一种血浆外泌体circRNA标志物及其应用的制作方法

一种血浆外泌体circrna标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子诊断技术领域，尤其是涉及一种血浆外泌体circrna标志物及其应用。


背景技术：

2.目前我国心血管疾病人数高达2.9亿，病死率居首位，高于肿瘤及其他疾病，占居民疾病死亡构成的40％以上。急性心肌梗死(ami)是最常见的心血管病之一，严重威胁着人类的健康。急性心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死。临床上多有剧烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯类药物不能完全缓解，伴有血清心肌酶活性增高及进行性心电图变化，可并发心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。
3.传统的循环生物标志物如ctnt在ami的诊断和预后评估中起着重要的作用，ctnt有着高灵敏性，但是由于在非ami患者(如心力衰竭或肺栓塞患者)中也容易检测到ctnt，所以其特异性相对较低。因此探究ami的发病机制，并寻找更特异的生物标志物是改善ami患者治疗和预后的关键。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于提供一种血浆外泌体circrna标志物，该血浆外泌体circrna标志物能够作为急性心肌梗死的检测生物标志物，与传统的循环生物标志物相比特异性更高，检测快捷方便，成本低。本发明还提供了血浆外泌体circrna标志物的应用。
5.本发明提供了一种血浆外泌体circrna标志物，所述血浆外泌体circrna标志物为hsa_circ_001558，所述hsa_circ_001558的核苷酸序列如seq id no：1所示。
6.本发明提供了一种血浆外泌体circrna标志物作为急性心肌梗死检测标志物的应用。
7.本发明提供了一种包括血浆外泌体circrna标志物检测急性心肌梗死的诊断产品。
8.优选地，所述诊断产品为芯片、制剂或试剂盒。
9.研究发现，外泌体hsa_circ_0001558在ami患者血浆外泌体中的相对表达水平较nccp(非心源性胸痛)患者血浆外泌体中组显著升高，为nccp患者血浆外泌体的4.45倍，其诊断ami的roc曲线下面积为0.793；外泌体hsa_circ_001558在nst-ami(非st段抬高的急性心肌梗死)、st-ami(st段抬高的急性心肌梗死)患者中的表达逐渐升高，在nst-ami患者中的相对表达为nccp患者的2.80倍，其诊断nst-ami的roc曲线下面积为0.72；在st-ami患者中的相对表达为nccp患者的5.27倍，其诊断st-ami的roc曲线下面积为0.831。
10.综上所述，本发明具有以下优点：
11.(1)本发明提供的标志物外泌体hsa_circ_001558与传统的标志物相比检测ami灵敏度更高，其诊断ami的roc曲线下面积为0.793，并且其诊断nst-ami的roc曲线下面积为0.72，诊断st-ami的roc曲线下面积为0.831，特异性更强，检测更加快捷方便，成本更低。
special；nc膜购于hyclone；difco
tm
skim milk购于bd；cd63抗体、hsp70抗体、gapdh抗体购于abcam公司；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗购于北京力高泰科技公司；外泌体提取试剂盒(货号为217184)、外泌体rna提取试剂盒(货号为76064)购于qiagen；逆转录试剂盒购于promega；荧光定量pcr试剂盒购于thermo fisher；18s rna购于奥科鼎盛生物科技有限公司。
27.二、实验方法
28.2.1患者标本收集
29.选取2016年10月至2018年3月首都医科大学附属北京朝阳医院和内蒙古包头市中心医院住院的患者，其中ami(急性心肌梗死)患者120例、nccp(非心源性胸痛)患者83例。记录入患者性别、年龄、吸烟史、饮酒史、sbp(收缩压)、dbp(舒张压)、tc(总胆固醇)、tg(甘油三酯)、hdl(高密度脂蛋白)、ldl(低密度脂蛋白)等临床资料。
30.入选标准：急性心肌梗死(诊断标准基于2015esc/aha/acc指南)：缺血症状，ctnt(肌钙蛋白)和ck-mb(肌酸激酶同工酶)表达量升高、心电图病理q波。所有ami患者均为首次确诊。非心源性胸痛患者：胸痛入院，冠脉造影阴性，最终诊断为心脏神经症、动脉硬化、反流性食管炎、高脂血症。
31.排除标准：ami合并其它疾病如糖尿病、甲状腺功能减退、支气管哮喘、慢性肾病、肿瘤等。
32.2.2采血、分离血浆
33.用采血针和抗凝管(含edta)采集病人入院次日早晨的空腹静脉血20ml,混匀后在4℃下静置3-4h。在3000rpm、4℃下离心10min，上清液即为血浆，用0.2μm滤器过滤，1ml/管分装后在-80℃保存。
34.2.3血浆提取外泌体
35.使用外泌体提取试剂盒从血浆中分离外泌体，方法如下：
36.(1)从-80℃冰箱中取出冻存血浆，在37℃金属浴中融化，在10000g下离心15min取上清液，取4ml血浆到新的15ml离心管中；
37.(2)加入1倍体积的xbp缓冲液轻轻颠倒管子5次，室温孵育；再将混合液放进柱子里500g离心1min，倒掉废液将柱子重新放回离心管中；
38.(3)加入10mlxwp缓冲液在3000g离心5min，将柱子重新转移到一个新的离心管中；
39.(4)最后加1mlxe缓冲洗脱液到柱子里，孵育1min，在500g离心5min后收集滤液，重新加到柱子上，再次孵育1min，在3000g离心5min；
40.(5)收集滤液(即外泌体)到一个新的无rna酶ep管中，在-80℃保存。
41.2.4外泌体粒径分析
42.外泌体原液中加入1ml磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，pbs)，混匀。使用纳米颗粒跟踪分析仪zeta view-particle metrix进行测量，将样品注入样品池。打开软件调节亮度和焦距，调整视野，进行观测，使用软件根据颗粒运动轨迹的时间与位移分析其粒径。
43.2.5外泌体透射电镜分析
44.(1)向提取的外泌体中加入50-100μl 2％多聚甲醛溶液，得到外泌体溶液；
45.(2)取5-10μl外泌体溶液滴于formvar-carbon载样铜网上，室温下放置10min；
46.(3)然后使用pbs缓冲液清洗1次；
47.(4)先在铜网上使用50μl 1％戊二醛液滴5min，再用100μl重蒸水洗8次每次2min；
48.(5)用50μl草酸双氧铀液滴(ph为7.0)处理5min；
49.(6)再将铜网放在冰上用50μl甲基纤维素液滴10min，空气干燥5-10min；
50.(7)将铜网放在样品盒里，80kv下调节合适的焦距及亮度并拍照。
51.2.6外泌体蛋白的提取与定量
52.向分离得到的外泌体中加入100μl含蛋白酶抑制剂的裂解液(radio-immunoprecipitation assay，ripa)，冰上裂解5min，在13000rpm、4℃下离心5min，弃去沉淀。使用bca蛋白浓度测定试剂盒提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度，本实验蛋白样品为3次独立重复外泌体实验收取完成。详细操作步骤如下：
53.(1)取0.8ml蛋白标准配制液加入蛋白标准品(20mg bsa)中，充分混合溶解后配置成25mg/ml的蛋白标准溶液；
54.(2)取20μl蛋白标准溶液，加入980μl稀释液中即可配制成0.5mg/ml蛋白标准液；
55.(3)根据样品数量，按50:1的体积将bca试剂a加入bca试剂b中配置成适量bca工作液体，充分混合；
56.(4)将标准品按照0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl加入到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足至20μl；
57.(5)分别加入10μl待测样品到96孔板的样品孔中，加入标准品稀释液至20μl，各孔中加入200μl bca工作液，室温放置2h；
58.(6)在560nm波长处测定样品的吸光度值，根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
59.待蛋白定量后，加入5 x sds凝胶加样缓冲液，100℃煮沸5min使蛋白变性，完成蛋白提取步骤，置于-80℃超低温冰箱保存样品。
60.2.7蛋白印迹(western blot)
61.2.7.1sds聚丙烯酰胺分离胶和基层胶的配制如下：
62.分离胶(浓度10％)的组成：超纯水4.0ml、30％丙烯酰胺3.3ml、1.5mtris-hcl(ph＝8.8)2.5ml、10％sds 0.1ml、10％过硫酸铵0.1ml、temed 0.004ml；
63.积层胶(浓度5％)的组成：超纯水4.1ml、30％丙烯酰胺1.0ml、1.0mtris-hcl(ph＝6.8)0.75ml、10％sds 0.06ml、10％过硫酸铵0.06ml、temed 0.006ml。
64.2.7.2蛋白印迹
65.(1)向上清液(血浆)中加入1/5体积5
×
上样缓冲液，95℃煮5min；
66.(2)煮后取20μl加入到10％sds聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳；
67.(3)电泳结束后将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，pvdf)膜上；
68.(4)5％bsa封闭1h；
69.(5)加入cd63抗体(abcam公司，1：1000)，hsp70抗体(abcam公司，1：3000)或gapdh抗体(abcam公司，1：5000)，4℃孵育过夜，tbst(tris盐洗膜缓冲液)洗涤3次，每次10min；
70.(6)之后加入羊抗兔二抗(北京力高泰科技公司，1:15000)或羊抗鼠二抗(北京力高泰科技公司，1:15000)，温室孵育1h，tbst洗涤3次，每次10min，曝光。
71.2.8外泌体总rna提取
72.使用外泌体提取试剂盒提取外泌体rna，步骤如下：
73.(1)向提取出的外泌体原液中加入600μl裂解液，室温孵育2min，3000g离心5min，取上清液；
74.(2)加入氯仿，分层，取上层水相加入1.5倍体积的100％乙醇，用移液器上下混匀；
75.(3)混匀后分批加到试剂盒提供的柱子里，8000g离心15s，倒掉废液，回收柱子；
76.(4)加入试剂盒的缓冲液到柱子上，离心洗涤柱子，再加80％乙醇到柱子上8000g离心2min；
77.(5)离心后把柱子转移到一个新的无rna酶的ep管中，晾干柱子上的过滤膜；
78.(6)然后加入14μl洗脱液，8000g离心1min后，扔掉柱子，收集滤液，储存至-80℃冰箱；
79.(7)用nano drop 2000(thermo scientific，usa)测定rna浓度，rna量》4μg；rna浓度为50ng/μl-500ng/μl；rna吸光度260/280在1.8-2.1之间。
80.2.9高通量测序
81.首先对外泌体rna经纯化等前期处理，然反转录形成cdna，末端修复加接头，pcr扩增等步骤建库，质检合格后上机测序。获得原始数据之后，首先要对数据进行过滤，去除接头序列以及低质量读长进行处理，再对测序质量进行评估，获得高质量的数据，并对高质量的数据及参考数据进行比对，获得bam文件。
82.2.10逆转录
83.rna的逆转录用逆转录试剂盒采用两步法进行，具体操做步骤如下：
84.(1)rna(100ng)xμl、oligot15(0.5μg)1μl、depc
·
h2o 9-xμl，总体积为10μl；
85.(2)70℃反应5min，打开rna二级结构；立即置于冰上，然后加入5
×
amv buffer 4μl、10mm dntp mixture 2μl、mg
2
2μl、rnasin(40u/μl)1μl、amv 1μl，总体积为10μl，42℃反应60min，99℃反应2min，4℃恒温，产物-20℃保存。
86.2.11实时定量pcr
87.使用powerup
tm
sybr
tm
green master mix荧光定量试剂盒和abi7500pcr仪检测circrna的水平。取4μl以10倍稀释的cdna作为模板，每个样品设置3个平行孔，18s rna作为内参基因。
88.(1)反应体系如下：2x master mix 10μl、h2o 4μl、primer f(10μm)1μl、primer r(10μm)1μl、cdna 4μl。
89.(2)反应条件如下：
[0090][0091][0092]
(3)qrt-pcr引物序列，信息如下表1所示。
[0093]
表1 qrt-pcr引物序列表
[0094][0095]
2.12统计分析方法
[0096]
应用spss17.0软件进行统计分析，正态分布数据用均数
±
标准差(x
±
s)表示，非正态分布数据用中位数(p25，p75)表示。正态分布数据两组间比较釆用t检验，非正态分布数据两组间比较采用非参数检验，两组数据率的比较采用卡方检验。circrna水平的差异由mann-whitney u检验确定。为了评估选定circrna对ami的预测价值，我们使用roc曲线，以p值《0.05为差异具有统计学意义。
[0097]
三、试验结果
[0098]
1、外泌体鉴定
[0099]
1.1透射电镜观察提取的外泌体
[0100]
透射电镜下观察到提取的囊泡大小不均，呈圆形或类圆形，具有脂质双层膜，直径在30-150nm之间，符合外泌体的形态特征，如图1所示。
[0101]
1.2外泌体粒径分析
[0102]
提取到的囊泡颗粒粒径大小在30-200nm，主峰在100nm左右，如图2所示。
[0103]
1.3 western blot测定外泌体特异性分子标志
[0104]
免疫印迹实验结果显示，ami患者和nccp患者血浆外泌体表达特异性标志蛋白cd63和hsp70，而不表达gapdh，如图3所示，进一步证明提取的囊泡为外泌体。
[0105]
2、高通量测序
[0106]
为了明确ami患者血浆外泌体中circrna的表达情况，我们用高通量测序的方法对15例nccp和15例ami(测序队列)的标本进行了筛选。
[0107]
2.1测序队列临床特征
[0108]
ami与nccp组的年龄、性别没有明显差异，ctnt、ck-mb、nt-probnp(氨基末端脑钠肽前体)的水平在ami组较nccp组显著升高，符合ami患者的临床特征，ami组和nccp组患者资料见表2。
[0109]
表2患者基本临床资料
[0110][0111][0112]
2.2高通量测序结果
[0113]
高通量测序的结果显示，ami患者血浆外泌体中circrna的表达谱与对照组相比明显不同，以|log2(fold change)|》1，q-value《0.001为标准，筛选到ami血浆外泌体中差异表达的circrnas 893个，表达上调118个，表达下调775个(如图4中的a图所示)，这些差异表达的circrnas在circbase中有注释的107个，见表3。
[0114]
表3 circbase中有注释的ami中差异表达circrna
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122][0123]
2.3小样本量验证差异表达的circrnas
[0124]
为了验证高通量测序的结果，同时考虑到作为生物标志物的可行性，我们在上调表达的circrnas中挑选了在circbase数据库中有注释、在ami组表达量高、升高倍数较大的5个circrnas(外泌体hsa_circ_0001535、外泌体hsa_circ_0003270、外泌体hsa_circ_0000972、外泌体hsa_circ_0001119和外泌体hsa_circ_0001558)，如图4中的b图所示。用rt-pcr的方法在小样本量标本中进行了验证。
[0125]
2.3.1小样本队列临床特征
[0126]
小样本队列入选了20例nccp和20例ami患者，临床资料见表4。两组之间的年龄、性别、身高、体重等没有差异；高血脂的比例、wbc(白细胞)、glu(葡萄糖)、k

、ast(天冬氨酸转氨酶)、alt(丙氨酸转氨酶)、crp(c反应蛋白)、ft3(血清游离三碘甲状腺原氨酸)、ft4(血清游离甲状腺素)、stsh(敏感促甲状腺激素)、ck-mb、tni(血清心肌坏死标记物)的水平在ami组显著高于nccp组；lvef(％)(左心室射血分数)、na

的水平在ami组显著低于nccp组。
[0127]
表4小样本队列临床资料表
[0128]
[0129][0130]
2.3.2小样本量验证结果
[0131]
rt-pcr验证的结果显示，外泌体hsa_circ_0001119表达量低，在多数样本中检测不到，外泌体hsa_circ_0003270在ami患者和nccp患者两组之间的表达没有差异，外泌体hsa_circ_0001535、外泌体hsa_circ_0000972和外泌体hsa_circ_0001558的检测结果与测序结果一致。外泌体hsa_circ_0001535在ami患者血浆外泌体中的相对表达水平(8.49(5.34，13.94))较nccp组(5.45(3.50，7.57))显著升高(p《0.05)，为nccp组1.56倍，在本队列人群中其诊断ami的roc曲线下面积为0.685(如图5中a图和d图所示)；外泌体hsa_circ_0000972在ami患者中的相对表达水平(15.7(1.75，21.71))较nccp组(3.43(1，12.4))显著升高(p《0.05)，为nccp组的4.58倍；在本队列人群中其诊断ami的roc曲线下面积为0.683(如图5中b图和e图所示)；外泌体hsa_circ_0001558在ami患者血浆外泌体中的相对表达水平(27.62(20.47，44.81))较nccp组(7.42(4.21,31.08))显著升高(p《0.01)，为对照组的3.72倍，在本队列人群中其诊断ami的roc曲线下面积为0.790(如图5中c图和f图所示)。由于在这三个circrnas中，外泌体hsa_circ_0001558诊断ami的roc曲线下面积最大，因此，选择外泌体hsa_circ_0001558进一步在大样本量标本中进行了验证。
[0132]
其中图5中的a图为外泌体hsa_circ_0001535在ami和nccp中的相对表达水平；b图为外泌体hsa_circ_0001558在ami和nccp中的相对表达水平；c图为外泌体hsa_circ_0000972在ami和nccp中的相对表达水平；d图为外泌体hsa_circ_0001535诊断ami的roc曲线；e图为外泌体hsa_circ_0000972诊断ami的roc曲线；f图为外泌体hsa_circ_0001558诊断ami的roc曲线。*p《0.05，**p《0.01。
[0133]
2.4大样本量验证差异表达的circrnas
[0134]
为了验证小样本量队列的结果，我们将外泌体hsa_circ_0001558的水平在更大样本量中进行了验证。
[0135]
2.4.1大样本量队列临床资料
[0136]
48例nccp以及85例ami患者的临床信息见表5。ami组男性患者的比例、心率、高血压的比例、高血脂的比例、wbc、hb、tg、glu、ast、alt、k

、d-d、crp、tt3、ft3、stsh、ck-mb、tni的水平高于nccp组，lvef(％)、na

的水平低于nccp组。
[0137]
表5研究人群的临床特征:外泌体circrna在大样本中循环验证
[0138]
[0139][0140]
2.4.2大样本队列验证结果
[0141]
血浆外泌体hsa_circ_0001558在大样本量ami和nccp患者中验证的结果与小样本队列验证结果一致。外泌体hsa_circ_0001558在ami患者血浆外泌体中的相对表达水平(8.81(4.87,17.76))较nccp组(1.98(0.74,6.44))显著升高(p《0.01)，为nccp组的4.45倍，其诊断ami的roc曲线下面积为0.793，如图6所示(a图为hsa_circ_0001558在ami患者血浆外泌体中的表达水平；b.图为血浆外泌体hsa_circ_0001558诊断ami的roc曲线图；**p《0.01)。
[0142]
进一步将ami患者分为st段抬高性ami(st-ami)和非st段抬高性ami(nst-ami)，血浆外泌体hsa_circ_0001558在nst-ami组中的相对表达(5.54(4,11.96))较nccp组(1.98(0.74,6.44))显著升高，为nccp组的2.80倍，其诊断nst-ami的roc曲线下面积为0.72；在st-ami组中的相对表达(10.44(6.95,22.93))为nccp组的5.27倍，其诊断st-ami的roc曲线
下面积为0.831，如图7所示(a图为外泌体hsa_circ_0001 558在nst-ami和st-ami中的表达变化；b图为外泌体hsa_circ_0001558诊断nst-ami的roc曲线图；c图为外泌体hsa_circ_0001558诊断st-ami的roc曲线图。*p《0.05,**p《0.01)。
[0143]
ami多发生于冠状动脉粥样硬化性狭窄，主要由斑块破裂或血栓形成及继发冠状动脉阻塞引起，导致心肌细胞凋亡和心肌坏死。研究表明，外泌体介导的细胞间信息沟通在ami中通过多种机制发挥作用。通过分析外泌体中的信息物质可以直接获得细胞的基本信息。已有的研究多集中在对外泌体中mirna在ami早期诊断、移植治疗、以及ami后的心肌纤维化和血管新生中的作用及机制。circrna是外泌体中的重要信息物质之一。
[0144]
circrna是近年来的研究热点，由外显子或内含子序列组成的环形rna分子。circrna没有5’和3’端，不易被rna酶降解，因此比线性rna更稳定。circrna大量存在于真核细胞的细胞质中，具有组织、时序和疾病特异性。
[0145]
本研究首先通过高通量测序发现ami血浆外泌体中的circrna表达谱与对照组相比明显不同，以|log2(fold change)|》1，q-value《0.001为标准，筛选到ami血浆外泌体中差异表达的circrnas 893个，表达上调118个，表达下调775个，说明ami时循环外泌体对circrna的包装具有选择性，能够作为ami生物标志物。
[0146]
接下来我们挑选了在circbase数据库中有注释、表达量高、升高倍数明显的5个外泌体circrna在小样本量中用rt-pcr的方法进行了验证。结果显示，外泌体hsa_circ_0001535、外泌体hsa_circ_0000972和外泌体hsa_circ_0001558的检测结果与测序结果一致，且在小样本队列中，外泌体hsa_circ_0001558在ami组中升高的倍数最高，诊断ami的roc曲线下面积最大(如图5所示)，因此将其在更大样本量中进行了验证。
[0147]
外泌体hsa_circ_0001558在更大样本量患者中验证的结果与小样本量验证结果一致，其在ami患者血浆外泌体中的表达较nccp组的确显著升高，为nccp组的4.45倍，其诊断ami的roc曲线下面积为0.793(如图6所示)。
[0148]
ami根据其心电图特征，可将其分为st-ami与nst-ami心肌梗死。因此，我们进一步在大样本量队列中分析了外泌体hsa_circ_0001558在st-ami和nst-ami患者中的表达水平。结果显示，外泌体hsa_circ_0001558在nccp、st-ami和nst-ami血浆外泌体中的表达水平逐渐升高，其诊断nst-ami的roc曲线下面积为0.72，其诊断st-ami的roc曲线下面积为0.831(如图7所示)。外泌体hsa_circ_0001558位于5号染色体上，长328nt，可以在血小板、k562细胞、血管内皮细胞等组织/细胞中检测到。
[0149]
ami循环外泌体中circrna的表达谱与对照相比显著不同，外泌体hsa_circ_0001558在nccp、st-ami和nst-ami血浆外泌体中的表达水平逐渐升高，能够作为ami诊断生物标志物。
[0150]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。