用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒及其检测方法与流程

用于cyp3a5多态性位点基因分型检测的试剂盒及其检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及用于cyp3a5多态性位点基因分型检测的试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.对于cyp3a5*3基因多态性检测的方法有很多种，如限制性长度多态性分析(rflp)、直接测序法、印记杂交法、taqman技术、等位基因特异性扩增法(arms)等。其中，最常用的测序法能够直接检测突变位点的位置和类型，但该方法操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，且扩增产物容易产生污染。
3.例如探针水解法，在pcr反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，它们可分别与2个等位基因完全配对。正常情况下，由于探针5
′
端荧光基团和3
′
端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着pcr的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被taq dna聚合酶5
′→3′
外切酶活性切割，致使探针5
′
端上的荧光基团与3
′
端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针(代表另一种等位基因)不能被有效切割，故检测不到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现snp位点检测。目前常用的探针修饰技术主要是mgb探针、lna探针和pna探针，它们均在一定成都上能提高反应特异性，但仍然在反应扩增末期容易出现非特异性荧光信号。
4.又例如arms-pcr法，扩增阻滞突变系统pcr(amplification refractory mutation system pcr，arms-pcr)，又称为等位基因特异性pcr(allele-specific pcr，as-pcr)。arms-pcr技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。常规pcr扩增dna所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因pcr采用等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷酸不同，一个对野生型等位基因特异，另一个对突变型等位基因特异，在taq dna聚合酶作用下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成pcr产物，而与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qpcr就能很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定snp基因型，目前市场主流为arms qpcr技术，采用taqman探针进行检测。(比如肿瘤靶向用药egfr基因检测，cfda批准的检测试剂盒，90％以上都是arms检测方法)简而言之：引物3’端错配的碱基会导致pcr引物延伸速度变慢，当错配达到一定程度时，引物延伸将终止，得不到特异长度的pcr扩增产物，从而提示模板dna没有与引物3’端配对的碱基，反之则有。
5.上述方法对引物设计区域序列和反应酶有严格的限制要求，且容易产生非特异性扩增。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于为了解决探针水解法或arms-pcr法，对引物设计区域序列和反应酶有严格的限制要求，且容易产生非特异性扩增的缺陷，而提供一种用于cyp3a5多态性
位点基因分型检测的试剂盒及其检测方法，能够提高检测结果的准确度，提高反应的特异性。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.用于cyp3a5多态性位点基因分型检测的试剂盒，包括：野生型检测序列1、野生型检测序列2、突变型检测序列1与突变型检测序列2；
9.所述野生型检测序列1、所述野生型检测序列2中从5'端依次包括引物通用序列区域、引物序列与野生型探针序列的共用区域，rna碱基、第一淬灭基团与3'端；所述突变型检测序列1与所述突变型检测序列2中，从5'端依次包括引物通用序列区域、引物序列与突变型探针序列的共用区域，rna碱基、第一淬灭基团与3'端；
10.5'端具有荧光基团，3'端具有第二淬灭基团。
11.作为本发明的一种优选方案，所述rna碱基的引入点位于为待检测的snp分型位点。
12.作为本发明的一种优选方案，所述第一淬灭基团包括zen
tm
double-quenched probe或dbq1。
13.作为本发明的一种优选方案，所述第二淬灭基团包括mgb。
14.作为本发明的一种优选方案，所述野生型检测序列1如seq id no:1所示，所述野生型检测序列2如seq id no:2所示，所述野生型探针序列如seq id no:3所示与所述突变型检测序列1如seq id no:4所示。
15.一种cyp3a5多态性位点基因分型检测方法，包括以下步骤：
16.1)设计，合成，扩增序列：在序列中引入rna碱基以及第一淬灭基团，合成所述的野生型检测序列1、野生型检测序列2、突变型检测序列1与突变型检测序列2；
17.2)将步骤1)得到的野生型检测序列1或野生型检测序列2和突变型检测序列1或突变型检测序列2进行arms-pcr扩增反应。
18.作为本发明的一种优选方案，步骤2)的反应体系包括2*pcr buffer、taq酶、切口酶、野生型检测序列1或野生型检测序列2、突变型检测序列1或突变型检测序列2、模板dna与纯化水。
19.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中扩增反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火延伸，重复40个循环。
20.在本发明中，本发明将引物和探针序列合并设计，引物区域的序列可以是通用的序列，减少引物环节的设计，也可以是根据目的序列相互匹配进行设计。探针区域的设计主要是通过提高杂交特异性的原理，目前常见的方法是序列的末端用mgb修饰，其有两个作用，一方面是提高序列与目片段的结合特异性，一方面是是封闭3端序列在反应的过程中不会延伸。
21.通用运用切口酶的技术，当设计的序列和目的片段完全匹配时，对rna修饰的碱基进行特异性切割，暴露出引物3端oh，在合适的pcr反应体系下反应可以继续扩增，同时在每一轮的pcr过程中结合进行修正校正，能在mgb探针的基础上进一步提高反应的特异性，当设计的序列和目的片段完全不匹配时，反应无法延申。
22.因需要将引物结合序列和探针结合序列整合到一起，猝灭效果不是很理想，所以在序列的设计过程中引入了双猝灭基团，提高反应灵敏度，降低本底信噪。
23.同时为了提高杂交的特异性，在原有mgb探针的基础上，在引物后半区域引入一个rna碱基，此碱基用于区分snp分型检测位点，当snp位点引入rna碱基后，只有与模板完全匹配情况下，切口酶可以切割碱基，暴露出3-oh，后续反应得以扩增，产生荧光，当不匹配时，因为没有切割，不会暴露3-oh，没有荧光产生。
24.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25.1)本发明提供的试剂盒在设计过程中引入了双猝灭基团，提高反应灵敏度，降低本底信噪；
26.2)本发明为了提高杂交的特异性，在rna修饰的碱基的上游引入突变设计，进一步提高反应的特异性；
27.3)本发明的检测方法具有简单、微量、快速的优点，兼容性强，药物筛选工作量小，实验快速精确，实验结果重复性好，可用于抗手足口病药物的筛选与开发。
附图说明
28.图1是野生型探针序列的实验结果。
29.图2是突变型探针序列的实验结果。
30.图3是本发明野生型检测序列1的结果。
31.图4是本发明突变型检测序列1的结果。
32.图5是本发明野生型检测序列2的结果。
33.图6是本发明突变型检测序列2的结果。
具体实施方式
34.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.在本发明中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。
36.实施例：
37.根据cyp3a5(rs776746)多态性位点基因分型检测，通过对生物信息学工具，获得带设计的目标区域，具体序列如下所示：
38.agtccttgtg agcacttgat gatttacctg ccttcaattt ttcactgacc taatattctt tttgataatg aagtatttta aacatataaa acattatgga gagtggcata ggagataccc acgtatgtac cacccagctt aacgaatgct ctactgtcat ttctaaccat aatctcttta aagagctctt ttgtctttcartatctcttcc ctgtttggac cacattaccc ttcatcatat gaagccttgg gtggctcctgtgtgagactc ttgctgtgtg tcacacccta atgaactaga acctaaggtt gctgtgtgtc(seq id no:9)。
39.通过使用设计软件对序列进行设计，根据实验方案对序列进行修饰，具体如下：
40.野生型检测序列1：fam-atgccaggtaagagctcttttgtctttcargtxactcttccct-mgb(seq id no:1)；
41.野生型检测序列2：
42.野生型探针序列：fam-tgtctttgagtatctctccct-mgb(seq id no:3)；
43.突变型检测序列1：vic-atgccaggtaagagctcttttgtctttcaratxactcttccct-mgb(seq id no:4)；
44.突变型检测序列2：突变型检测序列2：
45.突变型探针序列：vic-tgtctttgaatatctctccct-mgb(seq id no:6)；
46.上游引物序列：atgccaggtaagagctct(seq id no:7)。
47.下游引物序列：ggtgtgacacacagcaagagtctc(seq id no:8)
48.其中，rg或ra为中间引入的rna碱基，x为中间插入的第一淬灭基团，为引入的突变碱基g，尾部用mgb修饰。
49.反应扩增体系见表1，反应扩增程序见表2。
50.表1.反应扩增体系
[0051][0052][0053]
*若使用野生型检测序列1，则在同一个体系中需加入突变型检测序列1，若用野生型检测序列2，则在同一个体系中需加入突变型检测序列2。
[0054]
表2.反应扩增程序
[0055][0056]
在荧光定量pcr仪选择相对应的荧光基团采集信号运行反应程序，结果见图3，图4，图5与图6。
[0057]
对比例，对照taqman-mgb扩增反应体系见表3。
[0058]
表3.taqman-mgb扩增反应体系
[0059]
组分体积终浓度2*pcr buffer21*pcr buffer
taq酶0.52u上游引物0.5100nm下游引物0.5100nm野生型探针序列0.450nm突变型探针序列0.450nm模板2μl 纯化水加水至20μl [0060]
结果见图1与图2。
[0061]
图1与图2中，1表示fam荧光基团，2表示rox荧光基团，3表示vic荧光基团。
[0062]
图3，图4，图5与图6中，1表示fam荧光基团，3表示vic荧光基团。
[0063]
参见图1，模板为野生纯合样本时的检测结果，仅使用taqman-mgb探针作为snp分型的技术进行分型时，极容易产生非特异性扩增曲线3。
[0064]
参见图2，模板为突变纯合样本时的检测结果，仅使用taqman-mgb探针作为snp分型的技术进行分型时，极容易产生非特异性扩增曲线1。
[0065]
参见图3，模板为野生纯合样本时的检测结果，仅使用本发明的野生型检测序列1作为snp分型的技术进行分型时，略微产生非特异性扩增曲线3。
[0066]
参见图4，模板为突变纯合样本时的检测结果，仅使用本发明的突变型检测序列1作为snp分型的技术进行分型时，略微产生非特异性扩增曲线1。
[0067]
参见图5，模板为野生纯合样本时的检测结果，仅使用本发明的野生型检测序列2作为snp分型的技术进行分型时，无非特异性扩增曲线3产生，说明使用本发明的技术可以显著改善snp分型的特异性和准确性。
[0068]
参见图6，模板为突变纯合样本时的检测结果，仅使用本发明的突变型检测序列2作为snp分型的技术进行分型时，无非特异性扩增曲线1产生，说明使用本发明的技术可以显著改善snp分型的特异性和准确性。
[0069]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。