一株产胞外多糖且具有免疫调节能力的瑞士乳杆菌LZ-R-5及其应用的制作方法

一株产胞外多糖且具有免疫调节能力的瑞士乳杆菌lz-r-5及其应用
一、技术领域
1.本发明属于微生物发酵领域，涉及一株产胞外多糖且具有免疫调节能力的瑞士乳杆菌lz-r-5，具体涉及功能性乳酸菌的开发及其在乳制品方面的应用。
二、

背景技术：

2.乳酸菌在其发酵过程中不仅能赋予食品独特的风味口感并改善产品的质地营养，还能降解蛋白乳糖生成具有益生功能的次级代谢产物。乳酸菌在乳制品中的良好效益加速了各式各样风味、口感、质地、益生功能产品的开发。在发酵乳的制备过程中，发酵剂的质量直接影响着产品的最终品质，发酵剂中若含有具有功能活性的菌株可大大强化产品的益生效益。瑞士乳杆菌作为公认的安全性益生菌，在调节肠道菌群平衡和增强机体免疫系统中发挥了重要作用，具有被开发为功能性乳酸菌的潜力。随着我国发酵乳制品行业的发展壮大，对于发酵性能良好且免疫调节功能强大的菌株的需求不断增加，因此优选具有免疫调节能力的瑞士乳杆菌对益生菌的开发及其在功能性食品上的应用具有积极意义。
3.乳酸菌胞外多糖是微生物生长过程中产生的重要代谢产物，可促进人体健康，具有提高免疫、抗炎症、平衡肠道菌群和抗肿瘤等多种益生功能。利用产胞外多糖的乳酸菌发酵酸奶可以在不添加稳定剂的条件下改善发酵乳的质地、粘度和口感，并显著增强产品的生理活性，从而促进宿主健康。因此，优选高产胞外多糖的乳酸菌在提高发酵乳品质方面发挥了重要作用。
三、

技术实现要素：

4.本发明目的之一是提供一株高产胞外多糖且具有免疫调节功能的瑞士乳杆菌lz-r-5。
5.为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
6.一株瑞士乳杆菌lz-r-5(lactobacillus helveticus lz-r-5)，已于2019年5月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心cgmcc，保藏编号为17870，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
7.所述瑞士乳杆菌lz-r-5是从西藏灵菇颗粒中分离获得，该菌株经16s rrna测序分析鉴定为瑞士乳杆菌，并命名为瑞士乳杆菌lz-r-5，所述菌株为高粘酸乳发酵菌种且可生产胞外多糖，以期应用于发酵乳制品行业，制备具有益生特性的高产黏发酵乳制品。
8.本发明所述的瑞士乳杆菌lz-r-5基本特征如下：
9.1、该菌株在mrs培养基上菌落较小，直径约0.5～1.0cm，表面皱缩，呈扁平型，菌体呈长杆状；
10.2、该菌株在mrs培养基或者乳基中生长迅速，产酸快，具有主发酵剂应用潜力；
11.3、该菌株在mrs培养基或乳基中均可产生胞外多糖，发酵24h胞外多糖产量达126mg/l。
12.在本发明的具体实施中包括所述菌株活菌和已灭活菌及该菌株产生的胞外多糖均具有免疫调节能力。
13.在本发明的具体实施中，一株具有免疫调节能力的瑞士乳杆菌lz-r-5具体表现为：(1)所述菌株活菌和已灭活菌及其产生的胞外多糖有助于提高细胞的增殖能力；(2)所述菌株活菌和已灭活菌及其产生的胞外多糖有助于促进细胞的的吞噬能力；(3)所述菌株活菌和已灭活菌及其所产生的胞外多糖有助于提升细胞的no释放量，激发细胞免疫系统；(4)所述菌株活菌和已灭活菌及其产生的胞外多糖有助于增强细胞因子的产生。
14.本发明还提供了所述具有免疫调节能力的瑞士乳杆菌lz-r-5在功能性乳品发酵剂方面的应用。
15.在本发明的具体实施中所述乳品发酵剂包括液体、粉末、固体、薄膜和凝胶等形式。
16.本发明目的之二是提供所述的瑞士乳杆菌lz-r-5菌株及含有瑞士乳杆菌lz-r-5的发酵剂在功能性发酵乳制品中的应用。
17.在本发明的具体实施中，其特征在于发酵乳制品具有免疫调节功能，对机体健康有益。
18.在本发明的具体实施中发酵乳制品在不添加外源食品添加剂条件下可生产高稳定性，无乳清析出的发酵乳制品。
19.在本发明的具体实施中发酵乳制品在不添加外源增稠剂条件下可生产高粘性发酵乳产品，有效避免了外源添加剂引起的风味不佳或食品安全等问题。
20.本发明的有益效果：
21.(1)本发明提供的瑞士乳杆菌lz-r-5生长迅速，产酸快，具有主发酵剂应用潜力。
22.(2)本发明提供的瑞士乳杆菌lz-r-5具有免疫调节能力，同时产生具有功能活性的胞外多糖，作为益生元协同益生菌应用于发酵乳制品中，显著强化了产品的益生功能。
23.(3)本发明提供的瑞士乳杆菌lz-r-5属于高粘酸乳发酵菌种，在不添加外源食品添加剂的情况下可生产高粘性发酵乳，有效避免了外源增稠剂引起风味不佳等问题，并赋予产品稠厚细腻的质地。
24.(4)本发明所述的瑞士乳杆菌lz-r-5制备的发酵乳在不添加外源食品添加剂的条件下可维持较高稳定性，21d保藏期内无乳清析出。
附图说明：
25.图1：瑞士乳杆菌lz-r-5单菌落形态和显微镜图片
26.图2：瑞士乳杆菌lz-r-5在牛奶培养基中生长动力学曲线
27.图3：瑞士乳杆菌lz-r-5及其胞外多糖对raw264.7细胞增殖作用的影响
28.图4：瑞士乳杆菌lz-r-5及其胞外多糖对raw264.7细胞吞噬能力的影响
29.图5：瑞士乳杆菌lz-r-5及其胞外多糖对raw264.7细胞no释放量影响
30.图6：瑞士乳杆菌lz-r-5及其胞外多糖对raw264.7细胞il-6分泌量的影响
四、具体实施方式
31.通过具体实施例，并结合附图对本发明进一步阐述：
32.实施例1：瑞士乳杆菌lz-r-5分离纯化与鉴定
33.(1)将藏灵菇菌粒接种至牛奶培养基，28℃下培养48h，然后用无菌金属网过滤，并用无菌冷水冲洗3遍，得到的藏灵菇菌粒再转接至纯牛奶中，如此重复培养复活，连续3次，将复活菌液梯度稀释成10-5
、10-6
、10-7
的菌悬液，并涂布于mrs固体培养基上于37℃下培养48h，挑取菌落大小、颜色、表面光滑度等具有不同形态特征的单菌落继续划线，直至分离出纯种。挑选在培养基上呈典型乳酸菌形态的单菌落进行革兰氏染色，并用显微镜观察其颜色和形态，判断革兰氏阴阳性和纯度。将3％过氧化氢溶液滴于镜检为革兰氏阳性的菌落，若无气泡，初步鉴定为过氧化氢酶阴性。得到纯培养物后，挑取单菌落活化培养，菌液与80％甘油(v/v)等体积混匀，-20℃保藏。
34.(2)吸取1ml活化好的菌液于12000rpm离心10min，收集沉淀，te缓冲液洗涤2次再重悬，并裂解破碎细胞壁，加入酚/氯仿/异戊醇萃取核酸dna，乙醇洗涤两次，挥干，te缓冲液重悬得菌株dna模板。
35.(3)pcr扩增体系：
36.表1 细菌pcr扩增体系
[0037][0038]
注：上游引物(27f)序列：5
′‑
agagtttgatcmtggctcag-3
′
；
[0039]
下游引物(1492r)序列：5
′‑
ggctaccttgttacgactt-3
′
。
[0040]
(4)pcr扩增反应条件：
[0041][0042]
(5)pcr产物电泳
[0043]
(6)将经过琼脂糖凝胶电泳检测过的pcr产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，所得序列提交至genbank数据库，利用blast(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov)与已有细菌的16s rdna基因进行比对；同时，将所得乳酸菌序列提交到ezbiocloud数据库，进行相似性搜索，找出与所得基因序列同源性最高的已知菌种。
[0044]
实施例2：瑞士乳杆菌lz-r-5在牛乳培养基中生长情况
[0045]
由附图2所知，0～24h内乳酸菌活菌数持续增长，当发酵24h活菌数达9.32lg cfu/g，表明瑞士乳杆菌lz-r-5在牛乳培养基中可大量繁殖，其数值大于6lg cfu/g，具有发挥功
能活性的潜力；ph值和酸度值相对应，在发酵12h内，ph快速下降，酸度快速上升，当发酵24h后，ph和酸度均平稳变动。
[0046]
实施例3：瑞士乳杆菌lz-r-5在牛乳培养基中产胞外多糖能力测定
[0047]
多糖含量采用硫酸苯酚法测定，发酵28h时多糖含量达最高值128mg/ml(见图2)。
[0048]
实施例4：免疫调节能力测定
[0049]
本试验主要研究本发明中瑞士乳杆菌lz-r-5活菌和已灭活菌及其产生的胞外多糖的免疫调节能力，由细胞实验结果证实(见图3-6)
[0050]
(1)所述菌株活菌和已灭活菌及其产生的胞外多糖有助于提高细胞的增殖能力；
[0051]
(2)所述菌株活菌和已灭活菌及其产生的胞外多糖有助于促进细胞的吞噬能力；
[0052]
(3)所述菌株活菌和已灭活菌及其所产生的胞外多糖有助于增加细胞的no释放量，激发细胞免疫系统；
[0053]
(4)所述菌株活菌和已灭活菌及其产生的胞外多糖有助于增强细胞因子的产生。