一种柱状黄杆菌毒力蛋白在病原检测和弱毒株制备中的应用的制作方法

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‑‑
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技术实现要素：

13.本发明的目的是提供柱状黄杆菌毒力蛋白在细胞裂解中的应用，所述的柱状黄杆菌毒力蛋白的氨基酸序列为seq id no.1或seq id no.3所示。
14.本发明的另一个目的在于提供了柱状黄杆菌毒力蛋白的抗体，在制备柱状黄杆菌检测试剂中的应用，所述的抗体为以抗原为knlkqesihdgpkse的多肽制备的抗体。
15.本发明的还有一个目的在于提供了通过敲除柱状黄杆菌毒力蛋白获得的柱状黄杆菌弱毒株。
16.本发明最后一个目的在于提供了柱状黄杆菌弱毒株的应用。
17.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：
18.柱状黄杆菌毒力蛋白的获得：根据目前已经公开了62株柱状黄杆菌全基因组序列，结合柱状黄杆菌的感染特征进行筛选，最终发现cytolysin为毒力基因，其包含两个同源基因ctl1和ctl2，这两个基因对应的蛋白对细胞均具有明显裂解效果。所述的黄杆菌毒力蛋白ctl1的氨基酸序列为seq id no.1所示，编码该蛋白的基因序列为seq id no.2所示；所述的黄杆菌毒力蛋白ctl2的氨基酸序列为seq id no.3所示，编码该蛋白的基因序列为seq id no.4所示。
19.黄杆菌毒力蛋白在细胞裂解中的应用，所述的黄杆菌毒力蛋白的氨基酸序列为seq id no.1或seq id no.3所示。
20.柱状黄杆菌毒力蛋白的抗体在制备柱状黄杆菌检测试剂中的应用，包括利用本领域的常规方式，以柱状黄杆菌毒力蛋白或其核心抗原表位为抗原，制备的单抗或多抗，用于柱状黄杆菌检测。
21.以上所述的应用中，优选的，所述的抗体为以抗原为knlkqesihdgpkse的多肽制备的抗体。
22.通过本领域的常规方式，敲除柱状黄杆菌毒力蛋白(seq id no.1和/或seq id no.3所示)获得的柱状黄杆菌弱毒株也属于本发明的保护范围。
23.柱状黄杆菌弱毒株的应用，所述的应用包括但不限于用于制备成柱状黄杆菌弱毒疫苗。
24.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
25.1.首次在柱状黄杆菌这一鱼类病原中筛选到毒力蛋白cytolysin。发现其编码基因为ctl1和ctl12，所编码的蛋白可裂解鱼类细胞。
26.2.首次在柱状黄杆菌中成功缺失了两个毒力基因cytolysin1(ctl1)和/或cytolysin2(ctl12)，以便从事柱状黄杆菌研究的人员能快速且深入研究其致病机制。
27.3.首次实现了对柱状黄杆菌的毒力基因cytolysin的原核表达和抗体制备，为制备柱状黄杆菌检测制剂提供支持。
28.4.首次将柱状黄杆菌cytolysin缺失突变株，在材料鱼的鱼体上开展毒力试验，进一步证明cytolysin对材料鱼具有毒性，为开发弱毒疫苗株奠定了基础。
29.5.首次以cytolysin缺失突变株为候选疫苗株，开展免疫保护测试，取得一定的保护效果。
附图说明
30.图1为cytolysin1和cytolysin2原核表达蛋白感染鱼类细胞系示意图。
31.图2为cytolysin抗体western blot检测细菌结果示意图；
32.其中泳道m为marker，wt为黄杆菌强毒株野生型为g4株，δctl1δctl2为ctl1和ctl2双基因缺失株。
33.图3为cytolysin1和/或cytolysin2基因缺失突变株感染材料鱼结果示意图。
34.图4为cytolysin1和/或cytolysin2基因缺失突变株免疫材料鱼后，再行人工感染结果示意图。
具体实施方式
35.下面结合附图及实施例子对本发明作进一步说明，但并不作为对本发明权利范围的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。
36.本发明实施例所用的柱状黄杆菌强毒株野生型为g4株(difference in genes between a high virulence strain g
4 and a low virulence strain g
18 of flavobacterium columnare by using suppression subtractive hybridization.li n,zhang j,zhang lq,nie p.j fish dis.2010may；33(5):403-12.doi:10.1111/j.1365-2761.2009.01132.x.epub 2010jan 24.)。实施例中所涉及的基因缺失突变株是在g4株中，进行基因缺失突变获得的菌株。
37.实施例1：
38.柱状黄杆菌毒力蛋白的获得：
39.根据目前已经公开的62株柱状黄杆菌全基因组序列，结合柱状黄杆菌的感染特征，筛选出可能的毒力基因。通过体外表达和亲和纯化的方式，获得这些基因的外源表达蛋白。分别用这些蛋白与鱼类细胞共孵育以检测其毒力。结果发现仅有具备巯基活化细胞毒
素家族(thiol-activated cytolysin superfamily)结构域的蛋白cytolysin能引起鱼类细胞病变。经过对比这两条cytolysin的编码序列ctl1和ctl2，发现虽然两者序列高度相似，也具备相同的结构域(thiol-activated cytolysin superfamily)，但只有ctl2的原核表达蛋白对细胞具有明显裂解效果，所述的ctl1的氨基酸序列为seq id no.1所示，编码该蛋白的基因序列为seq id no.2所示；所述的ctl2的氨基酸序列为seq id no.3所示，编码该蛋白的基因序列为seq id no.4所示。
40.实施例2：
41.柱状黄杆菌ctl1和ctl2基因原核表达蛋白的毒力检测，具体方法包括：
42.(1)原核表达纯化ctl1和ctl2蛋白
43.将ctl1蛋白的25-558aa区域和ctl2蛋白的23-558aa区域分别克隆至pgex-4t-ab1载体，将表达质粒转入大肠杆菌rosseta(de3)菌株中。将携带表达质粒的菌株在16℃诱导表达16h，进行破碎处理。取破碎后上清进行纯化并酶切，去掉gst标签后，去内毒素备用。
44.(2)制备毒力蛋白cytolysin的多克隆抗体
45.选择毒力蛋白cytolysin抗原表位合成多肽(knlkqesihdgpkse)，制备兔多克隆抗体。将免疫后的兔血清进行亲和纯化后，获得柱状黄杆菌cytolysin的多克隆抗体。
46.(3)将细胞接种至24孔板
47.将鲤科鱼类上皮细胞系epc按照3-3.5
×
105个/孔接种于24孔板中，28℃静置过夜培养，以形成单层细胞。
48.(4)用纯化后的蛋白刺激鱼类细胞系
49.取0.6μg纯化后的ctl1蛋白和ctl2蛋白分别用150μl m199培养基稀释后备用，另外取0.6μg纯化后的ctl1蛋白和ctl2蛋白分别与cytolysin的抗体混合孵育5min后(对照组，即证明这种裂解作用，确实是用蛋白引起，而不是由溶解蛋白的缓冲液所引起的)，再分别用150μl m199培养基稀释后备用。
50.用移液器将24孔板中的细胞培养基上清吸弃，实验组每孔加入上述稀释后的蛋白溶液或蛋白抗体复合物溶液，对照孔加入150μl m199培养基，28℃静置孵育30min。
51.孵育结束后，在各孔中加入1μl pi后，在荧光显微镜下各孔细胞的破裂情况。
52.结果如图1所示，毒力因子原核表达并经过去内毒素纯化后，ctl2蛋白对细胞具有显著的毒性(图1中c)，ctl1蛋白也对细胞有毒性，但毒性比ctl2蛋白低(图1中a)。两种蛋白的毒性可通过制备的多克隆抗体中和减弱(图1中b、d、e)。
53.实施例3:
54.柱状黄杆菌弱毒株的构建：
55.(1)将ctl1基因的开放阅读框编码的起始密码子及其上游的序列(共2084bp)克隆至柱状黄杆菌自杀质粒pms75的psti和sali酶切位点，再将该基因orf的终止密码子及其下游序列(共1989bp)克隆至自杀质粒pms75的bamhi和sali酶切位点。最终形成用于ctl1基因缺失的自杀质粒pnl-73。
56.(2)采用相同方法，将ctl21基因的起始密码子及其上游的序列(共2069bp)克隆至自杀质粒pms75的bamhi和sali酶切位点，再将该基因orf的终止密码子及其下游序列(共2011bp)克隆至自杀质粒pms75的sali和psti酶切位点。最终形成用于ctl2基因缺失的自杀质粒pnl-65。
57.(3)将上一步获得的基因敲除质粒转化到能用于接合转移的大肠杆菌(escherichia coli)菌株中(sm10、s17-1λ等均可)。筛选阳性菌株培养至对数生长期，离心收集菌体。用shieh液体培养基将柱状黄杆菌培养至对数生长期，收集菌体。两种菌体经不含抗生素的shieh液体培养基分别洗涤两次。再用无抗的shieh培养基重悬，并将悬液滴至shieh固体培养基上。将该平板在28℃静置培养20-24h。
58.(4)筛选在柱状黄杆菌中发生两次同源重组的菌株
59.用玻棒刮取已完成接合转移的细菌混合物，涂布至含抗生素的shieh平板，28℃静置培养至有菌落长出。该菌落即为完成第一次同源重组的菌株。
60.将这些菌株分别接种在无抗shieh液体培养基中过夜培养，将菌液涂布于含10％蔗糖的shieh平板。在28℃静置培养24-48h，选择单菌落分别在含四环素和不含四环素的shieh平板上划线培养。选取只能在无四环素的shieh平板上生长的该菌株即可获得经过两轮同源重组的细菌。
61.(5)缺失突变株筛选和确认
62.将经过两轮同源重组的细菌接种至液体shieh培养基中，振荡培养至对生生长期。在待缺失dna区域的序列的上游和下游分别选择一段序列作为正向和反向引物，菌液pcr方法检测经过两轮同源重组的细菌，以相同方法检测野生型菌株基因组为对照。若扩增获得的片段，与野生型菌株基因组中扩增得到序列大小相同，表明细菌经过两轮同源重组后恢复了野生型；不能用于后续测试。若扩增得到的片段，与突变株基因组中的对应序列大小，表明该菌株毒力基因已发生缺失突变，选取菌株用于毒力检测和免疫测试。分别将在野生型g4中敲除了ctl1基因的δctl1突变株命名为fcg-67，将敲除了ctl2基因的δctl2突变株命名为fcg-60。
63.ctl1突变株的检测引物序列为：
64.pr164：5
’–
aactatttaaaattctttatatta
–3’
65.pr157：5
’–
taaatggtgtaataaatgtttttgaa
–3’
66.扩增产物片段大小：2046bp表明回复野生型；372bp表明ctl1基因已被成功缺失突变。ctl2突变株的检测引物序列为：
67.pr141：5
’–
caaattagagaaagggctaaat
–3’
68.pr149：5
’–
ggctgtctgaagaggttataa
–3’
69.扩增产物片段大小：2147bp表明回复野生型；476bp表明ctl2基因已被成功缺失突变。
70.以fcg-60菌株为背景，按照上述步骤将ctl1基因的缺失突变质粒pnl-73转入fcg-60中，经过两轮同源重组和pcr检测的方法，筛选在fcg-60中敲除了ctl1基因的菌株。该菌株即ctl1和ctl2均被敲除了的双缺失突变株δctl1δctl2，将其命名为fcg-66。该过程所涉及的pcr检测引物如下：
71.pr164：5
’–
aactatttaaaattctttatatta
–3’
72.pr157：5
’–
taaatggtgtaataaatgtttttgaa
–3’
73.扩增产物片段大小：2046bp表明回复野生型；372bp表明在fcg-60菌株中，ctl1基因已被成功缺失突变，最终形成了ctl1和ctl2基因双缺失突变株。
74.实施例4：
75.柱状黄杆菌cytolysin抗体在细菌检测中的应用，具体方法包括：
76.本例以western blot方法为例来阐述毒力蛋白cytolysin多克隆抗体在柱状黄杆菌检测药物中的应用：
77.将柱状黄杆菌野生型g4株和双缺失突变株fcg-66株分别培养至对数生长期。
78.样品制备：取1ml菌液离心收集菌体，重悬于5
×
loading buffer，沸水浴15min。
79.电泳及转膜：将样品经sds-page胶电泳分离，采用湿转法将蛋白转移至pvdf膜。
80.封闭：用终浓度为5％脱脂奶粉tbst溶液室温封闭1h。
81.一抗孵育：根据抗体效价，以1:5000～1:1000的比例将抗体稀释于含1％脱脂奶粉的tbst中，室温孵育1-4h。tbst溶液洗膜4次，每次5min。
82.二抗孵育：以1:1000的比例将hrp标记的羊抗兔抗体稀释于含1％脱脂奶粉的tbst中，室温孵育30min-1h。tbst溶液洗膜4次，每次5min。
83.显色：加入化学发光底物进行显色，待目的带出现终止反应。
84.结果如图2所示，仅野生型菌株有显色条带，双缺失突变株fcg-66株无检出，说明利用本发明抗原制备的抗体特异性良好。
85.实施例5：
86.实施例3制备的柱状黄杆菌毒力ctl1和/或ctl2基因缺失突变株毒力测试。包括以下步骤：
87.(1)培养细菌至对数生长期
88.将柱状黄杆菌野生株、ctl1缺失突变株fcg-67、ctl2缺失突变株fcg-60以及ctl1和ctl2双缺失突变株fcg-66分别培养至对数生长期(od
600
＝0.4-0.5)。以不接种细菌的等体积shieh培养基作为对照。
89.(2)浸泡感染斑马鱼
90.分别将上述各组细菌在250ml温度为28℃的水体中稀释至约0.8
×
105cfu/ml，对照组将等体积的shieh培养基在相应的水体中稀释备用。向各组水体中分别放入10尾健康成年斑马鱼，在28℃浸泡感染1h后，转移至2l的养殖水体中。连续7天观察并记录感染及死亡情况。结果显示，突变株感染鱼体的能力明显下降，受试鱼存活率较野生株提高10-70％。存活率的计算公式：存活率＝(受试斑马鱼总数-7天累计死亡的斑马鱼数量)
×
100/受试斑马鱼总数。
91.表1材料鱼经野生株和突变株感染后的存活率
92.菌株名称g4δctl1δctl2δctl1δctl2存活率10％20％50％80％
93.实施例6：
94.柱状黄杆菌基因缺失突变株在制备柱状黄杆菌弱毒株疫苗中的应用：
95.(1)用ctl1和ctl2基因突变株免疫斑马鱼
96.取500ml温度为28℃的养殖水体，将处于对数生长期的单基因缺失突变株fcg-67、fcg-60和双基因缺失突变株fcg-66分别稀释至约2.5
×
104cfu/ml。同时，将等体积的shieh培养基在相应的水体中作为对照组。向各组水体中分别放入20尾健康成年斑马鱼，28℃浸泡1h后，转移至4l的养殖水体中养殖4周。
97.(2)用强毒株的野生型分别感染各组斑马鱼
98.将柱状黄杆菌强毒株(g4菌株)的野生型培养至对数生长期(od
600
＝0.4-0.5)。按照本例步骤(1)中的方法分别将细菌稀释至约0.8
×
105cfu/ml后，分别将步骤(1)中经过免疫并饲养4周的斑马鱼和对照组的斑马鱼浸泡感染1h，然后转移至4l的养殖水体中养殖一周，观察并记录死亡情况。结果显示，突变株免疫斑马鱼后，鱼体被野生强毒株感染后存活的数量较对照提高约30％。
99.表2经突变株免疫的材料鱼人工感染后的存活率
100.菌株名称对照组δctl1δctl2δctl1δctl2存活率10％10％25％40％