一种大体积液体样品中病原微生物的快速绝对定量方法与流程

1.本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种基于双重纳米限域的快速检测大体积液态样品中微生物的方法。


背景技术：

2.传统的致病菌检测方法主要通过细菌培养来实现定量检测，该方法耗时长且特异性低。随着分子生物学分析技术的发展，以pcr技术和环介导等温核酸扩增技术为代表的基于基因组的核酸分析技术是目前应用最为广泛的致病微生物分析方法，利用对微生物中特定的dna或rna片段进行检测分析，从而获取病原微生物的生化信息。
3.近年来，随着分子生物学技术和微流控技术的不断发展，数字化pcr技术应运而生。数字化pcr技术作为定量分析的突破性技术，可对样品中的核酸数目进行绝对定量。它将pcr技术提升到了一个新的高度，使定量分析的步骤进入了一个新的阶段。
4.现有的数字化pcr技术往往通过设计仪器生成包裹目标基因的微型液滴或通过设计微流控芯片形成微腔室使目标基因分隔开，从而进行目标基因扩增检测，实现绝对定量的检测。
5.同样的，在传统环介导等温核酸扩增技术的基础上，数字化环介导等温扩增技术也得到了快速的发展。相比之下，其在恒温条件即可进行，具有更高的特异性和灵敏度，有望降低检测技术所需的成本，大大缩短检测时间。
6.目前市场上已经推出了各种数字化核酸扩增设备，如基于集成流体电路(ifc)芯片的设备、基于旋转离心圆盘的设备、基于滑动芯片的设备和基于液滴的设备等。这些数字化核酸扩增设备设计成本高，往往无法适应和满足现场或基层检测环境。
7.然而，目前报道的数字化核酸扩增技术检测限都较高，这是因为其只能对超微量样品进行检测(比如2微升)。为了降低检测限，避免假阳性，研究者通常需要对大体积样品进行一系列繁琐前处理如离心、过滤、杂质洗涤、细菌洗脱、dna提取、纯化等步骤，最后再对纯化洗脱后的核酸样品进行数字化扩增检测。该过程不仅繁琐、耗时，而且需要专业人员在专门实验室内，利用大型化仪器进行，无法用于实地快速检测。
8.因此，如何实现大体积液体样品中目标微生物的快速绝对定量，简化样品前处理是本领域技术人员需要解决的问题。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种针对大体积液体样品中致病微生物的直接快速检测，如果汁、啤酒、奶茶、环境水源等液体样品中存在的细菌、病毒微生物，克服现有技术存在的缺陷，实现大体积液体样品中微生物的绝对定量分析。
10.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
11.本发明提供了一种大体积液体样品中病原微生物的快速绝对定量方法，包括以下步骤：
12.(1)利用纳米孔径膜过滤待测液体样品，使目标微生物被截留在滤膜表面，再将滤膜吹干；
13.(2)在截留了目标微生物的滤膜表面贴合上密封小室，往密封小室内加入含有水凝胶单体的环介导等温核酸扩增反应体系，密封；水凝胶单体交联成胶使得反应体系呈胶态覆盖滤膜表面的目标微生物，所述反应体系中含有针对目标微生物dna或rna设计配套的引物；
14.(3)将整个扩增反应体系置于恒温条件下进行核酸等温扩增反应；
15.(4)反应结束后，利用荧光成像技术分析扩增反应体系中出现的荧光信号，计数荧光点，计算得出待测液体样品中目标微生物的绝对定量浓度。
16.所述的待测液体样品可以为液态真实样品或经均浆均质后的液态样品。
17.所述病原微生物可以为细菌，也可以为病毒，具体的，细菌可以为大肠杆菌、沙门氏菌或李斯特菌，也可以是其他菌种。病毒可以为ms2病毒、诺如病毒、非洲猪瘟病毒、新冠病毒等，也可以是其他病毒。
18.当目标微生物的核酸物质为rna时，在反应体系中添加反转录酶，将rna反转录成cdna，进行lamp扩增。
19.本发明将具有纳米孔径的过滤膜与水凝胶反应体系整合，实现目标微生物lamp扩增的双重纳米限域，首先，利用过滤膜过滤使得微生物的初始位置被滤膜上的纳米孔所限定，然后在截留了细菌或病毒的滤膜表面形成水凝胶反应体系，利用水凝胶的三维网状结构作为天然物理分隔的微腔室对微生物进行原位分隔，使得微生物在初始位置开始原位扩增且其扩增后的产物不会扩散出去，最终的结果是单个微生物形成形状鲜明的扩增荧光点，实现绝对定量检测。
20.步骤(1)中，本发明利用纳米孔径膜对液体样品中的目标微生物进行截留，一方面对大体积液态样品中分散的微生物进行富集，另一方面将致病菌定位于纳米孔径膜表面用于下一步的原位核酸扩增反应。
21.所述纳米孔径膜的纳米孔径应非常均匀，且小于细菌、病毒尺寸。作为优选，所述纳米孔径膜为径迹蚀刻膜，其纳米孔径为50～500nm。径迹蚀刻膜是用径迹蚀刻法制备的一种微孔滤膜，孔径分布均匀且数量紧密，过滤过程中，溶液均匀匀速地通过滤膜，合适的孔径保证一个滤孔只截留一个病原微生物，不会造成重叠。
22.更为优选，当目标微生物为细菌时，径迹蚀刻膜的纳米孔径为400nm；当目标微生物为病毒时，径迹蚀刻膜的纳米孔径为100nm。
23.所述的纳米孔径膜的厚度为1～50μm。
24.进一步的，采用过滤器对液体样品进行过滤。具体的：首先将纳米孔径膜装在过滤器滤头上，再用过滤注射器抽取样品，将样品匀速注入过滤器，使样品均匀的分布在滤膜的纳米孔上。然后取下过滤注射器抽吹滤膜直至吹干，取出滤膜贴合至载玻片上，用密封小室贴合。
25.进一步的，本发明对比了不同材质过滤膜对lamp扩增结果的影响，本发明方法中目标微生物定位在过滤膜上直接进行lamp扩增检测，因此膜的材质会影响到扩增结果。比如膜自身的荧光太强会影响显示结果的亮暗比；比如膜生物兼容性差会导致其无法作为基底用于固相lamp扩增。
26.作为优选，所述纳米孔径膜的材质为聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二醇酯。研究表明，在聚碳酸酯膜或聚对苯二甲酸乙二醇酯上进行目标微生物的lamp扩增，扩增产物在激发光的照射下会呈现出亮而聚的点，并且每个扩增点都清晰可见。
27.步骤(2)中，将含有溶菌酶或反转录酶的水凝胶体系直接加入到密封小室中，使得整个扩增体系覆盖过滤膜表面的目标微生物，反应体系中的水凝胶单体在室温下交联成胶，水凝胶的三维网状结构起到对微生物限位的作用。微生物在初始位置被裂解并发生核酸原位扩增反应。
28.在本发明中，先将含有溶菌酶或反转录酶的环介导等温核酸扩增反应体系配置好后再覆盖于过滤膜的目标微生物之上，避免在反应体系配制过程目标微生物提前与裂解试剂和扩增反应试剂接触而开始反应。
29.进一步的，当病原微生物为细菌时，所述环介导等温核酸扩增反应体系中含有溶菌酶。
30.作为优选，所述环介导等温核酸扩增反应体系包括：1
×
isothermal amplification buffer，6mm total mgso4、1.4mm dntps，640u/ml bst 2.0warmstart聚合酶，引物混合物，荧光染料和水凝胶单体；还包括0.1mg/ml溶菌酶和1.0mg/ml bsa；
31.在体系中加入了1.0mg/mlbsa、0.1mg/ml溶菌酶作为整个扩增体系的细胞裂解液。体系中的溶菌酶会原位裂解截留在纳米膜孔上的目标细菌，无需dna提取。
32.当病原微生物为病毒时，所述环介导等温核酸扩增反应体系中含有反转录酶。
33.作为优选，所述环介导等温核酸扩增反应体系包括：1
×
isothermal amplification buffer，6mm total mgso4、1.4mm dntps，640u/ml bst 2.0warmstart聚合酶，引物混合物，荧光染料和水凝胶单体；还包括300u/ml warmstart反转录酶。
34.所述引物混合物为针对目标细菌dna或病毒反转录cdna设计配套的lamp引物，作为优选，反应体系中引物混合物包括：1.6μm fib和bip，0.2μm f3和b3，0.8μm lf和lb。
35.作为优选，所述水凝胶单体包括四臂-聚乙二醇-丙烯酸酯和巯基-聚乙二醇-巯基，上述两种单体在室温下溶于水交联成胶，成胶时间仅需2～4min。因此，在配制环介导等温核酸扩增反应体系时，水凝胶单体最后添加。两者的摩尔比为1:1～4。
36.更为优选，分子量10000的四臂-聚乙二醇-丙烯酸酯和分子量3400巯基-聚乙二醇-巯基以摩尔比1:2混合。
37.作为优选，所述荧光染料为sybr green染料、eva green染料、lamp dye染料中的任意一种。
38.作为优选，利用防水膜对密封小室进行密封。使整个体系置于密封小室中，可以防止水凝胶中的水分因温度升高而蒸发，提高了检测结果的准确性。
39.步骤(3)中，整个纳米限域环介导等温核酸扩增体系置于一个密封小室中进行恒温扩增。
40.作为优选，所述环介导等温核酸扩增反应的条件包括：第一步，65～70℃，15～30min；第二步，75～80℃加热3～7min。
41.研究表明，在第一步的环介导等温扩增后，进行第二步的加热步骤，可以增强扩增后荧光成像的亮暗比，使得检测结果可视化效果更鲜明。
42.更为优选，所述环介导等温核酸扩增反应的条件包括：第一步，65℃，20min；第二
步，80℃加热5min。
43.步骤(4)中，扩增完成后，利用激光发射器(如荧光显微镜的激光器、led照射灯)照射反应体系，使反应后的扩增团迸发荧光，拍摄照片并用计数软件进行荧光点计数。
44.扩增产物在激发光的照射下会发出荧光，每一个扩增点会迸发出一个对应的荧光光团，在荧光成像技术下可清晰地呈现出来。实验结果表明，过滤在膜上的微生物可以原位裂解或反转录，进而进行扩增，且扩增产物仍在初始位置，一个微生物仅对应一个荧光点，可以通过计数软件对荧光点进行计数，最后通过换算，得出待测样品中目标致病微生物的浓度。
45.在本发明中，目标微生物被截留平铺于过滤膜表面，即目标微生物定位于水凝胶体系的二维平面内进行lamp扩增反应，便于后续荧光点的计数分析，提高计数准确率。因为通常荧光显微镜下观察到的是一个二维平面图像，如荧光点分散于反应体系的三维空间中，容易出现上下荧光点重合的情况，导致聚焦不清。
46.本发明方法最后的结果判定为可视化的荧光点分析，理论上只需提供激发光源激发荧光就可以观测到实验结果，有望在资源匮乏，条件简陋的地区实现微生物的快速检测。作为优选，激光发射器采用led手电筒。
47.作为优选，所述计数软件为image j软件。
48.本发明具备的有益效果：
49.(1)本发明提供了一种双重纳米限域的环介导等温核酸扩增的技术方法，第一重纳米限域是利用蚀刻了纳米孔的过滤膜将目标微生物截留在膜上，使得微生物的初始位置被滤膜上的纳米孔所限定；第二重纳米限域是整个扩增体系利用水凝胶的三维网状结构作为天然物理分隔的微腔室，通过上述两步方法的结合，使得微生物在初始位置开始扩增且其扩增后的产物不会扩散出去，最终的结果是形成形状鲜明的扩增荧光点，实现单个微生物的分隔从而进行致病微生物的定量定位检测。
50.(2)本发明的扩增方法不需要复杂且价格高昂的微控流设备装置即可完成待测微生物的纳米限域扩增分析，具有极其快速简易的操作步骤，简单易上手，可以一次性检测大体积样品且不需要提前对目标细菌或病毒进行dna提取或反转录，大大缩短了检测的时间。
51.(3)本发明的方法可应用于多种致病菌、病毒的检测，对目标微生物没有要求，只需要设计合适的孔径和配套的引物即可进行目标微生物的定量定位检测，为大体积液态真实样品或预处理后的液态样品中的微生物检测提供一种经济高效的快速检测手段。
52.(4)本发明提供的检测方法不仅可以应用于液态样品的直接检测，也可以应用于经预处理后的液态处理液的快速检测，反应速度快，检测成本低，可以很好的应用于现场或基层的快速检测。
附图说明
53.图1为聚碳酸酯纳米孔径膜的电镜图。
54.图2为不同材质膜与扩增体系整合的对比图，其中(a)为聚碳酸酯(pc)膜的实验结果图，(b)为聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)膜的实验结果图，(c)为传统商品化薄膜的实验结果图。
55.图3为是否进行80℃加热的结果优化对比图，其中(a)为80℃加热，(b)为未不经过
80℃加热。
56.图4为在聚碳酸酯(pc)膜上修饰不同涂层的实验结果对比图，其中a、b、c分别在pc膜上镀上黑色涂层、金色涂层、灰色涂层，d为未有涂层的pc膜。
57.图5为溶液中环介导等温核酸扩增方法检测样品中的普通大肠杆菌(a)和基于蚀刻过滤膜的双重纳米限域环介导等温核酸扩增方法快速检测样品中的普通大肠杆菌(b)的荧光成像对比图。
58.图6为水凝胶中环介导等温核酸扩增体系(a)和基于蚀刻过滤膜的双重纳米限域环介导等温核酸扩增体系的检测限(b)比较结果。
59.图7为基于蚀刻过滤膜的双重纳米限域环介导等温核酸扩增方法快速检测样品中的单增李斯特菌的荧光成像对比图，其中(a)为样品中含有单增李斯特菌的检测成果，(b)为阴性对照。
60.图8为基于蚀刻过滤膜的双重纳米限域环介导等温核酸扩增方法快速检测样品中的新冠病毒rna的荧光成像对比图，其中(a)为样品中含有新冠病毒rna的检测成果，(b)为阴性对照。
具体实施方式
61.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。
62.以下实施方式采用配制标准样品进行测量，根据测量所得到的dna浓度与标准样品中实际dna浓度来判断本发明的检测方法的准确性。
63.实施例中所使用的引物均来源于生工生物工程(上海)股份有限公司；扩增体系中的10
×
isothermal amplification buffer、bst 2.0warmstart
tm
dna聚合酶、mgso4、dntps购买自美国new england biolab公司；4臂-聚乙二醇-丙烯酸酯(分子量10000)、巯基-聚乙二醇-巯基(分子量3400)购买自美国laysan bio公司；溶菌酶，sybr green购买自美国thermofisher scientific公司；密封小室(frame-seal)购买自美国bio-rad公司；聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)膜，聚碳酸酯(pc)膜和水系pes微孔滤膜购买自whatman公司，直径13mm。
64.实施例1基于蚀刻过滤膜的纳米限域环介导等温核酸扩增方法快速检测样品中的普通大肠杆菌
65.1、大肠杆菌对应的引物序列如下：
66.f3:5'-gccatctcctgatgacgc-3'；
67.b3:5'-atttaccgcagccagacg-3'；
68.lf:5'-ctttgtaacaacctgtcatcgaca-3'；
69.lb:5'-atcaatctcgatatccatgaaggtg-3'；'
70.fip:5'-cattttgcagctgtacgctcgcagcccatcatgaatgttgct-3'；
71.bip:5'-ctggggcgaggtcgtggtattccgacaaacaccacgaatt-3'；
72.配制标准样品：大肠杆菌dna原始浓度为100cfu/ml；
73.2、在过滤器中依次装载好垫圈，蚀刻了纳米孔的过滤膜，以及防止过滤膜变形的牺牲膜，随后过滤注射器抽取1ml标准样品，将样品匀速注入过滤器，使菌液均匀的分布在滤膜的纳米孔上，目标细菌被截留在纳米孔，然后取下过滤注射器抽吹滤膜直至吹干，用尖头镊子取出滤膜贴合至载玻片上，贴上密封小室。
74.本实施例选用不同材质的膜对目标细菌进行截留并用于后续的lamp扩增，探究膜自身的荧光、生物兼容性等因素对扩增结果的影响。具体采用了聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)膜(纳米孔直径为400nm)，聚碳酸酯(pc)膜(纳米孔直径为400nm)和传统商品化水系pes微孔滤膜(纳米孔直径为220nm)，其中聚碳酸酯纳米孔径膜(pcte膜)的电镜图如图1所示，纳米孔径为400nm。
75.3、配置含有水凝胶的扩增体系(25μl)：1.6mg 4臂-聚乙二醇-丙烯酸酯，1.1mg巯基-聚乙二醇-巯基，2.5μl 10
×
isothermal amplification buffer，6mm total mgso4、1.4mm dntps，640u/ml bst 2.0warmstart聚合酶，1.6μm fib和bip，0.2μm f3和b3，0.8μm lf和lb，1
×
sybr green，1.0mg/ml bsa、0.1mg/ml溶菌酶。
76.4、在密封小室中滴加上述3中配制好的扩增体系，贴上防水膜，形成完全封闭的空间。将整个扩增体系置于65℃恒温条件下扩增20min，随后再80℃加热5min。
77.同时，设置扩增反应条件为65℃恒温条件下扩增20min的对照组。
78.5、用荧光显微镜观察扩增后的反应体系并拍下扩增体系的荧光点图片，用image j软件对荧光点进行计数，定量计算水凝胶扩增体系中的待测物的原始浓度。
79.针对不同过滤膜选择的实验结果如图2所示，上述扩增体系在聚碳酸酯(pc)膜、聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)膜(图2a，b)上会呈现出亮而聚的点，并且每个扩增点都十分清晰可见，而在传统商品化膜(图2c)，该扩增体系的扩增受到影响，所呈现出来的点少且暗。因此，本发明优先采用聚碳酸酯(pc)膜。
80.针对扩增条件优化的实验结果如图3所示，在恒温扩增后，进行一个80℃，5min的加热优化过程，显著增强了荧光成像的亮暗比，使最后的检测结果可视化效果更鲜明。
81.对比例1在聚碳酸酯(pc)膜上修饰涂层对扩增结果的影响
82.已知在不同材质的滤膜会影响实验的扩增结果。进一步的，为了探究在同种材质滤膜上修饰不同涂层会对整个扩增过程及扩增结果产生何种影响，本发明方法研究了在聚碳酸酯(pc)膜上修饰涂层对扩增结果的影响。
83.具体的，分别在聚碳酸酯(pc)膜上涂上black dye，gold dye和gray dye形成黑色涂层、金色涂层、灰色涂层，其他同实施例1。
84.结果如图4所示，在黑色涂层上没有检测到扩增点(图4a)，在金色涂层(图4b)、灰色涂层(图4c)观察到较少的扩增点且扩增点的较散。而在未修饰涂层的pc膜(图4d)上则呈现出亮而聚的扩增点，且扩增数量最多，因此在本发明中我们最终选定未修饰涂层的pc膜作为过滤膜。
85.对比例2溶液中环介导等温核酸扩增方法检测样品中的普通大肠杆菌
86.1、大肠杆菌对应的引物序列，同实施例1。
87.配制标准样品：大肠杆菌dna原始浓度为50cfu/μl。
88.2、配制环介导等温核酸扩增反应体系：2.5μl 10
×
isothermal amplification buffer，6mm total mgso4、1.4mm dntps，640u/ml bst 2.0warmstart聚合酶，1.6μm fib和
bip，0.2μm f3和b3，0.8μm lf和lb，1x sybr green，1.0mg/mlbsa、0.1mg/ml溶菌酶。即将实施例1中的扩增反应体系的两种水凝胶单体除去，其余保持相同。
89.3、将2μl标准样品加入到反应体系中。将整个扩增体系置于65℃恒温条件下扩增20min，随后再80℃加热5min，整个扩增条件与实施例1一致相同。
90.4、用荧光显微镜观察扩增后的反应体系并拍下扩增体系的荧光点图片。
91.结果如图5(a)所示，25μl的反应体系在溶液中的反应扩增结果只能定性不能定量。
92.而在实施例1的条件下利用了蚀刻纳米孔的滤膜和水凝胶的双重纳米限域处理后，膜上的细菌的扩增产物固定在初始位置，形成亮而聚的光斑，如图5(b)。
93.可见，本发明方法的检测结果相较于普通的环介导等温核酸扩增方法可视化程度更高，且实验成本低，操作简洁。
94.对比例3水凝胶中环介导等温核酸扩增方法检测样品中的普通大肠杆菌
95.1、大肠杆菌对应的引物序列，同实施例1。
96.配制系列标准样品：
97.大肠杆菌标准样品a浓度为1cfu/μl；
98.大肠杆菌标准样品b浓度为10cfu/μl
99.大肠杆菌标准样品c浓度为20cfu/μl；
100.大肠杆菌标准样品d浓度为40cfu/μl；
101.大肠杆菌标准样品e浓度为80cfu/μl；
102.2、配制含有水凝胶的环介导等温核酸扩增反应体系，同实施例1。
103.3、将2μl标准样品加入到反应体系中。将整个扩增体系置于65℃恒温条件下扩增20min，随后再80℃加热5min，整个扩增条件与实施例1一致相同。
104.4、用荧光显微镜观察扩增后的反应体系并拍下扩增体系的荧光点图片，对荧光点进行计数，进而计算检测限。
105.结果如图6中所示，水凝胶中环介导等温核酸扩增的检测限为1000cfu/ml，而本发明方法的基于蚀刻过滤膜的纳米限域环介导等温核酸扩增方法检测限可低至0.2cfu/ml，大大提高了检测限。
106.实施例2基于蚀刻过滤膜的纳米限域环介导等温核酸扩增方法快速检测样品中的单增李斯特菌。
107.1、单增李斯特菌对应的引物序列如下：
108.f3:5'-ttgcgcaacaaactgaagc-3'；
109.b3:5'-gcttttacgagagcacctgg-3'；
110.lf:5'-taggacttgcaggcggagatg-3'；
111.lb:5'-gccaagaaaaggttacaaagatgg-3'；
112.fip:5'-cgtgtttcttttcgattggcgtctttttttcatccatggcaccacc-3'；
113.bip:5'-ccacggagatgcagtgacaaatgttttggatttcttctttttctccacaac-3'；
114.配制标准样品：单增李斯特菌dna原始浓度为100cell/ml；
115.2、在过滤器中依次装载好垫圈，蚀刻了纳米孔的过滤膜，以及防止过滤膜变形的牺牲膜，随后将500μl标准样品过滤到径迹蚀刻了纳米孔的滤膜上，目标细菌被截留在纳米
孔，反复抽吹过滤器，将滤膜吹干并置于载玻片上，贴上密封小室。同时做个阴性对照组。
116.3、配置含有水凝胶的扩增体系(25μl)：1.6mg 4臂-聚乙二醇-丙烯酸酯，1.1mg巯基-聚乙二醇-巯基，2.5μl 10x isothermal amplification buffer，6mm total mgso4、1.4mm dntps，640u/ml bst 2.0warmstart聚合酶，1.6μm fib和bip，0.2μm f3和b3，0.8μm lf和lb，1x sybr green，1.0mg/mlbsa、0.1mg/ml溶菌酶。
117.4、在密封小室中滴加上述3中配制好的扩增体系，贴上防水膜，形成完全封闭的空间。将整个扩增体系置于65℃恒温条件下扩增20min，随后再80℃加热5min。
118.5、用荧光显微镜观察扩增后的反应体系并拍下扩增体系的荧光点图片，用image j软件对荧光点进行计数，定量计算水凝胶扩增体系中的待测物的原始浓度。
119.实验结果如图7(a)所示，可以进行绝对的定性定量检测，形成了亮而聚的荧光团，可用计数软件进行直接计数。阴性结果如图7(b)所示，没有出现假阳性，该方法可以很好的避免假阳性的干扰。
120.实施例3基于蚀刻过滤膜的纳米限域环介导等温核酸扩增方法快速检测样品中的新冠病毒。
121.1、新冠病毒对应的引物序列如下：
122.f3:5'-aacacaagctttcggcag-3'；
123.b3:5'-gaaatttggatctttgtcatcc-3'；
124.lf:5'-ttccttgtctgattagttc-3'；
125.lb:5'-accttcgggaacgtggtt-3'；
126.fip:5'-cgcattggcatggaagtcactttgatggcacctgtgtag-3'；
127.bip:5'-tgcggccaatgtttgtaatcagccaaggaaattttggggac-3'；
128.配制标准样品：新冠病毒浓度为100copy/ml；
129.2、在过滤器中依次装载好垫圈，蚀刻了纳米孔的过滤膜(孔径100nm)，以及防止过滤膜变形的牺牲膜，随后将1ml标准样品过滤到径迹蚀刻了纳米孔的滤膜上，目标病毒被截留在纳米孔，反复抽吹过滤器，将滤膜吹干并置于载玻片上，贴上密封小室。同时做个阴性对照组。
130.3、配置含有水凝胶的扩增体系(25μl)：1.6mg 4臂-聚乙二醇-丙烯酸酯，1.1mg巯基-聚乙二醇-巯基，2.5μl 10x isothermal amplification buffer，6mm total mgso4、1.4mm dntps，640u/ml bst 2.0warmstart聚合酶，300u/ml warmstart反转录酶，1.6μm fib和bip，0.2μm f3和b3，0.4μm lf和lb，1x sybr green。
131.4、在密封小室中滴加上述3中配制好的扩增体系，贴上防水膜，形成完全封闭的空间。将整个扩增体系置于65℃恒温条件下扩增15min，随后再80℃加热5min。
132.5、用荧光显微镜观察扩增后的反应体系并拍下扩增体系的荧光点图片，用image j软件对荧光点进行计数，定量计算水凝胶扩增体系中的待测物的原始浓度。
133.实验结果如图8(a)所示，可以进行绝对的定性定量检测，形成了亮而聚的荧光团，可用计数软件进行直接计数。阴性结果如图8(b)所示，没有出现假阳性，该方法可以很好的避免假阳性的干扰。