地，植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组织内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规rna试验进行测定)，如pep羧化酶启动子。备选地，植物中可表达的启动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时，启动子调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于，马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pinⅰ和pinⅱ)和玉米蛋白酶抑制基因(mpi)的启动子。
64.所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用
‘
kdel’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植物凝集素基因的ctpp靶向液泡。
65.所述前导序列包含但不限于，小rna病毒前导序列，如emcv前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯y病毒组前导序列，如mdmv(玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(bip)；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mrna的不翻译前导序列(amv rna4)；烟草花叶病毒(tmv)前导序列。
66.所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(camv)增强子、玄参花叶病毒(fmv)增强子、康乃馨风化环病毒(cerv)增强子、木薯脉花叶病毒(csvmv)增强子、紫茉莉花叶病毒(mmv)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(cmylcv)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(clcumv)、鸭跖草黄斑驳病毒(coymv)和花生褪绿线条花叶病毒(pclsv)增强子。
67.对于单子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻act1内含子。对于双子叶植物应用而言，所述内含子包含但不限于，cat-1内含子、pkannibal内含子、piv2内含子和“超级泛素”内含子。
68.所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于，来源于农杆菌(agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(nos)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂ⅱ(pinⅱ)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssrubisco e9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。
69.本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白
的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子)、提供dna转移和/或整合功能的序列(即t-dna边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复制功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
70.本发明中所述的“杀虫”或“抗虫”是指对农作物害虫是有毒的，从而实现“控制”和/或“防治”农作物害虫。优选地，所述“杀虫”或“抗虫”是指杀死农作物害虫。更具体地，目标昆虫是亚洲玉米螟害虫。
71.本发明中ace1蛋白对亚洲玉米螟害虫具有毒性。本发明中的植物，特别是玉米，在其基因组中含有外源dna，所述外源dna包含编码ace1蛋白的核苷酸序列，亚洲玉米螟害虫通过摄食植物组织与该蛋白接触，接触后亚洲玉米螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。抑制是指致死或亚致死。同时，植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成。此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要(所述化学或生物杀虫剂为针对ace1蛋白所靶向的亚洲玉米螟害虫的杀虫剂)。
72.植物材料中杀虫蛋白的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mrna进行定量，或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。
73.可以应用不同的试验测定植物中杀虫蛋白的杀虫效果。本发明中目标昆虫主要为亚洲玉米螟。
74.本发明中，所述ace1蛋白可以具有序列表中seq id no:1至seq id no:18所示的氨基酸序列。除了包含ace1蛋白的编码区外，也可包含其他元件，例如编码选择性标记的蛋白质。
75.此外，包含编码本发明ace1蛋白的核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达，所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敌草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如epsps基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂(如ppt)的抗性基因，从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。
76.本发明中，将外源dna导入植物，如将编码所述ace1蛋白的基因或表达盒或重组载体导入植物细胞，常规的转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将dna摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的dna导入。
77.本发明提供了一种杀虫蛋白的用途，具有以下优点：
78.1、内因防治。现有技术主要是通过外部作用即外因来控制亚洲玉米螟害虫的危
害，如农业防治、化学防治、物理防治和生物防治；而本发明是通过植物体内产生能够杀死亚洲玉米螟的ace1蛋白来控制亚洲玉米螟害虫的，即通过内因来防治。
79.2、无污染、无残留。现有技术使用的化学防治方法虽然对控制亚洲玉米螟害虫的危害起到了一定作用，但同时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发明控制亚洲玉米螟害虫的方法，可以消除上述不良后果。
80.3、全生育期防治。现有技术使用的控制亚洲玉米螟害虫的方法都是阶段性的，而本发明是对植物进行全生育期的保护，转基因植物(ace1蛋白)从发芽、生长，一直到开花、结果，都可以避免遭受亚洲玉米螟的侵害。
81.4、全植株防治。现有技术使用的控制亚洲玉米螟害虫的方法大多是局部性的，如叶面喷施；而本发明是对整个植株进行保护，如转基因植物(ace1蛋白)的根、叶片、茎秆、果实、雄穗、雌穗、花药或花丝等都是可以抵抗亚洲玉米螟侵害的。
82.5、效果稳定。现有技术使用的无论是农业防治方法还是物理防治方法都需要利用环境条件对害虫进行防治，可变因素较多；本发明是使所述ace1蛋白在植物体内进行表达，有效地克服了环境条件不稳定的缺陷，且本发明转基因植物(ace1蛋白)的防治效果在不同地点、不同时间、不同遗传背景也都是稳定一致的。
83.6、简单、方便、经济。本发明只需种植能够表达ace1蛋白的转基因植物即可，而不需要采用其它措施，从而节省了大量人力、物力和财力。
84.7、效果彻底。现有技术使用的控制亚洲玉米螟害虫的方法，其效果是不彻底的，只起到减轻作用；而本发明转基因植物(ace1蛋白)可以造成初孵亚洲玉米螟幼虫的大量死亡。
85.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
86.图1为本发明杀虫蛋白的用途的含有ace1核苷酸序列的重组表达载体dbn01-p构建流程图。
具体实施方式
87.下面通过具体实施例进一步说明本发明杀虫蛋白的用途的技术方案。
88.第一实施例、基因的获得和合成
89.1、获得核苷酸序列
90.ace1杀虫蛋白的氨基酸序列，如表1所示；编码相应于所述ace1杀虫蛋白的氨基酸序列的ace1核苷酸序列，如表1所示。
91.表1、ace1蛋白及其对应的氨基酸及核苷酸序列
92.杀虫蛋白名称氨基酸序列号细菌核苷酸序列号植物核苷酸序列号ace1_3seq id no:1seq id no:19seq id no:43ace1_4seq id no:2seq id no:20seq id no:44ace1_5seq id no:3seq id no:21seq id no:45ace1_6seq id no:4seq id no:22seq id no:46ace1_8seq id no:5seq id no:23seq id no:47
ace1_9seq id no:6seq id no:24seq id no:48ace1_10seq id no:7seq id no:25seq id no:49ace1_11seq id no:8seq id no:26seq id no:50ace1_12seq id no:9seq id no:27seq id no:51ace1_13seq id no:10seq id no:28seq id no:52ace1_14seq id no:11seq id no:29seq id no:53ace1_15seq id no:12seq id no:30seq id no:54ace1_16seq id no:13seq id no:31seq id no:55ace1_17seq id no:14seq id no:32seq id no:56ace1_18seq id no:15seq id no:33seq id no:57ace1_19seq id no:16seq id no:34seq id no:58ace1_20seq id no:17seq id no:35seq id no:59ace1_21seq id no:18seq id no:36seq id no:60
93.2、合成上述核苷酸序列
94.上述18条ace1蛋白的核苷酸序列(如序列表seq id no:19至seq id no:36)由南京金斯瑞生物科技有限公司分别合成。
95.第二实施例、重组表达载体的构建和重组表达载体转化大肠杆菌获得ace1蛋白
96.1、构建含有ace1基因的重组表达载体
97.将第一实施例合成的ace1蛋白(ace1_3至ace1_6、ace1_8至ace1_21)的核苷酸序列连入蛋白表达载体pet28a(novagen，usa，cat：69864-3)上，操作步骤按novagen公司产品pet28a载体说明书进行，得到重组表达载体dbn01-p至dbn18-p，其构建流程如图1所示(其中，kan表示卡纳霉素抗性基因；f1 ori表示噬菌体f1的复制起点；lacl为lacl起始密码子；ace1_3为ace1_3核苷酸序列(seq id no:19)；mcs为多克隆位点)。
98.ace1蛋白及其对应的重组表达载体名称，如表2所示：
99.表2、ace1蛋白及其对应的重组表达载体名称
100.杀虫蛋白名称重组表达载体ace1_3dbn01-pace1_4dbn02-pace1_5dbn03-pace1_6dbn04-pace1_8dbn05-pace1_9dbn06-pace1_10dbn07-pace1_11dbn08-pace1_12dbn09-pace1_13dbn10-pace1_14dbn11-pace1_15dbn12-pace1_16dbn13-p
ace1_17dbn14-pace1_18dbn15-pace1_19dbn16-pace1_20dbn17-pace1_21dbn18-p
101.2、重组表达载体转化大肠杆菌获得ace1蛋白
102.然后将重组表达载体dbn01-p至dbn18-p用热激方法转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞(transgen，china，cat：cd501)，挑取阳性克隆于lb液体培养基(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 10g/l、氨苄青霉素100mg/l，用naoh调ph至7.5)中于温度37℃，转速200r/min条件下培养16h。再将培养液按照1：10的比例转接到yt培养基中，置于温度37℃，转速200r/min条件下培养。当培养液的od＝600值达到0.6-0.8时，加入iptg至终浓度为0.5mm进行诱导表达6h，离心培养液收集菌体，弃上清，加入pbs重悬后超声波破碎，用sds-page对表达蛋白进行检测，估算蛋白浓度，于温度-20℃保存备用。
103.第三实施例、饲喂ace1蛋白鉴定对亚洲玉米螟的抗虫效果
104.将实施例二中所述的2获得的ace1系列(ace1_3至ace1_6、ace1_8至ace1_21)蛋白分别对玉米螟、小地老虎、东方黏虫进行抗虫效果检测。每一个虫子共设置18组处理，分别为：ace1_3至ace1_6、ace1_8至ace1_21，以及1组阴性对照处理：gfp。将ace1_3至ace1_6、ace1_8至ace1_21、gfp的蛋白液分别混合到饲料中，终浓度为50μg/g。每组处理进行3次重复。
105.表3、ace1蛋白饲喂玉米螟、小地老虎、东方黏虫的抗虫结果
[0106][0107]“ ”代表有致死效果；
“‑”
代表无抗虫效果；“nt”代表未测试；“s”代表发育抑制
[0108]
表3的结果表明：ace1_3至ace1_6、ace1_8至ace1_11、ace1_13、ace1_14、ace1_16至ace1_18蛋白均对玉米螟表现出良好的抗虫效果，而对小地老虎和东方黏虫仅表现出抑制发育的效果。
[0109]
由此证明ace1蛋白(ace1_3至ace1_6、ace1_8至ace1_11、ace1_13、ace1_14、ace1_16至ace1_18)都显示出对玉米螟的抗性活性，这种活性足以对玉米螟的生长产生不良效应从而使其在田间得以控制。同时通过控制玉米螟为害，也有可能降低转ace1基因植株上病害的发生，极大的提高转ace1基因植株的产量及品质。
[0110]
综上所述，本发明杀虫蛋白的用途通过植物体内产生能够杀死玉米螟的ace1蛋白来控制玉米螟害虫；与现有技术使用的农业防治方法、化学防治方法、物理防治方法和生物防治方法相比，本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治玉米螟害虫的侵害，且无污染、无残留，效果稳定、彻底，简单、方便、经济。
[0111]
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明
的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。