一种血肽螯合物的制备方法与流程

1.本发明涉及一种血肽螯合物的制备方法，属于动物血深加工技术领域。


背景技术：

2.小肽螯合物是微量或常量元素与和活性肽通过配位键结合形成的具有环状结构的螯合物，是一种新型的微量元素添加剂或常量元素强化剂。可以在食品行业及宠物饲料中用作食品添加剂或营养强化剂。但是由于其存在大量无机酸根，易形成沉淀影响钙等金属元素的吸收。
3.动物血尤其是血细胞中富含蛋白质、维生素、多种微量元素等多种有效成分，具有预防贫血、降低胆固醇、抗衰老和提高免疫力等多方面的作用。因此血多肽可以作用添加剂或营养强化剂应用于食品或药品中。但是动物血肽的研究主要集中在sod、抗氧化肽、降血压肽等活性成分的提取、制备等，而对活性肽螯合物的研究相对较少，且传统制备方法螯合率低、成本高、分子量无法控制，大大限制了血肽及其螯合物在食品、宠物食品、功能性食品或医药领域的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决上述问题，提供了一种血肽螯合物的制备方法。
5.本发明采用如下技术方案：一种血肽螯合物的制备方法，包括如下步骤：（1）血红蛋白提取：新鲜动物血液加入抗凝剂后离心收集沉淀，均质化处理后收集上清血红蛋白，得到质量浓度为10-20%的血红蛋白溶液；（2）粗肽制备：在血红蛋白溶液中加入酶并加热至45-55℃进行酶解，酶解时间为4-6h，酶解完成进行灭酶处理；（3）粗肽分离提纯：将步骤（2）中酶解液于4℃下离心分离收集上清液，20nm的纳滤膜过滤，得到多肽液；（4）螯合物制备：在鳌合前对多肽溶液进行超声预处理，向步骤（3）中的多肽液中加入鳌合配体，鳌合配体占多肽溶液的质量比5-15%，鳌合反应结束浓缩后喷雾干燥得到动物血鳌合肽。
6.进一步的，所述步骤（2）中所述酶由地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶和米曲霉复合风味蛋白酶按质量比3-5:4-3:4-3混合组成。
7.进一步的，所述步骤（2）中酶的添加量为血红蛋白溶液质量的3-10
‰
。
8.进一步的，所述步骤（3）中离心分离条件为：离心温度4-5℃，离心转速3500-4500g，离心时间10-15min。
9.进一步的，所述步骤（2）中灭酶条件为：灭酶温度90-95℃，灭酶时间10-15min。
10.进一步的，所述鳌合配体为氯化钙时，将多肽溶液调整ph至 7-9，加入多肽溶液质量5%的cacl2.2h2o在40-45℃搅拌60-70min得到动物血螯合物。
11.进一步的，所述鳌合配体为硫酸铁时，将多肽溶液调整ph至 4-5，加入多肽溶液质
量8%的feso4.7h2o在37℃搅拌35-40min得到动物血螯合物。
12.进一步的，所述鳌合配体为硫酸锌时，将多肽溶液调整ph4-5，加入多肽溶液质量15%的znso4.7h2o，在30℃搅拌50-60min得到动物血螯合物。
13.进一步的，所述超声处理条件为：超声频率20khz，超声功率200w，超声时间5-20 min，超声温度45℃-55℃，超声工作时间为10-20 s，停歇时间为5-10s。
14.在本技术方案中采用地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶和米曲霉复合风味蛋白酶复配的三酶对血红蛋白进行酶解，以地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶为内切酶，使血红蛋白水解成肽段，从肽链内部再将多肽进一步水解成分子量较小的肽段，以米曲霉复合风味蛋白酶为外切酶，以多肽为底物从肽链末端水解肽段，进一步降低肽链长度，并能有效降低苦味、改善风味。三种酶复配可以实现对血红蛋白进行多位点酶解，提高血肽的提取率，并能降低血肽的分子量，有利于提高其生物利用度；同时还能缩短酶解时间，有效避免单酶酶解不彻底及苦味较重、风味不足的情况。
15.本发明的有益效果：制备方法简单，不产生任何有毒有害物质，反应条件温和、操作简单，能够有效提高动物血液的利用价值，在鳌合过程中采用超声预处理能够使多肽结构展开，暴露出结合位点，有利于螯合反应的进行，提高多肽的螯合率，制备得到的血肽鳌合物能用于宠物食品、保健食品等领域，从而实现多肽和微量元素或常量元素的同时补充。
附图说明
16.图1是本发明实施例1的血肽螯合物的紫外光谱图。
17.图2是本发明实施例2的血肽螯合物的红外光谱图。
18.图3是本发明实施例1的血肽螯合物的扫描电镜图像。
19.图4是本发明实施例1的血肽螯合物的xrd图。
具体实施方式
20.下面将结合具体实施例对本发明进行进一步的解释和说明。
21.本发明实施例中所使用的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶和米曲霉复合风味蛋白酶均外购于诺维信（中国）生物技术有限公司。
22.实施例1：取100 kg新鲜猪血经抗凝、除杂后，以3000g 离心15min，收集沉淀血细胞。加水搅拌均匀将血细胞浓度调至20%左右使细胞溶胀，同时进行均质化处理40min；3000g 离心10min，收集上清液血红蛋白。在血红蛋白溶液中加入4
‰
碱性蛋白酶、3
‰
中性蛋白酶和3
‰
复合风味蛋白酶进行酶解，酶解时间5 h，酶解结束将温度升至95℃保持15min进行灭酶，得到酶解液，将酶解液采用4000g 的管式离心机离心10min，上清再采用20nm的纳滤膜过滤纯化，将纳滤液超声处理5min，超声工作条件为工作时间为10s，停歇时间为5s，超声温度为55℃，频率20khz，功率200w。待ph调整为8后再加入5%的cacl2.2h2o，在45℃条件下以40rpm的转速搅拌70min得到鳌合液，螯合液浓缩后喷雾干燥，得到所述的动物血肽螯合物。
23.实施例2：取100 kg新鲜抗凝鸡血，以3000g 离心15min，在沉淀中加入5倍体积的水搅拌40min， 3000g 离心10min，得到血红蛋白溶液，加入4
‰
碱性蛋白酶、3
‰
中性蛋白酶和3
‰
复合风味蛋白酶进行酶解，酶解时间6 h，酶解结束将温度升至95℃保持15min进行灭
酶，得到酶解液，将酶解液采用4000g 的管式离心机离心10min，上清采用20nm的纳滤膜过滤纯化后超声处理15min，超声工作条件为工作时间为10-20s，停歇时间为5-10s，超声温度为55℃，频率20khz，功率200w。然后将其ph调整为4.5后加入8%的feso4.7h2o，在37℃条件下以40rpm的转速搅拌40min得到螯合液，螯合液浓缩后喷雾干燥，得到所述的动物血肽螯合物。
24.实施案例3：步骤同实施例2取新鲜鸡血提取血红蛋白后，加入4
‰
碱性蛋白酶、3
‰
中性蛋白酶和3
‰
复合风味蛋白酶进行酶解，酶解时间5 h，酶解结束将温度升至95℃保持15min进行灭酶，得到酶解液，将酶解液采用4000g 的管式离心机离心10min，上清再采用20nm的纳滤膜过滤纯化后超声处理10min，超声工作条件为工作时间为10-20 s，停歇时间为5-10s，超声温度为55℃，频率20khz，功率200w。然后将其ph调整为4后向所得纳滤液中加入15%的znso4.7h2o，在30℃条件下以40rpm的转速搅拌60min得到螯合液，螯合液浓缩后喷雾干燥，得到所述的动物血肽螯合物。
25.对比例1：取100 kg新鲜抗凝鸡血，以3000g 离心15min，在沉淀中加入5倍体积的水搅拌40min， 3000g 离心10min，得到血红蛋白溶液，加入2
‰
碱性蛋白酶和3
‰
复合风味蛋白酶进行酶解，酶解时间5 h，酶解结束将温度升至95℃保持15min进行灭酶，得到酶解液，将酶解液采用4000g 的管式离心机离心10min，上清再采用20nm的纳滤膜过滤纯化，超声处理15min后将ph调整为7后并加入5%的feso4.7h2o，在37℃条件下以40rpm的转速搅拌40min得到螯合液。螯合液浓缩后喷雾干燥，得到所述的动物血肽螯合物。
26.对比例2：同对比例1取新鲜鸡血提取血红蛋白后，加入4
‰
碱性蛋白酶、3
‰
中性蛋白酶和3
‰
复合风味蛋白酶进行酶解，酶解时间5 h，酶解结束将温度升至95℃保持15min进行灭酶，得到酶解液，将酶解液采用4000g 的管式离心机离心10min，上清再采用20nm的纳滤膜过滤纯化后不经超声处理直接将ph调整为4后向所得纳滤液中加入15%的znso4.7h2o，在30℃条件下以40rpm的转速搅拌60min得到螯合液。螯合液浓缩后喷雾干燥，得到所述的动物血肽螯合物。
27.实施例1-3中的提取率如表1所示。
28.表1
注：提取率=血肽的质量/血红蛋白的质量；钙螯合率=螯合肽钙的质量/添加的钙源中钙的质量；亚铁螯合率=螯合肽亚铁的质量/添加的铁源中亚铁的质量从表1中可以看出，本发明制备的血肽的提取率达到67.2%以上，得到的血肽的分子量小，低于1000道尔顿的肽含量达到76.8%以上，而对比例1所制备的血肽的提取率低且分子量分布范围广。本发明实施例1制备的鸡血肽与钙的螯合率高达77.5%，实施例2中的螯合率为73.2%，均显著高于对比例中的血肽螯合率。
29.对实施例1和2得到的血肽螯合物进行检测，分别进行紫外光谱、红外光谱和sem扫描电镜以及x-衍射分析。
30.1.紫外光谱测定：分别取约2mg的血肽及血肽螯合物冻干粉放入傅里叶变换红外光谱仪zx-27 型号-nicolet is50测定台上，在波长为 4000~525 cm-1
的范围内对其进行扫描，扫描32次，分辨率为4 cm-1
，得到紫外光谱图，如图1所示。
31.由图1可知，多肽及其螯合物均在260nm附近出现了另一吸收峰，这可能是由于多肽中的芳香族氨基酸构象变化所引起的紫外吸收特性；鸡血粗肽在195nm处出现最大吸收峰，与钙子螯合后，cp-ca的最大吸收峰发生了蓝移至193nm处，与亚铁离子螯合后cp-fe的最大吸收峰发生了蓝移至191nm处，且螯合物的吸收强度低于多肽，表现为减色效应。由此推测血肽与钙离子/亚铁离子发生了螯合反应，且可能涉及助色基和生色基（-co、-cooh、-oh、-nh2）手性的变化。
32.2. 红外光谱分析：分别取约2mg的血肽及血肽螯合物冻干粉放入傅里叶变换红外光谱仪zx-27 型号-nicolet is50测定台上，在波长为 4000~525 cm-1
的范围内对其进行扫描，扫描32次，分辨率为4 cm-1
，得到红外光谱图，如图2所示。
33.由图2可知，一般认为3080 cm-1
附近是多肽的特征吸收峰，鸡血多肽在2956.83 cm-1
处出现了吸收峰，说明鸡血多肽具有一般多肽特性，在多肽中对应于酰胺键的c=o（酰胺ⅰ带）1和n-h（酰胺ⅱ带）的特征峰为1640 cm-1
和1515 cm-1
。
34.与亚铁螯合后，酰胺ⅰ带和酰胺ⅱ带的吸收峰分别转移到1646 cm-1
和1541 cm-1
。1400 cm-1
附近为羧基伸缩振动引起的吸收峰，鸡血多肽在1389.68 cm-1
处出现特征吸收峰，螯合亚铁后吸收峰发生明显蓝移至1405.21 cm-1
，可以推测有-coo-fe
2
的形成。在指纹区，多肽出现了多个吸收峰的变化，这可能是由于c-h和n-h键的弯曲振动引起的。与钙配位螯合后，酰胺ⅱ带的吸收峰发生蓝移，位移到1555 cm-1
，这表明多肽与钙螯合后电子云密度增强、频率升高，推测酰胺键中的n-h（氨基）可能参与了肽钙螯合，多肽在1389.68 cm-1
处-coo-的特征峰蓝移至1404.14 cm-1
且吸收峰减弱，说明钙离子和羧基发生了结合。在指纹区，多肽在1245、1061、处的吸收峰在与钙离子螯合后分别位移至1241、1080处，此类吸收峰的偏移可能是由于羰基氧和钙离子螯合而形成-cooca导致的及c-h和n-h键的弯曲振动引起的，鸡血多肽在624 cm-1
出现的吸收峰在钙螯合物中小时，可以推测螯合无中可能形成了n-ca结构。
35.ftir结果表明，cp-fe和cp-ca是不同于肽的新的化合物，证实了血肽与亚铁离子及钙离子之间发生了螯合反应，且与亚铁的螯合反应可能与羧基和酰胺键有关，与钙离子的螯合反应可能与羧基和氨基有关。
36.3. sem扫描电镜：取适量的血肽及血肽螯合物 冻干粉均匀地涂抹于样盘双面胶上，真空喷金镀膜处理后，加速电压为15kv，在1500倍、10000倍扫描电镜下观察样品的显微结构、获取扫描图像，如图3所示。
37.由图3可知，血肽多为表面平滑的片状结构，而cp-ca与cp明显不同，在与钙离子或亚铁离子螯合后，表面平滑的片状结构变成了排列紧密的颗粒结构。
38.4. x-衍射分析：取血肽及血肽螯合物冻干样，用 d2 phaser zx-28 x-射线衍射仪进行分析测定。xrd 的测试条件为：cu靶，滤片镍管电压 40 kv，管电流 40 ma，cu 靶, 滤片镍， 扫描速度 15 deg/min，扫描角度 5~80
°
。结果如图4所示。
39.由图4可知，血肽在衍射角为20.6
°
出现强衍射峰，在衍射角为8.5
°
出现弱衍射峰，是由于多肽混合物的不同结构引起的漫散射，说明鸡血多肽呈无定型状态。与钙离子螯合后，血肽钙螯合物在20.6
°
处的衍射峰明显减弱并位移至22.2
°
，在40.4
°
处出现了新衍射峰，且鸡血多肽钙螯合物的吸收峰本地明显低于鸡血多肽，说明其和鸡血多肽的结构不同；在与亚铁螯合后，鸡血亚铁螯合物在此处的衍射峰强度降低、峰宽变窄且偏移至21.9
°
，同时在38.9
°
处出现1个微弱的衍射峰，表明血肽分别与钙离子及亚铁离子结合形成了新的化合物。