一种高产C的制作方法

一种高产c
21
甾体化合物的蜡样芽孢杆菌x
‑
32及其应用
技术领域
1.本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种高产c
21
甾体化合物的蜡样芽孢杆菌x
‑
32及其应用。


背景技术：

2.c
21
甾体化合物广泛应用于各领域，其在抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、保护肝脏、降血脂、化疗药物增效减毒、抗抑郁等方面具有显著的生物活性。c
21
甾体化合物主要存在萝蘼、通关藤、白首乌、青阳参和黑蔓藤等植物中。利用植物提取途径制备c
21
甾体化合物，存在提取过程复杂、生产周期长、溶剂消耗大且回收困难等缺点。
3.相关研究显示，植物内生菌与植物之间具有相同次生代谢产物合成的途径，能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分。迄今为止，对植物内生菌次级代谢产物的研究大多为真菌和放线菌，细菌相对较少。目前报道具有c
21
甾体化合物代谢活性的微生物，其活性表现为能够转化培养体系内的前体物并将其转化为c
21
甾体苷。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种高产c
21
甾体化合物的蜡样芽孢杆菌x
‑
32及其应用，旨在解决上述背景技术中现有技术的不足之处。
5.本发明是这样实现的，一种高产c
21
甾体化合物的蜡样芽孢杆菌x
‑
32，该蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)x
‑
32于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 20211165，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。
6.本发明进一步公开了一种通过上述蜡样芽孢杆菌x
‑
32发酵制备c
21
甾体化合物的方法，该方法包括以下步骤：将蜡样芽孢杆菌x
‑
32接种至营养肉汤培养基中培养，接种量为0.5％～2％，在ph为6.0～8.0、温度为28～37℃的条件下，发酵培养48～140h，得到含有c
21
甾体化合物的发酵液。
7.优选地，所述接种量为0.5％，ph为8.0，温度为37℃，发酵培养时间为120h。
8.本发明进一步公开了上述蜡样芽孢杆菌x
‑
32在制备抗癌药物c
21
甾类化合物中的应用。
9.优选地，所述抗癌药物c
21
甾类化合物为隔山消苷c1n。
10.优选地，所述蜡样芽孢杆菌x
‑
32代谢产出c
21
甾体化合物的关键酶。
11.优选地，所述关键酶包括3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰coa还原酶(hmgr)和鲨烯合酶(sqs)。
12.本发明克服现有技术的不足，提供一种高产c
21
甾体化合物的蜡样芽孢杆菌x
‑
32及其应用。本发明从滨海白首乌不同组织部位筛出28株内生细菌，采用改良香草醛比色法测定筛出内生细菌发酵液中c
21
甾体化合物含量，据此判定具c
21
甾体化合物合成能力的内生细菌14株，其中蜡样芽孢杆菌x
‑
32发酵液中c
21
甾体化合物含量显著高于其他菌株(p<
0.05)，进一步浓缩及纯化高产蜡样芽孢杆菌x
‑
32发酵液中c
21
甾体化合物，同时采用lc
‑
ms法对纯化产物进行鉴定。该蜡样芽孢杆菌x
‑
32经理化性状分析及分子鉴定为蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)，目前尚无文献报道该菌可以制备c
21
甾体化合物。该蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)x
‑
32于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 20211165，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。
13.综合蜡样芽孢杆菌x
‑
32胞内、外蛋白多样性分析及代谢关键酶活性及基因检测对蜡样芽孢杆菌x
‑
32中c
21
甾体化合物合成途径进行探究。设计正交实验优化该菌产c
21
甾体化合物的能力。
14.相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
15.(1)本发明蜡样芽孢杆菌x
‑
32在培养120h时，发酵液中c
21
甾体化合物含量为0.52mg/ml，比萝藦中c
21
甾苷含量0.0033mg/ml高出近150倍(杨蕾等，2012)，发酵条件优化后该菌发酵液中c
21
甾体浓度达1.280
±
0.005mg/ml；
16.(2)本发明的本发明中蜡样芽孢杆菌x
‑
32发酵液的代谢产物经鉴定为隔山消苷c1n，具有较大的市场应用前景；
17.(3)本发明为微生物合成c
21
甾体化合物的新途径，具有合成步骤少、生产周期短、转化率高、发酵过程易调控、更环保等优点。
附图说明
18.图1是本发明蜡样芽孢杆菌x
‑
32的菌落形态；
19.图2是本发明蜡样芽孢杆菌x
‑
32的lc
‑
ms分析结果；
20.图3是本发明蜡样芽孢杆菌x
‑
32的胞内、外蛋白含量检测结果；
21.图4是本发明蜡样芽孢杆菌x
‑
32的胞内蛋白多样性检测结果；
22.图5是本发明蜡样芽孢杆菌x
‑
32的胞外蛋白多样性检测结果；
23.图6是本发明蜡样芽孢杆菌x
‑
32的hmgr酶活性检测结果；
24.图7是本发明蜡样芽孢杆菌x
‑
32内sqs基因检测结果；
25.图8是本发明蜡样芽孢杆菌x
‑
32发酵优化结果。
具体实施方式
26.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
27.一、内生细菌的分离纯化及筛选
28.1、样品前处理
29.将采摘自江苏省滨海县果老首乌种植基地的白首乌样品进行预处理。
30.将自来水清洗过的新鲜白首乌放入超净工作台中，紫外杀菌10min，以无菌水冲洗3次，吸水纸将表面水分吸干后用75％乙醇溶液浸泡根、茎、叶、种子5min，依次经无菌水冲洗，3％次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用无菌水冲洗5次。将白首乌根、茎、叶、种子去皮切成小碎块(约5～10g)，置于研钵中，将加入蒸馏水和少量石英砂研磨成匀浆。静置30min后吸
取上清液1ml，用蒸馏水依次稀释10～1000倍。
31.2、内生细菌的分离与纯化
32.将3种不同浓度的根、茎、叶、种子组织液分别吸取100μl涂布于营养肉汤培养基平板上，恒温培养2～5d。待平板上长出菌落，划线分离纯化得到单一的纯菌落，保存菌种并编号。
33.营养肉汤培养基：蛋白胨10g、nacl 10g、牛肉浸出粉3.0g、蒸馏水1 000ml，ph 7.2～7.4，121℃灭菌20min。配制固体培养基时加15～20g琼脂粉。
34.二、菌种鉴定
35.1、理化指标检测
36.对白首乌内生细菌进行革兰氏染色，显微镜观察进行形态鉴定，利用淀粉作为碳源检查其是否能水解淀粉；进行吲哚实验、甲基红试验检测菌种对色氨酸和葡萄糖的利用情况；进行糖发酵实验检测菌株能否使用糖产酸产气情况。置于22℃、27℃、32℃、37℃、60℃恒温培养1～2d后，观察菌株的生长情况。
37.2、分子鉴定
38.用营养肉汤培养基过夜培养菌株，收集菌体，提取菌株基因组dna，pcr扩增菌株16s rrna基因。
39.pcr产物测序后，在ncbi上进行核酸序列比对，综合菌株生理生化特性、菌落形态和分子鉴定结果，对筛出内生细菌进行鉴定。
40.三、白首乌内生细菌发酵液中c
21
甾体苷含量测定
41.1、菌种扩选及发酵培养
42.将筛选出的白首乌内生细菌接入营养肉汤培养基进行扩培，接种量为2％，37℃，150rpm震荡培养24～48h，取样，测od
600
值。
43.将扩培后的细菌转接至营养肉汤培养基，设置3个平行组及对照空白组，接种量为1％，37℃，150rpm。培养72h后，每间隔48h取样，测定发酵液中c
21
甾体总苷含量。
44.2、比色法测定发酵液中c
21
甾体总苷含量
45.取适量发酵液10,000rpm离心10min，取1ml上清液于试管中，加入新配制的7％香草醛
‑
冰乙酸溶液0.4ml、浓硫酸0.6ml，摇匀，80℃水浴加热30min，反应结束，立刻取出转移至冰水浴，终止反应并加入10ml冰乙酸，摇匀，在450nm波长下测定样品吸光值。从白首乌不同部位分离得到的28株内生细菌，经测定，菌株x
‑
32产c
21
甾体苷的能力显著高于其他27株菌(p<0.05)，含量为：0.52mg/ml。
46.四、菌株x
‑
32发酵液中c
21
甾体化合物的纯化及lc
‑
ms鉴定
47.1、发酵液中c
21
甾体的提取
48.采集菌体发酵液，8,000rpm离心5min，取1ml上清经真空冷冻干燥后，加入8ml乙醇，打匀，10,000rpm离心5min，取上清，按1：4体积比加入混合有机溶剂(乙醚：丙酮(1：1)，摇匀，1,000rpm离心1min，40℃水浴挥发至无液体残留。
49.2、lc
‑
ms法鉴定c
21
甾体化合物
50.将上述纯化样品用60％甲醇水溶液定容至2ml中，摇匀，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，稀释10倍备用。精密称取各对照品适量，用甲醇溶解定容制成每毫升含告达庭0.165mg、青洋参苷元0.633mg、孕烯醇酮0.5mg的混合溶液，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，稀释10倍备
用。利用lc
‑
ms鉴定，对液相色谱得到的结果峰进行质谱分析，色谱条件:alltima c18色谱柱(250mm
×
4.6mm，5μm)；采用乙腈(a)
‑
水(b)梯度洗脱(0～10min，35％a)，流速1ml/min；柱温35℃；检测波长为263nm；进样量10μl。
51.五、菌株x
‑
32胞内、外蛋白质含量测定及蛋白质多样性分析
52.1、胞内、外蛋白质含量测定
53.胞外蛋白质测定样品制备：取一定量的发酵菌液，10,000rpm，离心10min，取上清，4℃保存待用。
54.胞内蛋白质测定样品制备：取一定量的发酵菌液，10,000rpm，离心10min，去上清。收集菌体沉淀，10mmol/l tris
‑
hcl缓冲液清洗，10,000rpm离心10min，去上清，重复2～3次。在菌体沉淀加入20ml 10mmol/l tris
‑
hcl缓冲液，冰浴条件下超声破碎(工作5s，停止10s，共40min)。破碎后，8,000rpm，4℃，离心15min，取上清，4℃保存，待用。
55.取提取液1ml于试管中，加入5ml考马斯亮蓝g
‑
250蛋白试剂，充分混合，静置2min。测定并记录od
595
的吸光度，并计算胞内、外蛋白含量。
56.考马斯亮蓝g
‑
250的配制：称取100mg考马斯亮蓝g
‑
250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％(w/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
57.2、蛋白质多样性分析
58.制备所需试剂：分离胶、浓缩胶、电泳缓冲液、染色液、脱色液。
59.将sds
‑
page样品前处理，利用sds
‑
page聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
60.六、菌株x
‑
32中c
21
甾体化合物代谢关键酶—hmgr酶活检测
61.1、样品前处理
62.10,000rpm，5min离心，收集发酵液或胞内提取液，取1mm乙酰
‑
coa母液至3倍体积的上述样品中，使其终浓度为0.24mm。37℃反应12h，检测hmgr酶活性。
63.2、酶活测定
64.(1)母液制备
65.1m tris
‑
hcl：称取1.2114g的tris加入8ml的超纯水，滴加盐酸，直至ph为7.0，滴定至10ml；
66.1mm乙酰
‑
coa母液：1mg样品加1ml的超纯水充分溶解后，再加入0.235ml灭菌超纯水混匀；
67.7.5mm nadph母液:10mg样品，加入1ml灭菌超纯水充分溶解后，再加入0.6ml灭菌超纯水混匀；
68.40mm dtt：10mg样品，加入0.62ml灭菌超纯水充分溶解后，再加入1ml灭菌超纯水混匀。
69.(2)对照组nadph的氧化速率(a)
70.hmgr酶活测定反应体系：5μl1 m tris
‑
hcl，1μl7.5 mm nadph，10μl40 mm dtt。
71.在上述反应体系中加入10μl上清液，立即计时，340nm处每隔30sec检测nadph的氧化情况，连续测定5min。
72.(3)试验组nadph的氧化速率(b)
73.在反应体系中加入10μl添加乙酰
‑
coa的处理样品后，立即计时，在340nm处每隔30sec检测nadph的氧化情况，连续测定5min。
74.3、酶活计算公式
75.hmgr相对活性(u/mg
‑
protein)＝酶液稀释倍数
×△
a340
×
v1/(ε*d*c*v2)
76.其中，
77.△
a340＝
△
a340b
‑△
a340a；
78.△
ab和
△
aa：平均每分钟相对对照组的吸光度变化值；
79.v1为反应体系体积(μl)；
80.ε为nadph的吸光系数(6.22x 10
‑6pmol
‑1cm
‑1)；
81.d为测定光源直径(0.67mm)；
82.c为蛋白浓度(mg/ml)；
83.v2为加入反应体系中的酶液体积(10μl)。
84.菌株x
‑
32胞内、外hmgr酶活测定结果见图6。
85.七、菌株x
‑
32中sqs鲨烯合酶基因检测
86.设计鲨烯合酶(sqs)特异性引物：
87.sqs f1231：cttttccatgctgccta，
88.sqs r1231：gctgttcttttttacgc。
89.对菌株x
‑
32基因组内sqs鲨烯合酶基因进行克隆及检测(见图7)。
90.八、高产c
21
甾体化合物菌株的发酵条件优化
91.采用3因素3水平正交实验，优化菌株x
‑
32发酵液中c
21
甾体化合物产量。其中，接种量为：0.5％、1％、2％；ph为6、7、8；温度为：28℃、32℃、37℃。
92.发酵方法：将菌株x
‑
32接种至营养肉汤培养基中培养，接种量为2％，37℃，150rpm。从培养72h起，每间隔48h测定发酵液中c
21
甾体总苷含量。
93.本发明中菌株x
‑
32在培养120h时，发酵液中c
21
甾体化合物含量为0.52mg/ml。
94.在温度37℃、接种量0.5％、ph 8.0、发酵时间120h时，该菌株发酵液中c
21
甾体化合物含量为：1.28
±
0.005mg/ml。
95.九、结论与分析
96.本发明中通过对白首乌内生细菌中c
21
甾体化合物代谢活动的研究，综合菌株生长特征及产c
21
甾体化合物的能力及稳定性，优选菌株为蜡样芽孢杆菌x
‑
32(图1)。经分析，菌株x
‑
32的发酵液纯化物中含有c
21
甾体化合物：隔山消苷c1n，菌株的lc
‑
ms鉴定结果判断其代谢c
21
甾体化合物能力较强(图2)。
97.本发明中高产菌株x
‑
32的胞内、外蛋白丰富(图3)，sds
‑
page均能检测出c
21
甾体化合物代谢两种关键酶(图4、图5)。菌株x
‑
32胞内hmgr酶活性测定结果显著高于胞外(p<0.05)(图6)。
98.本发明中菌株x
‑
32首先在胞内代谢产生较多且丰富的蛋白后分泌于胞外，通过类异戊二烯生物途径(mva)利用c
21
甾体化合物的两种关键酶(hmgr酶和sqs酶)合成c
21
甾体化合物(图7)。
99.本发明中菌株x
‑
32产c
21
甾体化合物最适发酵培养条件为：接种量为0.5％、ph为8、温度为37℃，最高含量为：1.280
±
0.005mg/ml。对发酵条件优化后白首乌蜡样芽孢杆菌x
‑
32产c
21
甾体化合物的能力比优化前提高了91％(图8)，比目前传统植株产c
21
甾体高出将近10倍，将极大缓解工艺生产c
21
甾体化合物的压力。
100.因此，白首乌蜡样芽孢杆菌x
‑
32作为新型药物来源，c
21
甾体化合物能力强，且生长条件和发酵过程易控制，本发明可为c
21
甾体化合物大规模高产制备提供新途径。
101.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。