温度优化的L-阿拉伯糖异构酶突变体的制作方法

温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶突变体
1.本发明涉及在包含高浓度二价金属离子的原料内具有高催化活性的温度优化的l
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阿拉伯糖异构酶，编码本发明所述的l
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阿拉伯糖异构酶的核酸序列，包含编码本发明所述的l
‑
阿拉伯糖异构酶的所述核酸序列的载体，包含本发明所述的l
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阿拉伯糖异构酶的组合物，包含本发明所述的l
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阿拉伯糖异构酶的酵母细胞，本发明所述的l
‑
阿拉伯糖异构酶、所述组合物或所述酵母细胞在具有高含量二价金属离子的原料的发酵中的用途。
2.近几十年来，传统化石燃料(石油基燃料)的大规模消耗导致了高度污染。这一点，以及对世界化石燃料存量有限的认识，激发了新的举措来研究替代燃料(例如生物质衍生乙醇)的可行性。
3.虽然可以通过发酵从农产品(例如蔗糖和玉米淀粉)中获得的己糖来生产生物质衍生乙醇，但这种原料昂贵，且工业规模生产也将严重影响全球粮食供应。
4.因此，较新的工艺侧重于被称为“木质纤维素原料”的替代生物质材料(例如秸秆和甘蔗渣)的转化，即所谓的第二代(2g)生物燃料生产。尽管木质纤维素原料可以高量供应且价格低廉，但所述原料更加复杂且难以高效且经济地转化为乙醇。
5.在现有技术中，已知木质纤维素原料至乙醇的转化有若干工艺步骤，从以下开始：通过例如研磨而进行的机械粉碎，通过例如施加蒸汽和压力而进行的对粉碎材料的预处理，通过使用包含纤维素和半纤维素降解酶的酶促组合物(例如，产生丝状真菌，例如里氏木霉(trichoderma reesei))而进行的对预处理的材料的酶促水解，和随后通过酵母而进行的水解产物至乙醇的发酵。
6.除了大量己糖外，木质纤维素原料的水解产物还包含大量戊糖，包括l
‑
阿拉伯糖。为了经济上可行的燃料生产，己糖和戊糖两者必须发酵成乙醇。
7.在此类过程中最常用的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是稳健的且非常适合乙醇生产，但其无法转化阿拉伯糖，尤其是l
‑
阿拉伯糖。而且，不知任何能够以高乙醇产率和高乙醇生产力将己糖和戊糖两者发酵成乙醇的天然存在的生物。
8.另一个障碍是水解产物内高含量的杂质和副产物，其干扰发酵过程。导致高含量二价金属离子的高含量盐是特别关注的，并且提出了许多用于去除或限制这些杂质和副产物的新方法。例如，最近公开了用膜和离子交换技术来纯化水解产物。然而，这些纯化步骤显著增加了使用木质纤维素原料的成本。
9.此外，在此类发酵过程中使用的酵母和酶需要在至少30℃的温度下显示出始终如一的最佳性能以实现灵活的过程调适，尤其是在发酵过程中，同时还要将水解产物在进入发酵过程之前的额外冷却限制在最低限度。
10.因此，需要能够将l
‑
阿拉伯糖转化为可由酵母(例如酿酒酵母)发酵为乙醇的糖类的新开发的酶，从而能够通过克服上述现有技术已知的障碍来从木质纤维素原料进行商业上可行的乙醇生产。
11.因此，本发明的发明人为自己设定了开发允许将l
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阿拉伯糖有效转化为l
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核酮糖的新型l
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阿拉伯糖异构酶的任务，l
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核酮糖是生产其他产品(例如乙醇)的必要中间体。因此，还要求介质内二价金属离子含量的高耐受性。此外，新型l
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阿拉伯糖异构酶还应在更宽
的温度范围内显示出优化的性能。最后，l
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阿拉伯糖异构酶无论作为单独的酶应用还是在酵母细胞中克隆时都应该是有效的。
12.本发明人现已令人吃惊地发现，该任务可以通过在包含高浓度二价金属磷脂的原料内具有高催化活性的温度优化的l
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阿拉伯糖异构酶突变体来解决，所述突变体与seq id no:2具有至少97.0％的序列同一性。
13.在下文中，将更详细地描述本发明的要素。这些要素与特定实施方式一起列出，然而，应当理解，其可以以任何方式和以任何数量组合以建立另外的实施方式。各种描述的实施例和实施方式不应被理解为将本发明仅限于明确描述的实施方式。本说明书应当被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方式与任何数量的公开要素结合的实施方式。此外，除非上下文另有说明，否则本技术中所有描述的要素的任何排列和组合都应被认为是本技术的说明书所公开的。
14.贯穿本说明书和权利要求书，除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”以及诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”之类的变体将被理解为暗示包含所述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代将被理解为涵盖单数和复数两者。本文对值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写。除非在本文中另有说明，否则每个单独的值都被并入说明书中，就好像其在本文中被单独引用一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法都可以任何适宜的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如(such as)”、“例如(for example)”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并且不对另外要求保护的本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被理解为是表示对本发明的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
15.本技术中氨基酸、肽、核苷酸和核酸的命名遵循iupac的建议。通常，在本文件中氨基酸是根据单字码命名的。
16.术语“dna”和“rna”是本领域技术人员众所周知的。dna包含脱氧核糖，而rna包含核糖(在脱氧核糖中，没有与位置2’中的戊糖环连接的羟基)。腺嘌呤的互补碱基不是胸腺嘧啶，因为其是在dna中，腺嘌呤的互补碱基是尿嘧啶，其是胸腺嘧啶的未甲基化形式。
17.如果没有另外说明，则在本发明中，术语“突变的”应理解为“置换的”、“缺失的”或“插入的”。如果没有另外说明，则术语“突变”应理解为“置换”、“缺失”或“插入”。将置换分类为其中嘌呤被嘌呤(a<
‑
>g)交换或嘧啶被嘧啶(c<
‑
>t)交换的转换，或者其中嘌呤被吡啶交换或与之相反(c/t<
‑
>a/g)的颠换。插入将一个或多个另外的核苷酸(a、c、t或g)添加到寡核苷酸中。一个或多个核苷酸从dna中的去除称为缺失。
18.使用emboss软件包的needle程序(emboss:the european molecular biology open software suite，rice等，2000,trends genet.16:276
‑
277)、优选地5.0.0版本或之后的版本中执行的needleman
‑
wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443
‑
453)，通过全局比对来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。使用的参数是标准设置(eblosum62计分矩阵，空位开放罚分10，空位扩展罚分0.5)。将标记为“同一性”的needle输出用作同一性百分比。
19.在本发明中，术语“l
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阿拉伯糖异构酶”应理解为属于类别ec 5.3.1.4的酶。根据本发明所述的l
‑
阿拉伯糖异构酶是催化从l
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阿拉伯糖到l
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核酮糖的化学反应的酶。这种酶属于异构酶家族，特别是那些相互转化醛糖和酮糖的分子内氧化还原酶。术语“l
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阿拉伯糖异构酶”和属于类别ec 5.3.1.4的酶是本领域技术人员熟知的，其能够从其他酶中鉴别和区分l
‑
阿拉伯糖异构酶。
20.在本发明中，术语“温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶”指在ph 7下在包含400mm l
‑
阿拉伯糖且包含1mm ca
2
或1mm mg
2
的底物上孵育20分钟期间，在30℃至50℃的温度范围内，显示出至少28.5kat/mol酶的催化活性的l
‑
阿拉伯糖异构酶。术语“kat”(katal的缩写)是国际单位制(si)中催化活性的单位。其量化酶的催化活性(即测量酶催化中的酶活性水平)。
21.在本发明中，术语“高催化活性”指在ph 7下在包含400mm l
‑
阿拉伯糖且包含1mm ca
2
或1mm mg
2
的底物上孵育20分钟期间，在30℃至50℃的温度范围内，至少28.5kat/mol酶的催化活性。
22.在本发明中，术语原料应理解为指任何包含至少0.5g/l l
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阿拉伯糖、至少5g/l d
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葡萄糖并且显示含量至少2mm的二价金属离子的原料。示例性的适宜原料包含0.5至15g/l l
‑
阿拉伯糖、5至200g/l d
‑
葡萄糖，并且显示含量2至50mm的二价金属离子。特别适宜的原料包含0.5至10g/l l
‑
阿拉伯糖、5至150g/l d
‑
葡萄糖、5至60g/l d
‑
木糖，并且显示总含量5至30mm的mg
2
和ca
2
离子。进一步特别优选的原料是来自纤维素和/或木质纤维素生物质的水解产物，例如来自谷物秸秆和/或谷壳、甘蔗渣、柳枝稷、米糠、玉米秸秆、纸、原纸浆、废纸、木材、农业残留物、林业残留物、城市固体废物、船体产品及其混合物的水解产物。这种水解产物的产生是本领域技术人员公知的并且例如描述在ep 2015723515或wo 2017042019中，其通过引用并入本文。
23.在本发明中，术语“高浓度二价金属离子”应理解为至少2mm、至少5mm、至少10mm或至少15mm的二价金属离子浓度。2至50mm、2至45mm或5至35mm的二价金属离子浓度也在本发明范围内。特别适宜的原料包含浓度为1至40mm、2至35mm或5至30mm的mn
2
、mg
2
和/或ca
2
。术语“二价金属离子”是本领域技术人员熟知的，并且应理解为包括ca
2
、mn
2
、mg
2
、ba
2
、cu
2
、zn
2
。
24.根据本发明所述的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶与seq id no:2具有至少97.0％的序列同一性，其中具有至少97.5、至少98.0％、至少98.5％、至少99.0％、至少99.5或至少99.9％的序列同一性的l
‑
阿拉伯糖异构酶特别适用于本发明目的。
25.进一步特别有利的根据本发明所述的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶显示出与seq id no:2至少97.0％的序列同一性，并且进一步包含具有选自以下的至少一个突变的seq id no:4：位置40、41、42、43、239、240、241、242、243、244、246、247、248、249、250和251处的缺失和突变。在特别有利的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶中，该至少一个突变是选自以下的置换：位置40、41、43、239、246、247、248、249、250和251处的置换，其中甚至更特别有利的是从a40k、s41k、k43d、m239i、h246p、d247k、k248a、y249s、v250m和h251d中选择所述至少一个置换。在其他特别有利的温度优化的l
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阿拉伯糖异构酶中，该至少一个突变是选自以下的缺失：位置42、240、241、242、243和244处的缺失，其中甚至更有利的是从g42、v240、e241、g242、d243和n244中选择所述至少一个缺失。这些指定突变的组合也在本发明的范围内。
26.其他特别有利的根据本发明所述的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶显示出与seq id no:2至少97.0％的序列同一性，并且进一步包含具有位置40、41和43处和/或位置239、246、247、248、249、250和251处的至少一个置换的seq id no:4。进一步特别有利的根据本发明所述的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶显示出与seq id no:2至少97.0％的序列同一性，并且进一步包含具有位置42处和/或位置240、241、242、243和244处的至少一个缺失的seq id no:4。这些指定突变的组合也在本发明的范围内。
27.其他特别有利的根据本发明所述的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶选自seq id no:6、seq id no:8、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15和seq id no:17。
28.其他特别有利的根据本发明所述的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶与seq id no:2具有至少97.0％的序列同一性，并且在ph 7下在30℃下孵育20分钟时，在l
‑
阿拉伯糖含量400mm和mgcl2含量5mm的原料内具有至少28.5kat/mol酶的催化活性，其中具有至少30.0kat/mol酶的催化活性和含量5mm的cacl2的l
‑
阿拉伯糖异构酶也是有利的。
29.在另一个实施方式中，本发明进一步提供了编码根据本发明所述的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶的核酸。
30.在另一个实施方式中，本发明进一步提供了包含本发明所述的核酸的载体。游离保持载体的实例是细菌质粒、酵母质粒、基于着丝粒的线性dna、病毒来源如sv40的构建体、噬菌体dna、基于真菌ars的dna载体、杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病毒的衍生物，以及来源于质粒和噬菌体或病毒dna的组合的载体。根据本发明的适宜表达载体可以包含代表启动子序列、转录起始位点、用于起始翻译的元件和用于蛋白质输出的功能元件的一个或多个遗传元件，所述功能原件在翻译上与根据本发明所述的核酸偶联。除了本发明所述的核酸之外，根据本发明所述的载体可以编码一种以上的多肽(包括一种以上的l
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阿拉伯糖异构酶)，或者可以编码包含本发明所述的l
‑
阿拉伯糖异构酶的融合多肽。根据本发明所述的载体可以游离保持在宿主细胞中或者整合到宿主的染色体中。
31.在进一步的实施方式中，本发明提供了包含根据本发明所述的温度优化的l
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阿拉伯糖异构酶的组合物。所述组合物可以是液体或干燥组合物。根据本发明的液体组合物可以仅包含本发明所述的l
‑
阿拉伯糖异构酶，优选高度纯化形式。然而，通常，还包含稳定剂，例如甘油、山梨醇或单丙二醇。所述液体组合物还可以包含其他添加剂，例如盐、糖、防腐剂、ph调节剂和/或蛋白质。典型的液体组合物是水性或油基浆液。干燥组合物可以是喷雾干燥组合物，在这种情况下，所述组合物不需要包含比本发明的干燥形式的l
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阿拉伯糖异构酶更多的任何东西。然而，通常，干燥组合物是所谓的颗粒，其可以容易地与底物/原料混合。用本发明所述的阿拉伯糖异构酶包覆的凝聚颗粒可以在高剪切混合器中使用凝聚技术制备。吸收颗粒可以通过使载体材料的核被本发明的l
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阿拉伯糖异构酶吸收/包覆来制备。所述载体材料可以是生物相容性的、不可生物降解的。凝聚技术中使用的典型填充材料包括盐，例如硫酸二钠盐。其他填充剂是高岭土、滑石、镁、铝、硅酸盐和纤维素纤维。任选地，粘合剂(例如糊精)也包括在凝聚颗粒中。
32.所述组合物可以进一步包含选自以下的至少一种酶：纤维素酶(例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β
‑
葡糖苷酶)，半纤维素酶(例如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶和甘露糖苷酶)，果胶酶，核酮糖激酶和核酮糖
‑5‑
磷酸
‑4‑
差向异构酶。
33.在进一步的实施方式中，本发明提供了一种酵母细胞，其包含根据本发明所述的
温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶。在特别有利的实施方式中，根据本发明所述的酵母细胞选自酵母属(saccharomyces)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、假丝酵母属(candida)、亚罗酵母属(yarrowia)、komagataella、毕赤酵母菌属(pichia)和汉逊酵母菌属(hansenula)，其中选自以下的酵母细胞甚至更适合用于本发明的目的：酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、贝酵母(saccharomyces bayanus)、saccharomyces uravum、巴斯德酵母(saccharomyces pastorianus)、库德维泽酵母(saccharomyces kudriavzevii)、三方氏酵母(saccharomyces mikatae)、卡尔斯伯酵母(saccharomyces carlsbergensis)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、解脂耶氏酵母(yarrowina lipolytica)、多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)、安格斯毕赤酵母(pichia angusta)、komagataella pastoris和毕赤酵母(pichia pastoris)。
34.根据本发明所述的酵母细胞可以包含根据本发明所述的一种或多种载体。此外或替代地，所述核酸被整合到所述酵母细胞的基因组中。
35.在进一步的实施方式中，本发明提供了所述温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶或包含所述温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶的本发明所述的组合物或包含所述温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶的本发明所述的酵母细胞在具有高含量二价金属离子的原料的发酵过程中的用途。此类发酵过程是本领域技术人员熟知的。
36.包含阿拉伯糖、特别是l
‑
阿拉伯糖的原料也可以作为可以转化为多种产品的平台化学品的前体。糖生产和转化的持续进步是未来基于生物质的燃料和化学品的关键因素。因此，根据本发明所述的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶、酵母细胞和/或组合物特别适合用于生产发酵产物(比如，例如，乙醇、丁醇、乳酸、3
‑
羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、氨基酸、1,3
‑
丙二醇、乙烯、甘油、β
‑
内酰胺类抗生素(例如青霉素)及其发酵衍生物)的发酵过程。
37.一般优选的实施方式
38.下文列出了本发明的一般优选实施方式。这些实施方式说明了本发明的特别有利的实施方式并且在任何方面都不限制本发明的范围和权利要求。
39.一般优选的实施方式a
40.在包含高浓度二价金属离子的原料内具有高催化活性的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶，其与seq id no:2具有至少97.0％的序列同一性，并且包含具有位置40、41和43处和/或位置239、246、247、248、249、250和251处的置换的seq id no:4。
41.一般优选的实施方式b
42.根据一般优选的实施方式a的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶，其具有位置42处和/或位置240、241、242、243和244处的缺失。
43.一般优选的实施方式c
44.根据一般优选的实施方式a或b的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶，其中所述l
‑
阿拉伯糖异构酶在ph 7下在30℃下孵育20分钟时，在l
‑
阿拉伯糖含量400mm和mgcl2含量5mm的原料内显示出至少28.5kat/mol酶的催化活性。
45.一般优选的实施方式d
46.根据一般优选的实施方式c的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶，其中所述l
‑
阿拉伯
糖异构酶在ph 7下在30℃下孵育20分钟时，在l
‑
阿拉伯糖含量400mm和cacl2含量5mm的原料内显示出至少30.0kat/mol酶的催化活性。
47.一般优选的实施方式e
48.根据一般优选的实施方式a或b的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶，其中所述l
‑
阿拉伯糖异构酶在ph 7下在30℃下孵育20分钟时，在l
‑
阿拉伯糖含量400mm和mgcl2含量5mm的原料内显示出至少28.5kat/mol酶的催化活性。
49.一般优选的实施方式f
50.根据一般优选的实施方式a或b的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶，其中所述l
‑
阿拉伯糖异构酶在ph 7下在30℃下孵育20分钟时，在包含0.5至15g/l l
‑
阿拉伯糖、5至200g/l d
‑
葡萄糖和含量2至50g/l的二价金属离子的原料内显示出至少28.5kat/mol酶的催化活性。
51.一般优选的实施方式g
52.根据一般优选的实施方式a或b的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶，其中所述l
‑
阿拉伯糖异构酶在ph 7下在30℃下孵育20分钟时，在包含0.5至10g/l l
‑
阿拉伯糖、5至100g/l d
‑
葡萄糖、5至50g/l d
‑
木糖和总含量5至30mm的mg
2
和ca
2
离子的原料内显示出至少28.5kat/mol酶的催化活性，并且其中所述原料是包含木质纤维素的生物质(例如谷秆、甘蔗渣、玉米秸、米糠、稻壳、稻草或其混合物)的水解产物。
53.一般优选的实施方式h
54.根据一般优选的实施方式a至g中任一项的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶，其与seq id no:2具有至少98.5％的序列同一性，并且包含具有位置40、41和43处和/或位置239、246、247、248、249、250和251处的置换的seq id no:4。
55.一般优选的实施方式i
56.根据一般优选的实施方式a至g中任一项的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶，其与seq id no:2具有至少99.5％的序列同一性，并且包含具有位置42处和/或位置240、241、242、243和244处的至少一个缺失的seq id no:4。
57.一般优选的实施方式j
58.编码根据一般优选的实施方式a至g中任一项的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶的核酸序列。
59.一般优选的实施方式k
60.包含根据一般优选的实施方式a至g中任一项的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶的组合物。
61.一般优选的实施方式l
62.包含根据一般优选的实施方式a至g中任一项的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构酶的酵母细胞。
63.一般优选的实施方式m
64.根据一般优选的实施方式a至g中任一项的温度优化的l
‑
阿拉伯糖异构体，根据一般优选的实施方式i的组合物或根据一般优选的实施方式j的酵母细胞在包含0.5至10g/l l
‑
阿拉伯糖、5至100g/l d
‑
葡萄糖、5至50g/l d
‑
木糖和总含量5至30mm的mg
2
和ca
2
离子的原料的发酵过程中的用途，其中所述原料是包含木质纤维素的生物质(例如谷秆、甘蔗渣、
玉米秸、米糠、稻壳、稻草或其混合物)的水解产物。
65.一般优选的实施方式n
66.根据一般优选的实施方式m的用途，其中所述发酵过程是用于生产发酵产物(比如，例如，乙醇、丁醇、乳酸、3
‑
羟基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、衣康酸、氨基酸、1,3
‑
丙二醇、乙烯、甘油、β
‑
内酰胺类抗生素(例如青霉素)及其发酵衍生物)的发酵过程。
67.实施例和附图
68.下文通过实施例和附图描述了本发明。实施例和附图仅用于说明目的，且不在任何方面限制本发明的范围和权利要求。
69.附图简述
70.图1显示了包含1或5mm mncl2、mgcl2或cacl2以及400mm seq id no:8(现有技术的l
‑
阿拉伯糖异构酶)和seq id no:6(根据本发明的l
‑
阿拉伯糖异构酶)的l
‑
阿拉伯糖的底物30℃下的酶促活性的比较。
71.图2显示了包含1或5mm mgcl2或cacl2以及400mm seq id no:8(现有技术的l
‑
阿拉伯糖异构酶)和seq id no:6(根据本发明的l
‑
阿拉伯糖异构酶)的l
‑
阿拉伯糖的底物30℃和50℃下的酶促活性的比较。
实施例1
72.用于大肠杆菌中l
‑
阿拉伯糖异构酶基因表达的载体的克隆
73.核酸分子的操作方法是本领域技术人员公知的，并在此通过引用并入(1.molecular cloning:a laboratory manual,michael r.green和joseph sambrook，第4版；2.current protocols in molecular biology,issn:1934
‑
3639)。
74.分别编码seq id no:2和4的seq id no:1和3是通过geneart(regensburg,germany)合成的，且然后用作pcr反应中的模板以用于克隆。在两个连续的pcr中，将编码其后跟tev蛋白酶位点(enlyfqs)的n端6xhis标签的序列添加到orf中。所得的开放阅读框分别是seq id no:5和seq id no:7。对应的氨基酸序列是seq id no:6和seq id no:8。对于第一pcr反应，引物对被设计为分别匹配seq id no:1和3的5’和3’末端。正向引物(与各自的orf的5’末端结合)具有包含tev蛋白酶位点序列和一部分6xhis标签序列(12bp)的5’延伸。反向引物具有适合用于至目标载体中的gibson克隆的5’延伸。第二反应的正向引物被设计为结合第一正向引物的5’延伸，并且具有包含残留的6xhis标签序列和允许至目标载体中的gibson克隆的序列的5’延伸。用于第一和第二反应的反向引物是相同的。遵循供应商对dntp、引物和缓冲液浓度的建议，使用q5高保真dna聚合酶(hf缓冲液系统)来建立两个pcr反应。pcr产物的扩增在eppendorf thermocycler中使用phusion聚合酶的标准程序完成(98℃，30秒初始变性，然后是98℃，20秒
‑
60℃，20秒
‑
72℃，30秒的30个循环，和72℃下5分钟的最后延伸相)。预期尺寸的pcr产物通过制备型、溴化乙锭染色的tae
‑
琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用promega wizard sv
‑
pcr和凝胶纯化试剂盒从凝胶中回收。
75.通过使用限制性内切核酸酶hindiii和ndei的消化来使质粒pet
‑
22b线性化，并通过琼脂糖凝胶电泳来分离消化的片段。遵循promega wizard sv
‑
pcr和凝胶纯化试剂盒的说明书，从凝胶中回收线性化的载体骨架。根据生产厂商的说明(载体插入比率1:3，
0.1pmol总dna，20μl反应)，使用gibson克隆方法(nebuilder)将扩增的pcr产物克隆到消化的载体骨架中。根据供应商的方案，将转化进行到感受态大肠杆菌mach1细胞中。转化体在lb
‑
氨苄青霉素平板上生长过夜，并通过质粒小量制备和对照消化以及dna测序来测试正确的质粒。使用promega pureyield
tm
plasmid midiprep system从确认的克隆制备更大量的质粒dna。
76.大肠杆菌中l
‑
阿拉伯糖异构酶的表达和l
‑
阿拉伯糖异构酶的纯化
77.通过使用标准分子生物学技术，在iptg(异丙基β
‑
d
‑1‑
硫代吡喃半乳糖苷)诱导型启动子下在大肠杆菌rosetta
tm
细胞中表达l
‑
阿拉伯糖异构酶。用转化的大肠杆菌细胞直接接种包含34μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素的200ml lysogeny肉汤的预培养物，并使其在37℃和250rpm振荡下生长过夜。2l摇瓶中将8个主要培养物的含100μg/ml氨苄青霉素的250ml terrific肉汤接种至0.1的od
600
，并在37℃和250rpm摇动下孵育过夜培养物。当培养物达到1,0od
600
时，将温度降低至20℃，并通过添加1mm iptg诱导ai的表达。在21.5小时后，通过离心收集细胞(10分钟，10,000x g)。使用盐水(0.9％nacl)洗涤球团一次，并将其合并到一个管中。然后，将球团储存在
‑
20℃下直至细胞裂解为止。
78.对于细胞裂解，将细胞球团解冻，重悬在70ml结合缓冲液(20mm trizma碱、500mm nacl、20mm咪唑，ph 7.4)中，并添加蛋白酶抑制剂(complete
tm
，不含edta的蛋白酶抑制剂混合物)、溶菌酶和benzonase核酸酶(sigma
‑
aldrich，62970和e1014)。将细胞悬液在冰上孵育30分钟。然后，在将细胞保持在冰上的同时，通过超声以以下设置裂解细胞：4x 1分钟，振幅70％，循环0.6，中间间隔1分钟。在4℃下以20,000x g离心裂解细胞60分钟。将澄清的上清液过滤(0.2μm)并将其用于纯化相应的ai。
79.使用explorer 900和5ml histrap hp柱(ge life sciences)进行纯化。使用结合缓冲液平衡柱，然后将样品上样到柱上。用结合缓冲液洗涤柱子直到在280nm处的吸收已归一化为止。使用洗脱缓冲液(20mm trizma碱、500mm nacl、500mm咪唑，ph 7.4)以超过10个柱体积(50ml，流速3ml/min，17分钟)的梯度进行洗脱。收集2ml级分，然后根据生产厂商的说明书，通过sds
‑
page(biorad criterion xt 4
‑
12％bis
‑
tris)进行分析。合并包含各自ai蛋白的级分，为了从蛋白中去除二价阳离子，在4℃下用2x 2l透析缓冲液(50mm hepes，ph 7.0，10mm edta)透析96h，更换一次缓冲液。ai浓度通过280nm处的吸收光度测定。
80.分别以15.4和12.3g/l的浓度获得具有seq id no:6和seq id no:8的蛋白。
81.l
‑
阿拉伯糖异构酶活性的测量
82.在终点测量中对纯化的蛋白进行测定以确定ai蛋白的催化活性。通过hplc(dionex ulimate 3000，带有ri检测器shodex ri
‑
101)，使用biorad aminex hpx
‑
87p柱(带有相应的预柱)来定量以l
‑
阿拉伯糖作为底物的ai活性产物l
‑
核酮糖的量。设置如下所示：
83.洗脱液：milliq水
84.流速：0.6ml/min
85.柱温箱：80℃
86.运行时间：40分钟
87.进样体积：20μl
88.检测：ri，50℃，极性( )，数据采集速率10hz
89.l
‑
阿拉伯糖和l
‑
核酮糖的校正范围分别为0.25
–
10mg/ml和0.05
–
2mg/ml。
90.预先进行测试以确定反应条件，尤其是蛋白的量和反应时间，以确保在线性范围中进行测量。反应的最终组分示于表1中。
91.组分最终浓度hepes ph 7100mmmncl2/mgcl2/cacl21/5mml
‑
阿拉伯糖400mm纯化的ai蛋白0.375μm
92.将100μl蛋白溶液(在100mm hepes中将纯化的ai稀释至0,75μm，ph 7)添加到20μl mncl2/mgcl2/cacl2溶液(在100mm hepes中为10或50mm，ph 7)中。添加80μl浓缩的l
‑
阿拉伯糖溶液(在100mm hepes中为1m，ph 7)，并将反应物混合和离心。反应在热循环仪中在30℃或50℃下进行20分钟。通过在95℃下热处理10分钟来终止反应，然后用水1:5稀释，将其过滤并通过hplc来分析。每个反应重复进行三次。根据75皮摩的酶在1200秒后产生的l
‑
核酮糖量(以摩尔计)计算酶活性。单位是kat/摩尔
酶
，其中kat是摩尔
核酮糖
/s。
93.在图1中可以看出，在30℃下，在低和高浓度的所有二价金属阳离子下，根据seq id no:6所述的酶比根据seq id no:8所述的酶具有更高的催化活性。在mn
2
的存在下催化活性至少高15％，以及在mg
2
和ca
2
的存在下，催化活性至少高30％。此外，图2显示了在30℃和50℃升高的温度下，根据seq id no:6所述的酶对二价阳离子mg
2
和ca
2
的催化活性优于根据seq id no:8所述的酶。综上所述，这表明在高浓度二价金属阳离子的存在下，与具有高催化活性的根据seq id no:8所述的酶相比，根据seq id no:6所述的l
‑
阿拉伯糖异构酶显示出显著增加的温度耐受性。
94.序列表说明：
95.seq id no:1：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的dna序列，密码子优化的
96.seq id no:2：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列
97.seq id no:3：野生型l
‑
阿拉伯糖异构酶的dna序列，密码子优化的
98.seq id no:4：来自乳酸杆菌(lactobacillus antri)dsm 16041的野生型l
‑
阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列
99.seq id no:5：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的dna序列，n端6xhis标签，密码子优化的
100.seq id no:6：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列，n端6xhis标签
101.seq id no:7：野生型l
‑
阿拉伯糖异构酶的dna序列，n端6xhis标签，密码子优化的
102.seq id no:8：野生型l
‑
阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列，n端6xhis标签
103.seq id no:9：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的dna序列，密码子优化的
104.seq id no:10：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的dna序列，密码子优化的
105.seq id no:11：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列
106.seq id no:12：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的dna序列，密码子优化的
107.seq id no:13：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列
108.seq id no:14：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的dna序列，n端6xhis标签，密码子优化的
109.seq id no:15：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列，n端6xhis标签
110.seq id no:16：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的dna序列，n端6xhis标签，密码子优化的
111.seq id no:17：修饰的l
‑
阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列，n端6xhis标签。