一种子宫内膜类器官培养基及培养方法与流程

1.本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种子宫内膜类器官培养基及培养方法。


背景技术：

2.子宫内膜经历着动态发育的过程，在生殖过程中，子宫内膜的功能层在下丘脑-垂体-卵巢轴的控制下经历月经周期的再生、分化和脱落。粘膜包含单层腺体，由分泌柱状上皮排列，间质分隔。子宫内膜的基本功能是腔上皮和腺上皮，由纤毛和分泌细胞的混合物。管腔上皮是胚胎附着的部位，上皮覆盖在子宫内膜表面，从内膜向间质内陷形成腺体。腺分泌物中富含胎盘生长所必需的生长因子和脂质。
3.类器官(organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细胞培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。
4.虽然多种人源其他组织(如肝脏、肠等)使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养成功为类器官，但是目前关于子宫内膜类器官的培养方法的研究及报道较少，尤其是具体的试验流程、操作步骤、培养条件、及培养基配方尚无太多报道。


技术实现要素：

5.针对目前国内子宫内膜类器官培养技术的空白，本发明提供一种子宫内膜类器官培养基及培养方法。本发明的技术方案为：
6.第一个方面，本发明提供一种子宫内膜类器官培养基，按照终浓度组成包括：10-100ng/ml的egf，20-500ng/ml的noggin，20-500ng/ml的r-spondin 1，20-500ng/ml的wnt3a，1-100ng/ml的fgf9，10-200ng/ml的kiaa1199，1-100ng/ml的sox2，10-100nm异黄酮，100-2000nm的chir99021，1-40μm的a83-01，2-50μm的rock抑制剂，50-200ug/ml的原代细胞抗生素；以上成分均溶于dmem/f12培养液中。
7.优选地，所述培养基按照终浓度的组成包括：20-100ng/ml的egf，100-400ng/ml的noggin，100-400ng/ml的r-spondin 1，100-400ng/ml的wnt3a，20-50ng/ml的fgf9，50-100ng/ml的kiaa1199，20-80ng/ml的sox2，20-80nm异黄酮，500-1000nm的chir99021，5-20μm的a83-01，5-20μm的rki-1477，50-150ug/ml原代细胞抗生素。
8.可选地，上述培养基组成中，将fgf9替换为fgf10。
9.第二个方面，本发明提供一种子宫内膜类器官培养方法，是采用上述培养基，包括以下步骤：
10.步骤一，将获得的子宫内膜标本经过预处理得到细胞数量为3-50个细胞的细胞
团；
11.步骤二，将细胞团与matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定20-30min；
12.步骤三，加入所述培养基，于37℃、5％co2条件下培养4-7天，期间每隔2-3天更换一次培养基，即得。
13.本发明培养基含有子宫内膜组织类器官培养所需的组分，适用范围广，能够培养包括来源于正常组织、癌组织等多来样本源的组织。本发明培养基具体特点如下：
14.①
本发明的培养基组分不需要细胞培养中最常见的组分牛血清白蛋白(fbs)，并且不需要加入激素等其他大蛋白分子，组成简单，节约成本的同时降低了fbs中带来的细胞毒性和抑制物。
15.②
本发明添加的特异性细胞因子有利于子宫内膜干细胞的快速扩增以及类器官的成熟与分化。
16.③
本发明添加的抑制剂全部为水溶性抑制剂，不需要dmso溶解，保证效果的同时减少了dmso对体外细胞培养的毒性。
17.④
本发明培养基经过组分浓度优化设计后适合子宫内膜组织类器官培养，生长速度快，传代次数显著提高，多次传代后仍能维持原代组织同样的组织结构与基因组特性。
附图说明
18.图1为实施例1子宫内膜癌类器官光学显微镜图。
19.图2为实施例2子宫内膜癌类器官光学显微镜图。
20.图3为实施例3子宫内膜类器官光学显微镜图。
21.图4为实施例4子宫内膜类器官光学显微镜图。
22.图5为实施例5子宫内膜癌类器官he染色图。
23.图6为实施例5子宫内膜类器官he染色图。
24.图7为实施例7子宫内膜癌类器官光学显微镜图。
25.图8为实施例8子宫内膜类器官光学显微镜图。
26.图9为对比例1子宫内膜癌类器官光学显微镜图。
27.图10为对比例2子宫内膜癌类器官光学显微镜图。
28.图11为对比例3子宫内膜癌类器官光学显微镜图。
具体实施方式
29.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
31.实施例1
32.本实施例提供一种子宫内膜癌类器官培养基及培养方法，子宫内膜癌类器官培养基按照终浓度组成为：80ng/ml的egf，150ng/ml的noggin，250ng/ml的r-spondin 1，150ng/ml的wnt3a，25ng/ml的fgf9，60ng/ml的kiaa1199，20ng/ml的sox2，80nm的异黄酮，500nm的
chir99021，8μm的a83-01，8μm的rki-1477，100ug/ml的原代细胞抗生素。子宫内膜癌类器官培养方法为：
33.1)样本洗涤：将获得的子宫内膜癌标本转入离心管中，然后用无菌生理盐水震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入无菌生理盐水洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
34.2)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3。
35.3)样本消化：加入1ml iv型胶原酶在37℃震荡消化30分钟，消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
36.4)细胞收集：将步骤(3)中的液体1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞数量为3-50个细胞的细胞团。
37.5)将细胞团与matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定20-30min。
38.6)在培养皿内加入上述培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％co2浓度下培养。
39.7)每隔2天更换一次培养基，培养6天后可得到子宫内膜癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图1所示。
40.实施例2
41.本实施例提供一种子宫内膜癌类器官培养基及培养方法，子宫内膜癌类器官培养基按照终浓度组成为：20ng/ml的egf，400ng/ml的noggin，80ng/ml的r-spondin 1，400ng/ml的wnt3a，50ng/ml的fgf9，100ng/ml的kiaa1199，80ng/ml的sox2，20nm的异黄酮，1000nm的chir99021，20μm的a83-01，18μm的rki-1477，50ug/ml的原代细胞抗生素。子宫内膜癌类器官培养方法同实施例1。培养6天后可得到子宫内膜癌类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图2所示。
42.实施例3
43.本实施例提供一种子宫内膜类器官培养基及培养方法，子宫内膜类器官培养基按照终浓度组成为：50ng/ml的egf，100ng/ml的noggin，500ng/ml的r-spondin 1，100ng/ml的wnt3a，50ng/ml的fgf9，30ng/ml的kiaa1199，50ng/ml的sox2，15nm的异黄酮，200nm的chir99021，15μm的a83-01，10μm的rki-1477，100ug/ml原代细胞抗生素。子宫内膜类器官培养方法为：
44.1)样本洗涤：将获得的子宫内膜标本转入离心管中，然后用无菌生理盐水震荡洗涤30秒，去掉上清，重新加入无菌生理盐水洗涤。按照上述方法反复洗涤3次去除组织表面的杂质。
45.2)样本剪切：在生物安全柜中，将样本转移至6cm培养皿，用已消毒的手术剪在冰上操作将组织剪碎至大小1-5mm3。
46.3)样本消化：加入1ml iv型胶原酶在37℃震荡消化30分钟，消化结束后，加入5ml无菌生理盐水终止消化。
47.4)细胞收集：将步骤(3)中的液体1000rpm离心5min，小心去除上清得到细胞数量为3-50个细胞的细胞团。
48.5)将细胞团与matrigel基质胶混匀后铺板，待凝固后倒置固定20-30min；
49.6)在培养皿内加入上述培养基，然后置于恒温培养箱在37℃，5％co2浓度下培养。
50.7)每隔2天更换一次培养基，培养5天后可得到子宫内膜类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图3所示。
51.实施例4
52.本实施例提供一种子宫内膜类器官培养基及培养方法，子宫内膜类器官培养基按照终浓度组成为：50ng/ml的egf，100ng/ml的noggin，500ng/ml的r-spondin 1，100ng/ml的wnt3a，50ng/ml的fgf9，30ng/ml的kiaa1199，50ng/ml的sox2，15nm的异黄酮，200nm的chir99021，15μm的a83-01，10μm的rki-1477，100ug/ml原代细胞抗生素。子宫内膜类器官培养方法同实施例3，培养5天后可得到子宫内膜类器官，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图4所示。
53.实施例5
54.实施例1获得的子宫内膜癌类器官形态鉴定与功能验证
55.利用实施例1培养出的子宫内膜癌类器官按照以下方法进行he染色：
56.1)包埋切片：用包埋模具包类器官，然后切片机切成4-6μm的切片贴于防脱载玻片。
57.2)烤片：将载玻片放置在玻片架上，放入烘箱中，65℃，30min，将载玻片上的水分烤干、石蜡烤融即可。
58.3)脱蜡：使用二甲苯脱蜡三次，每次10分钟；然后用100％酒精浸洗三次，每次1分钟；最后用流水浸洗1分钟。
59.4)h&e染色：先用苏木素染色8min，然后水洗1min，接着用1％盐酸酒精分化1-2秒钟，然后再用流水冲洗30min，再接着用1％伊红浸染1-2min，最后用流水冲洗1min。
60.5)染色后固定：依次浸入95％酒精和100％酒精，每种试剂各两次，每次2分钟。
61.6)透明及封固：使用二甲苯透明2min，取出晾干后用中性树胶封固。
62.在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图5所示，显示多形性细胞，细胞核深染，上皮组织紊乱，显示出子宫内膜癌特征。
63.实施例6
64.实施例3获得的子宫内膜类器官形态鉴定与功能验证
65.利用实施例3培养出的子宫内膜类器官，参照实施例5进行he染色，结果在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图6所示，子宫内膜类器官结构为空泡状，核染色正常。
66.实施例7
67.子宫内膜癌类器官的多次传代
68.按照实施例1得到原代子宫内膜癌类器官后，对其进行传代培养，传代培养操作如下：
69.1、用移液器吸出培养皿中的培养液，取1-2ml trypletmexpress消化含类器官的胶滴，放入培养箱，37℃消化10min；
70.2、加入10ml无菌hank’s平衡盐溶液，1000rpm，离心3min；
71.3、弃去上清液，加入200μl实施例1的培养基重悬类器官，加入250μlmatrigel基质胶混匀，滴至新的35mm培养皿，静置5min，移入培养箱，倒置，40min后，补2-4ml实施例2的培养基，37℃培养箱静置培养。
72.传代培养6天后得到第二代子宫内膜癌类器官，按照此方法连续传代，培养40天
后，得到第6代子宫内膜癌类器官，其在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图7所示，类器官结构形态良好，经过6代以后的子宫内膜癌类器官仍然可以维持原组织的形态结构。
73.实施例8
74.子宫内膜类器官的多次传代
75.按照实施例3得到原代子宫内膜类器官后，参照实施例7对其进行传代培养，每7天传代一次，培养35天后，得到第5代子宫内膜类器官，其在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图8所示，类器官结构形态良好，经过5代以后的子宫内膜类器官仍然可以维持原组织的形态结构。
76.对比例1
77.本对比例提供的培养基中不添加sox2，其他同实施例1。使用上述培养基按照实施例1方法进行子宫内膜癌类器官培养。结果在步骤(7)培养4天后，如图9所示，培养的细胞出现大面积死亡的情况，无法形成正常的空泡状类器官结构。这说明sox2对子宫内膜癌类器官形态结构的维持是不可或缺的。
78.对比例2
79.本对比例提供的培养基中不添加kiaa1199，其他同实施例1。使用上述培养基按照实施例1方法进行子宫内膜癌类器官培养。结果在步骤(7)培养2天后，如图10所示，培养的细胞出现大面积死亡的情况，无法形成正常的空泡状类器官结构。这说明kiaa1199对子宫内膜癌类器官形态结构的维持是不可或缺的。
80.对比例3
81.本对比例提供的培养基中不添加rki-1477，其他同实施例1。使用上述培养基按照实施例1方法进行子宫内膜癌类器官培养。结果在步骤(7)培养7天后，如图11所示，培养的细胞基本无明显扩增，无法形成正常的空泡状类器官结构。这说明rki-1477对子宫内膜癌类器官形态结构的形成是不可或缺的。
82.对比例4
83.将实施例1中fgf9换成fgf4，其他条件一样同实施例1，按照实施例1进行子宫内膜癌类器官培养。结果在步骤(7)培养5天后，在普通光学显微镜下随机挑选中间区域5个视野进行类器官数量观察，比较尺寸大于50μm类器官的数量。实施例1的类器官在数量上显著优于对比例4，如表1所示，这说明采用fgf9比采用fgf4更适宜子宫内膜癌类器官的生长。
84.表1对比例4和实施例1的类器官数量对比
85.对比项类器官数量实施例147个对比例415个
86.对比例5
87.将实施例1中wnt3a换成wnt5a，其他条件一样同实施例1，按照实施例1进行子宫内膜癌类器官培养。结果在步骤(7)培养5天后，培养的细胞出现大面积死亡的情况，无法形成正常的空泡状类器官结构。
88.综上所述，本发明的子宫内膜类器官培养基及培养方法能够培养包括来源于正常组织、癌组织等多来样本源的组织，类器官生长速度快，多次传代后仍能维持原代组织同样的组织结构与基因组特性。
89.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。