植物乳杆菌LactobacillusplantarumING1及其应用的制作方法

植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1及其应用。


背景技术：

2.饲草产业作为草地畜牧业发展的重要物质基础，是高效养殖中不可或缺的一环。我国草地自然资源丰富，是畜牧业健康稳定发展的根本，是肉羊业、肉牛业和奶牛业持续繁荣发展的基本保障。在保护天然草地的前提下，合理开发利用牧草资源，拓展饲料来源，丰富饲料种类，是缓解饲草供求不均衡，实现天然草地可持续利用的重要手段。干草流通便利，是世界范围内应用最广的饲草产品之一，但天然草地牧草主产区的牧草收获加工通常正值雨季，雨热同期的环境条件导致干草调制的难度增加，雨淋等原因造成的营养物质流失通常可占干物质总量的20~30%，严重影响牧草的饲用价值。显然，传统干草调制技术在利用和储藏上具有局限性，已无法满足当前天然草地生态保护和现代畜牧业可持续发展的迫切需求。
3.同鲜草或干草不同，青贮饲料具有独特的营养价值和理化特性，青贮能够最大限度的保存原料中的营养成分，适口性好，是草食家畜日粮的重要组成部分。青贮饲料中易发酵碳水化合物和真蛋白质含量通常较低，有机酸和非蛋白氮的含量较高，加之较短的饲料长度等独特优势，可以有效增加家畜的干物质采食量；此外，青贮饲料在营养成分、消化率和代谢能等方面与原料更为接近，能提高营养物质的吸收利用效率，有益于家畜机体健康。同时，青贮饲料较低的ph值不利于病菌和寄生虫的生命活动，降低了饲料中病虫害对家畜生长发育的不良影响。天然草地牧草群落结构复杂，不仅包括家畜喜食的豆科和禾本科牧草，还包括有特殊气味或质地粗硬的牧草。青贮可以改善天然草地牧草的气味和质地，并有效防除针茅属牧草对家畜的伤害，从而扩大饲料来源。天然草地牧草刈割后直接青贮可以有效保存营养成分，提高消化率，延长储藏时间；同时，青贮饲料的调制和储藏不受气候条件限制，可为家畜所需青绿饲料的全年均衡供给提供保障。青贮不仅最大限度地保存了天然草地牧草的营养价值，也解决了牧草刈割后补偿生长和安全越冬等问题，可以有效保护天然草地，有助于实现天然草地的可持续发展，生态效益、经济效益和社会效益显著。
4.但是现有技术在青贮饲料的调制过程中，有害微生物的生长和繁殖会导致营养物质的降解流失，影响青贮饲料品质。天然草地牧草的草种较为复杂，且具有“三低”的特性，即水分含量低、可溶性碳水化合物含量低、天然附着的乳酸菌数量低。天然草地牧草青贮调制难度较大，目前仍缺乏高效的专用青贮添加剂。
5.乳酸菌为革兰氏阳性菌，抗过氧化氢酶、厌氧、无孢子、无运动性，被认为是青贮发酵的关键启动因子而被广泛应用于青贮饲料生产加工。乳酸菌按发酵类型可分为同型发酵和异型发酵。同型、异型乳酸发酵参与发酵的微生物类群不同，其中同型乳酸发酵产物只含乳酸，产物理论发酵率高。同型发酵乳酸菌利用可溶性碳水化合物产生以乳酸为主的有机酸，降低青贮饲料ph值来抑制梭菌和霉菌等腐败菌的生长，延长青贮饲料的保存时间。但天然草地牧草群落结构复杂，水分含量低，植物表面附着乳酸菌数量少，可溶性碳水化合物含
量低和缓冲能值高等系列问题使乳酸菌添加剂难以有效发挥其能力，青贮效果不佳。因此，筛选适用于天然草地牧草青贮专用添加剂是解决天然草地牧草青贮的关键。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1及其应用。
7.本发明植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1的生物学特性为革兰氏染色阳性杆菌，葡萄糖同型发酵，耐酸性强（在ph3.0可以弱生长，在ph3.5可正常生长），生长速率快（mrs液体培养基培养20小时ph可降到4.0以下），生育温域宽（5-50℃可生长繁殖）。2021年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），北京市朝阳区北辰西路1号院3号，cgmcc no. 22706。
8.本发明植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1的获得方法是：富集培养该菌，稀释平板法筛选获得：将装有500 ml蒸馏水的锥形瓶、装有4.5 ml蒸馏水的试管、mrs固体培养基及平板灭菌，灭菌后将mrs培养基倒入平板内。无菌条件下，取10g天然牧草青贮样品于拍打袋内，再加入90 ml灭菌蒸馏水振荡均匀，使其最终浓度为10-1
，然后取500 ul该液体加入含有4500 ul灭菌蒸馏水的试管振荡使其均匀，连续稀释，使其浓度分别为10-2
，10-3
，10-4
和10-5
，取10-1
，10-3
和10-5
液体20 ul反复进行平板划线分离，直至得到单菌落，将其单菌落用无菌接种针接种到含有20%甘油mrs液体培养基的2 ml冻存管内，于-80℃保存备用。其中mrs培养基为蛋白胨 (proteose peptone no. 3) 10.0 g；牛肉膏 (beef extract) 10.0 g；酵母提取物 (yeast extract) 5.0 g；葡萄糖 (dextrose) 20.0 g；吐温 (polysorbate 80) 1.0 g；柠檬酸铵 (ammonium citrate) 2.0 g；醋酸钠 (sodium acetate) 5.0 g；硫酸镁 (magnesium sulfate) 0.1 g；硫酸锰(manganese sulfate) 0.05 g；磷酸氢二钾 (dipotassium phosphate) 2.0 g；蒸馏水 (distilled water) 1000 ml；固体培养基加15 g/l 琼脂(agar)，121 ℃，灭菌15 min。
9.本发明用生理生化方法筛选出生长速度快、产酸能力强、耐酸能力强及生育温域宽的植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1。提取植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1全长基因，然后运用pcr扩增引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-tacggctaccttgttacgact-3')，扩增出16s rrna基因，利用blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比对寻找已知分类地位中与待测乳酸菌菌株基因序列同源性最高的菌种。从genbank中选取已知乳酸菌菌株的基因序列，将其与待测乳酸菌菌株的16s rrna基因序列进行比较，确定其相似种。最后，将筛选出的菌株及对照菌（市售商业菌剂）分别添加到不同牧草中，开封后分析青贮饲料营养品质和发酵品质，并计算微生物数量，与空白组和对照菌进行对比，确认lactobacillus plantarum ing1可以显著改善青贮饲料的营养品质和发酵品质，增加有乳酸菌的数量，抑制霉菌和梭菌等腐败菌的生长繁殖。
10.本发明植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1可以用于调制青贮饲料。具体方法为：（1）将待发酵饲料原料切断混合均匀；（2）每千克待发酵青贮饲料加入植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1 1.0
×
105以上；
（3）将饲料真空密封后贮藏。
11.作为一种优选方案，步骤（1）所述待发酵青贮原料切断至1～2cm。
12.与现有技术相比，本发明具有如下效果：（1）本发明利用微生物植物乳杆菌lactobacillus plantarum ing1能抑制梭菌和霉菌等腐败菌的生长，成本低，安全，可靠，易于利用。
13.（2）本发明菌株适用于群落结构复杂的天然草地或禾本科牧草青贮，克服了植物水分含量低，表面附着乳酸菌附着数量少，可溶性碳水化合物含量低的草甸草原和典型草原天然草地牧草青贮的难点。。
具体实施方式
14.以下结合实施例来进一步阐述本发明，但本发明并不限于此。
15.实施例1 优良乳酸菌的筛选从天然草地牧草中分离的乳酸菌菌株ing1，进行革兰氏染色和细胞形状观察，并根据生育温度（5、10、15、30、45、50℃）、生育ph（3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）和生长盐浓度（3%和6.5%）等生理生化实验。结果表明ing1菌株为革兰氏阳性，同型发酵的杆菌，在5-50℃、ph3.0-8.0和盐浓度3-6.5%的条件下皆可生长，具有较强的耐酸性（表1）；可发酵大多数糖类（表2）。
16.表1 菌株ing1生理生化特性注： ，正常生长；-，不生长；w，弱生长。
[0017] 表2 菌株ing1糖发酵特性项目ing1项目ing1甘露醇﹣水杨苷w赤藻糖醇﹣d-纤维二糖﹢d-阿拉伯糖﹣d-麦芽糖﹢
l-阿拉伯糖﹣d-乳糖﹢d-核糖﹢d-密二糖﹢d-木糖﹣d-蔗糖﹢l-木糖﹣d-海藻糖﹢d-侧金盏花醇l﹣菊粉﹣甲基-βd吡喃木糖苷﹣d-松三糖﹢d-半乳糖﹢d-棉子糖﹢d-葡萄糖﹢淀粉﹣d-果糖﹢糖原﹣d-甘露糖﹢木糖醇﹣l-山梨糖﹣d-龙胆二糖wl-鼠李糖﹣d-土伦糖﹣卫茅醇﹣d-来苏糖﹣肌醇﹣d-塔格糖﹣甘露醇﹢d-岩藻糖﹣山梨醇﹢l-岩藻糖﹣甲基-αd-吡喃甘露糖苷﹢d-阿拉伯醇w甲基-αd-吡喃葡萄糖苷﹣l-阿拉伯醇﹣n-乙酰葡萄糖胺w葡萄糖酸钾w 苦杏仁苷﹢2酮基葡萄糖酸钾﹣arbulinw5酮基葡萄糖酸钾﹣七叶灵柠檬酸铁﹢ꢀꢀ注： ，正常生长；-，不生长；w，弱生长。
[0018]
乳酸菌ing1的生理生化、培养基及其配制的方法如下：1）革兰氏染色、发酵类型及形状观察参照东秀珠主编的《常见细菌系统鉴定手册》2）乳酸菌生长调节ph值使用1 mol/ l naoh和1 mol/l hcl。
[0019]
3）糖发酵采用api 50 chl （biom
é
rieux, l’etoile, france分析）。
[0020]
4）培养基mrs培养基（用于乳酸菌的培养）：蛋白胨 (proteose peptone no. 3) 10.0 g；牛肉膏 (beef extract) 10.0 g；酵母提取物 (yeast extract) 5.0 g；葡萄糖 (dextrose) 20.0 g；吐温 (polysorbate 80) 1.0 g；柠檬酸铵 (ammonium citrate) 2.0 g；醋酸钠 (sodium acetate) 5.0 g；硫酸镁 (magnesium sulfate) 0.1 g；硫酸锰(manganese sulfate) 0.05 g；磷酸氢二钾 (dipotassium phosphate) 2.0 g；蒸馏水 (distilled water) 1000 ml；固体培养基加15 g/l 琼脂(agar)，121 ℃，灭菌15 min。
[0021]
api 50 chl 培养基：蛋白胨 (proteose peptone no. 3) 10.0 g；酵母提取物 (yeast extract) 5.0 g；吐温 (polysorbate 80) 1 ml；醋酸钠 (sodium acetate) 5.0 g；柠檬酸铵（ammonium cirtrate）2.0 g；硫酸镁 (magnesium sulfate) 0.1 2；溴甲酚紫（bromcresol purple）
0.17 g。将上述试剂溶解，用蒸馏水定容至1000 ml，分装在15 ml的试管中，每试管10ml，121℃灭菌20 min。
[0022]
实施例2 乳酸菌的鉴定将待测乳酸菌菌株的单菌落接种至灭菌mrs液体培养基中，30 ℃恒温厌氧培养12 h。根据试剂盒使用说明提取dna，pcr扩增后将扩增产物4 ℃保存，送样检测基因序列，通过16s rrna基因序列同源性分析进行乳酸菌菌种的分析鉴定。
[0023]
pcr扩增引物为27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-tacggctaccttgttacgact-3')，由上海生工生物工程股份有限公司合成。pcr反应体系包括模板dna 2 μl，引物27f 2 μl，引物1492r 2 μl，dntp(mix) 2 μl，taq buffer(macl2) 5 μl，taq酶0.5 μl。pcr扩增参数为：95 ℃预变性3~5 min；94 ℃变性30 s；55~60 ℃退火25~30 s；72 ℃延伸30~50 s，35个循环。pcr扩增产物取5 μl 1%琼脂糖凝胶电泳10~20 min观察。琼脂糖凝胶电泳参数为150 v，100 ma。
[0024]
利用blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比对寻找已知分类地位中与待测乳酸菌菌株基因序列同源性最高的菌种。从genbank中选取已知乳酸菌菌株的基因序列，将其与待测乳酸菌菌株的16s rrna基因序列进行比较，与植物乳杆菌(lactobacillus plantarum jcm 1149)相似度超过99%，应为同一种。
[0025]
实施例3 添加到草甸草原牧草中的青贮效果以内蒙古赤峰市巴林左旗草甸草原牧草为材料进行青贮试验。材料切断至1-2 cm，混合均匀，按材料鲜重3%添加液体菌液，菌落单位约为105。添加剂分别为市售菌剂植物乳杆菌（lactobacillus plantarum, snow brand seed co., ltd, sapporo, japan）和添加实施例2鉴定后的菌株ing1，青贮材料装入30 cm
×ꢀ
20 cm的聚乙烯青贮袋，每个处理组3袋，室温保存，每袋约150 g，用真空密封机抽气密封，青贮饲料于室温贮藏30 d。
[0026]
菌株ing1草甸草原青贮发酵特性如表3所示。三个处理组干物质，粗蛋白质，酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量无显著差异，但乳酸菌处理后酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量呈降低趋势。发酵品质ph值，乙酸，丁酸和氨态氮含量均无显著差异，但乳酸菌处理组氨态氮含量低于对照组，且乳酸菌处理后乳酸和丙酸含量显著增加。乳酸菌数量在菌株ing1组显著增加，一般好氧性细菌和酵母菌在三个组无显著差异，大肠菌群和霉菌均未检测到。从营养品质，发酵品质和微生物角度综合考虑，菌株ing1能有效改善草甸草原牧草青贮品质，具有制备天然草地牧草青贮专用添加剂的潜力。
[0027]
表3 菌株ing1草甸草原青贮发酵特性
项目对照市售菌剂ing1干物质(%)41.64
±
0.4142.83
±
1.0743.39
±
0.45粗蛋白质(%dm)9.91
±
0.0710.10
±
0.1210.09
±
0.10酸性洗涤纤维(%dm)32.29
±
0.3031.61
±
0.4431.67
±
0.58中性洗涤纤维(%dm)57.97
±
0.4257.94
±
0.3156.98
±
0.21ph4.19
±
0.024.16
±
0.034.12
±
0.03乳酸(g/kg)14.39
±
0.98b17.18
±
1.62a17.61
±
1.97a乙酸(g/kg)2.86
±
0.032.62
±
0.242.38
±
0.24丙酸(g/kg)0.22
±
0.02b0.32
±
0.02a0.31
±
0.02a
丁酸(g/kg)0.15
±
0.010.13
±
0.010.12
±
0.02氨态氮(g/kg)5.99
±
0.295.66
±
1.215.67
±
0.52乳酸菌(log10cfu/g)7.02
±
0.36b7.04
±
0.10b7.50
±
0.24a一般好氧性细菌 (log10cfu/g)3.88
±
0.103.89
±
0.063.69
±
0.04酵母菌(log10cfu/g)2.23
±
0.093.14
±
0.133.11
±
0.11大肠菌群(log10cfu/g)ndndnd霉菌(log10cfu/g)ndndnd
实施例4 添加到典型草原牧草中的青贮效果以内蒙古锡林浩特市毛登牧场典型草原牧草为材料进行青贮试验。材料切断至1-2 cm，混合均匀，按材料鲜重3%添加液体菌液，菌落单位约为105。添加剂分别为市售菌剂植物乳杆菌（lactobacillus plantarum, snow brand seed co., ltd, sapporo, japan）和添加实施例2鉴定后的菌株ing1，青贮材料装入30 cm
×ꢀ
20 cm的聚乙烯青贮袋，每个处理组3袋，室温保存，每袋约150 g，用真空密封机抽气密封，青贮饲料于室温贮藏30 d。
[0028]
菌株ing1典型草原青贮发酵特性如表4所示。三个处理组干物质含量无显著差异。与对照组和市售菌剂处理组相比，菌株ing1处理后可有效保存粗蛋白质含量，降低酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量。发酵品质ph值在菌株ing1处理组显著降低，乳酸含量显著增加，丁酸含量显著降低，乙酸和丙酸含量无显著差异，且ph值和乳酸含量与市售菌剂组相比差异显著。乳酸菌数量在试验组中显著增加，酵母菌和大肠菌群在ing1处理组显著降低，三个处理组青贮30 d均未检测到霉菌。从营养品质，发酵品质和微生物角度综合考虑，菌株ing1能有效改善典型草原牧草青贮品质，具有制备天然草地牧草青贮专用添加剂的潜力。
[0029]
表4 菌株ing1典型草原青贮发酵特性
项目对照市售菌剂ing1干物质(%)46.52
±
0.7945.70
±
0.1845.98
±
0.04粗蛋白质(%dm)8.80
±
0.11c9.32
±
0.07b9.73
±
0.03a酸性洗涤纤维(%dm)34.58
±
0.37a33.32
±
0.28b31.83
±
0.14c中性洗涤纤维(%dm)68.30
±
0.56a66.81
±
0.44b66.61
±
0.05bph5.93
±
0.03a5.03
±
0.03b4.93
±
0.03c乳酸(g/kg)4.83
±
0.19c5.77
±
0.02b7.94
±
0.57a乙酸(g/kg)1.90
±
0.241.43
±
0.021.43
±
0.03丙酸(g/kg)0.37
±
0.040.26
±
0.060.26
±
0.02丁酸(g/kg)0.11
±
0.01a0.06
±
0.02b0.06
±
0.01b氨态氮(g/kg)3.29
±
0.30a2.94
±
0.29b2.78
±
0.14b乳酸菌(log10cfu/g)7.80
±
0.03b8.25
±
0.08a8.37
±
0.06a一般好氧性细菌 (log10cfu/g)8.10
±
0.03a8.05
±
0.07a7.83
±
0.05b酵母菌(log10cfu/g)8.00
±
0.038.05
±
0.078.01
±
0.03大肠菌群(log10cfu/g)5.12
±
0.04a4.73
±
0.15a4.03
±
0.23b霉菌(log10cfu/g)ndndnd
实施例5 添加到禾本科牧草高丹草的青贮效果以内蒙古农业大学试验基地种植的高丹草为材料进行青贮试验。材料切断至1-2 cm，混合均匀，按材料鲜重3%添加液体菌液，菌落单位约为105。添加剂分别为市售菌剂植物
乳杆菌（lactobacillus plantarum, snow brand seed co., ltd, sapporo, japan）和添加实施例2鉴定后的菌株ing1，青贮材料装入30 cm
×ꢀ
20 cm的聚乙烯青贮袋，每个处理组3袋，室温保存，每袋约150 g，用真空密封机抽气密封，青贮饲料于室温贮藏30 d。
[0030]
菌株ing1高丹草青贮发酵特性如表5所示。三个处理组干物质，酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量无显著差异，但菌株ing1处理后能有效保存粗蛋白质含量。发酵品质ph值在市售菌剂和菌株ing1处理组显著降低，乳酸含量在菌株ing1处理组显著增加，且丁酸和氨态氮含量显著降低。乳酸菌数量在试验组中显著增加，酵母菌和一般好氧性细菌在三个处理组无显著差异，且青贮30 d均未检测到大肠菌群和霉菌。从营养品质，发酵品质和微生物角度综合考虑，菌株ing1能有效改善高丹草青贮品质，具有制备禾本科牧草青贮专用添加剂的潜力。
[0031]
表5 菌株ing1高丹草青贮发酵特性
项目对照市售菌剂ing1干物质(%)45.36
±
0.1445.23
±
0.1345.36
±
0.25粗蛋白质(%dm)3.56
±
0.11c4.31
±
0.03b4.56
±
0.03a酸性洗涤纤维(%dm)31.14
±
0.4931.61
±
0.5831.21
±
0.50中性洗涤纤维(%dm)55.80
±
0.3856.55
±
0.1256.36
±
0.28ph 4.40
±
0.01a 4.21
±
0.02b 4.20
±
0.03b乳酸(g/kg)15.26
±
0.80c20.47
±
0.11b29.05
±
1.03a乙酸(g/kg)14.97
±
0.31b18.23
±
0.14a 3.30
±
0.19c丙酸(g/kg) 1.09
±
0.06 1.05
±
0.04 0.82
±
0.01丁酸(g/kg) 0.22
±
0.01a 0.24
±
0.01a 0.13
±
0.01b氨态氮(g/kg) 8.37
±
0.14a 6.35
±
0.14b 3.23
±
0.17c乳酸菌(log10cfu/g) 5.30
±
0.03b 6.18
±
0.07a 6.19
±
0.03a一般好氧性细菌 (log10cfu/g) 4.20
±
0.02 4.06
±
0.19 4.25
±
0.17酵母菌(log10cfu/g) 4.94
±
0.11 5.18
±
0.05 4.87
±
0.20大肠菌群(log10cfu/g) nd nd nd霉菌(log10cfu/g) nd nd nd
营养成分及青贮发酵指标测定方法如下：1）新鲜材料营养成分及微生物分析：干物质(dry matter, dm)含量采用65℃干燥法测定；粗蛋白质含量使用杜马斯燃烧法测定；中性洗涤纤维含量和酸性洗涤纤维含量使用van soest的方法测定。
[0032]
2）发酵品质分析：ph值使用ph计测定；乳酸、乙酸、丙酸及丁酸含量使用高效液相色谱测定；氨态氮含量使用苯酚-次氯酸比色法测定。
[0033]
3）微生物计数：称取5 g样品，加入45 ml灭菌蒸馏水，装入无菌聚乙烯袋混合均匀后使用拍打式无菌均质器拍打2 min，得到10-1
稀释液；使用灭菌蒸馏水按1：9连续稀释，制成 10-2
、10-3
、10-4
及10-5
梯度稀释液，取10-1
、10-3
及10-5 3种稀释梯度涂布，使用平板计数法测定微生物数量。
[0034]
乳酸菌数量的测定使用mrs培养基(de man, rogosa, sharpe)，30 ℃厌氧恒温培养48 h；一般好氧性细菌数量的测定使用na培养基(nutrient agar)，30 ℃恒温培养24 h；酵母菌和霉菌数量的测定使用pda培养基(potato dextrose agar)，30 ℃恒温培养24 h，
大肠菌群数量的测定使用blb培养基(blue light broth agar)，30 ℃恒温培养48 h。
[0035]
上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施方案仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。