miR-29在骨质疏松中的应用的制作方法

mir-29在骨质疏松中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种新型骨质疏松诊断和治疗方法，具体说，本发明涉及一种基于mir-29为理论基础的骨质疏松检测和相关疾病治疗的新方法，属于基因检测和基因治疗领域。


背景技术：

2.骨质疏松症(osteoporosis，op)是以骨微结构破坏、骨量减少和骨折易发为主要特征的全身系统性骨骼疾病。骨质疏松可发生于各种年龄段。骨质疏松症的疾病范畴包括原发性和继发性二大类。原发性骨质疏松症又分为绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症和特发性骨质疏松(包括青少年型)三种。继发性骨质疏松包括由内分泌系统疾病、结缔组织疾病、慢性肾脏疾病、胃肠疾病和营养性疾病、血液系统疾病、神经肌肉系统疾病、长期制动、器官移植术后以及常期使用糖皮质激素、免疫抑制剂或抗癌药物等疾病因素所引发的骨质疏松。 op被世界卫生组织称为“无声无息的流行病”，据统计全世界约有两亿人患有op，我国患病率显著高于欧美国家。65岁以上中国人群中，约 1/2的女性和1/5的男性存在骨质疏松骨折风险，其中1/4的op髋部骨折病人在患病后一年内死亡，女性更年期骨折的致死率更是与乳腺癌持平，危害十分严重。
3.op的发病机制目前未完全阐明，诊断手段有限。目前骨质疏松患者的诊断往往发生在第一次骨折后的ct检测，但此时，骨质疏松往往已经是中重度，患者治疗后二次骨折的风险极大。临床上用于辅助诊断骨质疏松的标志物有维生素d、胶原降解产物、甲状腺激素以及骨钙素。但是，通过对临床样本的分析发现，这四种标志物与骨质疏松之间的关联性较低。因此，构建可持续临床跟踪的骨质疏松检测方法是目前的技术难题。


技术实现要素：

4.为解决现有骨质疏松检测手段有限和治疗药物匮乏的现状，本发明在第一方面提供了一种用于检测骨质疏松的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测生物样本中的mir-29的检测试剂。
5.本发明在第二方面提供了mir-29在制备用于诊断受试者的骨质疏松的药物或试剂盒中的应用。
6.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
7.使用本发明所述的方法可实现对骨质疏松进展的动态监测和精准预防。
附图说明
8.图1显示了骨量减少和骨质疏松患者膝关节的he染色结果。
9.图2显示了骨量减少和骨质疏松患者膝关节的单位面积内骨小梁数量。
10.图3显示了骨量减少和骨质疏松患者膝关节的mir-29a表达量。
11.图4显示了骨量减少和骨质疏松患者膝关节的mir-29b1表达量。
12.图5显示了骨量减少和骨质疏松患者膝关节的mir-29c表达量。
13.图6显示了骨量减少和骨质疏松患者膝关节的mir-29b2表达量。
14.图7显示了骨量减少和骨质疏松患者外周血中mir-29c表达量。
15.图8显示了骨量减少和骨质疏松患者外周血中mir-29b2表达量。
16.图9显示了骨量减少和骨质疏松患者外周血中mir-29a表达量。
17.图10显示了骨量减少和骨质疏松患者外周血中mir-29b1表达量。
18.图11显示了1,25-二羟基维生素d预测骨质疏松风险的roc曲线表。
19.图12显示了骨钙素预测骨质疏松风险的roc曲线表。
20.图13显示了甲状旁腺激素预测骨质疏松风险的roc曲线表。
21.图14显示了胶原降解产物预测骨质疏松风险的roc曲线表。
22.图15显示了mir-29c预测骨质疏松风险的roc曲线表。
23.图16显示了mir-29a预测骨质疏松风险的roc曲线表。
24.图17显示了mir-29b1预测骨质疏松风险的roc曲线表。
25.图18显示了mir-29b2预测骨质疏松风险的roc曲线表。
具体实施方式
26.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。但是，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.如上所述，本发明在第一方面提供了一种用于检测骨质疏松的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测生物样本中的mir-29的检测试剂。
28.在一些优选的实施方式中，所述检测试剂为用于对生物样本中的 mir-29进行定性检测或定量检测的检测试剂。例如，通过对生物样本例如血液中的mir-29含量的监测，可以对骨质疏松发病风险和预后情况进行预警，以进行针对性前置用药。又例如，可以通过检测生物样本例如骨标本中的mir-29的含量，依据mir-29含量对骨质疏松发病进程和后续预后评估进行预测，作为进行个性化用药的依据。
29.mir-29基因家族有mir-29ab1和mir-29cb2两个初级转录本，分别位于两个不同的染色体上被编码转录，人、大鼠、小鼠间高度保守。因此，对mir-29的定量检测可以检测mir-29ab1和mir-29cb2两个初级转录本在生物样本中的含量。
30.所述mir-29具有mir-29a、mir-29b1、mir-29c、mir-29b2等包括在mir-29基因家族中的亚型。于是，在另一些优选的实施方式中，所述mir-29选自由mir-29a、mir-29b1、mir-29c和mir-29b2等组成的组。
31.在另一些优选的实施方式中，所述生物样品选自由血液、骨、脏器和软组织组成的组。
32.在另一些优选的实施方式中，所述骨质疏松为具有骨微结构破坏、骨量减少和/或骨折发生为特征。
33.在另一些优选的实施方式中，所述骨质疏松为原发性骨质疏松和继发性骨质疏松。
34.在另一些优选的实施方式中，所述原发性骨质疏松选自由绝经后骨质疏松症、老年性骨质疏松症和特发性骨质疏松组成的组。
35.在另一些优选的实施方式中，所述特发性骨质疏松为青少年型骨质疏松。
36.在另一些优选的实施方式中，所述继发性骨质疏松为由内分泌系统疾病、结缔组织疾病、慢性肾脏疾病、胃肠疾病和营养性疾病、血液系统疾病、神经肌肉系统疾病、长期制动、器官移植术后以及常期使用糖皮质激素、免疫抑制剂或抗癌药物所引发的骨质疏松。
37.在另一些优选的实施方式中，所述生物样本为血液，并且以“血液中mir-29亚型与骨质疏松程度呈负相关”作为骨质疏松诊断基准。
38.在另一些优选的实施方式中，所述生物样本为骨组织，并且以“骨组织中mir-29亚型与骨质疏松程度呈正相关”作为骨质疏松诊断基准。
39.本发明在第二方面提供了一种用于诊断或治疗骨质疏松的药物，所述药物含有mir-29、mir-29类似物、或以mir-29为作用靶点的治疗试剂，和药学可接受的载体和/或赋形剂。
40.本发明对所述药物的给药方式或途径没有特别的限制。例如，所述药物的给药方式包括全身给药方式和局部给药方式。但是优选的是，所述全身给药方式为口服给药和/或静脉注射给药。另外优选的是，所述局部给药方式为以骨科相关植入材料的药物涂层进行局部给药的方式。
41.本发明对所述药物的剂型没有特别的限制。但是，在一些优选的实施方式中，所述药物的剂型选自由片剂、胶囊、缓控释和针剂组成的组。另外可选的是，所述药物为靶向制剂和/或局部制剂。
42.本发明在第三方面提供了mir-29在制备用于诊断受试者的骨质疏松的药物或试剂盒中的应用。
43.在一些更优选的实施方式中，所述药物或试剂盒将mir-29作为骨质疏松的生物标志物例如作为预警标志物来使用。
44.在另一些优选的实施方式中，所述药物或试剂盒利用mir-29来诊断：(1)所述受试者是否患有骨质疏松；和/(2)所述受试者的骨质疏松的进展程度；或(3)所述受试者在针对骨质疏松进行的治疗后的预后评估。
45.在另一些优选的实施方式中，所述药物或试剂盒用于在常规体检或者特定受试者群体体检中并且将mir-29作为骨质疏松的生物标志物。优选的是，所述诊断以“血液中mir-29亚型与骨质疏松程度呈负相关”作为骨质疏松诊断基准或以“骨组织中mir-29亚型与骨质疏松程度呈正相关”作为骨质疏松诊断基准。
46.本发明对受试者没有特别的限制。例如，所述受试者可以是哺乳动物。优选的是，所述受试者是人。
47.骨质疏松症是由于多种原因导致的骨微结构破坏、骨量减少和骨折易发为主要特征的全身性骨骼疾病。本发明针对现阶段骨质疏松预警指标有限和治疗药物匮乏的困境，发现了可以以mir-29作为生物标志物或作用靶点，来对骨质疏松进行诊断和治疗。于是，本发明以mir-29为基础，开发出一种新型的骨骼系统疾病预警监测和治疗方法，例如，可以通过对生物样本中mir-29例如mir-29含量进行检测或者甚至监测，从而实现对骨质疏松发病进程的预测，可筛选骨质疏松高危人群，并进行有针对性的治疗。还可以通过对生物样本中
mir-29例如mir-29含量进行检测甚至监测，从而对骨质疏松患者的发病进程或针对骨质疏松实施了治疗之后的患者的预后情况进行评估等。此外，还可以使用mir-29类似物或者以mir-29为靶点研发的相关药物，可有效提高骨骼重塑性，治疗骨质疏松。而且，还可以考虑将mir-29检测作为常规体检项目或者针对特殊群体例如骨质疏松患者高危人群进行附加体检项目，以受检的受试者的骨质疏松情况进行预判、诊断、筛选和评估。
48.实施例
49.下面结合实施例对发明做进一步详细、完整地说明，但并不限制本发明的内容。
50.实施例1
51.收集接受膝关节置换手术的关节标本，使用pfa固定过夜。用edta脱钙液对样本脱钙，脱钙结束后，将样本包埋在蜡块中，切片，he染色。通过比较发现，骨质疏松病人的骨小梁数量明显少于骨量减少病人的骨小梁数量(图1和2)。
52.实施例2
53.收集接受膝关节置换手术的关节标本，于液氮中保存。将标本进行研磨，使用trizol提取检测标本中的rna，使用rt-pcr检测mir-29a/b1/c/b2的含量。结果发现，骨质疏松病人的膝关节中mir-29各亚型的表达量均明显低于骨量减少病人的表达量(图3、4、5和6)。
54.实施例3
55.为防止rna降解，将全血收集到paxgene血液rna管中进行后续检测。然后，用paxgene血液rna试剂盒浓缩和纯化总rna。简而言之，将从初始离心中收集的球团孵育在含有蛋白酶k的优化缓冲液中以消化蛋白质。55℃孵育10min后，悬液转入paxgeneshredderspin柱(psc)匀浆细胞裂解液，去除残留的细胞碎片。在上述上清液中加入乙醇调整结合条件后，将裂解液应用于paxgenerna旋转柱(prc)。在离心步骤中，rna选择性地结合到paxgene柱的硅胶膜上，作为污染物通过。剩余的污染物通过几个有效的清洗步骤被除去。在第一个和第二个洗涤步骤之间，用dnasei(rnfd)处理膜以去除痕量结合的dna。洗涤步骤完成后，rna在洗脱缓冲液中洗脱并热变性，为后续检测做好准备。接着，使用rt-pcr对入组的24位骨质疏松病人的外周血中的mir-2929a/b1/c/b2的含量进行测试。结果发现，骨质疏松病人外周血中的mir-2929a/b1/c/b2显著低于骨量减少病人。(图7和8)
56.实施例4
57.维生素d是一种脂溶性类固醇激素前体，主要由皮肤光照后产生。维生素d本身无生物活性，必须在肝脏和肾脏经过两部连续的羟基化过程成为有生物活性的1,25-二羟基维生素d。维生素d是维持骨骼健康的主要元素。其含量低与骨密度低有关，因此临床常用来帮助判定骨代谢。收集入组病人的外周血，离心得到血清，使用25-羟基维生素d检测试剂盒(电化学发光法，德国罗氏)测量入组的24位骨质疏松病人的血液的25-羟基维生素d含量。具体步骤如下：通过预处理试剂1和2与15μl样本一起孵育，释放出与维生素d结合蛋白结合的25-羟基维生素d；通过将欲处理的标本和钌标记的维生素d结合蛋白一起孵育，25-羟基维生素d和钌标记的微生物d结合蛋白形成复合物；添加链霉亲素包被的磁珠微粒和生物素标记的25-羟基维生素d后，钌标记的维生素d结合单倍空白位点被占据，随后形成一种由钌标记的维生素d结合蛋白和生物素化25-降级维生素d生物素构成的复合物。然后整个复合物在生物素和链霉亲和素的相互作用下结合到固相载体上。将反应液吸入测量池中，
通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物质通过procell/procell m被去除。给电极加以一定的电压，使复合体化学发光，并通过光电倍增器测量发光强度。测试结果使用graphpad分析，其roc曲线表明，25-羟基维生素d对骨质疏松患者进行预测的敏感性为0.5556。(图11)。
58.实施例5
59.骨钙素是骨基质中最重要的一种特异性非胶原蛋白，是古特异性的依赖于维生素k发挥作用的钙结合蛋白。骨钙素在骨形成过程中由成骨细胞生成，此过程依赖于维生素k，同时维生素d3有促进骨钙素生成的作用。成骨细胞产生的骨钙素一部分被吸收成为骨基质的组成部分，一部分被释放进入外周血循环。因此，血清(或血浆)中骨钙素的含量与各种骨代谢疾病的骨转换效率变化相关，如骨质疏松症。收集入组病人的外周血，离心得到血清，使用骨钙素检测试剂盒(电化学发光法，德国罗氏)测量入组的24位骨质疏松病人的血液的骨钙素。测试结果使用graphpad分析，其roc曲线表明，骨钙素对骨质疏松患者进行预测的敏感性为0.6830。(图12)。
60.实施例6
61.甲状旁腺激素是甲状腺内合成并分泌到血液中。甲状腺旁激素联合维生素d和降钙素动员骨骼系统钙和磷，促进小肠对钙的吸收和增加肾脏对磷的排泄。甲状旁腺激素和降钙素的相互作用确保血钙浓的稳定。高钙浓度抑制甲状旁腺激素分泌，低血钙浓度则促进甲状旁腺激素分泌。临床中可通过检测甲状旁腺激素水平来提示骨质疏松进展。收集入组病人的外周血，离心得到血清，使用游离甲状腺素测定试剂盒(电化学发光法，德国罗氏)测量入组的24位骨质疏松病人的血液的甲状旁腺激素。具体步骤为：50μl标本、生物素话的抗pth单克隆抗体和ru标记的抗体混匀，形成夹心复合物；加入链霉亲和素报备的微粒，让上述形成的复合物同坐生物素与亲和素的反应结合到微粒上；反应混合液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。将测试结果使用graphpad分析，其roc曲线表明，甲状腺激素对骨质疏松患者进行预测的敏感性为(图13)。
62.实施例7
63.骨基质的有机成分中，90％是由i型胶原组成的。在正常的骨代谢过程中，骨基质进行着有序的合成，同时也被分解成碎片释放进入血液中，并从肾脏排出。通过检测骨吸收指标，可了解骨转换的程度，在生理性和病理性(如年老或骨质疏松症)骨吸收增强时，i型胶原的降解也增高，相应的分解片段在血中的含量随之升高。检测血清c端肽可用于监测骨质疏松症或其他骨疾病的抗吸收治疗。收集入组病人的外周血，离心得到血清，使用β-胶原特殊序列检测试剂盒(电化学发光法)测量入组的24位骨质疏松病人血液中的胶原降解产物。将测试结果使用graphpad分析，其roc曲线表明，胶原降解产物对骨质疏松患者进行预测的敏感性为(图14)。
64.实施例8
65.使用graphpad分析实施例4中24位骨质疏松病人的外周血中的 mir-29c数据，其roc曲线表明，使用mir-29亚型对骨质疏松患者进行预测的敏感性为79％(图15)。
66.实施例9
67.使用graphpad分析实施例4中24位骨质疏松病人的外周血中的 mir-29a数据，其
roc曲线表明，使用mir-29亚型对骨质疏松患者进行预测的敏感性为79％(图16)。
68.实施例10
69.使用graphpad分析实施例4中24位骨质疏松病人的外周血中的 mir-29b1数据，其roc曲线表明，使用mir-29亚型对骨质疏松患者进行预测的敏感性为79％(图17)。
70.实施例11
71.使用graphpad分析实施例4中24位骨质疏松病人的外周血中的 mir-29b2数据，其roc曲线表明，使用mir-29亚型对骨质疏松患者进行预测的敏感性为79％(图18)。
72.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。