用于毛花猕猴桃雌雄性别鉴定的SSR分子标记AerM02及其应用的制作方法

用于毛花猕猴桃雌雄性别鉴定的ssr分子标记aerm02及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子遗传育种技术领域，具体涉及一种用于毛花猕猴桃雌雄性别鉴定的ssr分子标记aerm02(aerm02是为区别其它ssr分子标记而命名，aer为毛花猕猴桃拉丁名actinidia eriantha的三字母缩写，m为分子标记marker的首字母缩写)及其应用。


背景技术：

2.猕猴桃除含有猕猴桃碱、蛋白水解酶、单宁果胶和糖类等有机物，以及钙、钾、硒、锌、锗等微量元素和人体所需17种氨基酸外，还含有丰富的维生素c、葡萄酸、果糖、柠檬酸、苹果酸、脂肪。猕猴桃为雌雄异株的大型落叶木质藤本植物，猕猴桃杂交后代的雌雄分离比例约为1:1，鉴于猕猴桃雌雄异株的性别功能，猕猴桃果园通常配置少量授粉雄株以保证果园产量和果实品质，对猕猴桃雌雄株的辨别需要在猕猴桃开花后，从猕猴桃花的形态结构差异表别猕猴桃的雌雄株，给猕猴桃的育种和种植带来了不便以及浪费。
3.ssr(simple sequence repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物pcr为基础的分子标记技术，也称为微卫星dna(microsatellitedna)，是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。每个ssr两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，与其它分子标记相比，ssr标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。然而，现有的猕猴桃ssr分子标记依赖杂交群体，周期长，人力和资金投入大，所选潜在ssr标记只能局限于所筛选的性别决定区间，数量有限，只适用于中华猕猴桃，并不能用于毛花猕猴桃。
4.鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于解决没有适用于毛花猕猴桃群体的猕猴桃ssr分子标记的问题，提供了一种用于毛花猕猴桃雌雄性别鉴定的ssr分子标记aerm02及其应用。
6.为了实现上述目的，本发明公开了一种用于毛花猕猴桃雌雄性别鉴定的ssr分子标记aerm02，ssr分子标记aerm02引物的序列如seq.id no1和seq.id no2所示，扩增得到的雄株特异片段核苷酸序列如seq.id no3所示。
7.本发明还公开了上述用于毛花猕猴桃雌雄性别鉴定的ssr分子标记aerm02的获得方法，包括以下步骤：
8.s1：利用毛花猕猴桃雌雄株个体测序的基因组，进行基因组水平的数据分析和比较，筛选其中在雌雄株个体中具有特异性的序列片段；
9.s2：使用筛选到的特异序列进行ssr位点的鉴定，筛选得到潜在的ssr分子标记；
10.s3：合成潜在ssr分子标记的上下游引物，提取毛花猕猴桃的基因组dna，进行常规
pcr和琼脂糖凝胶电泳实验，筛选得到ssr分子标记aerm02，该分子标记的上下游引物能在雄株中扩增出两条清晰的条带，而在雌株中扩增出一条清晰的条带，其中雄株中的一条扩增条带与雌株的扩增条带大小相同，另一条扩增条带具有特异性。
11.所述步骤s2中潜在的ssr分子标记具有单个重复基序串联排列的完美型的结构类型，ssr分子标记位点上下游具有非特异性的侧翼序列，即在两个基因组中具有同源性较高的序列，保证设计的上下游引物能同时在雌雄株个体中扩增出条带。
12.本发明还公开了上述用于毛花猕猴桃雌雄性别鉴定的ssr分子标记aerm02的扩增引物在毛花猕猴桃(actinidia eriantha)
‘
华特(white)’和
‘
伴客(blank)’品种的杂交群体中进行雌雄性别鉴定的应用。
13.与现有技术比较本发明的有益效果在于：
14.1、已有的猕猴桃ssr分子标记都是利用中华猕猴桃杂交群体筛选获得，经实验验证，这些ssr分子标记并不能在毛花猕猴桃群体中适用，因此本发明主要针对毛花猕猴桃群体，具有特异性；
15.2、本发明直接利用已经发表的基因组进行差异序列的比较，省去了构建猕猴桃杂交群体的工作，具有快速、简便、低成本的优点，而且该方法可以扩展到任何具有基因组序列的物种群体；
16.3、本发明通过基因组比较分析，可以系统地鉴定出雌雄株个体在基因组水平上的序列差异，包括散布在不同染色体上的任何特异序列片段，这比利用传统杂交群体定位的单个区域要全面，因此能提供更多的潜在ssr分子标记。
附图说明
17.图1为ssr分子标记aerm02在毛花猕猴桃雄株和雌株中扩增条带图；
18.图2为ssr分子标记aerm02在其他猕猴桃雄株和雌株中扩增条带图。
具体实施方式
19.以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
20.一、ssr分子标记aerm02的获得
21.试验地点：中国安徽省合肥市安徽农业大学；试验时间：2020年
22.材料：试验所用材料为毛花猕猴桃(actinidia eriantha)
‘
华特(white)’和
‘
伴客(blank)’品种的杂交群体。毛花猕猴桃是中国特有的猕猴桃种，果实口感酸甜，香气浓郁，维生素c含量极高，适应性广，抗逆性强，同时其根在传统中医药中常用于治疗肝炎、胃癌、鼻咽癌等疾病。
23.1、获取毛花猕猴桃雌雄株个体
‘
华特’和
‘
伴客’的测序基因组序列。其中毛花猕猴桃
‘
华特’基因组为2019年测序已发表，从猕猴桃国际基因组数据库kgd下载，网址为：http://kiwifruitgenome.org/；而毛花猕猴桃
‘
伴客’基因组为2020年测序待发表，其中包含有该ssr位点的一段长为4012bp序列(上下游各2000bp序列)如seq.id no4。
24.2、利用misa软件分别对
‘
华特’和
‘
伴客’的基因组序列进行ssr位点的鉴定。在此操作中，使用较严格的参数设定(包含一、二、三、四、五、六核苷酸的重复基序的最小重复次数分别为10、6、5、5、5、5次)，只保留单个重复基序串联排列的完美型ssr位点类型用于分子
标记的筛选。
25.3、基于每个鉴定的ssr位点信息，在各自的基因组序列中获取其上下游200bp的侧翼序列；然后，将获得的侧翼序列与另一个基因组序列进行交叉比对(e值≤1e
‑
5，同源性≥80)，任何比对上的侧翼序列被认为是非特异性位点而保留。
26.4、基于保守ssr位点的上下游侧翼序列，利用primer3软件进行该位点上下游引物的批量设计，并利用e
‑
pcr软件在基因组序列中鉴定其特异性；去除特异性的引物，只保留非特异性的引物用于后续实验验证。
27.5、将设计的引物送交生物公司进行引物的合成；利用合成的引物，对毛花猕猴桃雌雄株个体的叶片dna进行pcr扩增，摸索合适的扩增条件，保证扩增条带的清晰度和稳定性；筛选得到本分子标记能在雄株中稳定性的扩增出两条清晰的条带，而在雌株中稳定性的扩增出与雄株中的其中一条带大小相同的唯一且清晰的条带，如图1所示。
28.6、将筛选得到的pcr引物用于猕猴桃属其他几个代表种(包括中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃等)已知雌雄性别个体的分子克隆和鉴定，确定了本分子标记特异性的应用于毛花猕猴桃，如图2所示。
29.二、ssr分子标记aerm02的应用
30.1、ssr分子标记aerm02在毛花猕猴桃杂交群体中的应用
31.采集安徽农业大学毛花猕猴桃(
‘
华特(white)’和
‘
伴客(blank)’)杂交群体中20份鲜嫩叶片，其中包含10份雌株和10份雄株样品；同时，采集中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃等多个种(下文称为其他猕猴桃)的10份雌株和10份雄株样品。首先分别提取各个植株的基因组dna，然后采用分子标记引物seq.id no1和seq.id no2对20份毛花猕猴桃及其他猕猴桃基因组dna进行pcr扩展。
32.pcr反应扩增体系为：10μl反应体系包括正、反向引物各0.3μm，0.5mm dntps，1μl 10x taq buffer(包含mgcl2)，0.3units taq聚合酶，100ng dna模板；
33.pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，28个循环；72℃延伸10min。
34.pcr扩增结果为：在毛花猕猴桃10份雄株样品中均扩增到两条大小一致的条带，而在毛花猕猴桃10份雌株样品中均扩增到一条大小一致的条带，其中雄株中一条大小为338bp的条带表现为特异性(seq.id no3)；在其他猕猴桃10份雄株和10份雌株样品中均没有扩增得到条带稳定且大小一致的特异条带。表1显示了本ssr分子标记在毛花猕猴桃杂交群体中随机选择的10株雄株和10株雌株中扩增的琼脂糖凝胶电泳结果；表2显示了本ssr分子标记在其他猕猴桃中随机选择的10株雄株和10株雌株中扩增的琼脂糖凝胶电泳结果，其中aer001和aer011为已知毛花猕猴桃的雄株和雌株，用于做正负对照。
35.表1 ssr分子标记aerm02在毛花猕猴桃杂交群体中随机选择的10株雄株和10株雌株中扩增的琼脂糖凝胶电泳结果
[0036][0037][0038]
表2 ssr分子标记aerm02在其他猕猴桃中随机选择的10株雄株和10株雌株中扩增的琼脂糖凝胶电泳结果
[0039][0040]
由表1和表2结果可知，这种ssr分子标记aerm02能用于毛花猕猴桃的雌雄性别鉴
定，不能对其他品种的猕猴桃进行雌雄性别鉴定，具有特异性，这种雌雄性别鉴定的ssr分子标记aerm02的获得方法，可应用于其他基因组序列已知的品种或物种中，具有普适性。
[0041]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。